FR2722411A1 - Immunonanoparticules revetues d'anticorps monoclonaux anti-beta2 microglobuline et leur utilisation pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues a une infection par le virus hiv - Google Patents

Immunonanoparticules revetues d'anticorps monoclonaux anti-beta2 microglobuline et leur utilisation pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues a une infection par le virus hiv Download PDF

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Abstract

L'invention concerne des immunonanoparticules constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate revêtues d'anticorps anti- beta2 microglobuline, ainsi que leur utilisation pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV, pour la fabrication de médicaments pour la prophylaxie et/ou le traitement desdites pathologies, en tant que réactifs biologiques, ou encore dans un procédé de détection de la présence de beta2 microglobuline associée à des particules virales.

Description

L'invention concerne des immunoparticules constituées de nanoparticules de méthylidène malonate polymérisé revêtues d'anticorps anti- & microglobuline et leur utilisation pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV, pour la préparation de médicaments les contenant ou en tant que réactifs biologiques.
La ss2 microglobuline (ci-après dénommée également 2m) est un polypeptide constituant la chaîne légère des antigènes HLA (human leukocytc antigen) de classe I. La 52m est associée à la chaîne lourde des antigènes HIA dc classe I.
L'association de protéines cellulaires telles que la ,B2m avec l'enveloppe virale a été rapportée par L. Arthur et al, Science, 1992, 258. 1935-1938.
La capacité d' anticorps monoclonaux anti-B2 microglobuline (anti ss2m) à retarder la production du virus HIV 1 dans des cellules mononucléaires de sang, périphérique (PBNC) a été rapportée dans la publication P.Corbeau et al, J.
Virol., 1990, 64. 1459-1464.
Le retardement de l'apparition de l'effet cytopathogène du virus Hw 1 vis-à-vis de cellules MT4 par des anticorps monoclonaux anti-ss2m est également décrit dans C. Devaux et al, Res. Immunol., 1990 141 357-372.
On a maintenant trouvé qu'il était possible d'utiliser des immunonanoparticules porteuses d'anticorps monoclonaux anti- & microglobuline susceptibles de reconnaître spécifiquement la ss2 microglobuline lorsqu'elle est associée à des particules virales dans la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV, en particulier le SIDA.
Par "ss2 microglobuline", on entendra dans la suite de la description la ss2 microglobuline seule ou associée à la chaîne lourde des antigènes FILA de classe I.
Les immunonanoparticules selon l'invention présentent les avantages dc conférer auxdits anticorps une meilleure stabilité, une plus grande activité et une meilleure immunoréactivité. Elles sont également totalement biodégradables et présentent une très faible toxicité, leurs produits de dégradation étant eux-mêmes non-toxiques. De plus, elles peuvent avantageusement être stérilisées et lyophilisées.
L'invention concerne donc des immunonanoparticules constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (1):
Figure img00020001

dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupe alkylc linéaire ou ramifié en C1-Cs et n est un entier de 1 à 5, lesdites nanoparticules étant revêtues d'anticorps anti-ss2 microglobuline susceptibles de reconnaîtrc spécifiquement la ss2 microglobuline lorsqu'elle est associée à des particules virales.
La préparation des composés de formule (I) est décrite dans le brevet
EP 0 283 364.
Les composés de formule (I) se polymérisent sous forme d'un réseau polymérique pour former les nanoparticules ayant un diamètre compris entrc 100 et 400 nm, de préférence de l'ordre de 300 nm. La masse moléculaire en poids (Mw) des polymères de méthylidène malonate de formule (I) est dc l'ordre de 1500 à 2000 exprimé en équivalents polystyrènes.
De préférence, le composé méthylidène malonate de formule (I) est le 1-éthoxycarbonyl-1-éthoxycarbonylméthylèneoxycarbonyléthène (composé dc formule (I) dans laquelle R1 = R2 = éthyle et n = 1).
Les immunonanoparticu les selon l'invention peuvent avantageusement contenir au sein de leur réseau polymérique une substance biologiquement activc, de préférence un agent antiviral. A titre d'exemples d'agents antiviraux, on peut citer de manière non limitative la didanosine, la ribavirine, la zidovudinc, l'acielovir, la vidarabine et la zalcitabine.
Dans un aspect avantageux, l'anticorps monoclonal anti- & microglobuline dont est revêtue la nanoparticule pour constitucr l'immunonanoparticule est choisi parmi les anticorps B1.lG6 et B2.62.2 (IMMUNOTECH., France), l'anticorps B1.lG6 étant préféré. On utilisera notamment les anticorps monoclonaux sous forme d'une solution contenant de la sérum albumine bovine telle que fournie commercialement.
Les anticorps monoclonaux anti-ss2m sont fixés sur les nanoparticules pour constituer les immunonanoparticules par des techniques connues en soi, dc préférence par adsorption passive, notamment dans un tampon phosphate.
Lesdits anticorps peuvent également être fixés sur les nanoparticules par adsorption spécifique notamment via la protéine A de Staphylococcus aureus ou une liaison biotine-avidine.
Différents procédés de fixation des anticorps sont décrits notamment dans la publication L. Illum et al, Meth. Enzymol., 1985, 112. 67-84.
Dans un aspect ultérieur, l'invention conceme l'utilisation des immunonanoparticules décrites ci-dessus pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV, et en particulier pour la fabrication d'un médicament pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV.
En effet, les immunonanoparticules décrites ci-dessus possèdent des propriétés d'inhibition de la formation de syncytia dans le modèle expérimental dc
F. Rey et al, Virology, 1991, 181. 165-171.
Selon un autre aspect, I'invention conceme également un procéda de détection de la présence de ss2m associée à des particules virales dans un échantillon de liquide biologique provenant d'un mammifere, humain ou animal, consistant à mettre en contact un échantillon de ce liquide biologique avec des immunonanoparticules décrites ci-dessus, constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (1):
Figure img00030001

dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupe aikyle linéaire ou ramifié en C1-Cs et n est un entier de 1 à 5, lesdites nanoparticules étant revêtues d'anticorps anti-ss2m susceptibles de reconnaître spécifiquement la ss2m lorsqu'elle est associée à des particules virales, en quantité suffisante pour former un complexe antigène-anticorps susceptible d'être détecté.
Dans un autre aspect, l'invention conceme également l'utilisation des immunanoparticules revêtues d'anticorps anti-ss2m décrites ci-dessus en tant que réactifs biologiques, notamment en tant que contrôles pour l'évaluation de l'activité de composés dans un modèle d'inhibition de la formation de syncytia, ou encorc dans des techniques d'immunoséparation, d'immunoprécipitation, d'immunomarquage ou d'immunopurification.
L'invention est illustrée par les exemples ci-après qui ne présentent aucun caractère limitatif.
EXEMPLE 1 Préparation d1immunonanoparticules d'éthoxycarbonyl-1 méthylèneoxycarbonyl- l-éthène revêtues d'anticorps anti-B2 microglobuline B1.lG6.
1) Préparation des nanoparticules:
Les nanoparticules sont préparées dans des conditions stériles à 250C par
émulsion-polymérisation du monomère comme décrit dans F. Lescure et al,
Proceed. Intem. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 1991, 18, 325-326, ou
F. Lescure et al. Pharm. Res., 1994 (sous presse).
Brièvement, 100 Hl de monomère d'éthoxycarbonyl-l-méthylèneoxycarbonyl-
1-éthène (UPSA laboratoires/CARPIBEM, France) sont appauvris en S 2 sous
vide pendant 3 h à 10-2 torr, puis ajoutés goutte à goutte sous agitation à un
milieu de polymérisation (10 ml) thermostaté à 250C constitué d'un tampon
KH2P04/NaH2P04, 0,066 M, pH 5,5 contenant 1% de dextran (Mr = 70 000,
FLUKA CHEMIE, Suisse).
L'ensemble est laissé sous agitation pendant 18 h puis les nanoparticules sont
récupérées après filtration sur papier filtre 8 m (Whatman, Grande-Bretagne),
puis réparties en fractions aliquotes, lyophilisées et conservées à températurt
ambiante à l'abri de la lumière.
Au moment de l'utilisation, les nanoparticules sont remises en suspension dans
de l'eau ultrafiltrée stérile de manière à obtenir une suspension en polymère
sensiblement égale à 10 mg/ml.
La taille moyenne des nanoparticules est mesurée avant et après lyophilisation à
l'aide d'un appareil à analyser les particules submicrométriques (Coulter
Electronics, USA). Le diamètre moyen des particules est de l'ordre de 320 nm.
Les masses moléculaires des polymères constitutifs des nanoparticules sont
déterminées par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) (Polymer
laboratories, Grande-Bretagne). Pour l'analyse, la suspension nanoparticulaire
est ultracentrifugée à 200.000 g durant 5 minutes, puis le culot repris par du
THF auquel on ajoute 0,5% de toluène (étalon interne), est injecté. La détection
se fait par réfractométrie.
2) Fixation des anticorps sur les nanoparticules
L'anticorps Bl.lG6 (lmmunotech, France) sous forme lyophilisée est repris
dans de l'eau ultrafiltrée de façon à obtenir une solution contenant 200 g
d'anticorps et 0,5% de sérum albumine bovine (BSA).
100 l de la solution d'anticorps sont prélevés, auxquels sont ajoutés 63 Crl de la
suspension de nanoparticules : le mélange est ajusté à 250 Fl par du tampon pH
7,4. On obtient ainsi une suspension contenant 2,5 mg/ml de nanoparticules,
400 Cug/ml d'anticorps Bl.lG6 et 0,2% de BSA.
Le mélange est incubé à 200C pendant 2h sous agitation.
On peut également réaliser une suspension contenant 200 llg/ml d'anticorps
Bl.lG6 et 0,1% de BSA pour 2,5 mg/ml de nanoparticules.
3) Détermination du taux de fixation de l'anticorps Bl.lG6 par dosage EUSA a) L'antigène, la t32 microglobuline (SIGMA, Etats-Unis) est mis en solution dans
un tampon carbonate/bicarbonate pH 9,6 à la concentration de 2,5 llg/ml . Cette
solution est répartie sur une plaque 96 puits IMMULON m (DYNATECH,
France), à raison de 100 Ill par puits. La plaque contenant l'antigène est incubée
pendant une nuit à + 4 C.
Les puits sont ensuite vidés, et on ajoute 125 pl de solution de blocage (tampon
PBS contenant 0,5% de BSA et 0,001 % d'azide de sodium) par puits. Lc
système est incubé pendant 1 heure à 37'C.
Les puits sont alors vidés, puis rincés à 4 reprises par la solution de lavage
(tampon PBS à 0,5% de Tween 20).
b) Les solutions contenant l'anticorps Bl.lG6 (anticorps fixé à doser ainsi que les
solutions d'anticorps constituant la gamme d'étalonnage) sont réparties dans les
puits à raison de 50 l par puits.
- Préparation de la solution d'anticorps fixé à doser:
A la fin de l'étape d'incubation nanoparticules-anticorps, la suspension est
soumise à une ultracentrifugation, l'anticorps non fixé et séparé des
immunanoparticules est recueilli avec le surnageant dans lequel il sera dosé.
- Constitution de la gamme d'étalonnage
La gamme d'étalonnage est issue d'une solution mère réalisée de façon identique
à la suspension d'immunonanoparticules, mais où les nanoparticules sont
remplacées par du surnageant d'ultracentrifugation renfermant milieu de
polymérisation et oligomères. Ce mélange est traité dans les mêmes conditions
d'incubation que la suspension nanoparticules-anticorps.
La gamme d'étalonnage est effectuée par dilution sérielle au demi de la solution
mère.
Le système est incubé pendant 1 heure à 37-C.
Les puits sont ensuite vidés, puis rincés à 4 reprises avec la solution de lavage.
c) On ajoute ensuite 50 l de la solution de travail (2 iil d'anticorps anti-fragment
Fc (SIGMA, France) marqué à la phosphatase alcaline, dans 16 ml de solution
de lavage).
Le système est incubé pendant 1 heure à 37 C.
Les puits sont alors vidés, puis rincés à 4 reprises avec la solution de lavage.
La solution de substrat (solution de tampon glycine 0,1 M à pH 10,4 contenant
1 mg/ml de p-nitrophénylphosphate) est ensuite introduite à raison de 100 Crl
par puits.
La plaque est alors mise à incuber à 37*C sous 5% de CO2
Après environ 2 heures d'incubation, le dosage est réalisé par lecture
colorimétrique à 405 mn par un lecteur de plaque MICROPIATE EL-310
(BIOTECH INSTRUMENT, Etats-Unis).
Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous:
Tableau 1
Figure img00060001
<tb> <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> Pourcentage <SEP> de <SEP> fixation <SEP> Quantité <SEP> d'anticorps
<tb> anticorps <SEP> (g/ml) <SEP> * <SEP> de <SEP> l'anticorps <SEP> B1.lG6 <SEP> fixée <SEP> par <SEP> les
<tb> <SEP> nanoparticules <SEP> ( > gfmg) <SEP>
<tb> <SEP> 5 <SEP> 40+5 <SEP> 0,8 <SEP>
<tb> <SEP> 2,5 <SEP> 80+3 <SEP> 0,8+0,03 <SEP>
<tb> <SEP> 1,25 <SEP> 97+1 <SEP> 0,485+0,005 <SEP>
<tb> * les concentrations en anticorps sont exprimées en Fg/ml et pour 2,5 mg/ml de
nanoparticules.
EXEMPLE 2: Etude de la stabilité des immunonanoparticules de l'exemple 1.
1) Fixation et dosage des anticorps B1-1G6
Les nanoparticules telles qu'obtenues dans l'exemple 1, étape 1) sont diluées
dans une solution de tampon pH 7,4 contenant de l'anticorps anti-ss2
microglobuline B1-1G6 (solution mère à 100 Sml, 0,2 % de sérum albumine
bovine, IMMUNOTECH, France). Le mélange final contenant 2,5 mg/ml de
nanoparticules et 5 Zg/ml d'anticorps, est incubé à température ambiantc
pendant 2 h sous agitation.
A l'issue de l'incubation (T=O), l'anticorps libre est séparé des
immunonanoparticules par ultracentrifugation à 40.000 g pendant 5 minutes,
puis dosé par la méthode ELISA décrite dans l'exemple 1, étape 3).
2) Détermination de la stabilité des immunonanoparticules
La suspension d'immunonanoparticules est entreposée à 3TC pendant 48
heures.
A l'issue de cette période, la suspension est ultracentrifugée et l'anticorps libre
recueilli dans le surnageant est dosé par dosage ELISA comme précédemment
(T=48 h et 72 h). La solution d'anticorps utilisée dans l'étalonnage du dosage
ELISA subit le même traitement que la suspension étudiée.
La stabilité du système est évaluée d'après la variation des valeurs de fixation
que l'on observe durant cette période.
Les résultats sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous
Tableau 2
Figure img00070001
<tb> <SEP> Pourcentage <SEP> de <SEP> fixation
<tb> <SEP> Initial <SEP> Après <SEP> 48 <SEP> h <SEP> Après <SEP> 72 <SEP> h
<tb> <SEP> d'incubation <SEP> d'incubation
<tb> Pourcentage <SEP> d'anticorps <SEP> fixé <SEP> 50 <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 42 <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 41 <SEP> t <SEP> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> sur <SEP> les <SEP> nanoparticules
<tb> Quantité <SEP> d'anticorps <SEP> fixé, <SEP> en <SEP> 1 <SEP> + <SEP> 0,1 <SEP> 0,84 <SEP> <SEP> + <SEP> 0,1 <SEP> 0,82 <SEP> t <SEP> 0,1
<tb> <SEP> Fg/mg <SEP> <SEP> de <SEP> polymère
<tb>
Les résultats montrent que le pourcentage d'anticorps fixé diminue de 20% pendant les 48 heures qui suivent la formation des immunonanoparticules mais qu'un état de stabilité est ensuite atteint.
EXEMPLE 3 : Etude de l'activité inhibitrice de la formation de syncytia dans un modèle in vitro par les immunonanoparticules de l'exemple 1.
a) Les immunonanoparticules fraîchement préparées sont diluées au 1/15ème dans
du RPMI 1640 (GlBCO, France) supplémenté à 10 % de sérum de veau foetal
(SVF), 1 % de L-glutamine (L-Gln) et 1 % d'antibiotiques PSN (Pénicillinc,
Streptomycine, Néomycine).
b) L'anticorps B1.lG6 sous forme lyophilisée est repris dans de l'eau ultrafiltrée de
façon à obtenir une solution contenant 200 g d'anticorps et 0,5 % de BSA dans
du PBS.
On prépare une gamme étalon d'anticorps B1.lG6 par dilution à l'aide de milieu
RPMI 1640 supplémenté à 10 % de SVF veau foetal, 1 % de L-Gln et 1 %
d'antibiotiques PSN.
c) 100 FI d'une solution 2.10-3 du virus HIV-1 provenant de surnageants de
cellules infectées (cellules CD4+, par exemple MT4, cultivées avec du virus
HIV-1 isolé du plasma d'un patient séropositif), cette dilution ayant étC
déterminée pour induire la formation de syncytia en 4 à 6 jours, sont prc-
incubés 2 heures à 370C avec:
soit 100 Ill de suspension d'immunonanoparticules ou de nanoparticules,
soit 100 Ill de dilution d'anticorps (gamme étalon),
soit 100 Fl de milieu de culture pour les témoins cellules et virus.
Au bout de ce temps, l'infection est réalisée en microplaque 96 puits en ajoutant
les 200 Fl précédemment obtenus, à un culot de 3.105 cellules MT4.
Après une incubation de 1 heure à 37-C, les cellules MT4 sont lavées 3 fois
avec du RPMI 1640 non supplémenté, puis mises en culture à la concentration
de 3.105 cellules par ml en microplaques 24 puits dans du RPMI 1640 à 10%
SVF, 1 % L-Gln, 1 % PSN.
Tous les 3 ou 4 jours, les cellules sont passées et ajustées à la concentration de
3.105 cellules par ml avec du milieu RPMI 1640 à 10 % SVF, 1 % L-Gln, 1 %
PSN.
Après 4 jours de culture, l'apparition des syncytia est observée au microscope toutes les 24 heures (2 mesures) parallèlement aux témoins suivants: - témoin nanoparticules (nanoparticules seules + cellules MT4 non infectées), - témoin virus (cellules MT4 infectées, sans immunonanoparticules), - témoin cellules (cellules MT4 non infectées, sans immunonanoparticules).
Les résultats sont rapportés dans les tableaux 3 et 4 ci-dessous, dans lesquels la formation de syncytia est notée de la manière suivante (+) début d'apparition des syncytia (on n'en observe que quelques-uns)
+ présence de syncytia en quantité plus appréciable
++ présence de nombreux syncytia
T toxique (cellules mortes).
Tableau 3
Figure img00090001
<tb> <SEP> Concentration <SEP> totale
<tb> <SEP> en <SEP> anticorps <SEP> jour <SEP> 4 <SEP> jour <SEP> 5 <SEP> jour <SEP> 6 <SEP> jour <SEP> 7
<tb> <SEP> (llg/106 <SEP> cellules)
<tb> <SEP> immunonano- <SEP> 2 <SEP> - <SEP> - <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> ++T
<tb> particules <SEP> revêtues <SEP> 1 <SEP> - <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> ++T
<tb> <SEP> d'anticorps <SEP> 0,5 <SEP> - <SEP> (+) <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> ++T
<tb> <SEP> Bl.lG6 <SEP> 0,25 <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> ++T
<tb> <SEP> anticorps <SEP> 300 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> B1.lG6 <SEP> 150 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> <SEP> libre <SEP> 75 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> + <SEP> ++T <SEP> ++T
<tb> <SEP> 37,5 <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> ++T
<tb> <SEP> 18,75 <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> + <SEP> +T
<tb> <SEP> 9,38 <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> ++T
<tb> témoin
<tb> nanoparticules
<tb> témoin <SEP> cellules <SEP> <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP> ~ <SEP>
<tb> témoin <SEP> virus <SEP> - <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> ++T
<tb>
Tableau 4
Figure img00100001
<tb> <SEP> Concentration <SEP> en
<tb> <SEP> anticorps <SEP> <SEP> 3our <SEP> 4 <SEP> jour <SEP> 5 <SEP> jour <SEP> 6 <SEP> jour <SEP> 7 <SEP>
<tb> <SEP> ( g/106 <SEP> cellules)
<tb> immunonano- <SEP> 8 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> (+) <SEP> - <SEP> ++
<tb> particules
<tb> revêtues
<tb> d'anticorps <SEP> 4 <SEP> - <SEP> - <SEP> (+) <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> T <SEP> ++T
<tb> Bl.lG6 <SEP>
<tb> <SEP> anticorps <SEP> 300 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> (+) <SEP> - <SEP> +
<tb> <SEP> B1.lG6 <SEP> 150 <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> (+) <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> ++
<tb> <SEP> libre <SEP> 75 <SEP> - <SEP> - <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T
<tb> <SEP> 60 <SEP> - <SEP> - <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> T <SEP> T
<tb> <SEP> 37,5 <SEP> - <SEP> - <SEP> (+) <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T
<tb> <SEP> 15,00 <SEP> (+) <SEP> (+) <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++T <SEP> ++T
<tb> témoin
<tb> nanoparticules
<tb> témoin <SEP> cellules <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> témoin <SEP> virus <SEP> - <SEP> + <SEP> (+) <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++T <SEP> ++ <SEP> T <SEP> ++T
<tb>
Les résultats montrent qu'en utilisant les immunonanoparticules selon
I'invention, on obtient une inhibition de la formation de syncytia à partir d'une concentration en anticorps très inférieure à celle de l'anticorps libre.
On observe notamment une inhibition au 4ème jour à partir d'une concentration en anticorps de 2 g/106 cellules pour les immunonanoparticules selon l'invention au lieu de 75 g/106 cellules d'anticorps libres (tableau 3).
Au jour 7, on observe la même inhibition, avec une concentration en anticorps de 8 g/106 cellules pour les immunonanoparticules selon l'invention, qu'avec 300 g/106 cellules d'anticorps libres (tableau 4).
Les immunonanoparticules décrites permettent donc d'abaisser la concentration minimale efficace en anticorps par environ un facteur 40 aussi bien au jour 4 qu'au jour 7.

Claims (12)

REVENDICATIONS
1. Immunonanoparticules constituées de nanoparticules de polymère d'un composé méthylidène malonate de formule (I):
Figure img00110001
dans laquelle R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié en C1-Cs et n est un entier de 1 à 5, lesdites nanoparticules étant revêtues d'anticorps anti-B2 microglobuline susceptibles de reconnaîtrc spécifiquement la ss2 microglobuline lorsqu'elle est associée à des particules virales.
2. Immunonanoparticules selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé méthylidène malonate est un composé de formule (I) dans laquelle
R1 =R2=éthyleetn= 1.
3. Immunonanoparticules selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisées en ce que les anticorps monoclonaux anti- & microglobuline sont choisis parmi les anticorps B1.lG6 et B2.62.2.
4. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que l'anticorps monoclonal anti-B2 microglobuline est l'anticorps B1.lG6.
5. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisées en ce que les anticorps monoclonaux anti-B2 microglobuline sont fixés sur la nanoparticule par adsorption passive.
6. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisées en ce que la nanoparticule a un diamètre compris entre 100 et 400 nm, de préférence de l'ordre de 300 nm.
7. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que le polymère de composé méthylidène malonate de formule (I) a une masse moléculaire en poids (Mw) de l'ordre de 1500 à 2000 exprimé en équivalents polystyrènes.
8. Immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisées en ce que les nanoparticules contiennent une substance biologiquement active, de préférence un agent antiviral.
9. Médicament contenant des immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 à titre de principe actif.
10. Utilisation d'immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la fabrication d'un médicament pour la prophylaxie et/ou le traitement de pathologies dues à une infection par le virus HIV.
11. Utilisation d'immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en tant que réactifs biologiques.
12. Procédé de détection de la présence de ss2 microglobuline associée à des particules virales dans un échantillon de liquide biologique provenant d'un mammifere, humain ou animal, consistant à mettre en contact un échantillon de ce liquide biologique avec des immunonanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en quantité suffisante pour former un complexe antigènc- anticorps susceptible d'être détecté.
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