FR2755036A1 - Procede de separation et de concentration de petites molecules a l'aide de pompes enzymatiques membranaires : reacteur separateur/concentreur - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de séparation et la surconcentration de petites molécules en phase liquide, par passage au travers d'une membrane (5) poreuse bioactive. Selon ce procédé, on met en oeuvre un pompage enzymatique d'un produit à concentrer (Pac) au travers de la membrane (5), délimitant deux compartiments liquides CI de départ et CII d'arrivée. Il est prévu un couple d'enzymes réversibles E1 /E2 , E1 étant fixée sur la face de la membrane (5) en regard de CI et E2 sur l'autre face. On fait en sorte que E1 ou E2 transforme le Pac en intermédiaire migrateur (IM) apte à traverser la membrane (5) pour ensuite être transformé en Pac par l'enzyme reverse dans CII . Les liquides CI /CII sont mis en mouvement pour ménager des couches de diffusion non turbulentes attenantes aux deux faces de la membrane (5). On prévoit également, dans le cas où l'IM est électriquement chargé, de donner à la membrane (5) un signe opposé à celui de cet IM, tandis que dans le cas où l'IM est neutre, on donne à la membrane (5) la même charge électrique que celle du Pac. On recueille enfin le Pac accumulé et surconcentré dans CII . La présente invention a également pour objet le réacteur séparateur/concentreur (1) faisant application du susdit procédé.
Description
Le domaine de la présente invention est celui de la séparation et de la surconcentration de petites molécules en phase liquide, par passage au travers d'une membrane poreuse bioactive. En d'autres termes, il s'agit du transport actif de certains solutés que l'on cherche à isoler et/ou à sur-concentrer.
Plus précisément, I'invention se réfère aux techniques de purification/séparation/concentration de molécules - généralement de petite taille - et présente dans des milieux liquides à l'état de traces. De telles molécules très diluées peuvent être intéressantes à purifier ou à isoler soit parce qu'elles présentent une haute valeur ajoutée par exemple dans l'industrie pharmaceutique, soit parce qu'elles constituent une charge polluante indésirable dans ces milieux liquides, soit parce qu'elles sont en dessous du seuil de détection analytique.
L'invention concerne ainsi spécifiquement un procédé et un dispositif de séparation et de concentration d'au moins un composé chimique, ci-après dénommé produit à concentrer = Pac, présent dans un milieu liquide sous forme solubilisée.
Les techniques de surconcentration connues à ce jour et mises en oeuvre industriellement, répondent difficilement et imparfaitement aux objectifs évoqués cidessus.
Ces techniques connues font intervenir des membranes passives, poreuses, au travers desquelles les molécules diffusent sous l'effet d'une surpression. Une telle technologie de filtration forcée, n'est que peu sélective et peu performante sur le plan des ratios de surconcentration surtout pour les petites molécules.
Les techniques de surconcentration forcées par surpression sont délicates à mettre en oeuvre, contraignantes pour le matériel dont notamment les membranes et extrêmement consommatrices d'énergie, donc coûteuses.
On connaît également la dialyse par diffusion passive de soluté au travers de membrane poreuse. La dialyse n'est efficace que pour des molécules présentes en quantité significative d'un côté de la membrane et aptes à traverser cette dernière sous l'effet d'un gradient de concentration. Il est clair que la dialyse ne permet pas de surconcentrer des molécules présentes à l'état de traces dans un liquide de l'autre côté de la membrane.
Force est donc de constater la carence, dans l'état de la technique, en moyens de surconcentration de petites molécules (Poids moléculaire < 1000 Daltons) présentes dans des milieux liquides - plus particulièrement en très petites quantités - et dont la surconcentration est exploitable:
- dans la récupération lorsqu'il s'agit de molécules de haute valeur
ajoutée (chimique et/ou pharmaceutiques),
- dans la dépollution lorsqu'il s'agit de molécules toxiques et/ou
indésirables)
- et dans la détection desdites molécules présentes à l'état de
traces.
- dans la récupération lorsqu'il s'agit de molécules de haute valeur
ajoutée (chimique et/ou pharmaceutiques),
- dans la dépollution lorsqu'il s'agit de molécules toxiques et/ou
indésirables)
- et dans la détection desdites molécules présentes à l'état de
traces.
Dans cet état de fait, I'un des objectifs essentiel de la présente invention est de pallier cette carence, en fournissant un procédé de séparation et de concentration d'au moins un Produit à concentrer Fac, présent dans un milieu liquide sous forme solubilisée. Plus précisément, le but visé par ce procédé serait de faire migrer le Produit Pac d'un compartiment de départ du milieu liquide faiblement concentré en Pac, vers un autre compartiment d'arrivée du milieu liquide, dans lequel il s'accumulerait de telle sorte que sa concentration dans ledit compartiment d'arrivée croisse.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé de séparationlsurconcentration d'un ou plusieurs solutés, qui soit sélectif et qui permette d'obtenir un surconcentrat pur ou sensiblement pur.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé de séparation/surconcentration d'au moins un soluté Pac, conduisant à des rapports de surconcentration d'un compartiment de départ vers un compartiment d'arrivée, nettement supérieurs à 1.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé de séparation/surconcentration d'un soluté Pac, qui soit simple à mettre en oeuvre et économique.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un dispositif de séparation et de concentration d'au moins un Produit à concentrer Pac, présent dans un milieu liquide sous forme solubilisé notamment pour la mise en oeuvre du procédé tel qu'évoqué supra,
S'étant fixé ces objectifs, l'inventeur a eu le mérite de mettre en évidence, après de longues et laborieuses recherches et expérimentations, le fait qu'il était envisageable de mettre en oeuvre un système de transport actif d'un soluté Pac, d'un compartiment liquide de départ à un autre compartiment liquide d'arrivée, par pompage enzymatique au travers d'une membrane poreuse. Ce principe mis en lumière par l'inventeur repose sur l'intervention d'un couple d'enzyme réversibles, l'une des enzymes du couple étant fixée sur une face de la membrane poreuse et l'autre enzyme sur la face opposée de ladite membrane. Le produit ou le substrat lié à ce couple d'enzymes est chargé avec un signe soit opposé, soit identique à celui d'au moins l'une des faces de la membrane. Le transfert d'un composé Pac s'effectue en fait au travers de son produit de transformation enzymatique par l'une des enzymes du couple mis en oeuvre. Dans tout le présent exposé, ce produit de transformation sera dénommé intermédiaire migrateur . Si l'intermédiaire migrateur est chargé, alors la membrane sera d'un signe opposé de manière à favoriser la diffusion transmembranaire de ce produit chargé. Si l'intermédiaire migrateur n'est pas chargé, alors la membrane est chargée du même signe que le composé Pac que l'on cherche à surconcentrer, de façon à produire ainsi un effet de clapet s'opposant au retour du produit Pac dans le compartiment de départ.
S'étant fixé ces objectifs, l'inventeur a eu le mérite de mettre en évidence, après de longues et laborieuses recherches et expérimentations, le fait qu'il était envisageable de mettre en oeuvre un système de transport actif d'un soluté Pac, d'un compartiment liquide de départ à un autre compartiment liquide d'arrivée, par pompage enzymatique au travers d'une membrane poreuse. Ce principe mis en lumière par l'inventeur repose sur l'intervention d'un couple d'enzyme réversibles, l'une des enzymes du couple étant fixée sur une face de la membrane poreuse et l'autre enzyme sur la face opposée de ladite membrane. Le produit ou le substrat lié à ce couple d'enzymes est chargé avec un signe soit opposé, soit identique à celui d'au moins l'une des faces de la membrane. Le transfert d'un composé Pac s'effectue en fait au travers de son produit de transformation enzymatique par l'une des enzymes du couple mis en oeuvre. Dans tout le présent exposé, ce produit de transformation sera dénommé intermédiaire migrateur . Si l'intermédiaire migrateur est chargé, alors la membrane sera d'un signe opposé de manière à favoriser la diffusion transmembranaire de ce produit chargé. Si l'intermédiaire migrateur n'est pas chargé, alors la membrane est chargée du même signe que le composé Pac que l'on cherche à surconcentrer, de façon à produire ainsi un effet de clapet s'opposant au retour du produit Pac dans le compartiment de départ.
C'est ainsi que la présente invention concerne un procédé simultané de séparation et de concentration d'au moins un Produit à Concentrer (Pac), présent dans un milieu liquide sous forme solubilisée, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement et successivement ou non:
- à sélectionner au moins un couple d'enzymes réversibles E,/E2,
E, étant apte à catalyser la réaction de transformation d'au moins
un substrat A en au moins un produit B et E2 la réaction inverse
de transformation du (ou des) substrat(s) B en au moins un
produit A:
de telle sorte * que A ou B corresponde à Pac * et qu'au moins l'un des composés A ou B soit électriquement chargé,
à prévoir au moins une membrane poreuse comprenant E1 et E2,
respectivement, sur et/ou dans l'une et l'autre de ses faces,
à immerger la (ou les) membrane(s) poreuse(s) dans le milieu
liquide, chaque membrane délimitant au moins en partie au moins
un compartiment liquide Cl et au moins un compartiment
liquide Cll,
à mettre en mouvement au moins l'un des liquides - de
préférence les liquides - des compartiments CI/CII, en prévoyant
au moins une couche de diffusion non-turbulente, attenante à
l'une des faces de la ou des membranes, de préférence une
couche de diffusion attenante à chaque face de la ou des
membranes,
à fixer les conditions opératoires de telle sorte qu'intervienne: .1. dans le compartiment Cl ou CII de départ, au moins une
transformation enzymatique par E1 ou E2, du composé Pac de
départ correspondant à A ou B, en métabolite B ou A
respectivement selon le cas:
.2. la migration du Pac métabolisé par E1 ou E2 intermédiaire
migrateur au travers des pores de la membrane pour passer
d'un compartiment Cl ou C11 à l'autre C11 ou Cl cette
migration intervenant notamment sous l'effet d'un gradient de
concentration, avec les conditions selon lesquelles:
si l'intermédiaire migrateur est un composé A ou B
électriquement chargé, alors chaque membrane est chargée du
signe opposé sur au moins l'une de ses faces, de préférence
Cette adjacente à la face portant l'enzyme ayant transformé le
Pac,
e et si l'intermédiaire migrateur est un composé A ou B
électriquement neutre alors chaque membrane est chargée
électriquement du même signe que l'autre composé A ou B
non métabolisé et non migrateur (Pac),
.3. puis au moins une transformation enzymatique inverse, par E2
ou El, de l'intermédiaire migrateur (B ou A), en Pac de
départ, de telle façon que ce dernier s'accumule et se
concentre dans le compartiment Cll ou Cl d'arrivée,
- à récupérer le Pac ainsi accumulé et surconcentré.
- à sélectionner au moins un couple d'enzymes réversibles E,/E2,
E, étant apte à catalyser la réaction de transformation d'au moins
un substrat A en au moins un produit B et E2 la réaction inverse
de transformation du (ou des) substrat(s) B en au moins un
produit A:
de telle sorte * que A ou B corresponde à Pac * et qu'au moins l'un des composés A ou B soit électriquement chargé,
à prévoir au moins une membrane poreuse comprenant E1 et E2,
respectivement, sur et/ou dans l'une et l'autre de ses faces,
à immerger la (ou les) membrane(s) poreuse(s) dans le milieu
liquide, chaque membrane délimitant au moins en partie au moins
un compartiment liquide Cl et au moins un compartiment
liquide Cll,
à mettre en mouvement au moins l'un des liquides - de
préférence les liquides - des compartiments CI/CII, en prévoyant
au moins une couche de diffusion non-turbulente, attenante à
l'une des faces de la ou des membranes, de préférence une
couche de diffusion attenante à chaque face de la ou des
membranes,
à fixer les conditions opératoires de telle sorte qu'intervienne: .1. dans le compartiment Cl ou CII de départ, au moins une
transformation enzymatique par E1 ou E2, du composé Pac de
départ correspondant à A ou B, en métabolite B ou A
respectivement selon le cas:
.2. la migration du Pac métabolisé par E1 ou E2 intermédiaire
migrateur au travers des pores de la membrane pour passer
d'un compartiment Cl ou C11 à l'autre C11 ou Cl cette
migration intervenant notamment sous l'effet d'un gradient de
concentration, avec les conditions selon lesquelles:
si l'intermédiaire migrateur est un composé A ou B
électriquement chargé, alors chaque membrane est chargée du
signe opposé sur au moins l'une de ses faces, de préférence
Cette adjacente à la face portant l'enzyme ayant transformé le
Pac,
e et si l'intermédiaire migrateur est un composé A ou B
électriquement neutre alors chaque membrane est chargée
électriquement du même signe que l'autre composé A ou B
non métabolisé et non migrateur (Pac),
.3. puis au moins une transformation enzymatique inverse, par E2
ou El, de l'intermédiaire migrateur (B ou A), en Pac de
départ, de telle façon que ce dernier s'accumule et se
concentre dans le compartiment Cll ou Cl d'arrivée,
- à récupérer le Pac ainsi accumulé et surconcentré.
Le principe technique novateur qui gouverne le procédé conforme à l'invention, peut être assimilé à un mécanisme de pompage enzymatique permettant de transférer un soluté Pac dilué dans un compartiment liquide de départ, vers un compartiment liquide d'arrivée, par transport actif au travers d'une membrane poreuse enzymatique. Le soluté Pac s'accumule ainsi et se surconcentre dans le compartiment d'arrivée.
Un tel procédé de pompage enzymatique est particulièrement avantageux puisqu'il permet une surconcentration sélective d'un ou plusieurs solutés Pac, et ce sans consommation exagérée d'energie, contrairement au système de surconcentration par surpression. En effet, cette pompe enzymatique ne nécessite essentiellement que de l'énergie chimique, qui peut etre apportée par exemple par des molécules à liaison riche en énergie, telles que l'adénosine triphosphate (ATP).
Un autre avantage du procédé selon l'invention est de conduire à une surconcentration en Pac sous forme relativement pure c'est-à-dire non polluée par l'intermédiaire migrateur.
La mise au point du procédé selon l'invention trouve racine, notamment, dans la compréhension du phénomène de transport actif propre aux membranes biologiques. Cette nouvelle théorie scientifique sur les transports transmembranaires biologiques apporte du sang nouveau à l'état des connaissances scientifiques en la matière. Ce dernier peut se résumer en la théorie basée sur les pores et en la théorie fondée sur la transformation conformationnelle des protéines des membranes biologiques.
La démarche nouvelle et innovante selon l'invention a donc consisté, dans un premier temps, à comprendre et expliquer le phénomène biologique et, dans un deuxième temps, à le reproduire (mymétisme) en l'adaptant aux spécifications industrielles de séparationlsurconcentration de composés chimiques, en particulier à des fins de récupération de molécules à haute valeur ajoutée : chimique, pharmaceutique, cosmétique ou autres, à des fins d'élimination et d'isolement de composés toxiques, ou bien encore à des fins d'abaissement des seuils de détection analytique de manière à rendre possibles les analyses.
Conformément à l'invention, pour un composé à concentrer Pac donné, il importe tout d'abord de choisir un couple d'enzymes réversibles El/E2, susceptible de former la pompe enzymatique permettant le transfert du Pac, par l'intermédiaire de son produit de transformation enzymatique par E1 ou E2.
Le caractère électriquement chargé d'au moins l'un des produit/substrat A et B de E,/E2 est une autre condition essentielle de l'invention, sachant que
- le composé A ou B, utile comme intermédiaire migrateur transmembranaire, est neutre ou possède une charge contraire à celle existant sur les faces de la membrane;
- et que le composé Pac est neutre ou possède une charge électrique de même signe que celle existant sur au moins l'une des faces de la membrane.
- le composé A ou B, utile comme intermédiaire migrateur transmembranaire, est neutre ou possède une charge contraire à celle existant sur les faces de la membrane;
- et que le composé Pac est neutre ou possède une charge électrique de même signe que celle existant sur au moins l'une des faces de la membrane.
La charge électrique des faces de la membrane poreuse peut être obtenue par exemple, en immobilisant avec El et E2 des polyaminoacides dont les pK confèrent à la membrane, pour un pH donné, des charges négatives ou positives. Ainsi, dans le cas où le polyaminoacide est e.g. la polylysine, alors la membrane est chargée positivement à pH 9, tandis qu'avec un polyaminoacide correspondant e.g. à un polyglutamate, la membrane est chargée négativement à pH 9.
Selon une alternative pour charger la membrane, on peut choisir des membranes dont le potentiel zéta au pH optimum est adapté à des conditions données du procédé de l'invention.
Cette membrane poreuse doit être agencée de telle sorte qu'elle délimite au moins en partie, une fois immergée dans le milieu liquide, au moins un compartiment Cr de préférence un - et au moins un compartiment Cn - de préférence un.
Le fait de prévoir une couche de diffusion non turbulente attenante à chaque face de la ou des membranes est une disposition importante du procédé selon l'invention.
De préférence, le compartiment Cl ou C11 de départ du Pac a un volume supérieur à celui du compartiment Cll ou Cl d'arrivée. Avantageusement, le ratio
Volume de C1 ou ll d'arrivée/V de Cn ou1 de départ doit être le plus faible possible, ce ratio jouant sur la cinétique du transport (mais non sur le rapport final de surconcentration).
Volume de C1 ou ll d'arrivée/V de Cn ou1 de départ doit être le plus faible possible, ce ratio jouant sur la cinétique du transport (mais non sur le rapport final de surconcentration).
Pour que les transformations enzymatiques E1/E2 interviennent au voisinage de chacune des faces de la ou des membranes, il est important de prévoir non seulement les couches de diffusion évoquées ci-dessus mais également de mettre en place des conditions opératoires optimales, notamment de pH et de température.
On aura compris que le transport actif transmembranaire selon l'invention, passe par l'exploitation d'un premier effet que l'on peut dénommer effet de clapet et/ou d'un deuxième effet que l'on peut dénommer effet de promotion de la diffusion de l'intermédiaire migrateur.
L'effet de clapet est obtenu en faisant en sorte que le Pac dont on souhaite limiter la migration au travers de la membrane, soit d'un signe opposé à cette dernière, de manière à être repoussé par celle-ci et ainsi ne pas avoir tendance à la traverser.
En revanche, dans l'effet promotion de la diffusion, on joue sur le caractère opposé des signes de l'intermédiaire migrateur qui traverse la membrane et de la membrane elle-même, qui a ainsi tendance à attirer l'intermédiaire migrateur.
L'invention n'est pas limitée à la mise en oeuvre d'un seul de ces effets. fl est tout à fait possible de prévoir leur cumul.
Les étapes - 1 - de transformation enzymatique dans un sens, - 2 - de migration transmembranaire et - 3 - de transformation enzymatique dans l'autre sens, respectivement, conduisent à une surconcentration du Pac dans le compartiment d'arrivée. Il est alors aisé soit de récupérer le Pac à des fins de valorisation (évaporation du solvant) ou d'élimination, soit de détecter et/ou de doser le Pac qui titre désormais au delà de son seuil de détecton analytique.
Selon un premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention (que l'on peut qualifier de discontinu ), la membrane enzymatique se présente sous la forme d'un film mono ou multicouche, de préférence sensiblement plan.
Ce mode discontinu correspond par exemple au cas de figure dans lequel on a un réacteur formé par un premier conteneur contenant le milieu liquide dans lequel est au moins partiellement immergé un deuxième conteneur. La partie immergée de ce deuxième conteneur étant constituée au moins en partie par la membrane enzymatique poreuse. Ces deux conteneurs définissent les compartiments
Cl ou ..
Cl ou ..
La membrane peut former tout ou partie de la paroi du conteneur. De manière préférée, cette membrane constitue une partie sensiblement plane de la paroi de séparation entre les deux compartiments C1 et Cl.
Selon un deuxième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, (que l'on qualifiera de continu ), la membrane enzymatique est sous forme tubulaire et plus précisément constitue tout ou partie de la paroi d'un tube, dont la lumière forme l'un des compartiments C1/C11.
Avantageusement, la membrane enzymatique peut être faite d'une pluralité de fibres creuses ou membranes tubulaires, de préférence réunis en faiscea(x).
Conformément à ce deuxième mode continu, on fait baigner au moins une partie de cette (ou ces) membrane(s) tubulaire(s) dans le milieu liquide formant l'autre compartiment C11/C1 et on fait circuler un liquide à enrichir ou à appauvrir en composé
Pac, dans cette (ou ces) membrane(s) enzymatique(s) tubulaire(s).
Pac, dans cette (ou ces) membrane(s) enzymatique(s) tubulaire(s).
En pratique, on fait appel dans ce mode continu, à un réacteur formant l'un des compartiment C1 ou C11 contenant le milieu liquide et l'on immerge la ou les membranes tubulaires dans ce réacteur, la circulation du liquide dans la ou les membranes tubulaires constituant l'autre ou les autres compartiments C11 ou , étant assurée par tout moyen approprié tel qu'une pompe.
A la lecture de ce qui précède, on perçoit aisément l'importance du milieu liquide des compartiments Cl et Cll, et notamment de leurs caractéristiques physicochimiques, pour la conduite du procédé selon l'invention.
Ainsi, selon une autre modalité intéressante du procédé selon l'invention, on ajuste les paramètres pH et température des milieux liquides, de manière à obtenir un optima en cinétique et en rendement pour les transformations enzymatiques par E et E2.
En pratique, on élabore donc le milieu liquide de Cl et/ou Cll en ayant recours à un solvant - de préférence essentiellement aqueux -, comprenant éventuellement des solutés choisis dans le groupe suivant:
o tampons de pH adaptés aux pH optimum de fonctionnement de
El et E2,
o molécules à liaisons riches en énergie - avantageusement ATP ou
toute molécule susceptible de transférer un groupement
phosphate sur un soluté (par exemple : phosphoénol pyruvate,
carbamyl phosphate, phosphocréatine...)
o et leurs mélanges,
les compositions de départ des milieux liquides de Cl et C11 étant, de préférence, sensiblement les mêmes ou non de la concentration en Pac.
o tampons de pH adaptés aux pH optimum de fonctionnement de
El et E2,
o molécules à liaisons riches en énergie - avantageusement ATP ou
toute molécule susceptible de transférer un groupement
phosphate sur un soluté (par exemple : phosphoénol pyruvate,
carbamyl phosphate, phosphocréatine...)
o et leurs mélanges,
les compositions de départ des milieux liquides de Cl et C11 étant, de préférence, sensiblement les mêmes ou non de la concentration en Pac.
Outre le réglage du pH et la fourniture de source d'énergie chimique nécessaire aux transformations enzymatiques El et E2 ; on régule également la température des milieux liquides par apport ou évacuation de calories, e.g. réacteur thermostaté avec double paroi de circulation de fluide régulateur de température.
Avantageusement, on fait en sorte que le compartiment Cl/Cll récepteur de l'intermédiaire migrateur au travers de la membrane, comprenne au départ une concentration en cet intermédiaire, inférieure à celle existant dans le compartiment émetteur.
Conformément à l'invention, l'obtention des couches de diffusion s'effectue par mise en mouvement du liquide dans chaque compartiment Cl/Cll, cette mise en mouvement s'opérant par agitation - de préférence à l'aide d 'un rotor - dans le premier mode de mise en oeuvre selon l'invention et/ou par circulation dudit liquide suivant le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
Par ces biais, on règle les conditions d'agitation et/ou de circulation de façon à ce que la ou les couches de diffusion non turbulentes, aient une épaisseur identique ou différente de part et d'autre de la membrane et comprise entre I et 10 fois l'épaisseur de la membrane.
Pour améliorer la cinétique et les performances de transfert de l'intermédiaire métabolisé migrateur, il est possible de prévoir conformément à l'invention, les effets clapet et/ou de promotion de la diffusion , des moyens auxiliaires d'assistance de la migration transmembranaire de (ou des) intermédiaire(s) migrateur(s), lesdits moyens étant de préférence constitués par un gradient de force ionique et/ou électrique, de part et d'autre de la membrane, et plus préférentiellement encore par des gradients de pH (force protomotrice).
Selon une variante du procédé de l'invention, on complète la surconcentration du Pac, par pompage enzymatique dudit Pac au travers de la ou des membranes à partir d'un compartiment Cl ou C11 contenant du Pac vers un compartiment C11 ou Cl à enrichir en Fac, par mise en oeuvre d'une translocation du
Pac, cette dernière consistant à introduire dans le compartiment C, ou C" de départ chargé en Pac, de l'intermédiaire migrateur A ou B de transformation enzymatique - 1 du Pac par El ou E2, de telle sorte que cet intermédiaire migrateur ajouté migre cumulativement à celui issu de l'étape - 1 -, dans les mêmes conditions que celles de l'étape - 2 -, pour être enfin soumis à l'étape 3 après avoir traversé la membrane, les étapes - 1 -, - 2 -, et - 3 - en cause étant celles telles que définies supra.
Pac, cette dernière consistant à introduire dans le compartiment C, ou C" de départ chargé en Pac, de l'intermédiaire migrateur A ou B de transformation enzymatique - 1 du Pac par El ou E2, de telle sorte que cet intermédiaire migrateur ajouté migre cumulativement à celui issu de l'étape - 1 -, dans les mêmes conditions que celles de l'étape - 2 -, pour être enfin soumis à l'étape 3 après avoir traversé la membrane, les étapes - 1 -, - 2 -, et - 3 - en cause étant celles telles que définies supra.
Une telle association entre le pompage enzymatique conforme à l'invention (transport actif) et la translocation, permet d'améliorer notablement la surconcentration du Pac.
La présente invention a également pour objet un dispositif de séparation et de concentration d'au moins un Produit à Concentrer (Pac), présent dans un milieu liquide sous forme solubilisée, notamment pour la mise en oeuvre du procédé tel que défini supra, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement:
- au moins une membrane enzymatique poreuse, comportant au
moins un couple d'enzymes réversibles E1/E2, El étant apte à
catalyser la réaction de transformation d'au moins un substrat A
en au moins un produit B et E2 la réaction inverse de
transformation du (ou des) substrat(s) B en au moins un produit
A:
de telle sorte
* que A ou B corresponde à Pac
* et qu'au moins l'un des composés A ou B soit électriquement
chargé, El et E2 étant respectivement supportées par l'une et
l'autre des faces de la membrane,
- au moins un conteneur du milieu liquide dans lequel baigne ou
est susceptible de baigner la membrane enzymatique pour
délimiter au moins partiellement au moins un compartiment
liquide C1 et au moins un compartiment liquide C11,
- des moyens de mise en mouvement d'au moins l'un des liquides
de préférence des liquides des compartiments C1, Cl,,
- éventuellement des moyens de réglage de la température du
milieu liquide.
- au moins une membrane enzymatique poreuse, comportant au
moins un couple d'enzymes réversibles E1/E2, El étant apte à
catalyser la réaction de transformation d'au moins un substrat A
en au moins un produit B et E2 la réaction inverse de
transformation du (ou des) substrat(s) B en au moins un produit
A:
de telle sorte
* que A ou B corresponde à Pac
* et qu'au moins l'un des composés A ou B soit électriquement
chargé, El et E2 étant respectivement supportées par l'une et
l'autre des faces de la membrane,
- au moins un conteneur du milieu liquide dans lequel baigne ou
est susceptible de baigner la membrane enzymatique pour
délimiter au moins partiellement au moins un compartiment
liquide C1 et au moins un compartiment liquide C11,
- des moyens de mise en mouvement d'au moins l'un des liquides
de préférence des liquides des compartiments C1, Cl,,
- éventuellement des moyens de réglage de la température du
milieu liquide.
Avantageusement, chaque membrane est électriquement chargée, sur au moins l'une de ses faces, de préférence sur celle adjacente à la face portant l'enzyme ayant transformé le Pac, et plus préférentiellement encore sur les deux.
Conformément à une caractéristique préférée de l'invention, cette membrane enzymatique est une matrice poreuse, dans et/ou sur les deux faces de laquelle sont incluses et immobilisées les enzymes El, E2 respectivement, cette matrice étant formée par au moins un composé macromoléculaire, de préférence choisi parmi les protéines, les polysaccharides, les (co)polymères synthétiques et leurs mélanges et/ou alliages, etc, ces composés étant choisis pour leurs porosité, épaisseur, potentiel zéta (charges) et la facilité de greffage de El/E2,
la cellulose et ses dérivés (e.g. acétate de cellulose, cellulose régénérée) de même que les (co)polyamides étant particulièrement préférés.
la cellulose et ses dérivés (e.g. acétate de cellulose, cellulose régénérée) de même que les (co)polyamides étant particulièrement préférés.
Selon un premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention, la membrane enzymatique se présente sous la forme d'un film mono ou multicouche, de préférence sensiblement plan, une fois montée dans le dispositif
Selon un deuxième mode de réalisation du dispositif selon l'invention, la membrane enzymatique constitue tout ou partie de la paroi d'au moins un tube dont la lumière forme l'un des compartiments C,/CXI.
Selon un deuxième mode de réalisation du dispositif selon l'invention, la membrane enzymatique constitue tout ou partie de la paroi d'au moins un tube dont la lumière forme l'un des compartiments C,/CXI.
Les couples d'enzymes susceptibles d'être mis en oeuvre dans le procédé et le dispositif selon l'invention sont nombreux. Pour fixer les idées on peut indiquer que ces couples E,/E2 sont principalement choisis parmi les couples d'enzymes E,/E2 permettant l'addition/enlèvement d'un groupement chimique chargé sur un métabolite, de préférence parmi les couples d'enzymes E1/E2 de phosphorylation/déphosphorylation, et plus préférentiellement encore parmi les kinases/phosphatases.
L'invention sera mieux comprise et ses avantages ou autres variantes de réalisation ressortiront bien de la description qui suit, de deux exemples de réalisation du dispositif qui en fait l'objet. Cette description de dispositif sera complétée par des essais de mise en oeuvre du procédé selon l'invention à l'aide des deux dispositifs exemplifiés auparavant correspondant chacun à un mode de mise en oeuvre particulier du procédé de l'invention.
La description des deux modes de réalisation du dispositif selon l'invention sera effectuée en référence aux dessins annexés dans lesquels:
- la Figure 1 représente un schéma simplifié du premier mode de
réalisation du dispositif de séparation et de concentration
conforme à l'invention (mode discontinu).
- la Figure 1 représente un schéma simplifié du premier mode de
réalisation du dispositif de séparation et de concentration
conforme à l'invention (mode discontinu).
- La Figure 2 est une représentation symbolique de la membrane
enzymatique séparant les deux compartiments Cl et C11 du
dispositif de la Figure 1 ou 4, ladite représentation
correspondant à une première voie enzymatique de transfert actif
au travers de la membrane et de surconcentration d'un composé
A, du compartiment II vers le compartiment I
enzymatique séparant les deux compartiments Cl et C11 du
dispositif de la Figure 1 ou 4, ladite représentation
correspondant à une première voie enzymatique de transfert actif
au travers de la membrane et de surconcentration d'un composé
A, du compartiment II vers le compartiment I
<tb> E2 <SEP> E, <SEP> Membrane <SEP> E1
<tb> A > B <SEP> 1$ <SEP> B <SEP> BX <SEP> A
<tb> -La Figure 3 est une représentation symbolique de même nature
que la Figure 2, à la différence près qu'elle concerne une
deuxième voie enzymatique de transfert au travers de la
membrane et de surconcentration d'un composé B, du
compartiment II vers le compartiment I
<tb> A > B <SEP> 1$ <SEP> B <SEP> BX <SEP> A
<tb> -La Figure 3 est une représentation symbolique de même nature
que la Figure 2, à la différence près qu'elle concerne une
deuxième voie enzymatique de transfert au travers de la
membrane et de surconcentration d'un composé B, du
compartiment II vers le compartiment I
<tb> B <SEP> XA <SEP> \A <SEP> Membrane <SEP> AX <SEP> BE2
<tb> BAA <SEP> B
<tb>
- La Figure 4 est un schéma simplifié illustrant le deuxième mode
de réalisation du dispositif de séparation et de concentration
conforme à l'invention (mode continu).
<tb> BAA <SEP> B
<tb>
- La Figure 4 est un schéma simplifié illustrant le deuxième mode
de réalisation du dispositif de séparation et de concentration
conforme à l'invention (mode continu).
- La Figure 5 met une vue simplifiée en coupe transversale droite
selon la ligne V-V de la Figure 4.
selon la ligne V-V de la Figure 4.
- La Figure 5 bis est une vue grosssie d'un des éléments de la
membrane tubulaire vue en coupe sur la Figure 5.
membrane tubulaire vue en coupe sur la Figure 5.
Le dispositif de séparation et de concentration d'au moins un composé à concentrer Pac, selon le premier mode de réalisation de l'invention, est désigné sur la
Figure 1 par la référence générale 1. Ce dispositif ou réacteur 1 est constitué par une cuve 2 thermostatée présentant une double paroi, prévue pour la circulation d'un fluide thermorégulateur, entre l'entrée 2l et la sortie 22.
Figure 1 par la référence générale 1. Ce dispositif ou réacteur 1 est constitué par une cuve 2 thermostatée présentant une double paroi, prévue pour la circulation d'un fluide thermorégulateur, entre l'entrée 2l et la sortie 22.
Cette cuve 2 a, par exemple, une forme générale sensiblement cylindrique creuse et peut être réalisée à partir de tout matériau approprié, métallique, plastique (polymère e.g. du type polyméthacrylate).
Cette cuve contient un milieu liquide non référencé sur le dessin et est équipée par ailleurs de moyens d'agitation 3 représentés symboliquement et qui sont avantageusement constitués par un rotor, qui peut être, par exemple, un barreau magnétique fonctionnant avec un agitateur magnétique, ou bien encore une hélice d'agitation classique.
Un corps tubulaire 4 contenant également du milieu liquide, baigne partiellement dans le milieu liquide contenu dans la cuve 2. Ce corps tubulaire 4 présente avantageusement une section transversale droite circulaire. L'extrémité inférieure immergée de ce corps tubulaire 4 est obturée par une membrane enzymatique 5 insérée entre deux joints 6 periphériques annulaires, constitués - par exemple - de matière plastique paraffinique. La membrane 5 est solidarisée avec le corps tubulaire 4 par l'intermédiaire d'une lèvre 7 ou d'un rebord annulaire ménagé à l'extrémité libre immergée dudit corps tubulaire. Les moyens de fixation utilisés sont par exemple des vis et écrous 8, e.g. en téflon.
Le corps tubulaire 4 est équipé de moyens d'agitation 9, du type agitateur à pale. Les niveaux de liquide dans la cuve 2 (ler conteneur) et dans le corps tubulaire 4 (2ème conteneur) sont ajustés de telle sorte qu'ils soient identiques.
La membrane enzymatique 5 d'extrémité, délimite avec la paroi du tube 4 le compartiment référencé par Cl sur la Figure 1. Cette membrane 5 sépare également ledit compartiment Cl du compartiment C11 constitué par la cuve 2 remplie de milieu liquide.
Dans cet exemple, le volume interne Vl du compartiment Cl = 4 cm3, tandis que le volume
La représentation symbolique de la Figure 2 montre la membrane 5 supportant dans sa face en regard du compartiment C11 l'enzyme E2 et dans sa face en regard du compartiment Cl, l'enzyme E1 du couple d'enzymes réversibles E1/E2 Cette membrane présente une épaisseur d et est attenante par sa face porteuse de E2 avec une couche de diffusion 6 d'épaisseur 62, et par sa face porteuse de E1 avec une autre couche de diffusion 6 d'épaisseur Sl. Dans la première voie de transformation enzymatique et de migration transmembranaire A e B o B e A illustrée par la
Figure 2, le composant Ajoue le rôle de substrat dans le compartiment C11 et donc de composé à concentrer Pac dans le compartiment Cl. Dans cette Figure 2, les substrat et produit A et B sont affectés d'un exposant 6 ou b selon qu'ils se trouvent dans une couche de diffusion 3 ou dans le reste du compartiment (b pour bulk en anglais), respectivement. A et B sont également identifiés par un premier indice en chiffre romain correspondant au compartiment dans lequel il se trouve, suivi d'un deuxième indice t désignant le temps.
Figure 2, le composant Ajoue le rôle de substrat dans le compartiment C11 et donc de composé à concentrer Pac dans le compartiment Cl. Dans cette Figure 2, les substrat et produit A et B sont affectés d'un exposant 6 ou b selon qu'ils se trouvent dans une couche de diffusion 3 ou dans le reste du compartiment (b pour bulk en anglais), respectivement. A et B sont également identifiés par un premier indice en chiffre romain correspondant au compartiment dans lequel il se trouve, suivi d'un deuxième indice t désignant le temps.
Dans cette première voie au temps t = 0 on a : Ab I1, t # ; Ab , = BbI, t =
BbII,t = 0.
BbII,t = 0.
Dans cette première voie, c'est donc le composé B qui sert d'intermédiaire migrateur transmembranaire
S'agissant de la deuxième voie représentée à la Figure 3, le but visé est de surconcentrer le compartiment C1 en composé B en le prélevant dans le compartiment
CII et en lui faisant traverser la membrane. Dans ce cas, c'est donc le composé A, qui sert d'intermédiaire migrateur transmembranaire. L'enzyme E1 est cette fois dans la face de la membrane en regard du compartiment CII et l'enzyme E2 est incluse dans la face de la membrane en regard du compartiment C,. La voie de transformation enzymatique et de migration transmembranaire est donc:
S'agissant de la deuxième voie représentée à la Figure 3, le but visé est de surconcentrer le compartiment C1 en composé B en le prélevant dans le compartiment
CII et en lui faisant traverser la membrane. Dans ce cas, c'est donc le composé A, qui sert d'intermédiaire migrateur transmembranaire. L'enzyme E1 est cette fois dans la face de la membrane en regard du compartiment CII et l'enzyme E2 est incluse dans la face de la membrane en regard du compartiment C,. La voie de transformation enzymatique et de migration transmembranaire est donc:
La mise en oeuvre du procédé selon l'invention à l'aide du dispositif cidessus exemplifié et représenté à la Figure 1, s'opère en sélectionnant le couple d'enzymes réversibles, par exemple E1 = phosphatase-alcaline et E2 = glycérol-kinase avec A = glycérol-3-phosphate2- et B = glycérol.
Après immobilisation de ces enzymes sur les faces de la membrane 5, on règle les conditions d'agitation des moyens 3 et 9. Ce règlage peut être effectué en s'inspirant de l'article de BARDELETTI et al., 1985, dont les références sont les suivantes
Bardeletti, G ; Maisterrena, B. Coulet, PR. (1985) J. Membr. Sci 24, 285-296).
Bardeletti, G ; Maisterrena, B. Coulet, PR. (1985) J. Membr. Sci 24, 285-296).
Selon une caractéristique préférée de l'invention, l'épaisseur des couches de diffusion 8î et 82 est comprise entre 50 et 500 llm, selon les conditions hyrodynamiques.
Selon une autre disposition du procédé de l'invention, on choisit le rapport de volume entre les compartiments Cl et Cn, (Cl jouant le rôle de compartiment d'arrivée (ou récepteur) dans lequel se produit la surconcentration en
Pac), de telle sorte que ce rapport soit le plus faible possible si l'on veut surconcentrer le Pac en un temps court.
Pac), de telle sorte que ce rapport soit le plus faible possible si l'on veut surconcentrer le Pac en un temps court.
De préférence, la composition du milieu liquide dans les compartiments Cl et C11 au temps t = 0, est sensiblement la même, y compris en ce qui concerne le composé A ou B à surconcentrer (Pac).
On prévoit également les conditions de pH, de température et de source d'énergie chimique, nécessaires aux enzymes E1/E2 pour effectuer des transformations enzymatiques. Ainsi, dans le cas du couple d'enzymes phosphatase alcaline/glycérolkinase, le pH est compris entre 8 et 10 (tampon), la température est comprise entre 20 et 300 C, de préférence de l'ordre de 25 C et l'on introduit dans le milieu une source d'ATP sous forme de solution saline aqueuse (ATP/MgCl2).
Dès lors que l'on a plongé la membrane dans le milieu liquide en fixant par ailleurs les autres paramètres énoncés ci-dessus, le pompage enzymatique suivant l'invention intervient et l'on récupère in fine dans le compartiment C1, soit du composé A = glycérol-3-phosphate2- soit du composé B = glycérol.
Dans le cas où le composé Pac est chargé, il convient qu'au moins une des faces de la membrane, de préférence les deux soient chargées du même signe.
Il en est ainsi pour Pac = A = glycérol-3-phosphate2; la membrane étant alors elleaussi chargée négativement de manière à avoir un effet clapet et à éviter ainsi la rétrodiffusion parasite de A au travers de la membrane.
Dans le cas où l'intermédiaire migrateur est chargé, alors on prévoit sur au moins l'une des faces de la membrane, de préférence les deux, une charge opposée de manière à favoriser la diffusion transmembranaire de cette intermédiaire migrateur.
II est ainsi pour Pac = B = glycérol et A = glycérol-3-phosphate2-.
Conformément à l'invention il n'est pas à exclure que les deux cas de figure visés ci-dessus se cumulent, c'est-à-dire que A et B soient de signes opposés et que celui constituant l'intermédiaire migrateur soit de signe opposé à la membrane, tandis que le composé correspondant à Pac est de même signe que la membrane.
Comme déjà signalé ci-dessus, suivant une variante avantageuse du procédé selon l'invention, on peut associer ou combiner le pompage enzymatique d'un composé Pac A ou B en prévoyant une translocation. Cette manipulation consiste à incorporer de l'intermédiaire migrateur dans le compartiment Cl ou Cn de départ du pompage. Dans la première voie Figure 2, on prévoira donc une concentration initiale non nulle en composé B dans le compartiment Cn et dans la deuxième voie Figure 3, la concentration initiale en composé A dans le compartiment Cn sera de la même façon supérieure à 0.
On remarquera que dans les deux voies enzymatiques 1 et 2 selon les
Fig. 2 et 3, le Pac traverse également la membrane par diffusion directe dans une mesure largement moindre (flèches en pointillés sur Fig.2 et 3).
Fig. 2 et 3, le Pac traverse également la membrane par diffusion directe dans une mesure largement moindre (flèches en pointillés sur Fig.2 et 3).
Le deuxième mode de réalisation du dispositif selon l'invention est représenté sur la Figure 4, sur laquelle il est désigné par la référence générale 10. Ce dispositif 10 de séparation et de concentration d'au moins un composé à concentrer
Pac, présent dans un milieu liquide sous forme solubilisé, peut être assimilé à un réacteur séparateur/concentreur, apte à fonctionner selon un mode continu.
Pac, présent dans un milieu liquide sous forme solubilisé, peut être assimilé à un réacteur séparateur/concentreur, apte à fonctionner selon un mode continu.
Ce réacteur 10 comprend une cuve i1 thermostatée du même type que celle (2) décrite dans le premier mode de réalisation de la Figure 1. Les références 11, et 112 désignent respectivement l'entrée et la sortie du circuit de circulation d'un fluide thermorégulateur dans la double enveloppe de la cuve 11.
Cette cuve 11 contient le milieu liquide contenant initialement le composé
Pac et constituant le compartiment liquide Cll. Des moyens 12 d'agitation mécanique sont prévus au sein de ce milieu liquide formant Cll. Ces moyens d'agitation 12 sont du même type que ceux décrits pour le premier mode de réalisation représenté à la
Figure 1 et désignés par la référence 9 dans cette figure.
Pac et constituant le compartiment liquide Cll. Des moyens 12 d'agitation mécanique sont prévus au sein de ce milieu liquide formant Cll. Ces moyens d'agitation 12 sont du même type que ceux décrits pour le premier mode de réalisation représenté à la
Figure 1 et désignés par la référence 9 dans cette figure.
Dans ce deuxième mode de réalisation, la membrane enzymatique est constituée par une pluralité de tube 13 à paroi poreuse et regroupés entre eux pour former un faisceau 14, dont une partie est immergée dans le milieu liquide de la cuve il (cl).
En fait, les lumières des tubes 13 constitue autant de compartiments Cl liquides, intervenant dans le procédé selon l'invention.
Les flèches indiquées sur la Figure 4 dans le faisceau 13 donne le sens de circulation du flux des compartiments Cl.
La coupe de la Figure 5 montre le faisceau 14 de membranes enzymatiques tubulaires 13.
Ce faisceau 14 présente une partie recourbée en forme de U, dont la base plonge dans le compartiment C11 liquide défini par la cuve 11. Ce faisceau tubulaire 14 est destiné à permettre la circulation de milieu liquide à surconcentrer en Pac par migration active transmembranaire. A cette fin, le faisceau 14 est équipé de moyens de mise en circulation 15 constitués, par exemple, par une pompe.
La Figure 5 bis est une vue en coupe transversale droite d'une membrane enzymatique tubulaire 13 constituant le faisceau 14 et délimitant par l'intermédiaire de sa paroi, d'une part, un compartiment C1 interne (lumière du tube), et d'autre part, pour ce qui concerne la partie immergée du faisceau 14, un compartiment C11 extérieur, défini par la cuve 11. A l'instar de la membrane 5 de la Figure 1, la paroi du tube 13 comprend sur chacune de ces faces interne et externe une enzyme El et E2 respectivement, constituant un couple d'enzymes réversibles El/E2. Les méthodes de fixation et d'immobilisation des enzymes sont les mêmes que celles décrites supra. En outre, les matériaux constitutifs de ces membranes tubulaires sont eux aussi de même nature que ceux évoqués pour la membrane 5 de la Figure 1. En pratique, il s'agira par exemple de cellulose régénérée de nature poreuse, présentant un seuil de coupure pouvant varier de 500 à 10 000 D.
Les moyens d'agitation 12 de la cuve 11 ainsi que la mise en mouvement du liquide de Cl dans les fibres creuses 13 à l'aide de la pompe 15, permettent de définir des couches de diffusion 61 et 82, montrés sur la Figure 5 bis. Cette dernière fait également apparaître le diamètre interne D de la fibre creuse 13, de même que l'épaisseur d de la paroi membranaire chargée d'enzymes El/E2.
De préférence, les multiples compartiments Cl constitués par les lumières des fibres creuses 13 servent de siège à la surconcentration en Pac provenant du compartiment Cn.
La somme des volumes des compartiments Cl immergés dans C11 est inférieure au volume V11 du compartiment Cll. Le rapport Vl/VII est le plus faible possible.
Les membranes tubulaires 13 peuvent être électriquement chargées en positif ou en négatif, de manière à assurer l'effet clapet et l'effet promoteur de diffusion transmembranaire des substrats et des produits A et B chargés.
Selon une variante, le milieu liquide de surconcentration du Pac pourraît être Cn, c'est-à-dire le milieu liquide contenu dans la cuve 11, les lumières C, des tubes 13 formant le compartiment de départ du Pac.
Ce deuxième mode de réalisation du dispositif selon l'invention est adapté à la deuxième forme de mise en oeuvre continu du procédé de séparation/ surconcentration. On retrouve la méthodologie employée pour le premier mode discontinu de mise en oeuvre, à la différence près que le milieu liquide des compartiments C1 circule dans les fibres creuses 13 enzymatiques, le transport actif transmembranaire de Pac s'opérant naturellement au niveau de la partie immergée du faisceau 14 dans le compartiment Cll liquide de la cuve 11.
La vitesse de circulation du milieu liquide des compartiments Cl est adaptée à la surface totale de la zone d'échange dans la partie immergée, des cinétiques de transformation enzymatique El/E2, ainsi que des vitesses de diffusion transmembranaire des produits A ou B chargés ou non.
Les exemples qui suivent illustrent le dispositif et le procédé selon l'invention dans leur deux modes préférés mais non exclusif de mise en oeuvre. Ces exemples permettront de mieux comprendre l'invention et d'en saisir tous ses avantages et variantes de réalisation.
EXEMPLES
EXEMPLE I : Séparation/surconcen*ahon de glycérol-3P2- dans un compartiment C, par pompage enzymatique à partir d'un compartiment CII, selon le ler mode de mise en oeuvre du procede de l'invention et a l'aide du dispositif de l'invention dans sa 1ère forme de realisation
1. 1. Matériel
Le dispositif mis en oeuvre est celui décrit supra et représenté sur la Fig. 1.
EXEMPLE I : Séparation/surconcen*ahon de glycérol-3P2- dans un compartiment C, par pompage enzymatique à partir d'un compartiment CII, selon le ler mode de mise en oeuvre du procede de l'invention et a l'aide du dispositif de l'invention dans sa 1ère forme de realisation
1. 1. Matériel
Le dispositif mis en oeuvre est celui décrit supra et représenté sur la Fig. 1.
Les membranes mise en oeuvre sont des membranes du type Pall NAZ commercialisées par la société PALL EUROP LIMITED. Ce sont des membranes en polyamide d'épaisseur = à 100 m de surface active de transfert (Aw) de 12 % et référencées sous le numéro 09025.
L'enzyme E1 = glycérolkinase - GK - (EC2.7.1.30) provenant de l'espèce cellulomonas (52 unités.mg', ref g. 6142).
E2 = phosphatase alcaline (EC3.1.3.1.) extraite de muqueuse intestinale bovine (1200 Unités.mg', réf. P 6672).
Les enzymes E1 et E2 définies ci-dessus sont commercialisées par la société SIGMA.
L'immobilisation des enzymes sur la membrane s'opère de la façon suivante:
Les membranes se présentent sous la forme de disques de 5 cm de diamètre que l'on active à l'aide d'une solution d'acide sulfurique dans le méthanol sous reflux pendant 6 heures. On les soumet ensuite à l'action d'une solution de glutaraldéhyde à 2 % VIV, comme décrit dans l'article de Michalon, P., Couturier, R., Hacques, M-F.,
Favre-Bonvin, G., Ville, A. & Marion, C. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun, 167, 9-15.
Les membranes se présentent sous la forme de disques de 5 cm de diamètre que l'on active à l'aide d'une solution d'acide sulfurique dans le méthanol sous reflux pendant 6 heures. On les soumet ensuite à l'action d'une solution de glutaraldéhyde à 2 % VIV, comme décrit dans l'article de Michalon, P., Couturier, R., Hacques, M-F.,
Favre-Bonvin, G., Ville, A. & Marion, C. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun, 167, 9-15.
Le greffage des enzymes E1 = GK et E2 = phosphatase alcaline est réalisé en immergeant les disques à température ambiante pendant 3 heures dans 5 cm3 d'une solution d'enzyme titrant 2 mg. cm-3 et 0,2 mg. cm-3 pour la GK et la phosphatase respectivement, dans un tampon borate 0,1 M, pH 8,5.
Le volume de C1 = 4 cm3 et le volume de C11 = 300 cm3.
1.2. Conditions opératoires
Les milieux liquides en Cl et C,l ont la même composition à l'exception des concentrations en composé A = glycérol-3-phosphate2- et en composé B = glycérol.
Les milieux liquides en Cl et C,l ont la même composition à l'exception des concentrations en composé A = glycérol-3-phosphate2- et en composé B = glycérol.
La température du milieu liquide est thermostatée par la cuve à 25 C.
Les autres conditions opératoires varient en fonction des essais réalisés.
1.3. Essais 1 à 3 selon la 1ère voie enzymatique de la Fig. 2:
<tb> <SEP> E <SEP> membrane <SEP> E,
<tb> A <SEP> aB <SEP> a <SEP> B <SEP> A <SEP> (Cl)
<tb>
Pour ces essais 1 à 3, les milieux liquides CI/CII contiennent du tampon borate 0,1M en quantité telle que le pH soit de l'ordre de 9 et de l'ATP Mg Cl2 - 7 mM.
<tb> A <SEP> aB <SEP> a <SEP> B <SEP> A <SEP> (Cl)
<tb>
Pour ces essais 1 à 3, les milieux liquides CI/CII contiennent du tampon borate 0,1M en quantité telle que le pH soit de l'ordre de 9 et de l'ATP Mg Cl2 - 7 mM.
A pH 9, la résistance électrique de la membrane vis-à-vis du substrat A (r # A), qui s'ajoute à la résistance passive de la membrane vis-à-vis de la diffusion du substrat A dans le compartiment C11 (RmA), est de l'ordre de 300 min.cm-3.
Les conditions d'agitation sont les suivantes : W1 = 70 tr/min (compartiment I)
W2 = 80 trlmin (compartiment II).
W2 = 80 trlmin (compartiment II).
Dans ces conditions, les couches de diffusion #1 et 82 sont respectivement de 100 m et 150 m.
Les concentrations initiales sont les suivantes:
Essai 1 : AbII,0 = 0,6 mM , BbII,0 = AbI,0 = BtI,t = 0
pompage enzymatique voie 1
Essai 2 : BbII,0 = 0,7 mM , AbII,0 = BbI,0 = AbI,t = 0
Translocation de B = glycérol de Cl vers CII avec transformation
Essai 1 : AbII,0 = 0,6 mM , BbII,0 = AbI,0 = BtI,t = 0
pompage enzymatique voie 1
Essai 2 : BbII,0 = 0,7 mM , AbII,0 = BbI,0 = AbI,t = 0
Translocation de B = glycérol de Cl vers CII avec transformation
Essai 3 : AbII,0 = 0,6 mM, BbII,0 = 0,7 mM,
BbI,0 = AbI,t = 0
pompage enzymatique voie 1 + translocation analogue à celle de
l'essai 2.
BbI,0 = AbI,t = 0
pompage enzymatique voie 1 + translocation analogue à celle de
l'essai 2.
Dans ces essais, on mesure en continu les concentrations AbII,0, BbII,0, BbI,0 # AbII,t,
BbII,t, BbI,t à l'aide d'analyseurs à électrodes ampérométriques.
BbII,t, BbI,t à l'aide d'analyseurs à électrodes ampérométriques.
Les Figures 6, 7 et 8 annexées sont des graphes donnant l'évolution des concentrations en G3P2- et Glycérol dans les compartiments C1 et Cll, pour les essais 1 à 3 respectivement.
La Figure 6 montre clairement la surconcentration du G3P 2-(A) dans Cl, obtenue par transport actif transmembranaire de Glycérol (B), jouant le rôle d'intermédiaire migrateur et issu de la transformation
dans Ci. La translocation (essai 2) combinée au pompage enzymatique (essai 1) permet d'améliorer encore la surconcentration en A (G3P2-) dans Cl (essai 3).
dans Ci. La translocation (essai 2) combinée au pompage enzymatique (essai 1) permet d'améliorer encore la surconcentration en A (G3P2-) dans Cl (essai 3).
EXEMPLE II : Séparation/surconcentration de glycerol 3-phosphate2-et de glycerol dans CI, en mettant en oeuvre les voies enzymatiques 1 et 2,. (Fig.2 et 3) respectivement, avec la même methodologie que celle utilisée dans l'exemple 1.
2. 1. Matériel
Le dispositif mis en oeuvre est celui décrit supra et représenté sur la Fig. 1.
Le dispositif mis en oeuvre est celui décrit supra et représenté sur la Fig. 1.
Pour la description des membranes et des enzymes, on se référera au point 1.1. supra.
2.2. Conditions opératoires
Les milieux liquides en Cl et C11 ont la même composition, à l'exception des concentrations en composé A = glycérol-3-phosphate2- et en composé B = glycérol.
Les milieux liquides en Cl et C11 ont la même composition, à l'exception des concentrations en composé A = glycérol-3-phosphate2- et en composé B = glycérol.
La température du milieu liquide est thermostatée par la cuve à 25 C.
Les autres conditions opératoires varient en fonction des essais réalisés.
2.3. Essais 4 à 6 : Voie 1 Transport de A de CII dans Cl
<tb> <SEP> E2 <SEP> membrane <SEP> E1
<tb> (CI) <SEP> A <SEP> B <SEP> B <SEP> A <SEP> (C11)
<tb>
La configuration de membrane enzymatique est la même que celle de l'exemple 1, la membrane est électriquement chargée de telle sorte que: r 'v A = résistance électrique de la membrane vis-à-vis de A = + 300 min. cm-3.
<tb> (CI) <SEP> A <SEP> B <SEP> B <SEP> A <SEP> (C11)
<tb>
La configuration de membrane enzymatique est la même que celle de l'exemple 1, la membrane est électriquement chargée de telle sorte que: r 'v A = résistance électrique de la membrane vis-à-vis de A = + 300 min. cm-3.
r # B = résistance électrique de la membrane vis-à-vis de B = 0.
Les coefficents de diffusion de A et B au travers de la membrane sont les suivants:
DA =4,09 104 cm2.min4.
DA =4,09 104 cm2.min4.
DB = 5,05.104 cm2.min-1.
Les constantes de vitesse du ler ordre vis-à-vis de A pour E1, E2, sont: k1 = 3,4 cm3. min k2 0,6 cm3.min-t l'épaisseur de la membrane d = 2,4.10-2cm
La surface de pore de la membrane est Aw = 0,38cm2.
La surface de pore de la membrane est Aw = 0,38cm2.
La surface de la membrane est A = 3,14 cm2.
Les volumes de CI/CII sont V1 = 4 cm3 et V2 = 300 cm3.
81 = 1.10-2 cm 62= 1,5.10-2cm.
Dans les essais 4 à 6, les concentrations initiales et finales (mol.cm-3) en A et B donc Cl, CII sont données dans le Tableau 1 ci-dessous:
Tableau 1
Tableau 1
<tb> Essais <SEP> AbII,0 <SEP> BbII,0 <SEP> AbI,# <SEP> <SEP> BbI,# <SEP> <SEP> Ratio <SEP> de
<tb> <SEP> surconcentration
<tb> <SEP> /AbII,0
<tb> <SEP> 4 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 1,87.10-6 <SEP> 1,15.10-9 <SEP> 2,67
<tb> <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 7.10-7 <SEP> 2,52.10-6 <SEP> 1,62.10-9 <SEP>
<tb> <SEP> 6 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 4,39.10-6 <SEP> 2,78.10-9 <SEP> 6,27
<tb> 4 = pompage enzymatique de A de CII dans CI 5 = translocation de B de CII en A dans CI.
<tb> <SEP> surconcentration
<tb> <SEP> /AbII,0
<tb> <SEP> 4 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 1,87.10-6 <SEP> 1,15.10-9 <SEP> 2,67
<tb> <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 7.10-7 <SEP> 2,52.10-6 <SEP> 1,62.10-9 <SEP>
<tb> <SEP> 6 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 4,39.10-6 <SEP> 2,78.10-9 <SEP> 6,27
<tb> 4 = pompage enzymatique de A de CII dans CI 5 = translocation de B de CII en A dans CI.
6=4+5.
# Essais 7 à 9 : transport de B de CII dans Cl: Voie 2
Ce sont les mêmes conditions que pour les essais 4 à 6 sauf en ce qui concerne r # A et rvB.
Ce sont les mêmes conditions que pour les essais 4 à 6 sauf en ce qui concerne r # A et rvB.
<tb>
<SEP> E <SEP> I <SEP> membrane <SEP> E
<tb> (C11)BA <SEP> A- > B <SEP> A <SEP> B <SEP> (C)
<tb>
Toutes choses égales par ailleurs, la configuration de cette voie 2 diffère de celle selon la voie 1 (essais 4 à 6), en ce que:
E1 est dans la face de la membrane en regard de CII et E2 dans celle en regard de CI.
<tb> (C11)BA <SEP> A- > B <SEP> A <SEP> B <SEP> (C)
<tb>
Toutes choses égales par ailleurs, la configuration de cette voie 2 diffère de celle selon la voie 1 (essais 4 à 6), en ce que:
E1 est dans la face de la membrane en regard de CII et E2 dans celle en regard de CI.
Les concentrations (mol.cm-3) initiales et finales mesurées en B et A dans CII et CI sont données dans le Tableau 2:
Tableau 2
Tableau 2
<tb> Essais <SEP> BbII,0 <SEP> AbII,0 <SEP> BbI,# <SEP> <SEP> Ab,, <SEP> Ratio <SEP> de
<tb> <SEP> surconcentration
<tb> <SEP> BbI,#/BbII,#
<tb> <SEP> 7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 1,88.10-6 <SEP> 2,47.10-8 <SEP> 2,69
<tb> <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 7.10-7 <SEP> 1,55.10-6 <SEP> 2,06.10-8 <SEP>
<tb> <SEP> 9 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 3,43.10-6 <SEP> 4,54.10-8 <SEP> 4,9
<tb> 7 = pompage enzymatique de B de CII dans CI 8 = translocation de A de CII en B dans Cl.
<tb> <SEP> surconcentration
<tb> <SEP> BbI,#/BbII,#
<tb> <SEP> 7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 1,88.10-6 <SEP> 2,47.10-8 <SEP> 2,69
<tb> <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 7.10-7 <SEP> 1,55.10-6 <SEP> 2,06.10-8 <SEP>
<tb> <SEP> 9 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 3,43.10-6 <SEP> 4,54.10-8 <SEP> 4,9
<tb> 7 = pompage enzymatique de B de CII dans CI 8 = translocation de A de CII en B dans Cl.
9 = 7 + 8.
EXEMPLE III Séparation/surconcentration de glycerol 3-p2- d'un compartiment
Cl par pompage enzymatique selon le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention et à l'aide du dispositif de l'invention dans sa deuxieme forme de realisation
3. 1. Matériel
Le dispositif mis en oeuvre est celui décrit supra et représenté sur la Fig. 4.
Cl par pompage enzymatique selon le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention et à l'aide du dispositif de l'invention dans sa deuxieme forme de realisation
3. 1. Matériel
Le dispositif mis en oeuvre est celui décrit supra et représenté sur la Fig. 4.
Le faisceau 14 est constitué de 88 fibres 13 creuses en cellulose régénérée (spectra / Por@) de 25 cm de long, soit au total 2200 cm de longueur de fibres. Le seuil de coupure de la paroi de ces fibres 13 qui forme la membrane enzymatique, est de 6 000 D (90 % molécules de PM = 6000 D sont retenues) D diamètre d'une fibre = 240 m, d = 40 llm.
Le volume interne total du faisceau = 1 ml.
A (surface totale) = 166 cm2.
La porosité est de 12 %, soit une surface active de transfert de Aw = 20 cm2.
Les enzymes; E2 = phosphatase alcaline
E1 = glycérol kinase.
E1 = glycérol kinase.
Ces enzymes sont de même nature que celles des exemples I et II.
Le greffage de E1 sur la face interne de la paroi des fibres 13 s'opère comme suit:
L'intérieur des fibres est hydrolysé par remplissage avec du KOH 0,1 M pendant 24 heures. Le KOH sert à désestérifier. Les fibres sont ensuite rincées à l'eau distillée.
L'intérieur des fibres est hydrolysé par remplissage avec du KOH 0,1 M pendant 24 heures. Le KOH sert à désestérifier. Les fibres sont ensuite rincées à l'eau distillée.
Puis elles sont remplies avec du périodate de sodium 0,25 M, à l'obscurité, pendant des périodes de temps variables. A l'issue de l'incubation, elles sont rincés à l'eau distillée, pour éliminer l'excès de périodate. Les fibres sont alors remplies d'urée à 15 % (p/v) à laquelle est ajoutée de l'acide sulfurique à 0,9 % (v/v). Le tout est incubé dans un bain-marie à 45 C. Les fibres sont alors lavés jusqu'à ce que l'eau de rinçage soit neutre puis mises à incuber 16 heures dans un bain-marie à 45 C avec une agitation constante dans du formaldéhyde 12,5 % (v/v) avec du tampon phosphate 0,1M pH7,5. L'excès de formaldéhyde est éliminé par rinçage à l'eau distillée.
On fixe alors E1 à l'intérieur des fibres, cette dernière étant mise à une concentration de 1 mg.ml-l, dans du tampon phosphate 0,1 M pH7,5. L'incubation dure environ 24 heures, avec une agitation douce. Les fibres sont alors rincées à l'eau distillée puis mis dans du KCI 1M pendant 15 minutes avec une agitation douce. Elles sont de nouveau rincées, puis remises 15 minutes dans du KCI 1M et rincées une dernière fois.
On reproduit les mêmes étapes pour le greffage de E2 à l'extérieur des fibres, qui ne sont cette fois plus remplies mais immergées.
Les caractéristiques de fibres greffées avec E1 et E2, sont les suivantes:
E1 et E2 activité de 25 n mol.min-l cm-l de longueur de fibre, soit 25.10 9 mol.min-1 x 2200 cm = 55.104 mol.min-l * E2 = phosphatase alcaline (Km = 6.10-6 mol.cm3) (k = Vm/Km) k2 = 55.10-6/6.10-6=9,1 cm3 min-1.
E1 et E2 activité de 25 n mol.min-l cm-l de longueur de fibre, soit 25.10 9 mol.min-1 x 2200 cm = 55.104 mol.min-l * E2 = phosphatase alcaline (Km = 6.10-6 mol.cm3) (k = Vm/Km) k2 = 55.10-6/6.10-6=9,1 cm3 min-1.
* E1 = glycérol kinase (Km = 7.10-8 mol.cm-3) (k1 = 55.104 /7.10-8 = 785 cm3.min-1).
DA = 5,05.10-4 cm2.min-1.
DB = 4,09. 104 cm2.min-1.
* 82 = 150 m= 1,5.10-2 cm.
* #1 = 10 m = 1.10-3 cm.
* V1 = 0,83 ml (en retranchant le volume correspondant à #1).
3.2. Essais 10 à 12 : Variation charge membrane enzymatique tubulaire
transport actif de: (II) (I) extérieur fibres
transport actif de: (II) (I) extérieur fibres
<tb> <SEP> E <SEP> membrane <SEP> E
<tb> A <SEP> > <SEP> B <SEP> A <SEP> (Cz)
<tb> intérieur fibres.
<tb> A <SEP> > <SEP> B <SEP> A <SEP> (Cz)
<tb> intérieur fibres.
Pour ces essais, les paramètres expérimentaux sont les suivants: k1 = 7,85 x 102 cm3 x min-1 k2 =9,1 cm3.min l.
d = 4.10-3 cm
Aw = 20 cm2
A= 166 cm2 #1 = = 1.10-3 cm
DA = 4,09 x 10-4 cm2.min-l.
Aw = 20 cm2
A= 166 cm2 #1 = = 1.10-3 cm
DA = 4,09 x 10-4 cm2.min-l.
DB= 5,05 .104 cm2.min-1.
V1 = 0,83 cm3 #2 = 1,5.10-2 cm r#A = 2 min.cm-3 essai 10
5 min.cm-3 essai 10
10 min.cm-3 essai 12 r#B = 0 min.cm-3
Les concentrations (mol x cm-3) en A (G3P-2) et en B (Glycérol) dans le CII (cuve 11) et le Cl (lumière fibres immergées) sont données dans le Tableau 3 ci-après p.27
La Figure 9 annexée rend également compte de ces résultats
3.3. Essais 13 à 1 - Variation charge membranaire * transport actif A (CII) # A(CI) * + translocation B (CII) # A(CI)
Les paramètres sont identiques à ceux des essais 10 à 12.
5 min.cm-3 essai 10
10 min.cm-3 essai 12 r#B = 0 min.cm-3
Les concentrations (mol x cm-3) en A (G3P-2) et en B (Glycérol) dans le CII (cuve 11) et le Cl (lumière fibres immergées) sont données dans le Tableau 3 ci-après p.27
La Figure 9 annexée rend également compte de ces résultats
3.3. Essais 13 à 1 - Variation charge membranaire * transport actif A (CII) # A(CI) * + translocation B (CII) # A(CI)
Les paramètres sont identiques à ceux des essais 10 à 12.
Les résultats sont donnés par le Tableau 4 ci-après p.28.
La Figure 10 annexée rend également compte de ces résultats.
EXEMPLE Iv : Séparation/surconcentration de glycerol (B) d'un compartiment
CII vers un compartiment Cl par pompage enzymatique selon le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention et à l'aide du dispositif de l'invention dans sa deuxieme forme de realisation
4. 1. Matériel et conditions expérimentales
Le dispositif mis en oeuvre est le même que celui de 1' exemple 3, à la différence que, E2 est greffée à l'intérieur des fibres 13 et E, à l'extérieur.
CII vers un compartiment Cl par pompage enzymatique selon le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention et à l'aide du dispositif de l'invention dans sa deuxieme forme de realisation
4. 1. Matériel et conditions expérimentales
Le dispositif mis en oeuvre est le même que celui de 1' exemple 3, à la différence que, E2 est greffée à l'intérieur des fibres 13 et E, à l'extérieur.
Les conditions expérimentales sont les mêmes qu'à l'exemple 3, à l'exception des paramètres suivants: k1 = 9,1 cm3#min-1.
k2 = 7,85.102 cm3.min-1.
DB = 5,05.10-4 cm2.min-1.
DA = 4,09.10-4 cm2.min-1.
= 0min.cm3 r#A = variable.
4.2. Essais 15 à 17 : Variation charge et porosité membrane tubulaire
transport actif B de CII vers CI: essai 15 : Aw = 20cm2 et r?A = - 0,4 min.cm-3 essai 16 : Aw =20cm2 et r#A = - 0,48 min.cm-3 essai 17 : Aw = 2cm2 et r#A = = - 0,48 min.cm-3
BbI,0 = 0.
transport actif B de CII vers CI: essai 15 : Aw = 20cm2 et r?A = - 0,4 min.cm-3 essai 16 : Aw =20cm2 et r#A = - 0,48 min.cm-3 essai 17 : Aw = 2cm2 et r#A = = - 0,48 min.cm-3
BbI,0 = 0.
Les résultats sont donnés dans le Tableau 5 ci-après p.29.
4.3. Essais 18 à 20 - Variation charge et porosité membranes tubulaires enzymatique: transport actif B(CII) # B (CI) + translocation A(Cll) e BA (CI)
Ce sont les mêmes conditions que dans les essais 15 à 17. BbI,0 = 0.
Ce sont les mêmes conditions que dans les essais 15 à 17. BbI,0 = 0.
Les résultats sont donnés dans le Tableau 6 ci-après p.30.
Ces résultats sont donnés également par la Figure 11.
Tableau 3
essais <SEP> AbII,0 <SEP> BbII,0 <SEP> AbIt(min) <SEP> =
<tb> AbI,# <SEP> BbI,#
<tb> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 30
<tb> AbII,0
<tb> 10 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 1,9876.10-6 <SEP> 2,2988.10-6 <SEP> 2,3475.10-6 <SEP> 2,3551.10-6 <SEP> 2,3563.10-6 <SEP> 2,3565.10-6 <SEP> 3,35 <SEP> 1,05.10-9
<tb> 11 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 2,7864.10-6 <SEP> 3,9696.10-6 <SEP> 4,4725.10-6 <SEP> 4,6859.10-6 <SEP> 4,7765.10-6 <SEP> 4,8149.10-6 <SEP> 6,85 <SEP> 1,05.10-9
<tb> 12 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 3,2653.10-6 <SEP> 5,3447.10-6 <SEP> 6,6685.10-6 <SEP> 7,5113.10-6 <SEP> 8,0479.10-6 <SEP> 8,9801.10-6 <SEP> 12 <SEP> 1,05.10-9
<tb> Tableau 4
<tb> AbI,# <SEP> BbI,#
<tb> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 30
<tb> AbII,0
<tb> 10 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 1,9876.10-6 <SEP> 2,2988.10-6 <SEP> 2,3475.10-6 <SEP> 2,3551.10-6 <SEP> 2,3563.10-6 <SEP> 2,3565.10-6 <SEP> 3,35 <SEP> 1,05.10-9
<tb> 11 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 2,7864.10-6 <SEP> 3,9696.10-6 <SEP> 4,4725.10-6 <SEP> 4,6859.10-6 <SEP> 4,7765.10-6 <SEP> 4,8149.10-6 <SEP> 6,85 <SEP> 1,05.10-9
<tb> 12 <SEP> 7.10-7 <SEP> 0 <SEP> 3,2653.10-6 <SEP> 5,3447.10-6 <SEP> 6,6685.10-6 <SEP> 7,5113.10-6 <SEP> 8,0479.10-6 <SEP> 8,9801.10-6 <SEP> 12 <SEP> 1,05.10-9
<tb> Tableau 4
essais <SEP> AbII,0 <SEP> BbII,0 <SEP> AbIt(min) <SEP> = <SEP> AbI,#
<tb> BbI,#
<tb> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 30
<tb> AbII,0
<tb> 13 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 5,2999.10-6 <SEP> 6,1296.10-6 <SEP> 6,2595.10-6 <SEP> 6,2798.10-6 <SEP> 6,2829.10-6 <SEP> 6,2834.10-6 <SEP> 9 <SEP> 3.10-9
<tb> 14 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7,6908.10-6 <SEP> 1,0957.10-5 <SEP> 1,2344.10-5 <SEP> 1,2933.10-5 <SEP> 1,3183.10-5 <SEP> 1,3289.10-5 <SEP> 19 <SEP> 3.10-9
<tb> 15 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 9,1463.10-6 <SEP> 1,4970.10-5 <SEP> 1,8678.10-5 <SEP> 2,1039.10-5 <SEP> 2,254.10-5 <SEP> 2,3499.10-5 <SEP> 33,6 <SEP> 3.10-9
<tb> Tableau 5
<tb> BbI,#
<tb> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 30
<tb> AbII,0
<tb> 13 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 5,2999.10-6 <SEP> 6,1296.10-6 <SEP> 6,2595.10-6 <SEP> 6,2798.10-6 <SEP> 6,2829.10-6 <SEP> 6,2834.10-6 <SEP> 9 <SEP> 3.10-9
<tb> 14 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7,6908.10-6 <SEP> 1,0957.10-5 <SEP> 1,2344.10-5 <SEP> 1,2933.10-5 <SEP> 1,3183.10-5 <SEP> 1,3289.10-5 <SEP> 19 <SEP> 3.10-9
<tb> 15 <SEP> 7.10-7 <SEP> 7.10-7 <SEP> 9,1463.10-6 <SEP> 1,4970.10-5 <SEP> 1,8678.10-5 <SEP> 2,1039.10-5 <SEP> 2,254.10-5 <SEP> 2,3499.10-5 <SEP> 33,6 <SEP> 3.10-9
<tb> Tableau 5
essais <SEP> BbII,0 <SEP> AbII,0 <SEP> BbI,t(min) <SEP> = <SEP> BbI,#
<tb> AbI,#
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> BbII,0
<tb> 15 <SEP> 7.10-9 <SEP> 0 <SEP> 1,9115.10-8 <SEP> 1,5628.10-8 <SEP> 1,6661.10-8 <SEP> 1,6948.10-8 <SEP> 1,7029.10-8 <SEP> 2,4 <SEP> 4,7.10-9
<tb> 16 <SEP> 7.10-9 <SEP> 0 <SEP> 7,6716.10-8 <SEP> 2,3825.10-8 <SEP> 2,6593.10-8 <SEP> 2,7670.10-8 <SEP> 2,8090.10-8 <SEP> 4 <SEP> 7,8.10-9
<tb> BbI,t(min) <SEP> =
<tb> essai <SEP> BbII,0 <SEP> AbII,0 <SEP> BbI,# <SEP> AbI,#
<tb> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 30
<tb> BbII,#
<tb> 17 <SEP> 7.10-9 <SEP> 0 <SEP> 8,5783.10-8 <SEP> 1,2837.10-7 <SEP> 1,4912.10-7 <SEP> 1,5923.10-7 <SEP> 1,6415.10-7 <SEP> 1,6655.10-7 <SEP> 23.7 <SEP> 4,7.10-9
<tb> Tableau 6
<tb> AbI,#
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> BbII,0
<tb> 15 <SEP> 7.10-9 <SEP> 0 <SEP> 1,9115.10-8 <SEP> 1,5628.10-8 <SEP> 1,6661.10-8 <SEP> 1,6948.10-8 <SEP> 1,7029.10-8 <SEP> 2,4 <SEP> 4,7.10-9
<tb> 16 <SEP> 7.10-9 <SEP> 0 <SEP> 7,6716.10-8 <SEP> 2,3825.10-8 <SEP> 2,6593.10-8 <SEP> 2,7670.10-8 <SEP> 2,8090.10-8 <SEP> 4 <SEP> 7,8.10-9
<tb> BbI,t(min) <SEP> =
<tb> essai <SEP> BbII,0 <SEP> AbII,0 <SEP> BbI,# <SEP> AbI,#
<tb> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 30
<tb> BbII,#
<tb> 17 <SEP> 7.10-9 <SEP> 0 <SEP> 8,5783.10-8 <SEP> 1,2837.10-7 <SEP> 1,4912.10-7 <SEP> 1,5923.10-7 <SEP> 1,6415.10-7 <SEP> 1,6655.10-7 <SEP> 23.7 <SEP> 4,7.10-9
<tb> Tableau 6
BbI,t(min) <SEP> = <SEP> 1
<tb> essais <SEP> BbII,0 <SEP> AbII,0 <SEP> BbI,# <SEP> AbI,#
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> BbII,0
<tb> 18 <SEP> 7.10-9 <SEP> 7.10-9 <SEP> 2,16034.10-8 <SEP> 2,8338.10-8 <SEP> 3,0212.10-8 <SEP> 3,0733.10-8 <SEP> 3,0878.10-8 <SEP> 4,4 <SEP> 8,5.10-9
<tb> 19 <SEP> 7.10-9 <SEP> 7.10-9 <SEP> 3,0325.10-8 <SEP> 4,3224.10-8 <SEP> 4,8246.10-8 <SEP> 5,0200.10-8 <SEP> 5,0962.10-8 <SEP> 7,2 <SEP> 1,48.10-8
<tb> BbI,t(min) <SEP> =
<tb> essai <SEP> BbII,0 <SEP> AbII,0 <SEP> BbI,# <SEP> AbI,#
<tb> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 30
<tb> BbII#
<tb> 20 <SEP> 7.10-9 <SEP> 7.10-9 <SEP> 1,5573.10-7 <SEP> 2,3305.10-7 <SEP> 2,7072.10-7 <SEP> 2,8907.10-7 <SEP> 2,9802.10-07 <SEP> 3,0237.10-7 <SEP> 43,2 <SEP> 8,5.10-9
<tb>
<tb> essais <SEP> BbII,0 <SEP> AbII,0 <SEP> BbI,# <SEP> AbI,#
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> BbII,0
<tb> 18 <SEP> 7.10-9 <SEP> 7.10-9 <SEP> 2,16034.10-8 <SEP> 2,8338.10-8 <SEP> 3,0212.10-8 <SEP> 3,0733.10-8 <SEP> 3,0878.10-8 <SEP> 4,4 <SEP> 8,5.10-9
<tb> 19 <SEP> 7.10-9 <SEP> 7.10-9 <SEP> 3,0325.10-8 <SEP> 4,3224.10-8 <SEP> 4,8246.10-8 <SEP> 5,0200.10-8 <SEP> 5,0962.10-8 <SEP> 7,2 <SEP> 1,48.10-8
<tb> BbI,t(min) <SEP> =
<tb> essai <SEP> BbII,0 <SEP> AbII,0 <SEP> BbI,# <SEP> AbI,#
<tb> 5 <SEP> 10 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 25 <SEP> 30
<tb> BbII#
<tb> 20 <SEP> 7.10-9 <SEP> 7.10-9 <SEP> 1,5573.10-7 <SEP> 2,3305.10-7 <SEP> 2,7072.10-7 <SEP> 2,8907.10-7 <SEP> 2,9802.10-07 <SEP> 3,0237.10-7 <SEP> 43,2 <SEP> 8,5.10-9
<tb>
Claims (15)
1 - Procédé de séparation et de concentration d'au moins un Produit à
Concentrer (Pac), présent dans un milieu liquide sous forme solubilisée, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement et successivement ou non:
- à sélectionner au moins un couple d'enzymes réversibles E1/E2,
E1 étant apte à catalyser la réaction de transformation d'au moins
un substrat A en au moins un produit B et E2 la réaction inverse
de transformation du (ou des) substrat(s) B en au moins un
produit A:
transformation enzymatique par E1 ou E2, du composé Pac de départ correspondant à A ou B, en métabolite B ou A respectivement selon le cas:
membranes, à fixer les conditions opératoires de telle sorte qu'intervienne: .1. dans le compartiment Cl ou CII de départ, au moins une
couche de diffusion attenante à chaque face de la ou des
l'une des faces de la ou des membranes, de préférence une
au moins une couche de diffusion non-turbulente, attenante à
préférence les liquides - des compartiments C1/C11, en prévoyant
CII, à mettre en mouvement au moins l'un des liquides - de
un compartiment liquide Cl et au moins un compartiment liquide
liquide, chaque membrane délimitant au moins en partie au moins
à immerger la (ou les) membrane(s) poreuse(s) dans le milieu
respectivement, sur et/ou dans l'une et l'autre de ses faces,
à prévoir au moins une membrane poreuse comprenant E1 et E2,
chargé,
* et qu'au moins l'un des composés A ou B soit électriquement
* que A ou B corresponde à Pac
de telle sorte
- à récupérer le Pac ainsi accumulé et surconcentré.
concentre dans le compartiment C11 ou Cl d'arrivée,
départ, de telle façon que ce dernier s'accumule et se
ou El, de l'intermédiaire migrateur (B ou A), en Pac de
.3. puis au moins une transformation enzymatique inverse, par E2
non métabolisé et non migrateur (Fac),
électriquement du même signe que l'autre composé A ou B
électriquement neutre alors chaque membrane est chargée
et si l'intermédiaire migrateur est un composé A ou B
Pac,
celle adjacente à la face portant l'enzyme ayant transformé le
signe opposé sur au moins l'une de ses faces, de préférence
électriquement chargé, alors chaque membrane est chargée du
e Si l'intermédiaire migrateur est un composé A ou B
concentration, avec les conditions selon lesquelles:
migration intervenant notamment sous l'effet d'un gradient de
d'un compartiment Cl ou C11 à l'autre C11 ou Cl cette
migrateur) au travers des pores de la membrane pour passer
.2. la migration du Pac métabolisé par E1 ou E2 (intermédiaire
2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane enzymatique se présente sous la forme d'un film mono ou multicouche, de préférence sensiblement plan.
3 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane enzymatique constitue tout ou partie de la paroi d'au moins un tube dont la lumière forme l'un des compartiments C,/C,
en ce que l'on fait baigner au moins une partie de cette membrane tubulaire dans le milieu liquide formant l'autre compartiment Cl,/CX,
en ce que l'on fait circuler un liquide à enrichir ou à appauvrir en composé
Pac, dans cette ou ces membranes enzymatiques tubulaires, de préférence réunies en au moins un faisceau.
4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'on élabore donc le milieu liquide de Cl et/ou C11 en ayant recours à un solvant - de préférence essentiellement aqueux -, comprenant éventuellement des solutés choisis dans le groupe suivant:
o tampons de pH adaptés aux pH optimum de fonctionnement de
El et E2,
o molécules à liaisons riches en énergie - avantageusement ATP ou
toute molécule susceptible de transférer un groupement
phosphate sur un soluté (par exemple : phosphoénol pyruvate,
carbamyl phosphate, phosphocréatine...)
o et leurs mélanges,
les compositions de départ des milieux liquides de Cl et C11 étant, de préférence, sensiblement les mêmes ou non de la concentration en Pac.
les compositions de départ des milieux liquides de Cl et Cn étant, de préférence, sensiblement les mêmes, à l'exception de la concentration en Pac.
5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on fait en sorte que le compartiment C1/C11 récepteur de l'intermédiaire migrateur au travers de la membrane, comprenne au départ une concentration en cet intermédiaire, inférieure à celle existant dans le compartiment émetteur.
6 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on ajuste les paramètres pH et température des milieux liquides de manière à obtenir un optima en cinétique et en rendement pour les transformations enzymatiques par El et E2.
7 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on met en mouvement le liquide de chaque compartiment Cl/Cll, cette mise en mouvement s'opérant par agitation et/ou par circulation du liquide, en ce que l'on règle les conditions d'agitation et/ou de circulation de façon à ce que la ou les couches de diffusion non turbulentes, aient une épaisseur identique ou différente de part et d'autre de la membrane et compnse entre 1 et 10 fois l'épaisseur de la membrane.
8 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on a recours à des moyens d'assistance de la migration transmembranaire de (ou des) intermédiaire(s) migrateur(s), lesdits moyens étant de préférence constitués par un gradient de force ionique et/ou électrique, de part et d'autre de la membrane, et plus préférentiellement encore des gradients de pH (force protomotrice).
9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'on complète la surconcentration du Pac, par pompage enzymatique dudit
Pac au travers de la ou des membranes, à partir d'un compartiment Cl ou C11 contenant du Pac vers un compartiment C11 ou C1 à enrichir en Pac, par mise en oeuvre d'une translocation du Pac, cette dernière consistant à introduire dans le compartiment Cl ou C11 de départ chargé en Pac, de l'intermédiaire migrateur A ou
B, de telle sorte que cet intermédiaire migrateur ajouté migre cumulativement à celui issu de l'étape - 1 -, dans les mêmes conditions que celles de l'étape - 2 -, pour être enfin soumis, à l'étape - 3 - après avoir traversé la membrane, les étapes - 1 -, - 2 -, et - 3 - en cause étant celles telles que définies dans la revendication 1.
10 - Dispositif de séparation et de concentration d'au moins un Produit à
Concentrer (Pac), présent dans un milieu liquide sous forme solubilisée, notamment pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement:
- au moins une membrane enzymatique poreuse (5,13),
comportant au moins un couple d'enzymes réversibles E/E2, E1
étant apte à catalyser la réaction de transformation d'au moins un
substrat A en au moins un produit B et E2 la réaction inverse de
transformation du (ou des) substrat(s) B en au moins un produit
A:
de telle sorte
* que A ou B corresponde à Pac
* et qu'au moins l'un des composés A ou B soit électriquement
chargé, El et E2 étant respectivement supportées par l'une et
l'autre des faces de la membrane,
- au moins un conteneur (2, 11) du milieu liquide dans lequel
baigne ou est susceptible de baigner la membrane
enzymatique(5, 13) pour délimiter au moins partiellement au
moins un compartiment liquide Cl et au moins un compartiment
liquide Cll,
- des moyens de mise en mouvement (3, 9, 12, 15) d'au moins l'un
des liquides de préférence des liquides des compartiments Cl/CIl,
- éventuellement des moyens (21S, 22, 11" 112) de réglage de la
température du milieu liquide.
11 - Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que chaque membrane (5, 13) est électriquement chargée, sur au moins l'une de ses faces, de préférence sur celle adjacente à la face portant l'enzyme ayant transformé le Pac, et plus préférentiellement encore sur les deux.
12 - Dispositif selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que la
membrane enzymatique (5, 13) est une matrice poreuse dans et/ou sur les deux faces
de laquelle sont incluses et immobilisées les enzymes F E2 respectivement, cette
matrice étant formée par au moins un composé macromoléculaire, de préférence
choisi parmi les protéines, les polysaccharides les (co)polymères synthétiques et leurs
mélanges et/ou alliages,
la cellulose et ses dérivés, de même que les (co)polyamides étant
particulièrement préférés.
13 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12,
caractérisé en ce que la membrane enzymatique (5) se présente sous la forme d'un
film mono ou multicouche, de préférence sensiblement plan.
14 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la membrane constitue tout ou partie de la paroi d 'au moins un tube (13) dont la lumière forme l'un des compartiments C,/CI,.
15 - Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, caractérisé en ce que le couple d'enzymes réversibles E,/E2 est choisi principalement parmi les couples d'enzymes E,/E2 permettant l'addition/enlèvement d'un groupement chimique chargé sur un métabolite, de préférence parmi les couples d'enzymes E1)E2 de phosphorylation/déphosphorylation, et plus préférentiellement encore parmi les kinases/phosphatases.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9613554A FR2755036B1 (fr) | 1996-10-31 | 1996-10-31 | Procede de separation et de concentration de petites molecules a l'aide de pompes enzymatiques membranaires : reacteur separateur/concentreur |
| AU49526/97A AU4952697A (en) | 1996-10-31 | 1997-10-29 | Method for separating and concentrating small molecules using enzymatic membrane pumps: separator/concentrator reactor |
| PCT/FR1997/001936 WO1998018904A1 (fr) | 1996-10-31 | 1997-10-29 | Procede de separation et de concentration de petites molecules a l'aide de pompes enzymatiques membranaires: reacteur separateur/concentreur |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9613554A FR2755036B1 (fr) | 1996-10-31 | 1996-10-31 | Procede de separation et de concentration de petites molecules a l'aide de pompes enzymatiques membranaires : reacteur separateur/concentreur |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2755036A1 true FR2755036A1 (fr) | 1998-04-30 |
| FR2755036B1 FR2755036B1 (fr) | 1999-01-22 |
Family
ID=9497394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9613554A Expired - Fee Related FR2755036B1 (fr) | 1996-10-31 | 1996-10-31 | Procede de separation et de concentration de petites molecules a l'aide de pompes enzymatiques membranaires : reacteur separateur/concentreur |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU4952697A (fr) |
| FR (1) | FR2755036B1 (fr) |
| WO (1) | WO1998018904A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2777803A1 (fr) * | 1998-04-24 | 1999-10-29 | Univ Claude Bernard Lyon | Procede d'elimination active et selective de petites molecules par pompage enzymatique : dialyse active |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0273679A2 (fr) * | 1986-12-29 | 1988-07-06 | EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) | Méthode d'exécution de réactions enzymatiques et réacteur enzymatique utilisable |
| US4956289A (en) * | 1987-03-16 | 1990-09-11 | Brunswick Corporation | Thin film membrane enzyme reactor and method of using same |
-
1996
- 1996-10-31 FR FR9613554A patent/FR2755036B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-10-29 AU AU49526/97A patent/AU4952697A/en not_active Abandoned
- 1997-10-29 WO PCT/FR1997/001936 patent/WO1998018904A1/fr active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0273679A2 (fr) * | 1986-12-29 | 1988-07-06 | EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) | Méthode d'exécution de réactions enzymatiques et réacteur enzymatique utilisable |
| US4956289A (en) * | 1987-03-16 | 1990-09-11 | Brunswick Corporation | Thin film membrane enzyme reactor and method of using same |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2777803A1 (fr) * | 1998-04-24 | 1999-10-29 | Univ Claude Bernard Lyon | Procede d'elimination active et selective de petites molecules par pompage enzymatique : dialyse active |
| WO1999055828A1 (fr) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Universite Claude Bernard Lyon I | Procede d'elimination active et selective de petites molecules par pompage enzymatique: dialyse active |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1998018904A1 (fr) | 1998-05-07 |
| FR2755036B1 (fr) | 1999-01-22 |
| AU4952697A (en) | 1998-05-22 |
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| ST | Notification of lapse |