FR2721945A1 - Accroissement genique, un procede d'amplicication genique isotherme et ses applications - Google Patents

Abstract

Procédé d'amplification du matériel génétique caractérisé en ce qu'il met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques comportant chacune une séquence spécifique du DNA à amplifier et une séquence répétée inversée, ou une série de séquences répétées inversées, ces amorces étant destinées à permettre l'action d'une DNA polymérase en présence des réactifs convenables, l'action de ladite enzyme ayant lieu à température constante pendant la plus grande partie de la réaction d'accroissement génique. Le procédé augmente à la fois le nombre et la taille des molécules de DNA à détecter.

Description

L'invention est relative à des réactifs d'acides nucléiques perfectionnés, ainsi qu'aux méthodes pour les mettre en oeuvre.

L'invention concerne la préparation de ces réactifs, leur utilisation pour détecter, identifier et doser des acides nucléiques particuliers, leur utilisation pour lutter contre des agent pathogènes particuliers, ainsi que les composés obtenus en utilisant ces réactifs et ces méthodes.

État de la technique
On utilise pour détecter, identifier et doser des acides nucléiques particuliers des séquences d'acides nucléiques complémentaires appelées sondes nucléiques ou sondes. De telles sondes sont complémentaires en ce sens qu'elles se fixent spécifiquement sur les séquences recherchées. La réaction de fixation de la sonde est appelée hybridation. De telles sondes sont rendues détectables et dosables grâce à un marquage particulier. Ce marquage peut être réalisé par incorporation d'isotopes radioactifs ou de méthodes chimiques ou biochimiques. Dans le cas de l'utilisation d'un marquage radioactif, il n'est pas nécessaire, la plupart du temps, d'augmenter artificiellement de façon spécifique la concentration du DNA à doser. (Amplification)
Dans le cas ou l'on utilise des sondes marquées par une méthode non radioactive (sondes froides), il est souvent nécessaire d'amplifier le DNA ou le RNA avant de le détecter grâce à la fixation de ces sondes marquées. Dans la description qui va suivre, on parlera le plus souvent de détection du DNA, mais il est entendu que nous considérons aussi la détection de RNA, puisque la conversion préalable du RNA en DNA est possible grâce à une enzyme: la transcriptase réverse.

Parmi les réactions d'amplification décrites, on doit citer la réaction de polymérisation en chaîne ou amplification génique. (P.C.R.) Cette remarquable méthode a été imaginée par M. Kary Mullis (prix
Nobel de médecine) Grâce a la PCR, il est possible d'augmenter la quantité d'une séquence nucléique donnée par un facteur atteignant un million de fois ou plus. La PCR permet d'obtenir des résultats extraordinaires, notamment dans le domaine de l'identification et de l'étude des gènes. Sa sensibilité est extrêmement élevée: on peut détecter une seule copie d'une séquence nucléique donnée.

Malheureusement, cette sensibilité extrême devient parfois gênante, d'autant que les produits d'amplification (amplicons) sont de petite taille et peuvent facilement contaminer les laboratoires.

Quelques amplicons suffisent pour contaminer les échantillons non encore testés ou les réactifs et produire ainsi des faux positifs.

La petite taille des produits d'amplification est aussi un désavantage dans le cas de tests utilisant la technique dite d'amplification in situ. En effet, les amorces (primers) utilisées et les produits d'amplification ont des tailles du même ordre de grandeur (typiquement 30 paires de bases pour les primers, et 200 paires de bases pour les amplicons). Dans la technique d'amplification in situ, on traite des cellules fixées sur des lames de microscope (ou fixées sur un support convenable, ou bien en suspension dans un milieu convenable) de façon à ce qu'une réaction d'amplification spécifique d'un ADN contenu dans ces cellules puisse avoir lieu. Par exemple, on utilise cette méthode pour détecter la présence d'un virus donné. Ensuite on identifie les cellules positives par leur fluorescence en présence d'un colorant spécifique du DNA ou par une étape d' hybridation in situ suivant l'étape d'amplification. Un des problèmes les plus difficiles à surmonter lors de la mise en oeuvre de la technique d'amplification in situ est qu'il est nécessaire de perméabiliser les membranes cellulaires par un traitement approprié de façon à ce que les amorces puissent diffuser au travers de la membrane pour atteindre le DNA cible. I1 est donc impossible de travailler sur des cellules non fixées et non traitées, à fortiori sur des cellules vivantes.

D'autre part, du fait de la taille voisine des amplicons et des primers, les amplicons ont tendance à diffuser à travers les membranes au fur et à mesure que l'amplification se déroule: on perd ainsi en sensibilité et en contraste lors de l'observation au microscope ou à l'aide d'un appareil de comptage automatisé des cellules.

La P.C.R. utilise des amorces oligonucléotidiques pour initier l'action de la DNA polymérase. I1 arrive que de mauvais appariements entre ces amorces et le DNA présent dans les tubes conduisent à la production de produits d'amplification parasites. Cet effet a lieu pendant la période ou la température est basse dans les tubes. I1 arrive que les amorces s'hybrident à 550C sur d'autres séquences que la séquence recherchée. On observe la formation de produits d'amplification non spécifiques. Si l'utilisateur se contente d'effectuer un contrôle par électrophorèse sur gel d'agarose ou d'acrylamide, et que les fragments obtenus ont une taille apparente voisine de celle du fragment attendu, I'utilisateur risque d'être induit en erreur.

En effet, la PCR, de même que d'autres techniques d'amplification exige un dispositif capable de déplacer la température du milieu réactionnel entre trois températures de travail: en général 550C (hybridation des amorces), 72"C(extension des nouveau brins de
DNA par la polymérase thermostable), et 94"C(dénaturation des nouveaux brins) La LCR (ligase chain réaction) utilise elle aussi un tel dispositif programmable pour faire varier la température (thermocycleur)
Il existe des techniques fonctionnant à une seule température, mais elles utilisent plusieurs enzymes de différants types et leur relative complexité n'à pas permis qu'elles obtiennent la diffusion qu'elles méritaient.

Si l'on augmente la température d'hybridation de façon à éviter les malappariements évoqués plus haut, alors le rendement d'amplification diminue de façon considérable.

On doit noter qu'il est délicat d'effectuer des dosages à l'aide de la
PCR: En effet, I'amplification du DNA ayant lieu selon une loi logarithmique, de faibles variations des conditions opératoires auront des effets très importants.

Bien que la PCR soit irremplaçable pour de nombreuses applications, les défauts énumérés plus haut limitent son utilisation pour des tests de routine.

Pour les applications médicales, une sensibilité extrême n'est pas une caractéristique recherchée pour les méthodes de dépistage.

(Par exemple pour les méthodes de dépistage des virus.)
Détecter quelques dizaines de copies d'un ADN viral est une opération d'une valeur diagnostique incertaine dans l'état actuel de nos connaissances médicales, y compris pour des virus extrêmement dangereux comme le virus HIV. Ce qui est souhaitable, c'est de pouvoir détecter une infection par un virus donné. (C'est à dire plusieurs dizaines de milliers à plusieurs milliards de copies par échantillon)
L'auteur a contribué à démontrer, dans le cas de l'infection au virus
HIV, que l'hybridation avec des sondes radioactives sans amplification donnait déjà des résultats supérieurs aux techniques immunologiques (Detection of H.I.V. Sequences by DNA hybridization. S. Berriche, F. David, V. Ganne, M. Mariotti et G.

Lucotte. Molecular probes: Technology and medical application,
Raven Press, New York 1989) Pour obtenir les même résultats avec les sondes froides, une amplification du DNA cible de quelques ordres de grandeurs est un objectif suffisant.

Description de l'invention.

L'invention est une méthode d'amplification du matériel génétique caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre des réactifs particuliers contenant des amorces oligonucléotidiques constituées d'une partie complémentaire du DNA cible et d'une partie comportant deux séquences répétées inversées. De telles amorces sont utilisées par paires. Les parties de ces amorces complémentaires du DNA cible correspondent à des région de celuici séparées de quelques dizaines à quelques milliers de nucléotides.

Les amorces sont orientées de telle sorte que la réplication se fasse en allant de l'une vers l'autre. (Figl, Fig. 5b et 5f)
Les séquences répétées inversées permettent un auto-appariement en forme d'épingle à cheveux. On appelle de telles séquences des séquences palindromiques. (Fig.2)
La séquence complémentaire du DNA cible est typiquement un peu plus longue que dans le cas des amorces utilisées pour la PCR:
I'hybridation peut se faire à une température supérieure (de l'ordre de 60") , ce qui améliore la spécificité de la réaction.

Déroulement de la réaction d'amplification par accroissement génique:
On chauffe à 95"C un mélange réactionnel contenant l'échantillon à tester, les amorces spécifiques de la séquence génétique recherchée, une DNA polymérase thermostable, les quatre nucléotides triphosphates, et des sels et des réactifs assurant des conditions opératoires optimales pour l'enzyme. On refroidit ensuite le milieu réactionnel à une température permettant l'hybridation des amorces dans des conditions de spécificité suffisantes (cette température dépend de la séquence et de la longueur des amorces.)(Fig.5b)
Une amorce s'hybride au DNA. La DNA polymérase thermostable utilisée se fixe sur le complexe DNA cible/amorce et commence l'élongation d'une nouvelle chaîne de DNA. (Fig.5c) Après un temps convenable (quelques minutes par exemple) on chauffe la solution de façon à dénaturer les acides nucléiques présents. (Fig.5e)
Une autre amorce se fixe sur le brin nouvellement synthétisé, et la
DNA polymérase réplique ce brin de nouveau. (Fig.Sf) En arrivant à la fin du brin, la DNA polymérase se décroche. (Fig.5h)
A partir de ce moment, et contrairement à la PCR, l'amplification se déroule de façon spontanée et à température constante.

En effet, sous l'effet de l'agitation thermique, la séquence palindromique qui termine le double brin de DNA va maintenant entrer dans un équilibre dynamique entre deux formes: Double brin normal ou double épingle à cheveux. La forme en double épingle permet à la DNA polymérase de se fixer et de commencer à répliquer l'un des brins. (Fig.Sj) Ce faisant, elle déplace le brin déjà en place. Arrivée au terme de la synthèse de ce nouveau brin, elle se décroche et chaque brin nouvellement synthétisé comporte une extrémité capable de servir à initier une nouvelle réplication.

(Fig.5j) L'un des brins est répliqué de façon cyclique, en s'hybridant avec un nouveau primer (Fig.Sf) , L'autre subit un accroissement de taille, toujours selon le même principe (Fig.5k, 51, 5m)
A partir de cette étape, une des deux molécules va s'allonger de façon cyclique, doublant sa longueur à chaque fois. L'amplification ne concerne donc plus seulement le nombre de molécules, mais la masse du DNA.

Il est important de remarquer que l'amplification du nombre de molécules se fait selon une loi arithmétique, permettant ainsi le
DOSAGE des molécules de DNA initiales.

Lorsque le DNA cible est en petite quantité, il est possible de réaliser plusieurs cycles thermiques de dénaturation/renaturation
au début de la manipulation, de façon à augmenter le nombre de
molécules initiales qui subiront l'accroissement lors de l'étape
isotherme ultérieure.

Une agitation modérée à le même effet: dès qu'il atteint une taille
suffisante, le DNA a tendance à se fragmenter spontanément et
chaque fragment peut être à la base de nouveaux cycles
d'accroissement, pour peu que la température permette
l'hybridation des amorces.

Les coupures qui ont lieu au centre de la séquence cible conduisent
à un arrêt de l'accroissement. Les coupures qui ont lieu au voisinage
des séquences palindromiques permettent au contraire à
l'accroissement de se poursuivre.

Dans une autre manière de réaliser l'invention, on peut aussi
utiliser une endonucléase thermostable coupant l'amorce au
voisinage de la séquence palindromique, mais les conditions
opératoires sont alors moins aisées à contrôler.

Dans une autre manière de réaliser l'invention on utilise une
amorce dont la séquence complémentaire du DNA cible est
suffisamment longue pour s'hybrider à haute température (650C ou
plus) A cette température, I'agitation thermique est suffisante pour
que les liaisons entre les brins de DNA s'ouvrent transitoirement
de façon aléatoire. Ces ouvertures permettent l'hybridation des
amorces et on a alors un rendement d'amplification maximal,
I'amplification concernant à la fois la taille des molécule de DNA et
le nombre de ces molécules.

remarque: Dans certaines conditions, il arrive que certaines DNA
polymérase n'achèvent pas totalement la réplication du brin de
DNA dont elles effectuent la copie. Après quelques cycles, la
capacité de former des épingle à cheveux disparais et
l'accroissement s'arrète. On peut prévenir ce phénomène en plaçant
plusieurs séquences palindromiques à la suite les unes des autres.

4es exemples de réalisations sont donnés en figure 3, et figure 4a et
4b. De toutes façons, après 8 ou 9 cycles d'accroissement, le facteur
limitant est le temps: même avec une vitesse de polymérisation de
100 bases à la seconde, qui est la vitesse moyenne à 370C, le
doublement de la taille des produits d'accroissement devient très
lent.

Les produits d'accroissement ont une taille importante: Une molécule de DNA produite par accroissement d'une séquence cible de 400 paires de bases aurait une taille (théorique) de 409 kb après seulement dix cycles d'accroissement. Le comportement physique des produits d'accroissement, mêmes cassés par l'agitation thermique, (leur taille moyenne en solution est d'environ 60 kilobases) diffère énormément de celui des amorces, et même du
DNA cible, si celui-ci est de petite taille (virus par exemple)
Dans une manière particulière de réaliser l'invention, la réaction est réalisée dans une solution contenant une faible concentration d'un gel thermofusible. (par exemple de l'agarose à 0,2%) On peut aussi ajouter la solution d'agarose a la fin de la réaction .On peut aussi placer l'agarose sous forme d'une bille d'agarose de forte concentration, placée dans chaque puit. On fond cette bille par un passage à 80/90 "C en fin de réaction, on agite la plaque pour mélanger les réactifs on laisse se figer les puits. (Fig.6a)
La réaction a lieu dans des plaques de microtitration à 96 puits (ou à 384 puits)ou dans tout récipient de capacité convenable. A la fin de la réaction, on place les plaques à basse température (40C) de façon à faire se figer l'agarose. Les plaques sont ensuites placées à incuber dans un grand volume d'une solution tamponnée contenant un colorant fluorescent spécifique du DNA (Bromure d'éthidium ou colorant Hoechst par exemple). Les amorces diffusent à l'extérieur des puits, mais les produits d'accroissement demeurent bloqués dans les gels. (Fig.6b) Les puits positifs pour la présence du DNA recherché apparaissent donc fluorescents sous éclairage UV. (Fig.6c) (ou bien lorsque l'on laisse diffuser dans ceux-ci un mélange de réactifs propres à exciter la luminescence du colorant par chemiluminescence) Il n'est donc plus la peine de réaliser une électrophorèse, dans le cas de tests rapides. Une éventuelle confirmation du test devra avoir lieu en effectuant une hybridation de controle, selon une des techniques connues. On effectuera avantageusement cette hybridation sous forme d'une hybridation en sandwich dans le puit même où à lieu l'amplification, une sonde de capture étant fixée sur le fond du puit.

Il est possible d'utiliser une telle technique de diffusion différentielle dans un gel après une réaction de PCR, mais le minutage de la diffusion relative des primers et des amplicons est délicat. I1 est évident que l'on peu faire suivre une réaction de PCR par une réaction d'accroissement, de façon à profiter des avantages de la méthode de détection rapide qui vient d'être décrite ci-dessus.

Une des applications des l'invention les plus utiles est le screening de grands nombres de composés biologiquement actifs. Ainsi, pour rechercher des produits actifs sur la transcriptase réverse du virus
HIV, on procèdera de la manière suivante: La solution réactionnelle placée dans les puits d'une plaque de microtitration contient des brins de RNA, en quantité suffisante, la trancriptase réverse du virus, les amorces spécifiques du cDNA synthétisé par l'action de la transcriptase réverse virale sur le RNA spécifique présent dans la solution, des nucléotides triphosphates, une DNA polymérase thermostable, un gel thermofusible (éventuellement ajouté après la fin de la réaction) Des puits servent de témoins: ils ne comporteront que ces réactifs. Dans chaque autre puit, on placera une certaine quantité des composés dont on veut tester l'activité sur la transcriptase réverse du virus HIV. Avant les étapes d'accroissement génétique, on incubera le mélange réactionnel aux températures physiologiques permettant l'action des transcriptases réverses. On peut aussi utiliser une DNA polymérase thermostable, de façon à travailler à température plus élevée. Les cDNA produits seront ensuite soumis à la réaction d'accroissement génique.

Certains puits ne présenteront pas de fluorescence, signe de la présence d'un inhibiteur de la transcriptase réverse. Cette méthode peut être aisément automatisée et permettre le screening d'un grand nombre de produits potentiellement actifs (chimiothèques, extraits de plantes, extraits d'algues, extraits de champignons, extraits animaux, etc...)
De nombreux virus et pathogènes divers synthétisent une
Transcriptase inverse spécifique dont l'activité leur est indispensable. Les rétrovirus, par exemple les lentivirus (HIV), les
Oncornavirus (HTLV), les spumavirus sont évidement les premiers concernés. Mais le virus HBV (hépatite B) nécessite lui aussi l'action d'un transcriptase réverse spécifique, bien qu'il s'agisse d'un virus à
ADN. Les plasmodia du paludisme synthétisent eux aussi de grandes quantités de transcriptase réverse spécifique. I1 est à noter que les plasmodia deviennent actuellement résistants à l'ensemble des produits actifs que nous avons à notre disposition dans la pharmacopée. Des inhibiteurs de toutes ces transcriptases réverses seraient d'un immense secours dans la lutte contre de nombreux pathogènes. Cependant, ceux-ci sont souvent difficiles à cultiver, ce qui interdit le screening extensif de nombreux produits. Les transcriptase réverses endogènes des eucaryotes sont elles aussi impliquées dans le processus de certaines affections. Citons pour mémoire le phénomène d'amplification des gènes de résistance aux médications de chimiothérapie observé lors du traitement de nombreux cancers.

De même, I'invention peut servir à tester l'activité des DNA polymérases. Passé les deux premières étapes qui exigent une dénaturation, il n'est pas utile de travailler avec des DNA polymérases thermostables. Il suffit de rajouter de la DNA polymérase après chacune des deux étapes de chauffage.

L'équilibre entre la forme double brin et la forme double épingle à cheveux à lieu aussi aux températures physiologiques, mais la vitesse d'accroissement est moindre.

Dans une autre manière d'appliquer l'invention, on utilise aussi la capacité de la méthode de produire l'amplification du DNA à température relativement basse. Dans le conditions physiologiques, à l'intérieur des cellules, des cofacteurs protéiques impliqués dans les phénomènes de réplication et d'expression des gènes permettent à l'hybridation des amorces d'accroissement d'avoir lieu sans chauffage, bien qu'avec un rendement faible. L'ensemble de la réaction d'accroissement peut avoir lieu à 370. Cependant le DNA synthétisé est dégradé assez rapidement. Cependant, si l'on arrive à faire rentrer des amorces d'accroissement en quantité suffisante dans les cellules, et à éviter leur dégradation, il est théoriquement possible d'altérer suffisamment les mécanismes cellulaires pour entrainer spécifiquement la mort des cellules contenant des séquences de DNA spécifiques des amorces. Cette altération a lieu par compétition avec les réactions cellulaires et épuisement de certains composés et aussi par l'action mécanique du DNA de haut poids moléculaire produit par la réaction d'accroissement. Par exemple, on pourrait tuer spécifiquement des cellules contenant le virus HIV (pour épurer des prélèvements de moelle osseuse en vue d'une réimplantation par exemple.)
Dans cette manière de réaliser l'invention, on synthétisera les amorces d'amplification dans un synthétiseur d'ADN en utilisant des analogues de nucléotides triphosphates conduisant à des oligonucléotides non dégradables par les enzymes cellulaires (phosphorothioates, par exemple) La charge électrique totale des amorces d'accroisssement sera diminuée par une méthode chimique (par couplage de groupements amines selon une méthode déjà décrite par exemple, ou en utilisant pour la synthèse des analogues de nucléotides dont la charge portée par le groupe phosphate aura été supprimée) de façon à leur permettre de traverser les membranes.

Les amorces d'accroissement résistantes peuvent aussi être incluses dans des liposomes, la surface de ceux-ci comportant éventuellement des marqueurs servant à les guider spécifiquement vers une catégorie de cellules particulières.

Exemple: L'invention pourra être réalisée en synthétisant des liposomes comportant à leur surface des parties des protéines recombinantes de la surface du virus HIV. De tels liposomes se fixent spécifiquement aux récepteurs CD4. De tels liposomes contenant de grandes quantité d'amorces d'accroissement vont aller fusionner spécifiquement avec la surface de certaines cellules.

(lymphocytes T4, T8, hématies, cellules du système immunitaire spécifiques de certains tissus, commes les astrocytes, les cellules de
Langerhans ou les plaques de Peyer) Dans les cellules contaminées par le virus HIV, la réaction d'accoissement va détourner une partie du stock de nucléotides triphosphates, cellulaires, et des enzymes du cycle de réplication, diminuant le taux de réplication du virus. Si l'accroissement génique à lieu avec un rendement suffisant, il est possible que les fonctions vitales de la cellule soient affectées et que la mort cellulaire soit accélérée. On a ainsi un processus mimant l'immunité cellulaire spécifique et conduisant à une sorte d'apoptose dirigée (Ce terme doit être entendu ici avec une sémantique élargie)
A titre d'exemple, on peut aussi citer la possibilité de réaliser des liposomes contenant des amorces spécifiques des plasmodia du paludisme. (amorces spécifiques du DNA génomique, du DNA mitochondrial, kinétoplasmique ou épisomique) La surface de ces liposomes contenant les protéines recombinantes spécifiques des récepteurs de surface des globules rouges (anticorps anti A, anti B, anti duffy, etc...) On peut aussi utiliser les protéines recombinantes spécifiques de la surface des stages infectieux du paludisme, ou des protéines recombinantes contenant tout ou partie de la protéine GP 120 du HIV. En effet, la membrane des globules rouges présente dans certains cas un nombre de récepteurs CD4 résiduels suffisants pour permettre la fusion des liposomes portant des protéines réceptrices de ces récepteurs. Cependant la méthode la plus efficace est de fixer sur les protéines de surface des liposomes des anticorps anti-marqueurs de groupes sanguins (A ou B)
Une fois introduites dans les hématies, les amorces d'accroissement diffusent vers le cytoplasme de l'hématozoaire en utilisant les pores reliant celui-ci avec le cytoplasme de l'hématie. L'accroissement génique interfère avec le dévelloppement de l'hémotozoaire, allant jusqu'a le désorganiser.

Il est important de remarquer que le déroulement de l'accroissement génique in vivo se déroule d'autant mieux que les cellules ou cette réaction a lieu se divisent d'autant plus rapidement, ou hébergent un parasite se divisant rapidement. Le
DNA est d'autant plus facilement accessible et les cofacteurs (polymérases, déroulases, topoisomérases, protéines déstabilisantes des doubles hélices, protéines stabilisantes des simples brins, etc..) sont présents en quantité d'autant plus grandes que les cellules sont dans un stade de division rapide. Considérant ce fait, des liposomes contenant des amorces d'accroissement correspondant à un gène donné et portant à leur surface des protéines reconnues par des recepteurs membranaires spécifiques d'une certaine classe de cellules peuvent être à la base d'un traitement des tumeurs cancéreuses tuant ou inhibant la croissance de cellules cancéreuses en division rapide, et restant sans action sur les cellules normales.

Cette technique bénéficie donc d'une double spécificité, tissulaire d'une part, dépendant du taux de division cellulaire d'autre part.

Détermination du sexe.

Une autre application particulière de l'invention est la détection prénatale du sexe des enfants à naître. I1 a été démontré que le chromosomes Y était porteur de séquences spécifiques, pouvant être détectées par hybridation. ( voir notamment, Nucléotide sequence of 49 a, a génomic probe detecting multiples RFLP on the
Y chromosome. Gérard LU COTTE, Martine MARIOTTI and Fabrice
DAVID. Molécular & Cellular Probes (1991) 5, 359-363. ) De façon précoce au cours de la grossesse, des cellules foetales traversent le placenta pour entrer dans la circulation générale de la mère. On peut mettre la présence de ces cellules en évidence grâce à la PCR, mais la méthode est extrèmement sensible aux contamination dues aux poussières de laboratoire. En effet, une partie importante de ces poussières est constituée de cellules desquamées desséchées. Si des chercheurs ou des techniciens se mêlent aux techniciennes dans les locaux où sont effectués les tests, tous les échantillons deviennent rapidement positifs.

Il est possible de pratiquer la méthode d'accroissement génique in situ sur un frottis de culot de globules blancs réalisé à partir d'un prélèvement sanguin. Les cellules feotales apparaissent fluorescentes en observation aux UV. On peut aussi opérer en solution, et dénombrer les cellules fluorecentes à l'aide d'un appariel de comptage en flux liquide.

Marqueurs de taille.

Les produits d'accroissement peuvent être utilisés comme marqueurs de taille lors d'expériences d'électrophorèse en champ pulsés. On mélangera les produits de réaction d'accroissement obtenus après des temps de réaction variables, la fin de chaque réaction étant conduite à température relativement basse. On ajoute au mélange de l'agarose pour éviter la fragmentation du DNA par les forces de cisaillement. Le mélange obtenu pourra être commercialisé tel quel, prèt à l'emploi, sous forme de petites lamelles d'agarose solide de la taille des puits du système d'électrophorèse. Après dépôt dans un puit et électrophorèse, on obtiendra une série de bandes correspondant à des fragment de
DNA de taille multiple de celle du DNA amplifié, et de séquence parfaitement connue

Claims (10)

1. DNA polymérase en présence des réactifs convenables, l'action de ladite enzyme ayant lieu à température constante pendant la plus grande partie de la réaction d'accroissement génique.

   Revendications 1 Procédé d'amplification du matériel génétique caractérisé en ce qu'il met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques comportant chacune une séquence spécifique du DNA à amplifier et une séquence repétée inversée, ou une série de séquences répétées inversées, ces amorces étant destinées à permettre l'action d'une
2. 2 Amorces oligonucléotidiques selon la revendication 1 caractérisées en ce que ces amorces sont synthétisées à l'aide d'un appariel de synthèse d'oligonucléotides, ou par clivage enzymatique d'un plasmide, ou bien obtenues par une méthode d'amplification génétique faisant partie de l'art antérieur.
3. 3 Procédé consistant à ajouter à une étape particulière de la réaction d'amplification selon la revendication 1 un gel d'agarose ou de polyacrylamide ou d'un polymère convenable, caractérisé en ce que ce gel est capable d'emprisonner spécifiquement les produits d'amplification, de permettre la coloration de ceux-ci tout en laissant diffuser les amorces hors du gel.
4. 4 Trousses de diagnostic contenant les amorces selon la revendications 2, et les réactifs nécessaires pour leur mise en oeuvre selon la revendication 1, et des récipients convenables tels que des plaques de microtitration, garnis de gel selon la revendication 3, et éventuellement un système de détection des produits d'accroissement utilisant une réaction d'hybridation avec des sondes nucléiques marquées.
5. 5 Procédé consistant à introduire des amorces selon la revendication 2 dans des liposomes, caractérisé en ce qu'il facilite la pénétration desdites amorces dans des cellules vivantes.
6. 6 Procédé selon l'une des revendications 1, 2 et 5 caractérisé en ce que les produits d'accroissement sont mis en évidence par coloration à l'aide d'un composé fluorescent colorant spécifiquement le DNA, les cellules étant fixées sur des lames ou en suspension dans un liquide, ladite suspension cellulaire pouvant être étudiée par des appariels de comptage cellulaire automatisés.
7. 7 Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que le déroulement de la réaction d'accroissement spécifique d'une séquence d'acide nucléique dans des cellules données interfère avec les fonctions vitales de celles-ci, allant parfois jusqu'à les tuer.
8. 8 Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la séquence cible est un gène constitutif des cellules humaines ou animales, éventuellement amplifié par un processus pathologique, et que le rendement de la réaction d'accroissement est dépendante de la vitesse de division cellulaire, les cellules se divisant le plus rapidement étant d'autant plus sensibles aux effets délétères de la réaction d'accroissement.
9. 9 Procédé selon l'une des revendications 1,2, et 5 caractérisé en ce que la séquence cible est le RNA d'un virus tel que HIV1 ou HIV 2 ou le DNA d'un virus tel que HBV ou

   HPV ou une partie du génome chromosomique ou extrachromosomique du plasmodium falciparum.
10. 10 Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la réaction d'amplification (ou accroissement génique) est précédée d'une étape mettant en jeu une transcriptase réverse, telle la transcriptase reverse du virus HIV, cette étape servant à tester l'efficacité de différants composés ou mélanges de composés pouvant inhiber spécifiquement ladite enzyme, en vue de sélectionner des agents thérapeutiques.

    1 1 Produits de la réaction d'accroissement selon le procédé de l'une quelquonque des revendications 1 et 2, la réaction étant interrompue après un, eux, trois, etc... cycles d'accroissement, ces produits d'accroissement étant destinés à être utilisés en mélange comme marqueurs de taille au cours d'électrophorèses en champs pulsés.