WO1987006257A1 - Procede pour la retention et le maintien de l'activite de micro-organismes - Google Patents

Procede pour la retention et le maintien de l'activite de micro-organismes Download PDF

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WO1987006257A1
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Guy-Alain Junter
Michel Charles Raoul Labbe
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs
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    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis

Definitions

  • the present invention relates to a process for the retention and the maintenance of micro activity. -organisms in structures carrying said activity, on the application of this process to perform bioreactions of industrial interest, as well as for analytical purposes (microbial electrodes).
  • the present invention also relates to the structures proper carrying the activity of microorganisms, as well as to the microbial bioreactors and electrodes incorporating these support structures.
  • microorganisms is understood here to mean all living microorganisms, both prokaryotic and eukaryotic, including in particular bacteria.
  • the terms "cell” or “cell” are sometimes also used, with the same meaning.
  • bioreaction denotes all of the processes generated by the metabolic activity of microorganisms, and in particular syntheses, degradations, conversions, and the like.
  • a bioreactive film (microorganisms) is immobilized on contact with the sensitive surface of an electrode and a signal generated by the metabolic activity of the film is measured on contact with a substrate; the signal intensity is related to the concentration of the substrate.
  • the best known microbial electrodes use the respiratory activity of microorganisms to determine the concentration of various substrates specific to the metabolism of the microbial space used; the answers are amperometric. Other electrodes use potentiometric detection (measurement of the variation in pH, for example).
  • the present invention achieves this objective and proposes, for this purpose, to have the microorganisms in a phase delimited by at least one membrane of suitable nature and porosity, to be permeable to all substrates and products, liquid or gaseous , consumed or excreted during cellular activity, said microorganisms being retained by said (or said) membrane (s).
  • a true microorganism filter is thus produced without limiting their activity, since the membranes are permeable to substrates and to products.
  • Devices using semi-permeable membranes, of low porosity would not be suitable for the needs of the invention, because these membranes limit the passage capacity of the substrates.
  • the microorganisms are immobilized by trapping in a gel
  • cell proliferation in the gel which has been indicated as being a source of release of the microorganisms, collides with the barrier " mechanical "created by the membrane, and there is no need to use chemical agents to stiffen the gel.
  • the present invention therefore firstly relates to a method for the retention and maintenance of the activity of microorganisms in structures carrying said activity, characterized in that one carries out, in a manner known per se, a phase containing the microorganisms and that said phase is delimited by at least one wall, or wall zone, constituted by a membrane whose porosity is just sufficient to retain the microorganisms, but which is permeable to all substrates or products consumed or excreted during the activity of said microorganisms, the phase comprising the microorganisms being constituted by a suspension of the latter in a liquid medium or by a solid or gelled medium in which said microorganisms are encapsulated.
  • the present invention also relates to the application of the process which has just been defined, on the one hand to the production of a bioreaction according to which a substrate is metabolized by an activity of microorganisms carried by a structure with which said substrate is brought into contact, and on the other hand, to the determination of the concentration of a substrate, according to which a structure carrying microorganisms, said substrate and a measuring electrode are brought into contact, and a signal is measured generated by the metabolic activity that said structure develops in contact with said substrate, the measured signal being used, to deduce therefrom, after calibration, the concentration of said substrate.
  • the substrate - which is subjected to bioreaction, in the first case (bioreactors) or whose concentration is sought, in the second case (microbial electrodes) - is placed on the other side of at least one wall, in the wall zone, delimiting the phase containing the micro-orqanis. ps, and constituted by a membrane whose porosity is just sufficient to retain microorganisms, but which is permeable to all substrates or products consumed or excreted during the activity of said microorganisms.
  • the present invention also relates to a structure carrying an activity of microorganisms, intended to be brought into contact with a phase conveying substrates and products brought into play during the activity of microorganisms, characterized in that said microorganisms are contained in a phase which is delimited by at least one wall, or wall zone, which separates said phase from that carrying said substrates of the products, and which consists of a membrane whose porosity is just sufficient to retain microorganisms, but which is permeable to all substrates or products consumed or excreted during the activity of said microorganisms.
  • the membrane will, as a general rule, have a porosity of between 0.2 and 1 micrometer, the highest values being preferred, which is explained in view of the problem which the present invention solves and which has been discussed above.
  • the membrane is a flexible membrane, normally permeable to the aforementioned substrates and products and impermeable to microorganisms, in particular a membrane of the type of those used for microbial filtration.
  • the membrane is a rigid, organic or inorganic membrane, made permeable to the aforementioned substrates and products, the porosity imparted by the permeabilization operation being too low to allow passage microorganisms through said membrane.
  • a membrane can be made permeable to the aforementioned substrates and products by bombardment with heavy ions.
  • the phase containing the microorganisms of the structure according to the present invention may be a liquid phase, or it may be a solid or gelled phase, the microorganisms being immobilized by trapping within said solid or gelled phase. It will be recalled that the latter is free of chemical stiffening agents.
  • the material constituting the rigid reinforcement (s) supporting the membrane (s) will be chosen and / or the membrane (s), a material transparent to light.
  • the present invention also relates to bioreactors and microbial electrodes equipped with a structure carrying activity of microorganisms, such as that which has just been described.
  • the structure carrying activity of microorganisms according to the present invention may consist of a phase containing said microorganisms, free or immobilized within this phase, and confined between at least one rigid reinforcement and at least a flexible or rigid membrane; or else the structure carrying the activity of microorganisms could be constituted by a phase containing the microorganisms, free or immobilized within this phase, and confined between at least one rigid membrane. There is therefore no longer any need in this second case of rigid reinforcement.
  • the phase containing the micro-or ⁇ ani srnes may be confined between two coaxial tubular membranes, this embodiment being simple in the case where rigid membranes are used.
  • the structure carrying the activity of microorganisms is constituted by a gel phase containing the microorganisms, with which the measurement electrode is directly in contact, and comprises a single membrane which is located at the interface of said gel phase and of the liquid phase containing the substrate to be analyzed, opposite to said measurement electrode.
  • the gel phase may also contain an indicator agent reacting to the metabolic activity when the substrate is brought into contact with the electrode.
  • FIGS. 1 to 5 schematically represent, in vertical section for FIGS. 1 to 3, and in perspective, for FIGS. 4 and 5, five examples given purely for illustration of structures carrying cellular activity according to the invention, intended to equip bioreactors, said structures comprising at least one flexible membrane;
  • Figure 6 is a schematic perspective view of a structure according to the invention intended to equip a tubular bioreactor and comprising two rigid membranes;
  • FIG. 7 schematically represents an experimental arrangement intended to measure the activity carried by a structure according to the invention;
  • Figures 8 and 9 show curves obtained with the experimental setup of Figure 4;
  • FIGS. 10 and 11 are diagrams of bacterial electrodes, using a structure carrying activity of microorganisms in accordance with the present invention.
  • Figure 1 designated by 1, as a whole a structure carrying activity of microorganisms, which comprises a flexible membrane 2, and a rigid frame 3 consisting, on the one hand, by a bottom wall 4 , arranged substantially parallel to the membrane 2, and, on the other hand, by two side walls 5, 6, connected to the bottom wall 4 and delimiting an opening 7 closed by said membrane 2.
  • Phase 8 containing the cells, free or immobilized, for example in a gel (polysaccharides), is confined between the rigid reinforcement 3 and the membrane 2.
  • FIG. 2 a structure 1 a has been shown constituted by the combination of two structures of the type of that of FIG. 1, the bottom 4 ⁇ being common. In this way, the exchange surfaces are multiplied by two.
  • FIG. 3 shows another embodiment of a supporting structure, this one (1b) comprising a rigid frame 3b constituted by two walls 5b, 6b, arranged substantially perpendicular to each other, a flexible membrane 2b closing the opening 7b delimited by the free edge of these walls.
  • This supporting structure is particularly suitable, when the product formed is gaseous, because the accumulation of gas in the upper part is avoided (against the walls 5 and 5a of the variants described above).
  • FIGS. 4 and 5 a 1c and 1d are shown, respectively parailITApi conclusionsdique and cylindrique, the first comprising flexible membranes 2c stiffened by an armature whose elements are designated by 3c, and the second comprising a flexible membrane 2d stiffened by the spaced 3d circular shims.
  • the exchange surface of structures 1c and 1d is excellent.
  • the above structures are easy to handle; in particular, the structures 1, 1a, and 1b, form bars easily usable in planar circulation bioreactors.
  • the rigid part of the structure is advantageously made of a material transparent to light, in particular of a material of the polymethacrylate or polycarbonate type.
  • FIG. 7 A structure is also shown, in the working position, in FIG. 7, where it is fitted to a measurement cell 9 used for tests of respiratory activity.
  • This cell 9 comprises a thermostatted enclosure 10, in the upper wall of which is disposed a pO 2 electrode 11, and which contains a culture medium 12, initially saturated with dissolved O 2 .
  • This medium 12 is likely to be agitated at 13.
  • the structure 1e is attached to the side wall of said enclosure 10, which comprises an opening 7e closed by the membrane 2e.
  • the side wall 5e consists in a cylindrical block delimiting phase 8e, with the bottom wall 4e.
  • the structure 1e is held against the enclosure 10, using clamping screws 14, passing through the wall 4e and the wedge 5e.
  • the seal between the wall 4e and the wedge 5e is ensured by the O-ring 15, and the seal between the wedge 5e and the enclosure 10 is ensured by the O-ring 16.
  • the microorganisms are bacteria
  • the flexible membrane 2e is a 0.22 micrometer membrane made of mixed cellulose esters.
  • the respiratory activity of this structure is measured using the oxygen electrode 11.
  • the respiratory activity index measured is the time of consumption of the dissolved oxygen in the culture medium, that is to say - say, the time necessary for the disappearance of this dissolved oxygen ( Figure 8).
  • Figure 8 the time necessary for the disappearance of this dissolved oxygen
  • FIG. 9 represents the variations in the respiratory activity index as a function of the age of the structure: it can be seen that the activity increases to a maximum value, then decreases to stabilize at a satisfactory level. The present inventors have verified that this stabilized activity is maintained in a structure aged 800 hours (corresponding to approximately 400 hours of operation).
  • the initial phase of increased metabolic activity corresponds to the multiplication of microorganisms in the structure when the latter is in contact with glucose.
  • the rate of diffusion of the substrate decreases, the diffusion of glucose limits the activity of the structure, which decreases.
  • the essential point of this experiment is the demonstration of a residual activity corresponding to a state of equilibrium between contradictory phenomena diffusion / growth.
  • the optical density of the culture medium was measured, in order to reveal the possible presence of microorganisms which would have escaped from the structure: in all cases, the optical density was the same as initially, while tests carried out on an agar membrane, not limited by a flexible membrane of the type of the 2e membrane, have shown a significant release of cells into the medium.
  • a structure 1f constituted by two membranes 2f, 2'f, cylindrical and coaxial. This constitutes a tubular trap for a phase 8f containing microorganisms.
  • the membranes 2f, 2'f are rigid membranes which have been permeabilized to the substrates and products, however giving them a porosity which is too low to allow the passage of the cells.
  • Such permeabilization can be achieved by any means. In general, to increase the exchange surface, permeabilization can be carried out on the entire structure. This is particularly well suited for use in a tubular bioreactor.
  • the arrows F and F ' respectively denote the possible directions of circulation of the substrate, respectively external and internal.
  • the materials used for the reinforcements and / or the membranes will be transparent to light.
  • the maximum efficiency will be obtained by simultaneously lighting the outside and the inside (central axis) of this reactor.
  • a particularly elegant method of lighting the structure lf will consist in introducing into the cylindrical space delimited by the inner membrane 2f, optical fibers, so as to restore the light over all the length of the structure, the light source can then be natural (practical case of biophotoreactors).
  • phase 8g is a gel containing bacteria and lipoic acid (indicator agent).
  • the microporous membrane 2g is located at the interface of the gel and the liquid phase containing a substrate for bacterial metabolism.
  • the immobilized microorganisms reduce the lipoic acid, the reduced form of which is detected by the gold electrode 17 which sees its potential, relative to a reference, decrease noticeably.
  • This potentiometric signal can be used (time required for the appearance of a given signal or signal intensity) to determine, after calibration, the concentration of the substrate of the liquid sample.
  • the response is more reliable and faster than if the lipoic acid was in a liquid medium.
  • any other type of microbial electrode exploiting the structures carrying microorganisms, such as, for example, electrodes based on measurements of oxygen consumption by the immobilized microorganisms.
  • the phase located between the electrode and the microporous membrane can be liquid, or else solid (according to the example which has just been described).
  • the supporting structure must however comprise two membranes separating the solid (active) phase from the internal (to the electrode) and external liquid phases (providing the interface with the liquid sample containing the substrate).
  • FIG. 11 shows a microbial electrode structure thus comprising, as the carrier structure 1 hour, an active phase 8 hours containing the bacteria, confined between two membranes 2 hours (electrode: 17; internal phase: 18; external phase: 19 ).
  • the operating principle is the same as when the gelled active phase is in direct contact with the electrode ( Figure 10).
  • These 2g or 2h structures can also be used for example in amperometric electrodes based on oxygen consumption.
  • the present invention provides a concrete solution to the problem of maintaining the activity of microorganisms, for example in bioreactors, said microorganisms being retained by the (or) membrane (s), thereby achieving a a true filter for microorganisms without limiting their activity.
  • the problem solved by the invention is not the separation of products through a membrane, but the retention of microorganisms in compact structures comprising a membrane, said structures being formed once and for all to carry the microorganisms.
  • the invention provides electrodes comprising the association, with a membrane retaining microorganisms, of the phase containing these, free or immobilized in a gel.

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Abstract

Dans la recherche d'une activité maximale des micro-organismes, en particulier, pour obtenir des rendements excellents des bioréactions, deux exigences contradictoires doivent être remplies: il est souhaitable de confiner le micro-organisme pour éviter la contamination des substrats et produits, mais ce confinement exerce un effet défavorable sur les vitesses de réaction qui sont limitées par le transport des substrats et produits à travers la structure assurant le confinement. Conformément à l'invention, on résout cette difficulté en disposant les micro-organismes dans une phase 8e délimitée par une membrane 2e dont la porosité est juste suffisante pour retenir les micro-organismes, mais qui est perméable à tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant l'activité desdits micro-organismes. Application aux bioréacteurs et aux électrodes microbiennes.

Description

PROCEDE POUR LA RETENTION ET LE MAINTIEN DE L'ACTIVITE DE MICRO-ORGANISMES DANS DES STRUCTURES PORTEUSES DE LADITE ACTIVITE, STRUCTURES RESULTANTES ET LEURS APPLICATIONS ANALYTIQUES ET BIOTECHNOLOGIQUES La présente invention porte sur un procédé pour la rétention et le maintien de l'activité de micro-organismes dans des structures porteuses de ladite activité, sur l'application de ce procédé pour effectuer des bioréactions d'intérêt industriel, ainsi qu'à des fins analytiques (électrodes microbiennes). La présente invention porte également sur les structures proprement dites portant l'activité de micro-organismes, ainsi que sur les bioréacteurs et électrodes microbiennes incorporant ces structures porteuses. On entend ici par "micro-organismes", tous les micro-organismes vivants, aussi bien procaryotes qu' eucaryotes, incluant notamment les bactéries. Dans la suite de la présente description, on utilise parfois aussi, dans la même signification, les termes "cellule" ou "cellulaire". Par ailleurs, on désigne par "bioréaction", l'ensemble des processus engendrés par l'activité métabolique des micro-organismes, et, notamment, des synthèses, dégradations, conversions, et autres.
La rétention de l'activité cellulaire à l'intérieur de systèmes facilement manipulables, souhaitable parce qu'en particulier, elle supprime la contamination des produits, pose, en effet, problème dans les bioréacteurs classiques (cellules libres) ou dans les bioréacteurs S cellules immobilisées, pour lesquels l'immobilisation est non immuable lorsque la population cellulaire augmente.
Lorsque les micro-organismes viables sont immobilisés dans un support permettant leur croissance, la population cellulaire interne augmente quand les micro-organismes sont mis en présence d'un substrat. On peut ainsi parvenir à un haut niveau d'activité enzymatique cellulaire ; en outre, il est bien établi que l'immobilisation assure une stabilisation dans le temps de l'activité cellulaire. Tel est le cas, par exemple, lorsque des micro-orqani smes sont piégés dans le réseau polymérique des polysaccharides d'origine naturelle : ce protocole, très largement pratiqué et exploité, possède le double intérêt de la simplicité et de ne pas entraîner de diminution notable de la viabilité microbienne. Cependant, les gels polysaccharidiques résistent mal à l'expansion interne de la bio-masse qu'ils renferment, lorsque cette dernière est mise en présence d'un substrat. Des traitements chimiques, comme la réticulation de l'agar par un agent pontant (glutaraldéhyde) peuvent améliorer la solidité du réseau polymérique, mais au détriment de l'activité cellulaire.
Dans le cas où les micro-organismes sont piégés dans des polymères gélifiés, habituellement utilisés à ces fins, (polysaccharides, en particulier), la prolifération dans le gel, source de relargage des micro-organismes, doit être prévenue par la rigidification dudit gel, sous l'action d'agents chimiques (exemple : agents pontants, comme le gl utaral déhyde), fortement inhibiteurs de l'activité cellulaire. En effet, cette activité, qui, comme indiqué ci-dessus, est produite par des organismes vivants, est trc-s facilement perturbable, conduisant alors à de mauvais rendements de la bioréaction.
En conclusion, il convient donc de pouvoir retenir les micro-organismes au sein d'une structure porteuse, sans relargage de ceux-ci dans le milieu contenant le substrat devant être métabolisë, et, en même temps, sans diminution ou altération de l'activité cellulaire.
Ce même problème se pose pour les électrodes microbiennes, dont on rappellera le principe général :
On immobilise un film bioréactif (micro-organismes) au contact de la surface sensible d'une électrode et on mesure un signal engendré par l'activité métabolique du film au contact d'un substrat ; l'intensité du signal est reliée à la concentration du substrat. Les électrodes microbiennes les mieux connues utilisent l'activité respiratoire des micro-organismes pour déterminer la concentration de divers substrats spécifiqups au métabolisme de l'espace microbienne employée ; les réponses sont ampérométriqués. D'autres électrodes font appel à une détection potentiomëtrique (mesure de la variation de pH, par exemple). Ainsi, S. Suzuki et I. Karube, dans "Immobilized
Microbial Cells", K. Venkatsubramanian ed., page 221, American Chemical Society, Washington, 1979, décrivent une électrode ampόrométrique pour le glucose, les bactéries étant i mmo b i l i s é e s dans une membrane de collagène. Un exemple d'électrode potentiométrique est donné par
G. A. Rechnitz et al., Science, 199 (1978) 440 : dans cette électrode décrite pour la glutamine, les bactéries sont immobilisées entre une membrane de dialyse et une membrane gaz-perméable. On peut s'interroger sur la stabilité dans le temps de tels biofilms, cette stabilité étant une condition impérative pour réaliser des électrodes 3 réponses étalonnables.
Dans la recherche d'une activité maximale des micro-organismes, en particulier pour obtenir des rendements excellents des bioréactions, deux exigences contradictoires doivent être remplies : il est, en effet, souhaitable de confiner les micro-organismes pour éviter la contamination des substrats et produits, mais ce confinement exerce un effet défavorable sur les vitesses de réaction, qui sont limitées par le transport des substrats et produits â travers la structure assurant le confinement.
La présente invention permet d'atteindre cet objectif et propose, à cet effet, de disposer les micro-organismes dans une phase délimitée par au moins une membrane de nature et de porosité adéquates, pour être perméable à tous substrats et produits, liquides ou gazeux, consommés ou excrétés durant l'activité cellulaire, lesdits micro-organismes étant retenus par ladite (ou lesdites) membrane(s). On réalise ainsi un véritable filtre â micro-organismes sans limiter l'activité de ceux-ci, car les membranes sont perméables aux substrats et aux produits. Des dispositifs utilisant des membranes semi-perméables, de porisité faible, ne conviendraient pas aux besoins de l'invention, car ces membranes limitent la capacité de passage des substrats. Selon l'invention, dans le cas où les micro-organismes sont immobilisés par piégeage dans un gel, la prolifération cellulaire dans le gel, dont on a indiqué qu'elle était source de relargage des micro-organismes, se heurte à la barrière "mécanique" créée par la membrane, et il n'est nullement besoin de faire appel aux agents chimiques de rigidification du gel.
La présente invention a donc d'abord pour objet un procédé pour la rétention et le maintien de l'activité de micro-organismes dans des structures porteuses de ladite activité, caractérisé par le fait qu'on réalise, de manière en soi connue, une phase contenant les micro-organismes et qu'on délimite ladite phase par au moins une paroi, ou zone de paroi, constituée par une membrane dont la porosité est juste suffisante pour retenir les micro-organismes, mais qui est perméable à tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant l'activité desdites micro-organismes, la phase comportant les micro-organismes étant constituée par une suspension de ces derniers dans un milieu liquide ou par un milieu solide ou gélifié dans lequel lesdits micro-organismes sont encapsulés.
La présente invention a également pour objet l'application du procédé qui vient d'être défini, d'une part à la réalisation d'une bioréaction selon laquelle un substrat est métabolisé par une activité de micro-organismes portée par une structure avec laquelle ledit substrat est mis en contact, et d'autre part, à la détermination de la concentration d'un substrat, suivant laquelle on met en présence une structure porteuse de micro-organismes, ledit substrat et une électrode de mesure, et on mesure un signal engendré par l'activité métabolique que ladite structure développe au contact dudit substrat, le signal mesuré étant exploité, pour en déduire, après étalonnage, la concentration dudit substrat. Selon l'invention, dans ces deux applications, on dispose le substrat - qui est soumis à la bioréaction, dans le premier cas (bioréacteurs) ou dont on recherche la concentration, dans le deuxième cas (électrodes microbiennes) - de l'autre côte d'au moins une paroi, eu zone de paroi, délimitant la phase contenant les micro-orqanis. ps, et constituée par une membrane dont la porosité est juste suffisante pour retenir les micro-organismes, mais qui est perméable à tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant l'activité desdits micro-organismes.
La présente invention a également pour objet une structure porteuse d'une activité de micro-organismes, destinée à être mise en contact avec une phase véhiculant des substrats et produits mis en jeu durant l'activité des micro-organismes, caractérisée par le fait que lesdits micro-organismes sont contenus dans une phase qui est délimitée par au moins une paroi, ou zone de paroi, qui sépare ladite phase de celle véhiculant lesdits substrats des produits, et qui est constituée par une membrane dont la porosité est juste suffisante pour retenir les micro-organismes, mais qui est perméable â tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant l'activité desdits micro-organismes. Conformément â la présente invention, la membrane présentera, en règle générale, une porosité comprise entre 0,2 et 1 micromètre, les valeurs les plus fortes étant préférées, ce qui s'explique compte tenu du problème que résout la présente invention et qui a été exposé ci-dessus. Conformément â un premier mode de réalisation de la structure selon l'invention, la membrane est une membrane souple, normalement perméable aux substrats et produits précités et imperméable aux micro-organismes, notamment une membrane du type de celles utilisées pour les filtrations microbiennes.
Conformément à un second mode de réalisation de la structure selon l'invention, la membrane est une membrane rigide, organique ou inorganique, rendue perméable aux substrats et produits précités, la porosité conférée par l'opération de perméabilisation étant trop faible pour permettre le passage des micro-organismes â travers ladite membrane. En particulier, une telle membrane peut être rendue perméable aux substrats et produits précités par bombardpment d'ions lourds.
On illustrera, dans ce qui suit, l'intérêt que peut présenter l'utilisation, qui doit être considérée comme nouvelle, de membranes rigides, notamment dans les bioréacteurs.
La phase contenant les micro-organismes de la structure selon la présente invention peut être une phase liquide, ou bien ce peut être une phase solide ou gélifiée, les micro-organismes étant immobilisés par piégeage au sein de ladite phase solide ou gélifiée. On rappellera que cette dernière est exempte d'agents chimiques de rigi dification.
Toutes les gëomëtries sont possibles pour les structures porteuses d'activité de micro-organismes selon la présente invention. On en décrira ci-après plusieurs exemples, mais il convient de préciser qu'ils sont donnés à titre purement indicatif.
Par ailleurs, dans le cas où l'activité des micro-organismes nécessite de l'énergie lumineuse, on choisira, comme matériau constituant la (ou les) armature(s) rigide(s) support(s) de membrane(s) et/ou la (ou les) membrane(s), un matériau transparent à la lumière.
La présente invention porte également sur des bioréacteurs et des électrodes microbiennes équipés d'une structure porteuse d'activité de micro-organismes, telle que celle qui vient d'être décrite.
Dans les bioréacteurs, la structure porteuse d'activité de micro-organismes selon la présente invention pourra être constituée par une phase renfermant lesdits micro-organismes, libres ou immobilisés au sein de cette phase, et confinés entre au moins une armature rigide et au moins une membrane souple ou rigide ; ou bien la structure porteuse de l'activité de micro-organismes pourra être constituée par une phase renfermant les micro-organismes, libres ou immobilisés au sein de cette phase, et confinés entre au moins une membrane rigide. Il n'est donc plus besoin dans ce deuxième cas d'armature rigide. En particulier, dans le cas des bioréacteurs du type tubulaire, la phase renfermant les micro-orαani srnes pourra être confinée entre deux membranes tubulaires coaxiales, ce mode de réalisation étant simple dans le cas où l'on utilise des membranes rigides. En outre, dans le cas de ces bioréacteurs tubulaires, lorsque les armatures et/ou les membranes sont réalisées en un matériau transparent â la lumière (activité de micro-organismes nécessitant de l'énergie lumineuse), on pourra prévoir des fibres optiques traversant l'espace délimité par la membrane interne.
En ce qui concerne les électrodes microbiennes, on citera celles dans lesquelles la structure porteuse de l'activité de micro-organismes est constituée par une phase gel renfermant les micro-organismes, avec laquelle l'électrode de mesure est directement en contact, et comporte une seule membrane qui se situe à l'interface de ladite phase gel et de la phase liquide contenant le substrat à analyser, à l'opposé de ladite électrode de mesure. Dans ce cas, la phase gel pourra renfermer en outre un agent indicateur réagissant à l'activité métabolique lors de la mise en contact du substrat avec l'électrode.
On peut également mentionner les électrodes microbiennes dans lesquelles la structure porteuse de l'activité de micro-organismes est constituée par une phase contenant les micro-organismes, confinée entre deux membranes, l'une, située â l'interface de ladite phase contenant les micro-organismes et une phase externe liquide contenant le substrat à analyser, et l'autre, située à l'interface de ladite phase contenant les micro-organismes et une phase interne liquide avec laquelle l'électrode de mesure est en contact et qui renferme un agent indicateur tel que défini ci-dessus.
Pour mieux faire comprendre l'objet de la présente invention, on décrira plus en détail ci-après, â titre indicatif et non limitatif, plusieurs modes de réalisation, en référence au dessin annexé. Sur ce dessin : les figures 1 à 5 représentent schématiqupment, en coupe verticale pour les figures 1 à 3, et en perspective, pour les figures 4 et 5, cing exemples donnés à titre purement illustratif de structures porteuses d'activité cellulaire selon l'invention, destinées à équiper des bioréacteurs, lesdites structures comportant au moins une membrane souple ; la figure 6 est une vue schématique, en perspective, d'une structure selon l'invention destinée ë équiper un bioréacteur tubulaire et comportant deux membranes rigides ; la figure 7 représente schématiquement un montage expérimental destiné à mesurer l'activité portée par une structure selon l'invention ; les figures 8 et 9 représentent des courbes obtenues avec le montage expérimental de la figure 4 ; et les figures 10 et 11 sont des schémas d'électrodes bactériennes, utilisant une structure porteuse d'activité de micro-organismes conforme à la présente invention.
Sur la figure 1, on a désigné par 1, dans son ensemble une structure porteuse d'activité de micro-organismes, qui comprend une membrane souple 2, et une armature rigide 3 constituée, d'une part, par une paroi de fond 4, disposée sensiblement parallèlement à la membrane 2, et, d'autre part, par deux parois latérales 5, 6, raccordées à la paroi de fond 4 et délimitant une ouverture 7 obturée par ladite membrane 2. La phase 8, renfermant les cellules, libres ou immobilisées, par exemple dans un gel (polysaccharides), est confinée entre l'armature rigide 3 et la membrane 2 .
Sur la figure 2, on a représenté une structure 1 a constituée par la combinaison de deux structures du type de celle de la figure 1, le fond 4^ étant commun. De la sorte, on multiplie par deux les surfaces d'échange. Sur la figure 3, on a représenté une autre réalisation de structure porteuse, celle-ci (1b) comportant une armature rigide 3b constituée par deux parois 5b, 6b, disposées sensiblement perpendiculairement l'une à l'autre, une membrane souple 2b venant obturer l'ouverture 7b délimitée par la bordure libre de ces parois. Cette structure porteuse convient particulièrement, lorsque le produit formé est gazeux, car on évite l'accumulation de gaz en partie haute (contre les parois 5 et 5a des variantes décrites précédemment).
Sur les figures 4 et 5, on a représente des structures 1c et 1d, respectivement parailélépipédique et cylindrique, la première comportant des membranes souples 2c rigidifiées par une armature dont les éléments sont désignés par 3c, et la seconde comportant une membrane souple 2d rigidifiée par les cales circulaires 3d espacées. La surface d'échange des structures 1c et 1d est excellente.
Les structures ci-dessus sont facilement manipulables; en particulier, les structures 1, 1a, et 1b, forment des barrettes aisément utilisables dans les bioréacteurs plans à circulation. De plus, dans le cas où les micro-organismes mis en oeuvre exercent une activité photosynthëtique, par exemple, photoproduction d'hydrogène et d'ammoniac par des bactéries et micro-algues, la partie rigide de la structure est avantageusement réalisée en un matériau transparent à la lumière, notamment en un matériau du type polyméthacrylate ou polycarbonate.
Une structure le est également représentée, en position de travail, sur la figure 7, où elle équipe une cellule de mesure 9 utilisée pour des tests d'activité respiratoire. Cette cellule 9 comporte une enceinte thermostatée 10, dans la paroi supérieure de laquelle est disposée une électrode â pO2 11, et qui renferme un milieu de culture 12, saturé initialement en O2 dissous. Ce milieu 12 est susceptible d'être agité en 13.
La structure 1e est rapportée sur la paroi latérale de ladite enceinte 10, laquelle comporte une ouverture 7e obturée par la membrane 2e. La paroi latérale 5e consiste en une cale cylindrique délimitant la phase 8e, avec la paroi de fond 4e.
La structure 1e est maintenue contre l'enceinte 10, à l'aide de vis de serrage 14, traversant la paroi 4e et la cale 5e . L'étanchéité entre la paroi 4e et la cale 5e est assurée par le joint torique 15, et l'étanchéité entre la cale 5e et l'enceinte 10 est assurée par le joint torique 16.
Dans ce cas, les micro-organismes sont des bactéries
( Escherichia coli) qui sont immobilisées par piégeage dans un gel d'agar, coulé sous la forme d'une phase plene épaisse, cette phase étant constituée d'environ 4cm3 d'une solution de 0,21 g d'agar + 0,5 cm3 de milieu de culture +
0,7 cm3 de suspension bactérienne (9 x 109 bactéries), sa surface étant d environ 3 cm2.
Dans ce montage, la membrane souple 2e est une membrane de 0,22 micromètre en esters mixtes de cellulose.
On mesure l'activité respiratoire de cette structure à l'aide de l'électrode à oxygène 11. L'index d'activité respiratoire mesuré est le temps de consommation de l'oxygène dissous dans le milieu de culture, c'est-à-dire, le temps nécessaire à la disparition de cet oxygène dissous (figure 8). Après chaque mesure, la structure est. mise au contact du milieu de culture sans glucose, pendant environ 12 heures. La figure 9 représente les variations de l'index d'activité respiratoire en fonction de l'âge de la structure : on s'apercoit que l'activité augmente jusqu'à une valeur maximale, puis diminue pour se stabiliser à un niveau satisfaisant. Les présents inventeurs ont vérifié que cette activité stabilisée se maintient chez une structure âgée de 800 heures (correspondant à environ 400 heures de fonctionnement).
La phase initiale d'augmentation de l'activité métabolique correspond à la multiplication des micro-organismes dans la structure lorsque cette dernière est au contact de glucose. Lorsque la concentration bactérienne dans le gel devient élevée, la vitesse de diffusion du substrat diminue, la diffusion du glucose limite alors l'activité de la structure, qui diminue. Le point essentiel de cette expérimentation est la mise en évidence d'une activité rémanente correspondant à un état d'équilibre entre phénomènes contradictoires diffusion/croissance.
A la fin de chaque essai respiratoire, on a mesuré la densité optique du milieu de culture, afin de révéler la présence éventuelle de micro-organismes qui se seraient échappés de la structure : dans tous les cas, la densité optique était la même qu'initialement, alors que des essais effectués sur une membrane d'agar, non limitée par une membrane souple du type de la membrane 2e, ont témoigné d'un relargage important de cellules dans le milieu. Sur la figure 6, est représentée une structure 1f constituée par deux membranes 2f, 2'f, cylindriques et coaxiales. On constitue ainsi un piège tubulaire pour une phase 8f renfermant des micro-organismes. L'originalité de cette structure 1f est que les membranes 2f, 2'f sont des membranes rigides que l'on a perméabilisées aux substrats et produits, en leur conférant toutefois une porosité trop faible pour permettre le passage des cellules. Une telle perméabilisation peut être réalisée par tous moyens. De façon générale, pour augmenter la surface d'échange, la perméabilisation peut être effectuée sur l'ensemble de la structure. Celle-ci est particulièrement bien adaptée pour être utilisée dans un biorëacteur tubulaire. Sur cette figure 6, on a noté par les flèches respectivement F et F', les sens de circulation possibles respectivement externe et interne du substrat.
On pourrait, de la même façon, créer toute autre configuration, par exemple parailélépipédique, en appliquant le même principe.
Par ailleurs, également d'une manière générale, dans la cas où l'activité des micro-organismes nécessite de l'énergie lumineuse (métabolisme photosynthétique), les matériaux utilisés pour les armatures et/ou les membranes, seront transparents â la lumière. Dans le cas d'un réacteur tubulaire, le rendement maximum sera obtenu en éclairant simultanément l'extérieur et l'intérieur (axe central) de ce réacteur. Dans le cas du mode de réalisation de la figure 6, un procédé particulièrement élégant d'éclairage de la structure lf consistera à introduire dans l'espace cylindrique délimité par la membrane intérieure 2f, des fibres optiques, de façon à restituer la lumière sur toute la longueur de la structure, la source lumineuse pouvant alors être naturelle (cas pratique des biophotorëacteurs). Sur la figure 10, on a représenté une électrode bactérienne ou bio-capteur, de forme compacte utilisant une structure 1g selon l'invention porteuse de micro-organismes. Dans cet exemple, la phase 8g est un gel contenant des bactéries et de l'acide lipoïque (agent indicateur). La membrane microporeuse 2g se situe à l'interface du gel et de la phase liquide contenant un substrat du métabolisme bactérien. Lorsque l'électrode bactérienne est mise en contact avec un substrat, les micro-organismes immobilisés réduisent l'acide lipoïque, dont la forme réduite est détectée par l'électrode d'or 17 qui voit son potentiel, par rapport à une référence, baisser sensiblement. Ce signal potentiomëtrique est exploitable (temps nécessaire à l'apparition d'un signal donné ou intensité du signal) pour déterminer, après étalonnage, la concentration du substrat de l'échantillon liquide.
Avec cette structure, la réponse est plus fiable et plus rapide que si l'acide lipoïque était en milieu liquide. On peut particulièrement concevoir tout autre type d'électrode microbienne exploitant, les structures porteuses de micro-organismes, comme, par exemple, des électrodes basées sur des mesures de consommation d'oxygène par les micro-organismes immobilisés. La phase située entre l'électrode et la membrane micro-poreuse peut être liquide, ou bien solide (selon l'exemple qui vient d'être décrit). Dans le cas où cette phase interne est liquide, la structure porteuse doit cependant comporter deux membranes séparant la phase solide (active) des phases liquides interne (vers l'électrode) et externe (assurant l'interface avec l'échantillon liquide contenant le substrat).
On a représenté, sur la figure 11, une structure d'électrode microbienne comportant ainsi, corrme structure porteuse 1h, une phase active 8h renfermant les bactéries, confinée entre deux membranes 2h (électrode: 17; phase interne: 18; phase externe: 19).
On peut aussi utiliser une telle structure dans une électrode potentiométrique mesurant la réduction de l'acide lipo'ique par la structure 1h, lorsque cette dernière est mise en présence d'un substrat. Le principe de fonctionnement est le même que lorsque la phase active gélifiée est en contact direct avec l'électrode (figure 10). On peut également utiliser ces structures 2g ou 2h par exemple dans des électrodes ampérométriques basées sur la consommation d'oxygène.
On notera que la présente invention apporte une solution concrète au problème du maintien de l'activité de micro-organismes, par qxemple dans des bioréacteurs, lesdits micro-organismes étant retenus par la (ou les) membrane(s), en réalisant ainsi un véritable filtre à micro-organismes sans limiter l'activité de ceux-ci. Le problème résolu par l'invention n'est pas la séparation de produits à travers une membrane, mais la rétention des micro-organismes dans des structures compactes comprenant une membrane, lesdites structures étant constituées une fois pour toutes pour porter les micro-organismes. Egalement, l'invention procure des électrodes comprenant l'association, à une membrane retenant les micro-organismes, de la phase contenant ceux-ci, libres ou immobilisés dans un gel.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour la rétention et le maintien de l'activité de micro-organismes dans des structures porteuses de ladite activité, caractérisé par le fait qu'on réalise, de manière en soi connue, une phase (8 à 8h) contenant les micro-organismes et qu'on délimite ladite phase (8 à 8h) par au moins une paroi, ou zone de paroi, constituée par une membrane (2 à 2h) dont la porosité est juste suffisante pour retenir les micro-organismes, mais qui est perméable à tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant l'activité desdits micro-organismes, la phase comportant les micro-organismes étant constituée par une suspension de ces derniers dans un milieu liquide ou par un milieu solide ou gélifié dans lequel lesdits micro-organismes sont encapsulés.
2. Application du procédé tel que défini à la revendication 1, à la réalisation d'une bioréaction, selon laquelle un substrat est métabolisé par une ativité de micro-organismes portée par une structure avec laquelle ledit substrat est mis en contact, caractérisée par le fait qu'on dispose le substrat, qui esst soumis à la bioréaction, de l'autre côté d'au moins une paroi, ou zone de paroi, délimitant la phase (8 à 8h) contenant les micro-organismes, et constituée par une membrane (2 à 2h) dont la porosité est juste suffisante pour retenir les micro-organismes, mais qui est perméable à tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant l'activité desdits micro-organismes.
3. Application du procédé tel que défini à la revendication l1 à la détermination de la concentration d'un substrat, suivant laquelle on met en présence une structure porteuse de micro-organismes, ledit substrat et une électrode de mesure, et on mesure un signal engendré par l'activité métabolique que ladite structure développe au contact dudit substrat, le signal mesuré étant exploité, pour en déduire, après étalonnage, la concentration dudit substrat, caractérisée par le fait qu'on dispose le substrat, dont on recherche la concentration, de l'autre côté d'au moins une paroi, ou zone de paroi, délimitant la phase (8 à 8h contenant les micro-organismes, et constituée par une membrane (2 à 2h) dont la porosité est juste suffisante pour retenir les micro-organismes, mais qui est perméable à tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant l'activité desdits micro-organismes.
4. - Structure porteuse d'une activité de micro-organismes, destinée à être mise en contact avec une phase véhiculant des substrats et produits mis en jeu durant l'activité des micro-organismes, caractérisée par le fait que lesdits micro-organismes sont contenus dans une phase (8 à 8h) qui est délimitée par au moins une paroi, ou zone de paroi, qui sépare ladite phase de celle véhiculant lesdits substrats et produits, et qui est constituée par une membrane (2 â 2h) dont la porosité est juste suffisante pour retenir les micro-organismes, mais qui ert perméable â tous substrats ou produits consommés ou excrétés durant l'activité desdits micro-organismes.
5. - Structure selon la revendication 4, caractérisée par le fait que la membrane (2 â 2h) présente une porosité comprise entre 0,2 et 1 micromètre.
6. - Structure selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisée par le fait que la membrane est une membrane souple, normalement perméable aux substrats et produits, et imperméable aux micro-organismes, notamment du type de celles utilisées pour les filtrations microbiennes.
7. - Structure selon l'une des revendications 4 et 5 , caractérisée par le fait que la membrane est une membrane rigide, organique ou inorganique, rendue perméable aux substrats et produits, la porosité conférée par l'opération de perméabilisation étant trop faible pour permettre le passage des micro-organismes â travers la membrane.
8. - Structure selon la revendication 7, caractérisée par le fait que la membrane a été rendue perméable aux substrats et produits par bombardement d'ions lourds.
9. - Structure selon l'une des revendication 4 à 8, caractérisée par le fait que la phase contenant les micro-organismes est une phase liquide.
10. - Structure selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisée par le fait que la phase contenant les micro-organismes est une phase solide ou qélifiée, les micro-organismes étant immobilisés par piégeage au sein de ladite phase solide ou gélifiée.
11. - Structure selon l'une des revendications 4 à 10, utilisable dans le cas où l'activité des micro-organismes nécessite de l'énergie lumineuse, caractérisée par le fait que le matériau utilisé pour constituer la (ou les) armature(s) rigide(s) support(s) de membrane(s) et/ou la (ou les) membrane(s) (2 à 2h) est un matériau transparent à la
1 umière.
12. - Bioréacteur, caractérisé par le fait qu'il est équipé d'une structure porteuse d'activité de micro-organismes, telle que définie â l'une des revendications 4 à 11.
13. - Bioréacteur selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la structure porteuse d'activité de micro-organismes est constituée par une phase renfermant les micro-organismes, libres ou immobilisés au sein de cette phase, et confinée entre au moins une armature rigide et au moins une membrane souple ou rigide.
14. - Bioréacteur selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la structure porteuse d'activité de micro-organismes est constituée par une phase renfermant les micro-organismes, libres ou immobilisés au sein de cette phase, et confinée entre au moins une membrane rigide.
15. - Bioréacteur selon l'une des revendications 13 et 14, du type biorëacteur tubulaire, caractérisé par le fait que la phase renfermant les micro-organismes est confinée entre deux membranes tubulaires coaxiales.
16. - Biorëacteur selon la revendication 15, dans lequel les armatures et/ou les membranes sont réalisées en un matériau transparent à la lumière, caractérisé par le fait qu'il est doté de fibres optiques traversant l'espace, délimité par la membrane interne.
17. - Electrode microbienne, caractérisée par le fait qu'elle est équipée d'une structure porteuse d'activité de micro-organismes, telle que définie à l'une des revendications 4 à 11.
18. - Electrode microbienne selon la revendication 17, dans laquelle la structure (1g) porteuse de l'activité de micro-organismes est constituée par une phase gel (8g) renfermant les micro-organismes avec laquelle l'électrode de mesure (17) est directement en contact, et comporte une seule membrane (2g) qui se situe à l'interface de ladite phase gel (8g) et de la phase liquide contenant le substrat à analyser, à l'opposé de ladite électrode de mesure (17).
19. - Electrode microbienne selon la revendication 18, caractérisée par le fait que la phase gel (8g) renferme en outre, un agent indicateur réagissant à l'activité métabolique lors de la mise en contact du substrat avec l'électrode (17).
20. - Electrode microbienne selon la revendication 17, dans laquelle la structure (1h) porteuse de l'activité de micro-organismes est constituée par une phase (8h) contenant les micro-organismes confinée entre deux membranes (2h), l'une, située 3 l'interface de ladite phase (8h) contenant les micro-organismes et une phase externe liquide (19) contenant le substrat à analyser, et l'autre située à l'interface de ladite phase (8h) contenant les micro-organismes et une phase interne liquide (18) avec laquelle l'électrode de mesure (17) est en contact et qui renferme un agent indicateur tel que défini à la revendication 19.
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