FR2739561A1 - Utilisation d'un vecteur assurant l'expression ou l'augmentation transitoire de l'activite bc1-2 - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un vecteur assurant l'expression de bcl-2, ou l'augmentation transitoire de l'activité Bcl-2 ou d'une protéine du type Bcl-2 dans un ou plusieurs organes, pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement ou la prévention d'une défaillance aiguë d'un ou plusieurs organes impliquant un processus apoptotique, par inhibition totale ou partielle du signal apoptotique.

Description

La présente invention concerne un nouveau médicament utile plus particulièrement dans le traitement et la prévention de processus apoptotiques impliqués dans la pathogénie des défaillances aiguës d'organes.

L'apoptose, appelée aussi "mort cellulaire programmée" ou "suicide cellulaire", est aujourd'hui considérée comme un mécanisme essentiel pour le développement harmonieux des organismes multicellulaires. Il joue, en particulier, un rôle important dans le développement embryonnaire et lors de l'organogénèse de systèmes tels que le système nerveux ou le système immunitaire.

L'apoptose est un processus physiologique qui permet l'élimination d'un nombre important de cellules de façon programmée par le biais de systèmes de régulation complexes, notamment des signaux activateurs ou inhibiteurs qui proviennent d'autres cellules ou de la cellule elle-meme. Ce processus permet d'éliminer certaines cellules "malades", lesquelles sont "acculées" au suicide, et évite la prolifération cellulaire lorsque celle-ci n'est pas souhaitable.

Alors que l'on a cru longtemps que les cellules pouvaient être détruites directement par certains effecteurs immunitaires, il apparait que ces effecteurs sont, en fait, des messagers transmettant aux cellules l'ordre de se suicider. Ce mécanisme est donc essentiel dans la défense de l'organisme contre le cancer et les infections (1).

Parmi les différentes voies d'apoptose, I'une présente un intérêt plus particulier dans le cadre de la présente invention ; il s'agit de la voie dite "à médiation Fas"(2). L'antigène Fas (APO-1/CD 95), qui appartient à la superfamille des récepteurs de type TNF, est une protéine transmembranaire exprimée dans une grande variété de tissus, notamment le foie, le coeur, les poumons, les ovaires, les reins et le thymus. L'antigène
Fas induit l'apoptose dans des cellules cibles sensibles lorsqu'il se lie à son ligand physiologique FasL (3), ou à un anticorps agoniste anti-Fas (4,5). FasL est une protéine membranaire reliée au TNF de type Il, dont l'expression est limitée aux cellules immuno-compétentes ( Iyrnphocytes T cytotoxiques matures activés CTL, cellules NK).

Les progrès récents dans la caractérisation du programme d'apoptose médiée par Fas ont montré l'importance de cette voie, notamment dans la mise en route des réactions immunitaires et leurs régulations, ainsi que dans la pathogénie de certaines désordres auto-immuns.

Ainsi, en plus de la lyse cellulaire à médiation perforine, I'apoptose médiée par Fas parait être une des deux voies majeures de la cytotoxicité des cellules T (6,7). La caractérisation de mutations spontanées de l'antigène Fas ou de FasL chez les souris (8,9) et les humains (10,11) conduisant à des syndromes auto-immuns et lymphoprolifératifs supporte le rôle critique de l'interaction moléculaire Fas/FasL dans l'homéostasie du système immunitaire.

Le mécanisme intracellulaire convoyant le message proapoptotique de Fas commence à être mis en évidence. Fas présente un domaine intracellulaire appelé "domaine de mort" qui transduit son signal (12). Les effecteurs de transduction du signal en aval de Fas ont également été identifiés, et paraissent impliquer l'activation de cystéine-protéases de la famille ICE (13,14). En revanche, on sait assez peu de choses sur la capacité et le mode d'action de certains suppresseurs de la mort cellulaire tels que les protéines Bcl-2 ou les membres de la famille Bcl-2 à interférer avec le signal de mort à médiation Fas.Toutefois, I'intervention de Bcl-2 sur le message de mort médié par Fas a été suggéré dans un certain nombre de modèles expérimentaux in vitro (15,16,17)
Le produit du gène bcl-2 est une protéine associée aux membranes, présente dans les mitochondries, le réticulum endoplasmique lisse, et dans l'enveloppe cellulaire (18). On a montré qu'il pouvait prévenir l'apoptose induite par différents stimuli de mort comprenant la suppression en facteurs de croissance, les radiations ou la chimiothérapie cytotoxique (19).

Dans le cadre de la présente invention, on a mis en évidence l'importance que pouvait présenter pour le traitement d'affections aiguës, et notamment des défaillances aiguës d'organes, l'expression ou la surexpression à titre transitoire de bcl-2 ou de gènes codant pour des protéines de type Bcl-2.

Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'un vecteur assurant l'expression de bcl-2 ou l'augmentation transitoire de l'activité Bcl-2 ou d'une protéine du type Bcl-2 dans un ou plusieurs organes pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement ou la prévention d'une défaillance aiguë d'un ou plusieurs organes impliquant un processus apoptotique, par inhibition totale ou partielle d'un signal apoptotique.

Bien que la présente invention puisse être mise en oeuvre dans le cadre de processus apoptotiques très variés, I'objet principal de la présente invention est le traitement ou la prévention d'une défaillance aiguë d'organes dans lequel le processus apoptotique mis en oeuvre est à médiation Fas.

Comme cela sera démontré ci-après, l'expression de bcl-2 ou l'augmentation transitoire de l'activité de Bcl-2 bloque le message d'apoptose et permet aux cellules de dépasser la phase aiguë de l'affection.

Il est important de bien remarquer que, dans le cadre de la présente invention, I'expression ou l'augmentation transitoire de l'activité
Bcl-2 ou d'une protéine de type Bcl-2 peut aussi bien être obtenue, soit en augmentant la production de Bcl-2 ou de la protéine de type Bcl-2, qui sera en général appelée ici par simplification "Bcl-2", soit en induisant une augmentation de l'activité intrinsèque de ladite protéine par d'autres moyens. Dans ce cas, le vecteur sera conçu pour surexprimer la protéine
Bcl-2 ou bien un variant de Bc1-2 ou une forme particulière de Bc1-2 plus active (variant délété ou variant par mutation).

Niais, I'augmentation de l'activité de Bcl-2 peut être obtenue par un vecteur dont l'expression conduira, en aval ou en amont de la production de Bcl-2, à l'augmentation de l'expression de Bcl-2 ou au contraire, à l'augmentation d'une protéine favorisant la production de Bcl-2 ou bien, au contraire, en diminuant la production d'une protéine bloquant la production de Bcl-2 ou ayant une activité inhibant l'activité de Bcl-2.

En particulier, dans ce cadre, on pourra utiliser le système complet de Bcl-2 mettant en oeuvre Bax qui favorise l'apoptose, au contraire de Bcl-2, ainsi que les transcrits par épissage alternatif de bcl-2, bcl-xL et bcl-xS. D'autres protéines de la famille de bcl-2 doivent également être prises en compte dans la présente invention; il s'agit notamment des gènes apparentés, bad et bak, dont les produits interviennent également dans la voie d'apoptose, par des stratégies antisens par exemple.

Diverses constructions de ce type seront évoquées dans ce qui va suivre. Lorsque la présente invention impliquera la diminution de la production d'un inhibiteur, le vecteur pourra être constitué par un vecteur anti-sens bloquant l'expression dudit inhibiteur.

Il est important de noter que l'augmentation de l'activité de
Bcl-2 qui se traduira, comme cela sera démontré ci-après, par un bloquage de la voie Fas d'apoptose, doit être transitoire. En effet, il faut rappeler que le gène bcl-2 fut découvert il y a une dizaine d'années dans un lymphome humain. Dans ce type de lymphome, la production massive de Bcl-2 est dérégulée, et dans ces conditions, inhibe le programme d'apoptose. Ceci conduit à une survie prolongée de cellules ayant acquis un phénotype tumoral. La protéine Bcl-2 n'est donc pas en elle-même oncogène, mais elle peut participer à l'amplification d'un processus oncogénique.C'est pourquoi il est nécessaire de prévoir la surexpression de bcl-2 dans des périodes aiguës, permettant aux cellules de résister à une atteinte apoptotique et à l'organe agressé de survivre, mais de pouvoir supprimer assez rapidement la production de Bcl-2 lorsque la phase aiguë est passée, afin de ne pas voir se développer des processus de cancérisation.

C'est pourquoi il est important que l'expression, si possible massive, soit ciblée à l'organe menacé, et que l'expression de bcl-2 cesse dès la disparition de l'agression initiale.

Parmi les défaillances aiguës qui peuvent être traitées par l'utilisation du vecteur selon la présente invention, il faut citer plus particulièrement les défaillances aiguës d'organes incluant les hépatites fulminantes, les néphropathies aiguës, les détresses respiratoires aiguës, les cardiopathies aiguës, ainsi que les dysfonctions aiguës de greffons ou de transplants.

Ces défaillances peuvent être secondaires aux développements de processus apoptotiques observés lors d'agressions toxiques, infectieuses, ischémiques (ou lors d'ischémie-reperfusion) et immunologiques, telles que dans les pathologies auto-immunes ou les rejets de greffes.

De façon préférentielle, le vecteur s exprimera majoritairement dans le ou les organes sujets à ladite défaillance aiguë.

Toutefois, comme cela a été indiqué précédemment, l'expression de la protéine en cause sera de préférence importante mais transitoire.

Parmi les vecteurs utilisables pour l'expression transitoire de Bcl-2, il faut citer plus particulièrement les vecteurs viraux ainsi que les vecteurs à acides nucléiques nus.

Afin d'obtenir une expression transitoire, on préférera choisir les vecteurs viraux ou les systèmes d'expression virale non intégratifs.

De façon générale, ce type de vecteur permettant l'expression de protéines est connu, il s'agit en particulier des vecteurs adénoviraux, même si d'autres vecteurs viraux sont utilisables.

Lorsque l'augmentation d'activité est due à l'expression de la protéine Bcl-2 ou d'une protéine de type Bcl-2 ("Bcl-2 like"), on prévoit d'assurer une spécificité tissulaire d'expression par l'utilisation de promoteurs tissus spécifiques. Il est possible, en particulier, de prévoir d'utiliser un système promoteur qui provienne d'une protéine, enzyme par exemple, exprimée essentiellement dans certains tissus. C'est le cas de la L
Pyruvate Kinase, dans les constructions qui vont suivre, ou de l'Aldolase B, enzymes du métabolisme glucidique essentiellement exprimées dans le foie, mais il est possible de prévoir l'utilisation d'autres éléments d'expression tissus spécifiques.Dans un mode de réalisation particulier, 1'ADNc du gène bcl-2 est placé sous contrôle et en aval des séquences régulatrices de la L
PK, ainsi que des premiers exon et intron et tout ou partie du second exon de la L-PK. Dans une autre réalisation, I'enhancer de l'Aldolase B, et les séquences régulatrices, les premiers exon et intron et tout ou partie du second exon de la L-PK sont insérés en amont de l'ADNc du gène bcl-2. Ces constructions ont montré une forte spécificité ct expression dans le foie, ainsi qu'une capacité à protéger d'un processus apoptotique médié par Fas pour la première citée.

Il est également possible de prévoir l'utilisation de virus ayant une spécificité tissulaire en eux-memes, par exemple des virus de type hépatotrope.

Il est également possible de prévoir une administration ciblée desdits vecteurs par l'emploi d'un mode d'administration approprié, injection dans le foie (directement dans un greffon ou par voie portale), ou voie aérosol pour l'administration dans les poumons par exemple.

On peut également prévoir l'utilisation de cellules réimplantées après modification ex vivo, cc sera Ic cas notamment pour les greffes ou les implants.

Afin d'assurer l'expression transitoire de la protéine Bcl-2 ou de ses analogues, il est intéressant d'utiliser des vecteurs qui permettront une expression massive, et qui pourront être, soit rapidement dilués lors de la croissance cellulaire, comme dans le cas des adénovirus, ou bien dont la multiplication sera rapidement interrompue, afin que l'expression de la protéine tombe en dessous d'un seuil d'efficacité. On peut ainsi prévoir que l'expression de ladite protéine soit soumise à un système de régulation.

Parmi les systèmes de régulation envisagables, on peut prévoir un feedback négatif contrôlé par la surexpression de bcl-2 ou bien un contrôle de l'expression positive soumise à la présence de l'agent pathogène quel qu'il soit, I'expression de bcl-2 étant activée par la présence d'une protéine virale spécifique ou d'un agent toxique provoquant l'activation des séquences de contrôle de l'expression de bcl-2, laquelle expression est ensuite inhibée en l'absence dudit agent pathogène ou de son sous produit et/ou dans le cas où cet agent pathogène tombe en dessous d'un certain seuil.

En tout état de cause, on préférera des systèmes dans lesquels, au bout d'un temps déterminé, les gènes assurant l'expression de la protéine
Bcl-2 seront détruits ou du moins suffisamment altérés pour ne plus pouvoir jouer leur rôle anti-apoptotique.

Cette expression transitoire pour le traitement des pathologies aiguës constitue l'une des caractéristiques essentielles des vecteurs selon l'invention par rapport aux méthodes décrites dans la technique antérieure dans lesquelles une expression de bcl-2 au long cours était envisagée.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans les exemples ci-après. Les exemples sont décrits en se référant aux figures suivantes - Figure 1
Représentation schématique des constructions de PK-bcl-2 transréniq ues
a : Construction transgénique - b : Produits du transgène.

Le transgène code deux protéines qui sont traduites à partir du codon
d'initiation ATG indiqué dans le premicr et Ic second exon du gène L
PK. Le motif du signal d'ancrage Bcl-2, responsable de la localisation
membranaire, est représenté par des hachures.

Figure 2 E,xDression du transgène a: L'ARNm PK-Bcl-2 de 1 kb est détecté comme cela est attendu dans le foie, les reins et les intestins par Northern blot. La bande supérieure visualisée dans les intestins correspond à la forme non épissée.

b : Deux bandes des deux protéines attendues sont observées dans le même tissu par Western blot.

Les protéines sont détectées sélectivement dans la fraction membranaire du foie. Comme contrôle, la protéine humaine Bcl-2 est détectée dans les cellules de lymphome B folliculaire t (14:18) à 26 kDa c : Bcl-2 immunocolorée obtenue avec un anticorps de lapin anti-Bcl2 révèle le marquage cytoplasmique des hépatocytes (x 500). L'aspect granulaire observé suggère une association avec les organelles intracellulaires.

d : Aucune coloration immunologique n'est observée avec les mêmes anticorps dans les foies des contrôles non transgéniques (x 500).

Figure 3 Expression de l'antigène Fas dans les souris transéniaues a : ARNm de Fas révélé par Northern blot quantitativement similaire entre le contrôle et les souris transgéniques.

b : L'antigène Fas est mis en évidence par Western blot dans les fractions membranaires des foies, dans les contrôles comme dans les souris transgéniques.

c : L'immunocoloration Fas des foies de souris transgéniques PK-Bcl-2 est réalisée avec un anticorps de lapin anti-Fas et révèle un marquage diffus des membranes d'hépatocytes (x 640).

Figure 4
Effets Drotecteurs de la protéine PK-Rcl-2 dans une atteinte hépatique apoptotique létale et aiguë induite par un agoniste anti-Fas, l'anticorps 102 28 parmi les 30 souris transgéniques PK-bcl-2 survivent (i), tandis que 10 sur 10 des souris non transgéniques (3) meurent dans les 40 heures après l'injection intraveineuse de 10 mcg de l'anticorps J02 (p < 0,001).

figure 5
CouDes histologiques de foie des contrôles (a. b. c) et des souris
transréniques (d. e. f.) traitées par des anticorps anti-Fas
La veine centrilobulaire et l'espace porte sont indiqués.

a : début de l'apoptose dans la zone médiolobulaire commençant à
90 minutes et supérieure à 60%.

b Aspects typiques des évènements apoptotiques condensation
marquée de chromatine et de cytoplasme, rétrécissement cellulaire,
corps (Councilman) acidophiles et fragmentation des cellules
(flèches épaisses) dans les corps extracellulaires accumulés dans les
sinusoïdes (Masson, x 500).

c : Nécrose apoptotique massive, pan lobulaire et multilobulaire
supérieure à 90% et péliose à 6 heures conduisant à 100% de mortalité
(HES x 250).

d : Absence d'atteinte hépatique à 90 minutes (Masson x 250).

e: Apoptose focale à 3 heures inférieure à 10 % (casson x 250).

f : Cellules inflammatoires (flèches fines) et nombreuses mitoses
(triangle noir) entourant une nécrose focale suggérant l'initiation
d'un processus de régénération à 48 heures (HES x 250 et x 780).

figure 6
AST. ALT. mesure des sérums (movenne + SD) et score histolonisue
d'apoptose (% t SD) sur les contrôles (2) et sur les transnéniaues
traitées (i)
Une cytolyse sévère et aiguë (appréciée par le dosage des
transaminases sériques et un score évaluant l'intensité du processus
apoptotique en histologie) est observée pour les souris contrôles,
tandis qu'une atteinte moins sévère et différée est enregistrée chez
les souris transgéniques (P < 0,05 par rapport au contrôle).

Méthodes
Génération de souris transnéniaues
Un fragment de 0,9 kb correspondant à l'ADNc humain de bcl-2 a est sous-cloné dans un vecteur contenant la région de régulation du gène de la L-pyruvate kinase de rat (L-PK), ces régions s'étendant depuis la position -5700 bp dans la région flanquante 5' jusqu'à la position 712 bp dans le second exon. La séquence codant bcl-2 a est insérée en position +712 bp dans le plasmide précédent après mutation du codon d'initiation ATG (ATG en ACG), ce qui conduit à la synthèse de deux protéines hybrides PK
Bcl-2, dont le début de traduction est dans le premier et le second exon du gène de la L-PK.

Les souris transgéniques sont identifiées par analyse Southern blot effectuée par extraction de l'ADN des queues de souris vieilles de 2 semaine, et digéré par les enzymes de restriction appropriées. Le Southern blot est hybridé avec le fragment de 0,9 kb contenant les séquences codant bcl-2 a radiomarquées avec (a P32)dCTP par marquage aléatoire. Le nombre de copie du transgène est déterminé par densitométrie, et comparé avec des quantités déterminées d'ADN injecté dans le même gel.

Protocole expérimental
84 souris transgéniques hétérozygotes et souris de la même fratrie non transgéniques (CBA/B6D2), âgées de 2 à 13 mois sont utilisées dans cette étude. Les animaux reçoivent une injection intraveineuse de 10 llg d'anticorps anti-Fas monoclonal de hamster J02 dans 100 crl de solution saline stérile. 30 animaux transgéniques et 10 contrôles sont analysés pour déterminer le pourcentage de mortalité. Les foies, et les échantillons sanguins sont collectés à partir de 15 contrôles et de 28 animaux transgéniques, lesquels sont sacrifiés toutes les 30 minutes entre 1 heure et 6 heures et à 12, 24 et 48 heures (pour les animaux PK-Bcl-2 seulement) après l'injection d'anticorps.

Northern blot
L'ARN total est extrait à partir de tissus homogénisés en utilisant la procédure au thiocyanate de guanidium. 20 Fg de l'ARN total sont fractionnés dans un gel de 1,5% (poids/volume) d'agarose-formaldéhyde, transférés sur des membranes de nylon Hybond-N+ puis testés avec le fragment 0,9 kb contenant les séquences codantes bcl-2 a ou avec le fragment 1,6 kb contenant la séquence codant pour l'antigène Fas de souris, radiomarqués avec (a P32)dCTP par marquage aléatoire. Les membranes sont lavées dans 2 x SSC avec 0,1% (poids/volume) SDS pour 15 minutes à température ambiante et 2 fois dans 1 x SSC avec 0,1% SDS pendant 15 minutes à 45"C.

Western blot
Pour la préparation des membranes, les foies sont homogénisés dans 50 mM de Tris-CHI pH 7,5 tampon d'homogénéisation, contenant 0,25 M de sucrose, 0,2 mNl de fluorure de phénylméthylsulfonyle et 0,5 Fg/ml de leupeptine, et mélangés pendant 15 minutes à 12 000 g. Le surnageant est homogénisé de nouveau pendant 60 minutes à 100 000 g. Les culots microsomals et autres tissus sont mélangés 1/1 avec un tampon d'échantillon Laemmli 2x, mis à bouillir 3 minutes et homogénisés pendant 10 minutes à 10 000 g. Les surnageants sont résolus dans 12% (poids/volume)
SDS-gel de polyacrylamide (Bio-Rad) et transférés sur des filtres de nitrocellulose.Les membranes sont bloquées avec 5% (poids/volume) de poudre de lait écrémé dans un tampon salin Tris avec 0,05% (volume/volume) Tween 20 (Sigma). La protéine hybride PK-Bcl-2 est détectée en utilisant un anticorps primaire de lapin anti-Bcl-2 (Dako), la protéine Fas étant détectée en utilisant un anticorps primaire de lapin anti
Fas (Pharmingen). L'immunomarquage est effectué avec la peroxydase couplée à un IgG anti-lapin et amplifié par chimie luminescence ECL (Amersham).

Examen histologique et détection immunohistochimigue de Bcl-2 et de l'antigène Fas
Les foies sont excisés et les tissus sont immédiatement transférés dans un fixateur de Bouin et mélange formaline-acide acétiquealcool. Les échantillons incorporés dans le paraplaste selon la procédure habituelle sont coupés à 3 llm et colorés avec HES et trichrome basson. Les sections de foies obtenues à partir de différents lobes sont testées pour la sévérité du processus apoptotique par un observateur qui ne sait pas à quel groupe appartient la souris traitée.En utilisant la microscopie en lumièrc normale (x 500), 10 champs de chacun des échantillons sont analysés pour les caractéristiques communément admises pour l'apoptose : condensation marquée de la chromatine et du cytoplasme (rétrécissement cellulaire et corps apoptotique). La sévérité de l'apoptose est évaluée par un taux de nombre d'hépatocytes apoptotiques par rapport aux hépatocytes totaux du champ. Le score d'apoptose (%) correspond à la moyenne des valeurs sur 10 champs.

Les sections de tissus incorporées dans le paraplaste sont deux fois déparaffinées dans le toluène (5 minutes) et immergées dans le méthanol contenant 0,5% (volume/volume) dc peroxyde d'hydrogènc pendant 20 minutes. Les si tes non spécifiques sont bloqués par incubation pendant 20 minutes avec un sérum d'âne. Les sections sont recouvertes après hydratation avec les anticorps respectifs durant 60 minutes dans des chambres d'humidification. Les sections traitées aux ultrons 5 minutes deux fois sont incubées avec un anticorps anti-Bcl-2 humain de lapin (1:40,
Pharmingen).Après rinçage dans le tampon PBS et incubation pendant 30 minutes avec l'anticorps secondaire biotinylé (1:200, Vector Lab.), la procédure est continuée en utilisant les réactifs complexes streptavidinebiotine-peroxydase (1:100, Amersham) pendant 30 minutes. A l'étape finale,
I'amino-éthyl-carbazole (sigma) est utilisé comme chromogène pendant un maximum de 10 minutes dans le noir et les sections sont contre-colorées avec l'hématoxiline Harris pendant 15 secondes. Les sérums de lapin nonimmunes sont utilisés comme contrôle négatif. Pour l'immunomarquage de
Fas, les spécimens de foie sont incorporés dans un composé ornithinecarbamoyl-transférase (Miles In., Elkhart In.) et congelés rapidement dans l'azote liquide.Les sections congelées de 3 zm sont fixées dans l'acétone pendant 5 minutes à 4"C et incubées avec une dilution 1:40 d'anticorps de lapin anti-Fas (Santacruz).

Analvse sérique
Les paramètres biochimiques du sérum (AST : aspartate aminotransférase, ALT : alanine aminotransférase) sont quantifiés en utilisant un analyseur automatique de clinique standard (Hitachi, type 7150).

Analvse statistique des données
Le test de Chi carré pour les survivants, et les analyses de Kruskal et Wallis non paramétriques du test de la variance pour les paramètres biochimiques et histologiques sont utilisés dans cette étude (p < 0,05 correspond à un résultat significatif).

EXEMPLES
Un ADNc humain bcl-2 a (19) est placé sous le contrôle de séquences régulatrices du gène de la Pyruvate Kinase de type L du rat (L-PK), qui code pour une enzyme glycolytique essentiellement exprimée dans les hépatocytes, les entérocytes et les cellules tubulaires proximales des reins et légèrement dans le pancréans endocrine (20).

La construction est constituée pour remplacer la plupart du gène L-PK avec l'ADNc correspondant, mais tout en maintenant l'intégrité de l'exon 1 et d'une partie de l'exon 2, ce qui conduit à un gène hybride PKbcl-2 (figure 1). Pour les deux lignées transgéniques établies, A et B, portant respectivement 2 et 10 copies de la construction hybride, l'expression transgénique (1 kb d'ARNm PK-bcl-2) est limitée aux tissus précédents (figure 2a), et le taux d'expression présente une bonne corrélation avec le nombre de copies intégrées. La présence du produit du gène hybride PK-bcl2 est, en outre, examinée par Western blot dans tous les tissus exprimant le transgène (figure 2b) et par immunohistochimie dans le foie (figure 2c).

Deux bandes de protéine sont détectées avec le poids moléculaire apparent de 30,5 et 26,8 kDa qui correspondent respectivement aux protéines hybrides attendues.

Une analyse complémentaire indique que les deux protéines hybrides sont sélectivement intégrées dans les membranes cellulaires des hépatocytes (figure 2b), conformément à la présence du motif d'ancrage dans la séquence codante de bcl-2 c. .L'expression du transgène PK-bcl-2 est confirmée par immunochimie avec un anticorps polyclonal dressé contre un peptide synthétique de la protéine humaine Bcl-2 (figure 2c).

Une immunoréactivité Bcl-2 homogène est observée sous forme d'un marquage cytoplasmique et granulaire, consistant avec la localisation transmembranaire des organelles intracellulaires. Les cellules biliaires, endothéliales et de Kupffer ne sont pas marquées. Aucun immunomarquage Bcl-2 n'est observé dans les souris contrôles (figure 2d).

Toutes les souris transgéniques PK-bcl-2 des lignées A et B se développent, se reproduisent et ne présentent aucun phénotype particulier.

Pour assurer que la transgénèse n'a pas affecté l'expression endogène de l'antigène Fas dans les foies, L'analyse des messagers Fas et de la protéine a été effectuée. Les divers tissus exprimant l'antigène Fas aussi bien des souris transgéniques que non-transgéniques sont examinés par
Northern blot. Comme cela apparaît dans la figure 3a, une abondance similaire de l'ARNm Fas de 2,1 kb est détectée dans le foie et dans les autres tissus (le coeur, le thymus, les reins) des souris, qu'elles soient transgéniques ou non.

De façon similaire, L'analyse des western blot des fractions membranaires du foie des souris transgéniques et contrôles révèle une abondance identique de la bande de protéine spécifique 37 kDa qui est consistant avec le poids moléculaire apparent de la protéine Fas de souris (21) (figure 3b).

En outre, l'antigène Fas est immunochimiquement détecté (figure 3c) à l'intérieur et le long des membranes des hépatocytes de transgéniques comme des hépatocytes des contrôles.

Lorsque l'on rassemble l'ensemble de ces observations, elles démontrent que l'expression de bcl-2 humain dans les hépatocytes murins n'affecte pas l'expression de Fas.

Bcl-2 protège contre une défaillance hépatique aiguë léthale médiée par Fas.

10 Fg d'anticorps anti-Fas monoclonal de hamster purifiés (J02,
Pharmingen) sont injectés par voie intraveineuse à des souris transgéniques et contrôles. Une défaillance hépatique aiguë et rapide conduisant à la mort apparait chez toutes les souris non transgéniques en 40 heures (n = 10) avec un taux de mortalité de 90% à 6 heures. Par contraste, 28 des 30 souris transgéniques, qu'il s'agisse de la lignée A (n = 12) ou B (n = 16), survivent à l'injection d'anticorps (figure 4, p < 0,001). Ces 28 animaux sont toujours vivants et n'ont pas de phénotype altéré au bout de deux mois après l'injection.

Analvse histoloziaue et biochimiaue indiquant une apoptose hépatique différée et modérée chez les souris transgéniques
Le foie des souris traitées est prélevé pour l'examen histologique de 30 minutes à 48 heures après l'injection intraveineuse de l'anticorps (figure 5). Comme cela a été indiqué précédemment, des lésions histologiques sévères du foie sont observées dans les souris contrôles traitées avec changement morphologique caractérisant l'apoptose.

L'apoptose apparaît dans une séquence bien définie sur le plan morphologique qui commence par une condensation de la chromatine dans la membrane nucléaire, puis une fragmentation de la cellule dans les corps extracellulaires qui s'accumulent dans des lumens sinusoïdaux. Des corps apoptotiques plus grands appelés "corps acidophiliques (Councilman) sont aussi présents. Dans les souris contrôles traitées, l'apparition rapide d'une apoptose massive est observée 90 minutes après l'injection de l'anticorps agoniste, quantitifiée à 60 % et essentiellement localisée dans l'aire médiolobulaire (figure Sa et 5b). Le processus apoptotique continue à progresser, s'détendant à tout l'acinus. 6 heures après l'injection (figure 5c), l'apoptose hépatique est complète, estimée à plus de 90% pan- et multi-lobulaire.

L'atteinte des cellules endothéliales sinusoïdales est également observée qui conduit à la péliose et l'hémorragie dans l'ensemble des lobules, excepté pour certaines parties autour de la veine terminale et dans la proximité du tractus portal. L'absence de cellules inflammatoires est compréhensible, compte tenu de la nature non inflammatoire de la mort cellulaire apoptotique. Par contraste, l'analyse histotologique des foies des souris transgéniques traitées montre une apoptose sévère bien moins importante et différée pour les deux lignées transgéniques A et B. Aucune atteinte hépatocellulaire n'est observée 90 minutes après l'injection d'anticorps (figure 5d). L'apoptose apparaît initialement 3 à 6 heures après le traitement, et ne peut être mise en évidence que comme 5 à 10 corps apoptotiques isolés (figure 5e).En dépit d'une augmentation constante, l'apoptose demeure modérée (moins de 30%), essentiellement limitée à la zone médiane du lobule. De façon intéressante, quelques granulocytes, lymphocytes et macrophages sont observés, entourant les nécroses apoptotiques 48 heures après le traitement. La présence de plusieurs mitoses dans les hépatocytes suggère l'initiation d'un phénomène de régénération (figure 5f).

Les teneurs sériques en aspartate aminotransférase (AST) et alanine aminotransférase (ALT) augmentent considérablement dans les 60 minutes après l'injection de l'anticorps anti-Fas dans les souris contrôles traitées (figure 6a et 6b). L'atteinte hépatique aiguë et sévère est également confirmée par l'augmentation constante du niveau sérique des aminotransférases qui atteignent 200 x N. Une sévère hypoglycémie ( < 0,2 mN1/1) est observée pour les souris contrôles traitées, et pour une souris transgénique non survivante. Ce dernier point est probablement important comme reflet d'une insuffisance hépato-cellulaire terminale. Par contraste, des niveaux d'AST et d'ALT significativement plus faibles sont observés chez les souris transgéniques PK-bcl-2 à 3 heures et 6 heures après l'injection de l'anticorps.Une configuration similaire est observée pour les scores d'apoptose à 2, 3 et 6 heures, ce qui est consistent avec les corrélations significatives établies entre la sévérité de la cytolyse hépatique biochimique et l'intensité du processus apoptotique biologique (figure 6c).

L'apoptose induite par un anticorps anti-Fas est limitée au foie.

La haute résistance de souris transgéniques à l'effet létal de l'anticorps anti
Fas a conduit à analyser le processus apoptotique et les atteintes organiques dans d'autres tissus. Les analyses histologiques ont été effectuées dans différents tissus autres que le foie exprimant l'antigène Fas. Dans ces tissus exprimant le transgène PK-bcl-2 (les reins) ou non (le coeur, les poumons ou le thymus), aucune cellule apoptotique ou nécrosée n'a été observée, même sur des tissus prélevés jusqu'à 48 heures après l'injection de l'anticorps.

Cet exemple démontre in vivo qu'il est possible de bloquer, au moins transitoirement, le message de mort médié par Fas en augmentant l'expression de bcl-2, et que cette expression permet au foie de résister à des conditions générant chez les témoins des hépatites fulminantes.

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Claims (16)

REVENDICATIONS

1) Utilisation d'un vecteur assurant l'expression transitoire de bcl-2, ou l'augmentation transitoire de l'activité Bcl-2 ou d'une protéine du type Bcl-2 dans un ou plusieurs organes pour la réalisation d'un médicament destiné au traitement ou la prévention d'une défaillance aiguë d'un ou plusieurs organes impliquant un processus apoptotique, par inhibition totale ou partielle du signal apoptotique.

2) Utilisation d'un vecteur selon la revendication 1, caractérisée en ce que le processus apoptotique est à médiation Fas.

3) Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la défaillance aiguë est liée à une agression toxique, infectieuse, ischémique et/ou immunologique.

4) Utilisation d'un vecteur selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement ou la prévention d'une défaillance aiguë liée à une hépatite fulminante, une néphropathie aiguë, une détresse respiratoire aiguë, une défaillance cardiaque aigue.

5) Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le vecteur s'exprime majoritairement dans l'organe ou les organes sujets à ladite défaillance.

7) Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le vecteur assure l'expression de bcl-2 ou d'une protéine de type Bcl-2.

8) utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le vecteur assure l'expression d'une protéine ou d'un précurseur augmentant la production de Bcl-2 cellulaire, ou son activité.

9) Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le vecteur est choisi parmi les vecteurs viraux et les vecteurs à acides nucléiques nus.

10) Utilisation d'un vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que les vecteurs viraux sont choisis parmi les vecteurs viraux non intégratifs.

11) Utilisation d'un vecteur selon la revendication 10, caractérisée en ce que les vecteurs viraux sont choisis parmi les vecteurs adénoviraux.

12) Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le vecteur est tissu spécifique, ou dont l'expression est rendue spécifique de tissu par l'utilisation de promoteurs tissus-spécifiques.

13) Utilisation d'un vecteur selon la revendication 12, caractérisée en ce que le vecteur comporte les séquences régulatrices de la

L-Pyruvate Kinase (L-PK), ou de l'aldolase B, pour conférer une expression hépatique à l'ADNc du gène bcl-2.

14) Utilisation d'un vecteur selon la revendication 13, caractérisée en ce que le vecteur comporte les séquences régulatrices en 5' de la L-PK, les premiers exon et intron et tout ou partie du second exon de la

L-PK, en amont de l'ADNc du gène bcl-2.

15) Utilisation d'un vecteur selon la revendication 13 à 14, caractérisée en ce que le vecteur comporte l'enhancer de l'Aldolase B, tout ou partie des séquences régulatrices en 5' de la L-Pyruvate Kinase, les premiers exon et intron et tout ou partie du second exon de la L-PK, en amont de l'ADNc du gène bcl-2.

16) Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que l'expression du gène bcl-2 ou bcl-2-like est régulée positivement par la présence de virus ou de toxiques responsables de la défaillance.

17) Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que le vecteur peut etre inhibé ou détruit par administration d'un composant spécifique.