FR2756143A1 - Utilisation de l'ascididemine et derives dans des composi- tions antisalissures biologiques - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation de composés de formule générale (I): (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle R1 et R2 , indépendamment l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou des radicaux saturés ou insaturés à une ou plusieurs double liaisons, notamment un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, ou des amines substituées, ou R1 et R2 constituent un cycle de 4 à 8 atomes de carbone dans le cycle, ou comprenant un ou plusieurs hétéroatomes en lieu et place desdits atomes de carbones dans le cycle, notamment un cycle benzénique ou un cycle pyridine, en tant qu'agents antisalissures biologiques (encore désignés agents antifouling).

Description

UTILISATION DE L'ASCIDIDEMINE ET DERIVES DANS DES
COMPOSITIONS ANTISALISSURES BIOLOGIQUES
La présente invention a pour objet des compositions antisalissures biologiques, ainsi que leurs utilisations dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de traitement de milieux aqueux et/ou de surfaces immergées en milieu aquatique, contre les salissures biologiques.

Toute surface immergée en milieu aquatique (milieu marin, eau saumâtre, eau douce) est rapidement colonisée par des organismes vivants si elle n'est pas efficacement protégée.

La présence de ces organismes sur des structures artificielles, désignés sous le terme de salissures biologiques (ou sous le terme anglo-saxon de fouling), peut affecter et entraver de façon considérable le fonctionnement des activités maritimes.

Les organismes responsables de salissures en milieu marin sont nombreux et variés. Plus de 2000 espèces appartenant à plus de 20 phyla différents ont été décrites, parmi lesquelles figurent:
- des micro-organismes tels que bactéries, diatomées, protozoaires,
- des macro-organismes sécrétant des structures rigides fermement attachées au support tels que balanes, serpules, bryozoaires, bivalves,
- des macro-organismes dépourvus de structures rigides tels que algues, hydrozoaires, éponges, ascidies.

Les salissures biologiques constituent de véritables nuisances vis-à-vis:
- des équipements flottants : augmentation du poids des bouées et des piquets,
- des centrales électriques et des installations offshore : obstruction des circuits de pompage d'eau, diminution de l'efficacité des échangeurs thermiques,
- des activités aquacoles : diminution des échanges d'eau à travers les filets et cages d'élevage, diminution de leur flottabilité, rigidification des cordages,
- des bateaux : perte de vitesse des navires, surconsommation de carburant, opérations de carénage répétées.

Le contre-coût pour l'économie maritime mondiale est estimé à 1,4 milliards $ par an.

La méthode traditionnellement utilisée pour contrôler le développement des salissures biologiques consiste à protéger les structures immergées à l'aide d'un revêtement (peinture, vernis, gel) contenant un ou plusieurs agents toxiques qui sont libérés dans la couche de surface et empêchent la fixation des organismes.

Actuellement le système de protection le plus efficace pour protéger les structures immergées est l'application de peintures anti salissures qui agissent par relargage de biocides à la surface du revêtement. Les principaux biocides utilisés sont des dérivés du cuivre et de l'étain.

En 1974. la commercialisation de formulations autolissantes à base d'organoétains, capables d'assurer une protection d'au moins cinq ans, a totalement révolutionné le marché des peintures antisalissures et relégué au second plan les peintures traditionnelles à base de cuivre. Le succès des peintures autolissantes tient au fort pouvoir biocide des organoétains et à la possibilité de les lier de façon covalente avec des polymères acryliques, permettant un relargage contrôlé du biocide et du liant et assurant un lissage permanent du revêtement. Cependant, l'inconvénient majeur de ces peintures est leur impact sur l'environnement marin et en particulier sur les activités ostréicoles, ce qui a conduit la majorité des pays à interdire, dès les années 80, leur utilisation sur les bateaux de moins de 25 mètres.

La législation sur les peintures à base d'organostanniques a eu pour conséquence un retour vers des formulations à base de cuivre en association avec des biocides organiques tels que des herbicides (diuron, triazine, isothiazoline) ou des fongicides (carbamates) destinés à combattre les espèces résistantes au cuivre.

Dès la fin des années 80, des formulations sans étain plus efficaces que les peintures conventionnelles à base de colophane ont été développées. Ces peintures renferment une forte proportion de résines solubles associées à des polymères insolubles performants qui permettent de mieux contrôler la vitesse de dissolution du revêtement, et par là, le taux de relargage des biocides. Ces peintures donnent actuellement les meilleurs résultats des formulations sans étain (36 mois).

Cependant les produits actifs qu'elles libèrent sont toxiques et potentiellement dangereux pour l'environnement.

L'utilisation croissante des peintures à base d'oxyde cuivreux constitue donc un risque important d'accumulation de cuivre dans certaines zones portuaires (Claisse & Alzieu, 1993; Lewis, 1994).

Une seconde approche pour le remplacement des sels d'étain consiste à rechercher des molécules naturelles actives, notamment à partir d'organismes manns. Cette voie de recherche a connu un développement très important ces dernières années. L'intérêt qu'elle suscite repose sur deux arguments principaux:
- de nombreux organismes marins ont développé des systèmes de protection contre l'épibiose, parmi lesquels les défenses chimiques jouent un rôle prépondérant. L'extraction, la purification biodirigée et l'identification structurale des métabolites secondaires constituent les principales étapes de cette recherche.

- les substances naturelles sont supposées être facilement dégradables et leur utilisation comme agent antisalissure ne constitue a priori pas un risque pour l'environnement.

Des composés présentant une activité supérieure à celle de l'étain, sur la fixation des larves de balane, ont été isolés d'invertébrés marins ou d'algues (Kon
Ya et al, 1994;DeNysetaî, 1995).

Compte tenu de la relative complexité des produits naturels qui limite leur production par synthèse, on préférera tester, quand ils existent, des analogues structuraux déjà commercialisés. Ainsi plusieurs demandes de brevet ont été déposées sur certaines classes de composés chimiques, comme: les lactones (Bonaventura et al, 1994; Clare et al, 1994; Gerhart et al, 1993), les indoles (Kon
Ya,1993; Khimizu et al, 1994), les stéroïdes (Bonaventura et al, 1993; Kaiyo
Biotechnology Kenkyusho, 1993), les acides gras (Mehta & Sherba, 1992; Lion
Corp., 1993) et autres.

Parmi les agents antisalissures décrits jusqu'à maintenant, on peut également citer les biocides par contact. Contrairement aux systèmes antisalissures classiques qui fonctionnent par libération de biocides dans la couche de surface, l'originalité des biocides par contact est d'être fixés à la surface du revêtement par une liaison non hydrolysable, de ne pas diffuser dans le milieu environnant et d'agir uniquement sur les organismes qui entrent en contact avec la surface.

Les biocides utilisés sont des sels d'ammonium quaternaire, connus pour leur fort pouvoir antimicrobien et déjà largement employés en solution dans des produits désinfectants. Selon leur proportion dans le revêtement, les sels d'ammonium quaternaire agissent comme agents bactériostatiques ou bactéricides pour empêcher la formation du biofilm bactérien qui est à l'origine des salissures marines.

Les premiers essais d'incorporation de sels d'ammonium quaternaire dans des formulations commerciales ne furent pas très satisfaisants (Mellouki et al, 1989 a, b). Les biocides peuvent être couplés à des polymères de type siloxane (Hazziza
Laskan et al, 1993) ou polyuréthanne (Toyobo, 1993). Récemment la société française Oléronlac a commercialisé un liant bactéricide obtenu par greffage de sels d'ammonium quaternaire sur une résine vinylique chlorée (Oléronlac-Peintures du littoral, 1995). L'efficacité du produit est apparue limitée dans le cas des peintures à matrice dure où les biocides, greffés par des liaisons non hydrolysables, peuvent être inactivés par recouvrement par des hydrocarbures, surtout dans le cas des bateaux restant souvent à quai. Depuis, la société a développé des peintures à matrice érodable formulées à partir du liant bactéricide, démontrant ainsi de façon évidente la nécessité d'un relargage du biocide pour une efficacité accrue.

Au milieu des années 70 de gros efforts ont été entrepris pour le développement de revêtements anti-adhésifs à faible tension de surface. L'énergie libre de surface d'un substrat détermine sa plus ou moins grande mouillabilité. Ainsi un revêtement à faible tension de surface présente un caractère hydrophobe et une faible mouillabilité. Ce paramètre a une influence directe sur la diffusion et l'adhésion des colles sécrétées par les organismes pour leur fixation. Ces revêtements sont basés sur les propriétés des silicones et des polyuréthannes fluorés. Bien qu'ils n'empêchent pas la fixation des organismes, ils affaiblissent considérablement les forces d'adhésion avec la surface, qui peut ainsi être nettoyée facilement avec un jet d'eau sous pression, voire par simple déplacement du bateau si sa vitesse est suffisante.

En théorie ces revêtements ont une durée de vie illimitée. Malgré les nombreux espoirs qu'ils ont suscités, leur utilisation est encore peu répandue et limitée essentiellement aux circuits de refroidissement des centrales électriques. Les principaux obstacles à leur développement sont leur coût élevé, leur difficulté d'application, leur faible adhésion aux surfaces et enfin leur faible résistance mécanique qui en font des revêtements inadaptés à la plupart des bateaux. A l'heure actuelle les meilleurs résultats ont été obtenus avec les polysiloxanes.

Un des buts de la présente invention est de fournir de nouvelles compositions antisalissures biologiques, présentant l'avantage de ne pas être nuisibles pour l'environnement par rapport aux compositions antisalissures biologiques utilisées actuellement, tout en luttant de manière aussi efficace, voire même plus efficace, contre les salissures biologiques en milieu aqueux, que lesdites compositions antisalissures biologiques actuelles.

Un autre but de la présente invention est plus particulièrement celui de fournir de nouveaux procédés de lutte contre les salissures biologiques, et, à ce titre, de nouveaux produits de revêtement de surface, notamment de nouvelles peintures, protégeant efficacement les surfaces immergées dans l'eau contre le développement des salissures biologiques.

La présente invention a pour objet l'utilisation de composés de formule (I) suivant:

dans laquelle R1 et R2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou des radicaux saturés ou insaturés à une ou plusieurs double liaisons, notamment un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, ou des amines substituées, ou R1 et R2 constituent un cycle de 4 à 8 atomes de carbone dans le cycle, ou comprenant un ou plusieurs hétéroatomes en lieu et place desdits atomes de carbones dans le cycle, notamment un cycle benzénique ou un cycle pyridine, en tant qu'agents antisalissures biologiques (encore désignés agents antifouling).

Un composé particulièrement préféré utilisé en tant qu'agent antifouling dans le cadre de la présente invention est l'ascididemine de formule

Par agent antisalissures biologiques dans ce qui précède et ce qui suit, on entend tout composé tel que défini ci-dessus, susceptible d'inhiber totalement ou partiellement le développement d'au moins un, et de préférence de l'ensemble des trois principaux organismes responsables de salissures en milieu aqueux suivants
- les bactéries vivant en milieu aqueux (eau douce ou milieu marin), notamment les bactéries marines suivantes Deleya marina, Alteromonas haloplanktis, Vibrio canlpbellii et Bacillus niarinus,
- les végétaux (d'eau douce ou d'eau de mer) tels que microalgues, et plus particulièrement les algues marines telles que les diatomées, notamment celles des genres Amphore et Nitzschia,
- les larves d'animaux vivant en milieu aqueux, notamment les larves d'invertébrés benthiques, et plus particulièrement les larves de balanes, tels que
Balanus amphitrite.

L'invention a également pour objet toute composition antisalissures biologiques (ou antifouling), comprenant au moins un composé de formule générale (I) décrite ci-dessus.

Des compositions antisalissures biologiques particulièrement préférées sont celles comprenant de l'ascididemine dont la formule est décrite ci-dessus.

L'invention a également pour objet toute composition de revêtement de surface, notamment peinture, vernis, gel, comprenant une composition antisalissures biologiques telle que définie ci-dessus, cette dernière contenant au moins un composé de formule (I) susmentionnée, en association avec un produit de revêtement de surface, ce dernier étant avantageusement choisi parmi les produits de revêtement érodables tels que les colophanes, ou les produits de revêtement insolubles tels que les caoutchoucs chlorés ou vinyle, ou les produits de revêtement autolissant tels que les supports acryliques.

Avantageusement, les compositions de revêtement de surface susmentionnées sont telles que la proportion de composé utilisé est d'environ 0,1 % à environ 50 % en poids par rapport au poids total de ladite composition de revêtement de surface, de préférence d'environ 1 % à environ 20 %.

Des compositions de revêtement de surface particulièrement préférées dans le cadre de la présente invention, sont celles comprenant de l'ascididemine en association avec un produit de revêtement tel que déjà décrit ci-dessus, dans des proportions telles que le pourcentage en poids d'ascididemine est d'environ 1 % à environ 20 % par rapport au poids total desdites compositions.

L'invention a également pour objet tout procédé de prévention et/ou de traitement de milieux aqueux contre les salissures biologiques, notamment contre le développement de bactéries, des végétaux et des larves susmentionnées, sur les surfaces en contact avec ce milieu aqueux, caractérisé en ce qu'il est effectué par addition d'une composition antisalissures biologiques décrite ci-dessus, au milieu aqueux à traiter.

Le procédé susmentionné est plus particulièrement adapté à la prévention et/ou au traitement contre les salissures biologiques dans les installations à circulation d'eau fermée, dans lesquelles l'eau est recyclée en permanence.

Un autre moyen de lutter contre le développement des salissures biologiques dans ce type d'installation à circuit d'eau fermé, est de revêtir les surfaces en contact avec le milieu aqueux, avec une composition de revêtement selon l'invention, selon le procédé décrit ci-dessous.

L'invention a également pour objet tout procédé de prévention et/ou de traitement des surfaces immergées dans un milieu aqueux contre les salissures biologiques susmentionnées, notamment contre le développement sur ces surfaces de bactéries, microalgues et larves d'invertébrés, par revêtement desdites surfaces avec une composition de revêtement telle que décrite ci-dessus.

Parmi les principaux matériaux ou équipements d'eau douce ou d'eau de mer, susceptibles d'être traités dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment:
- tout navire d'une manière générale, notamment tout type de bateaux, y compris les pétroliers, les sous-marins, etc...

- tuyaux,
- plates-formes offshore,
- toute structure immergée (ponts, etc...),
- les installations aquacoles, notamment filets, bouées, etc...

- les capteurs sous-marins.

Avantageusement les composés de formule (I) de l'invention sont obtenus par mise en oeuvre du procédé suivant:
- condensation du composé de formule (A) indiquée ci-dessous dans laquelle
R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus avec la 2-aminoacétophénone en présence de chlorure de calcium dans l'éthanol à 20"C pendant 24 heures, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (B) indiquée ci-dessous suivant le schéma réactionnel suivant:

<tb> <SEP> o <SEP> o
<tb> <SEP> R1 <SEP> CH3GO
<tb> <SEP> CaCI2 <SEP> R1 <SEP> COGH
<tb> (A) <SEP> t <SEP> dansEtOli <SEP> EtOE
<tb> <SEP> R <SEP> <SEP> H2N <SEP> 20C,24H <SEP> M
<tb> <SEP> R2 <SEP> NH
<tb>
- traitement du composé (B) ci-dessus par de l'acide sulfurique dans l'acide acétique (AcOH) à reflux pendant 10 minutes, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (C) indiquée ci-dessous:

- réaction du composé de formule (C) ci-dessus avec du
N,N-diméthylformamide diéthylacétal de formule HC(OC2H5)2N(CH3)2 dans du diméthylformamide à 120"C pendant une heure, ce qui conduit au composé de formule (D) suivante:

- traitement du composé de formule (D) ci-dessus, par du chlorure d'ammonium NH4Cl dans l'acide acétique (AcOH) pendant 1 heure à reflux ce qui conduit au composé de formule (I) de l'invention suivante:

S'agissant du cas particulier de l'ascididemine, sa synthèse est décrite dans l'article de Bracher, 1989, et est effectuée selon le procédé décrit ci-dessus à l'aide du composé de formule (A)a susmentionnée dans laquelle R1 et R2 représentent ensemble un cycle pyridine, à savoir le composé de formule (A)a suivante:

L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'activité antisalissures biologiques de l'ascididemine à titre d'exemple.

La recherche de molécules antisalissures naturelles à partir d'organismes marins benthiques constitue une alternative très prometteuse à l'emploi des biocides inorganiques. Les invertébrés sessiles, en raison de leur mode de vie fixé, sont soumis à une pression de colonisation comparable à celle des structures immergées. Pourtant un grand nombre de ces organismes parviennent à maintenir leur surface corporelle propre (dépourvue d'épibiontes) grâce, notamment, à la production de métabolites secondaires assurant une fonction antisalissure.

1.3. - Descriptif détaillé
L'illustration qui suit a pour objet la validation des propriétés antisalissures d'un alcaloïde marin, l'ascididemine, de formule

Cet alcaloïde à noyau pyridoacridine a été isolé d'une ascidie de la famille des
Didemnidae, Didemnum sp. (Kobayashi et al, 1988) et de deux ascidies de la famille des Polycitoridae, Eudistoma sp. (He & Faulkner, 1991) et Cystodytes dellechiajei (Badre, 1993). La molécule faisant l'objet de cette étude a été synthétisée d'après le protocole mis au point et publié par Bracher (Bracher, 1989).

Les exemples suivants ont pour objet de décrire en détail l'activité de l'alcaloïde sur les principaux organismes responsables des salissures marines: bactéries, diatomées et balanes. La toxicité de l'ascididemine a également été testée sur la division de l'oeuf d'oursin.

Exemple 1. Test d'activité antibactérienne
L'activité antibactérienne de l'ascididemine a été évaluée sur quatre souches de bactéries marines, Deleya marina (CIP: 748-T), Alteromonas haloplanktis (CIP: 103197-T), Vu brio campbellii (cil: 751-T) et Bacillus marinas (cil: 103308-T), par détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) en milieu liquide. Ce paramètre correspond à la concentration minimale d'alcaloïde nécessaire pour inhiber la croissance visible des bactéries (effet bactériostatique).

La CMI est estimée visuellement par absence de trouble après 48h d'incubation à 30 C.

Pour comparaison, les activités du chlorure cuivrique (CuCl2) et de l'oxyde
de tributylétain (TBTO) ont également été déterminées.

Conditions de culture
Les bactéries sont cultivées à 30 C dans des tubes stériles Falcon de 50ml
contenant 20ml de bouillon nutritif: 0,5% peptone (p/v), 0,01% FePO4 (p/v),
0,05% NH4CI (p/v), 75% eau de mer filtrée (v/v), 25% eau distillée (v/v). Avant
chaque test, les cultures sont repiquées dans du bouillon frais et incubées une nuit
dans un incubateur rotatif à 30 C sous agitation modérée (200rpm). La pureté des
souches bactériennes est controlée régulièrement par isolement sur gélose nutritive
(Marine Agar 2216 - Difco). Entre chaque test, les cultures sont conservées à 4"C.

Protocole expérimental
Les tests sont réalisés dans des tubes en verre autoclavables contenant du
bouillon stérile. Les tubes tests reçoivent une solution d'ascididemine, de CuC12 ou
de TBTO à différentes concentrations. Les tubes servant de témoins reçoivent une
dose de solvant équivalente aux plus fortes concentrations testées. Les tubes sont
alors inoculés avec 30,u1 de culture bactérienne en fin de phase exponentielle. Le
volume final par tube est de 3ml. Chaque concentration est testée en duplicats. Les
tubes sont placés dans une étuve à 30 C et la CMI est déterminée après 48h
d'incubation.

Résultats
Le test fut répété 3 fois. Les résultats figurant dans le tableau 1 représentent
les concentrations minimales de chaque produit (CMI) nécessaires pour inhiber le
développement des cultures bactériennes.

<tb>

TABLEAU <SEP> t <SEP> Développeineat <SEP> bactérien
<tb> <SEP> CMI <SEP> mi <SEP>
<tb> souche <SEP> Grain <SEP> ascididemine <SEP> CuC12 <SEP> TBTO
<tb> <SEP> eleyanzarina <SEP> (-) <SEP> 1 <SEP> > 100 <SEP> > 10
<tb> <SEP> iteromonas <SEP> hatopkinktis <SEP> (-) <SEP> (-) <SEP> <SEP> 2 <SEP> > 100 <SEP> 2,5
<tb> <SEP> Vzbrio <SEP> campbellii <SEP> (-) <SEP> 0,5 <SEP> > 100 <SEP> 2,5
<tb> <SEP> Bacillus <SEP> marinus <SEP> (+) <SEP> 0,1 <SEP> 100 <SEP> 0,1
<tb>
L'activité antibactérienne de l'ascididemine est supérieure à celle de l'oxyde de tributylétain sur les trois souches Gram (-), et du même ordre de grandeur sur la souche Gram(+). Elle est également très supérieure à celle du chlorure cuivrique sur l'ensemble des souches testées.

Exemple 2. Test d'activité antidiatomée
Les diatomées des genres Aniphora et Nitzschia sont des algues unicellulaires qui participent activement aux salissures biologiques. Amphore, connue pour être particulièrement résistante, est fréquemment rencontrée sur les peintures à base d'organoétains. L'effet de l'alcaloïde sur Nitzschia acicularis et Aniphora coffeaefomzis (CCAP: 1001/1) a été évalué sur gélose, en boîte de Pétri, par mesure des zones d'inhibition induites autour de disques en papier imprégnés du produit à différentes concentrations. Le chlorure cuivrique et l'oxyde de tributylétain ont également été testés comme référence.

Conditions de culture
Les diatomées sont cultivées dans des erlenmeyers de 150ml contenant 100ml de milieu de Guillard 112 préparé à partir d'une solution de Guillard enrichie (Sigma) diluée dans de l'eau de mer naturelle. Les cultures sont maintenues à 18i1 C dans une chambre de culture avec une photopériode de 12h. La source lumineuse est constituée de quatre tubes fluorescents Day-Light de 18W. Les cultures sont repiquées régulièrement à 7 jours d'intervalle dans du milieu f/2 frais.

Protocole expérimental
La gélose nutritive est préparée par addition de 1,2% (p/v) d'agar granulé (BioMérieux) dans du milieu f/2, autoclavée puis distribuée dans des boîtes de
Pétri par aliquotes de 20ml.

200p1 d'une culture en phase exponentielle (âgée de 4-5 jours) sont ensemencés au centre de chaque boîte et étalés uniformément à la surface de la gélose à l'aide d'une pipette Pasteur coudée à la flamme. Des disques en papier stériles (Filtres Durieux, : 6mm) sont imprégnés avec les solutions des produits à tester.

Après évaporation du solvant, chaque disque est déposé au centre des boîtes ensemencées. Chaque concentration est testée en triplicats. Les boîtes sont incubées dans la chambre de culture dans les conditions précédemment citées. Le diamètre des zones d'inhibition est mesuré après 10 jours d'incubation.

Les données présentées dans le tableau 2 correspondent aux valeurs moyennes des zones d'inhibition mesurées autour des disques en papier, diamètre du disque inclus.

<tb>

TABLEAU <SEP> 2 <SEP> Croissance <SEP> alále <SEP>
<tb> <SEP> Zone <SEP> d'inhibition <SEP> mm <SEP>
<tb> <SEP> Produit <SEP> Concentration( <SEP> Nitzschia <SEP> acicularis <SEP> Aniphora <SEP>
<tb> <SEP> nmole/disque) <SEP> coffeaeformis <SEP>
<tb> ascididemine <SEP> 100 <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP>
<tb> <SEP> 10 <SEP> 53 <SEP> 53
<tb> <SEP> 1 <SEP> 26 <SEP> 18
<tb> <SEP> 0.1 <SEP> o <SEP> o
<tb> <SEP> CuCl2 <SEP> 100 <SEP> 16 <SEP> 14
<tb> <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> O <SEP>
<tb> <SEP> 1 <SEP> O <SEP>
<tb> <SEP> 0.1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> TBTO <SEP> 100 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP>
<tb> <SEP> 10 <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP>
<tb> <SEP> 1 <SEP> ++ <SEP> 20
<tb> <SEP> 0*1 <SEP> 9 <SEP> 0
<tb> inhibition totale du développement algal ++: inhibition majeure du développement algal
L'activité de l'ascididemîne est très supérieure à celle du chlorure cuivrique
tandis que l'oxyde de tributylétain présente la plus forte activité vis-à-vis des deux
diatomées testées.

Exemple 3. Test d'inhibition de fixation larvaire
Les balanes sont des organismes incrustants communément rencontrés sur les
structures immergées, sur lesquelles ils se fixent grâce à un ciment très dur.

Balanus anaphitrite est une espèce cosmopolite qui se reproduit durant toute
l'année, assurant un approvisionnement constant en larves, et dont le
développement larvaire est rapide et synchrone. Cet organisme offre donc un
modèle particulièrement adapté pour des tests d'inhibition de fixation larvaire.

Conditions de culture
Les tests ont été réalisés au centre TNO de Den Helder (Pays-Bas) qui dispose des structures nécessaires à l'élevage de Balanus amphitrite.

Les organismes adultes sont maintenus dans des bacs de 101 d'eau de mer aérée à 26-28"C avec un cycle jour/nuit (15h:9h). Ils sont nourris quotidiennement avec une culture de Skeletonen1cr costatuni et des larves d'Artémia salina.

Obtention et culture des larves
L'éclosion des larves de balane (stade nauplius) est obtenue après renouvellement de l'eau des bacs et arrêt de l'aération. Les larves sont ensuite concentrées à l'aide d'une source lumineuse, collectées avec une pipette et transférées dans des bacs de 81 d'eau de mer aérée maintenus dans les conditions précédemment citées. Les larves sont nourries quotidiennement avec une culture de Skeleíonema costatum. La majorité des larves atteignent le stade cypride (stade de recrutement) 4 à 6 jours après l'éclosion. La culture est alors filtrée à travers deux tamis séquentiels de 250 et 1501lm retenant respectivement les larves nauplii et cyprides. Les larves cyprides sont conservés durant 4 jours à 4-6"C, à l'obscurité, avant le début du test.

Protocole expérimental
Les tests sont effectués dans des plaques multi-puits en polystyrène (Corning, : 35mm). 2ml d'eau de mer contenant une dose de produit (cupules tests) ou une dose de solvant équivalente à la plus forte dose utilisée (contrôles solvants) sont répartis dans chaque cupule. Les cupules ne recevant que de l'eau de mer servent de témoins. Les produits testés sont l'ascididemine, le sulfate de cuivre (CuSO4) et le chlorure de tributylétain (TBTCI). Les concentrations testées varient suivant le produit considéré afin de déterminer leur niveau d'inhibition respectif.

Quatre réplicats sont effectués par concentration.

20 à 30 larves cyprides sont distribuées dans chaque cupule. Les plaques sont alors placées à 26-28"C avec un cycle jour/nuit (15h:9h). Après 24h d'incubation, les plaques sont rapidement examinées sous une loupe binoculaire pour évaluer le taux de survie des larves. Le test est alors stoppé par addition de deux gouttes de formaldéhyde 10% et les larves fixées et libres sont dénombrées. Le pourcentage de fixation est calculé en prenant en compte le nombre total de larves fixées (cyprides non métamorphosés + cyprides métamorphosés en balanes).

Résultats
Les valeurs présentées dans le tableau 3 correspondent aux concentrations de produit nécessaires pour inhiber de 50% la fixation des larves cyprides (IC50).

TABLEAU 3

<tb> Produit <SEP> Fixation <SEP> larvaire
<tb> <SEP> IC5O <SEP> (llg/ml) <SEP>
<tb> ascididemine <SEP> 0,83
<tb> CuS04 <SEP> 0 <SEP> 84 <SEP>
<tb> <RTI ID=14.6 maintenus sous faible agitation au moyen d'une table d'agitation. Juste avant la fécondation, le sperme est dilué 100 fois dans de l'eau de mer et 101l1 de la dilution sont ajoutés à chaque bécher. Le produit à tester est ajouté à différentes concentrations 30 secondes après la fécondation, ce délai étant suffisant pour permettre une fécondation complète. Les béchers contrôles ne reçoivent que le solvant. Des prélèvements successifs de 500p1 d'oeufs sont effectués à 5 ou 10min d'intervalle durant le premier cycle de division et fixés dans une solution de glutaraldéhyde (3%) dans l'eau de mer.

Pour chaque prélèvement, le pourcentage de division est déterminé au microscope par dénombrement des oeufs ayant atteint le stade 2 cellules.

Résultats
Le test fut répété 3 fois. La concentration de produit entraînant une inhibition de 50% de la division des oeufs (ICso) est déterminée au moment où le contrôle est entièrement divisé. Le tableau 4 présente les valeurs moyennes des ICso obtenues pour l'alcaloïde et l'oxyde de tributylétain.

TABLEAU 4

<tb> Produit <SEP> Division <SEP> des <SEP> oeufs
<tb> <SEP> IC50 <SEP> (rAI) <SEP>
<tb> ascididemine <SEP> 1650
<tb> TBTO <SEP> 112
<tb>
L'ascididemine présente une ICso plus de 100 fois supérieure à celle de l'oxyde de tributylétain, indiquant une toxicité nettement plus faible de l'alcaloïde vis-à-vis d'organismes non cibles.

Les tests d'activité présentés ci-dessus ont clairement mis en évidence le spectre d'activité très large de l'alcaloïde, qui montre un effet inhibiteur à faible dose sur les principaux micro- et macro-organismes responsables des biosalissures marines. Dans tous les exemples présentés l'ascididemine montre une activité très supérieure à celle du cuivre, notamment sur les bactéries et les diatomées contre lesquelles les formulations à base de cuivre sont connues pour être inefficaces.

D'autre part l'activité antibactérienne de l'ascididemine est comparable, voire supérieure, à celle de l'oxyde de tributylétain. Ainsi l'effet antimicrobien très important de l'alcaloïde permet d'inhiber les premiers stades de la colonisation biologique, étapes souvent indispensables à la fixation des larves d'invertébrés et de spores d'algues.

En plus de son spectre d'activité très étendu, l'ascididemine a une solubilité convenable dans l'eau de mer, c'est-à-dire assez faible pour éviter sa diffusion excessive après incorporation dans des formulations commerciales.

Mais l'intérêt majeur de l'invention tient au fait que l'ascîdidemine est une substance naturelle donc susceptible d'être inactivée beaucoup plus rapidement que les biocides inorganiques tels que le cuivre ou l'étain. Preuve en est donnée par les organismes eux-mêmes qui, pour beaucoup, ont développé des moyens de défense chimique pour maintenir leur surface corporelle propre, voire axénique, sans qu'aucun effet toxique dû à cette protection biologique n'ait été détecté.

L'ascididemine fut extraite de l'ascidie Cystodytes dellechiajei à un taux de 0,43% du poids sec, taux très élevé pour un métabolite secondaire. Pourtant la grande diversité biologique présente autour de l'ascidie témoignait de l'action non "polluante" de l'alcaloïde.

Enfin l'ascididemine est une molécule relativement simple qui peut être produite par synthèse. Ce point est d'autant plus important qu'il constitue souvent le facteur limitant à la production en masse des produits naturels et donc à leur développement comme agents anti salissures. La synthèse de l'ascididemine est simple et facilement transposable à de plus grandes unités de production.

La présente invention démontre donc l'efficacité de l'ascididemine comme agent antisalissure respectueux de l'environnement, dans un contexte où l'utilisation des biocides inorganiques est de plus en plus remise en question.

Comme nous l'avons vu ci-dessus, l'activité importante de l'ascididemine visà-vis des bactéries, des microalgues et des larves d'invertébrés benthiques offrent des débouchés principalement dans le domaine des peintures antisalissures, pour la protection des coques de bateaux et des capteurs sous-marins, et dans le domaine de l'aquaculture, pour la protection des filets de pêche dans les fermes marines.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
BADRE A. (1993). Alcaloïdes à potentialités pharmacologiques isolés des ascidies Cystodytes dellechiajei et Lissoclinum fragile forme hospes. Thèse de doctorat de l'université de Perpignan.

BONAVENTURA J., GERFIART D. & RITTSCHOF D. (1993). Low toxicity underwater antifouling compsn. - contg. 17-substd. steroid deriv. and film-former, esp. effective against barnacle. Brevet US5252630 A93 1012 DW9342.

BONAVENTURA J., GERHART D. & RITrscHoF D. (1994). Barnacle inhibition byl7-heterocyclyl steroid(s), esp. lactone(s) - used in cementitious compsn. to protect underwater structures from fouling. Brevet US5314932 A940524
DW9420.

BONNARD I., BONTEMPS N., LAHMY S., BANAIGS B., COMBAUT G.,
FRANCISCO C., COLSON P., HOUSSIER C., WARING M. & BAILLY C. (1995).

Binding to DNA and cytotoxic evaluation of ascididemin, the major alkaloid from the Mediterranean ascidian Cystodytes dellechiajei. Anti-Cancer Drug Design, 10: 333-346.

BRACHER F. (1989). Total synthesis of the pentacyclic alkaloid ascididemin.

Heterocycles, 29: 2093-2095.

CLAISSE D. & ALLEU C. (1993). Copper contamination as a result of antifouling paint regulations? Manne Pollution Bulletin, 26: 395-397.

CLARE A., GERHART D., HOOPER I. & RlTrscHoF D. (1994). Marine or fresh water antifoulant compsns. esp. effective against barnacles - contg., e.g. ethyl-2furoate or alantolactone as active agent. Brevet W09408904 Al 940428 DW9418
US5334389 A940802 DW9430 AU9454043 A940509 DW9432.

DE NYS R., STEfNBERG P., WILLEMSEN P., DWORJANYN S., GABELISH C. & KING R. (1995). Broad spectrum effects of secondary metabolites from the red alga Deliseapulchra in antifouling assays. Biofouling, 8: 259-271.

GELLERMAN G., RUDI A. & KASHMAN Y. (1994). Biomimetic synthesis of ascididemin and derivatives. Synthesis, 3: 239-241.

GERHART D., HOOPER I. & RIErSCHOF D. (1993). Gamma-lactone antifouling compsn. - has low environmental toxicity, inhibits settlement of aquatic organisms on structures and articles. Brevet US5248221 A930928 DW9340.

HAzzlzA-LAsKAN J., HELARY G. & SAUVET G. (1993). Active biocides or bactericides grafting on synthetic polyurethane resin base - by poly:alkyl:siloxane copolymer contg. quat. ammonium terminal and functional gps. for grafting of polymer on resin, for biocidal polymer. Brevet FR2686610 Al 930730 DW9343.

HE H. & FAULKNER D. (1991). Eudistones A and B: two novel octacyclic alkaloids from a Seychelles tunicate Eitdistonia sp. J. Org. Chem. 56: 5369-5371.

KAIYO BIOTECHNOLOGY KENKYUSHO K.K. (1993). Antifouling agent for paints used on marine structures - contains poly:hydroxy:steroid cpds. for low toxicity to fish. Brevet J05310515 A931122 DW9351.

KHIMIZU K., SONYA K. & MIKI W. (1994). Agents for controlling underwater fouling organismes. Brevet US 5,342,547: 1-5.

KOBAYASHI J., CHENG J., NAKAMURA H., OHIZUMI Y., HIRATA Y., SASAKI
T., OHTA T. & NOZOE S. (1988). Ascididemin, a novel pentacyclic aromatic alkaloid with potent antileukemic activity from the Okinawan tunicate Didemnum sp. TetrahedronlLetters, 29: 1177-1180.

KOBAYASHI J. & OMIZUMI Y. (1989). An antitumor pentacyclic alkaloid from
Didemnum. Jpn. KokaiKoho JP 01,186,885 [89,186,885].

KoN-YAK. (1993). Brevet EP 0556949 A2.

KON-YA K., SHMDZU N., MIFU W. & ENDO M. (1994). Indole derivatives as potent inhibitors of larval settlement by thr barnacle, Balanus amphitrite. Biosci.

Biotech. Biochem. 58, 2178-2181.

LEWIS J. (1994).Biofouling and fouling protection: a defence perspective.Pp 39-43 dans Kjelleberg S. & Steinberg P. (1994). Proceedings workshop biofouling: problems and solutions. University ofNew South Wales, Sydney, Australia, 14-15
Avril 1994.

LINDSAY B., BARROWS L. & CoPP B. (1995). Structural requirements for biological activity of the marine alkaloid ascididemin. Bioorg. & Med. Chenu.

Lellers, 5: 739-742.

LION CORP. (1993). Antifouling agent against aquatic organisms - contains one or more fatty acids derivs. obtd. from palm oil and bound with ethylene or propylene oxide in random or block orders. Brevet J05186302 A930727 DW9334.

MEHTA R. & SHERBA S. (1992). New antimicrobial compsn. - comprises 4,5di:chloro-2-N-octyl-3-isothiazolone and fatty acid cpd. pref. in synergistic combination. Brevet EP-488606 Al 920603 DW9223 A0lN-043/80.

MELLOUKI A., BIANCHI A., PERICHAUD A. & SAUNEZ G. (1989 a). Testing of antibacterial properties of antifouling paint based on quaternary ammonium salts.MaHneNature, 2: 1-5.

MELLOUKI A., BIANCHI A., PERICHAUD A. & SAUVET G. (1989 b).

Evaluation of antifouling properties of non-toxic marine plaints. Marine Pollution
Bulletin, 20: 612-615.

MOODY C., REES C. & THOMAS R. (1990). Synthesis of the marine alkaloid ascididemin. Tetrahedron Le tiers, 31: 4375-4376.

MOODY C., REES C. & THOMAS R. (1992). The synthesis of ascididemin.

Tetrahedron, 48: 3589-3602.

OLERONLAC-PE1NTURES DU LITTORAL (1995). Biocarène. Antifouling par contact. Plaquette publicitaire de la société Oléronlac.

TOYOBO K.K. (1993). Non-toxic paint resin compsn. for ships to prevent marine organisms fouling - comprises polyurethane-(urea) having quaternised tert.

amino gps. and halogenated (sulphonic acid) alkyl ester. Brevet J05017708
A930126 DW9309.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. Utilisation de composés de formule générale (I)

dans laquelle R1 et R2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou des radicaux saturés ou insaturés à une ou plusieurs double liaisons, notamment un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, ou des amines substituées, ou R1 et R2 constituent un cycle de 4 à 8 atomes de carbone dans le cycle, ou comprenant un ou plusieurs hétéroatomes en lieu et place desdits atomes de carbones dans le cycle, notamment un cycle benzénique ou un cycle pyridine, en tant qu'agents antisalissures biologiques (encore désignés agents antifouling).

2. Utilisation selon la revendication 1, de l'ascididemine de formule:

3. Composition antisalissures biologiques (ou antifouling), caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de formule générale (I) suivante:

dans laquelle R1 et R2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou des radicaux saturés ou insaturés à une ou plusieurs double liaisons, notamment un groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbone, ou des amines substituées, ou R1 et R2 constituent un cycle de 4 à 8 atomes de carbone dans le cycle, ou comprenant un ou plusieurs hétéroatomes en lieu et place desdits atomes de carbones dans le cycle, notamment un cycle benzénique ou un cycle pyridine.

4. Composition antisalissures biologiques selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'ascididemine de formule:

5. Composition de revêtement de surface, notamment peinture, caractérisée en ce qu'elle comprend une composition selon la revendication 3 ou la revendication 4, en association avec un produit de revêtement de surface, ce dernier étant avantageusement choisi parmi les produits de revêtement érodables tels que les colophanes, ou les produits de revêtement insolubles tels que les caoutchoucs chlorés ou vinyle, ou les produits de revêtement autolissant tels que les supports acryliques.

6. Composition de revêtement de surface selon la revendication 5, caractérisée en ce que la proportion de composé utilisé est d'environ 0,1 % à environ 50%, de préférence d'environ 1% à environ 20%, en poids par rapport au poids total de ladite composition de revêtement de surface.

7. Procédé de prévention et/ou de traitement de milieux aqueux contre les salissures biologiques, notamment contre le développement de bactéries, des microalgues et des larves d'invertébrés benthiques, sur les surfaces en contact avec ce milieu aqueux, caractérisé en ce qu'il est effectué par addition d'une composition selon la revendication 3 ou la revendication 4 au milieu aqueux à traiter.

8. Procédé de prévention et/ou de traitement des surfaces immergées dans un milieu aqueux contre les salissures biologiques, notamment contre le développement sur ces milieux de bactéries, microalgues et larves d'invertébrés, par revêtement desdites surfaces avec une composition selon la revendication 5 ou la revendication 6.