FR2714474A1 - Method, composition and combination of enzymatic labeling, and test kit and corresponding labeled substance - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne le marquage d'une substance ou d'un article dans le but d'identifier ladite substance ou ledit article. Plus précisément, l'invention concerne un procédé, une composition, une combinaison utilisables pour marquer une substance ou un article avec une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, ainsi qu'une trousse de test utilisable pour identifier la substance ou l'article, et la substance marquée ou l'article marqué ainsi obtenu. Le marquage selon l'invention peut être utilisé notamment pour vérifier l'authenticité d'une substance ou d'un article.The present invention relates to the marking of a substance or an article for the purpose of identifying said substance or article. More specifically, the invention relates to a method, a composition, a combination useful for labeling a substance or an article with an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a. binder for a fragment of an enzyme molecule, as well as a test kit usable to identify the substance or article, and the labeled substance or labeled article thus obtained. The marking according to the invention can be used in particular to verify the authenticity of a substance or of an article.
Description
i La présente invention concerne le marquage d'une substance ou d'unThe present invention relates to the marking of a substance or a
article et peut être utilisée pour le marquage d'une substance ou d'un article dans le article and can be used for the marking of a substance or article in the
but d'identifier ladite substance ou ledit article. purpose of identifying said substance or said article.
Selon un aspect de la présente invention, il est proposé un procédé destiné à être utilisé pour le marquage d'une substance ou d'un article, lequel proc&édéi comprend la fourniture à une substance ou un article d'une molécule d'enzyme, d'un fragment d'une molécule d'enzyme, d'un liant pour une molécule According to one aspect of the present invention, there is provided a method for use in the labeling of a substance or article, which method comprises providing to a substance or article an enzyme molecule, d. a fragment of an enzyme molecule, a binder for a molecule
d'enzyme ou d'un liant pou un fragment d'une molécule d'enzyme. of enzyme or a binder for a fragment of an enzyme molecule.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est proposé un procédé qui peut être utilisé pour identifier une substance ou un article, lequel procédé comprend la fourniture à une substance ou un artidcl d'une molécule d'enzyme, d'un fragment d'une molécule d'enzyme, d'un liant pour une molécule d'enzyme ou d'un liant pour un fragment d'une mol6culc d'enzyme et l'accomplissement d'une étape de détection pour dterminer la pr6sence ou l'absence d'une moléculec d'enzyme, d'un fragment d'une molecule d'enzyme, d'un liant pour une molécule d'enzyme ou d'un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme. A titre d'exemple, la présente invention peut êtrc utilisée pour le According to another aspect of the present invention, there is provided a method that can be used to identify a substance or article, which method comprises providing to a substance or an artide of an enzyme molecule a fragment of a an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme moleucle and performing a detection step to determine the presence or absence thereof of an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule. By way of example, the present invention may be used for the
marquage dissimulé d'une substance ou d'un article. concealed marking of a substance or article.
Il importe de comprendre que, selon la présente invention, un marqueur peut êtrec une mol6culc d'enzyme, un fragment d'une molculc d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme. Selon un autre aspect de la présente invention, il est proposé un procèdé qui peut être utilise pour identifier une substance ou un article, lequel proc&édé comprend l'accomplissement d'une étape de détection pour d6terminer la présence ou l'absence d'une molécule d'enzyme, d'un fragment d'une moléculc d'enzyme, d'un liant pour une mol&culc d'enzyme ou d'un liant pour un fragment It is important to understand that, according to the present invention, a label may be an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of a molecule of a molecule. 'enzyme. According to another aspect of the present invention, there is provided a method that can be used to identify a substance or article, which method comprises performing a detection step to determine the presence or absence of a molecule. of enzyme, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment
d'une moléculc d'enzyme.of an enzyme molecule.
A titre d'exemple, il importe de comprendre qu'une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, selon l'aspect de l'invention imm&édiatement précèdent, peut êctre choisie de manière à être un marqueur. Il est à noter qu'un anticorps dirigé contre une molécule d'enzyme est un liant pour une molécule d'enzyme et qu'un anticorps dirigé contre un fragment By way of example, it is important to understand that an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule, according to the aspect of the invention immediately preceding, may be chosen so as to be a marker. It should be noted that an antibody directed against an enzyme molecule is a binder for an enzyme molecule and an antibody directed against a fragment
d'unc moléculc d'enzyme est un liant pour un fragment d'une molécule d'enzymc. an enzyme molecule is a binder for a fragment of an enzymic molecule.
De même, il est à noter quune molécule d'enzyme et un liant pour celle- ci peuvent être considérés comme étant des partenaires de liaison spécifiquc ct qu'un fragment d'unc molécule d'cnzymc et un liant pour cclui-ci peuvent êtrc considérés commec étant des partenaires de liaison spécifiquc. On dispose dc nombreuses molécules d'cnzyme ct de nombreux fragments de molécules d'enzymc. A titre d'exemplc, il cst possible d'utiliscr selon l'invention toutc molécule d'cnzymc appropriée, tout fragment approprié d'une molécule d'enzyme, tout liant approprié pour une molécule d'enzyme ou tout liant Similarly, it should be noted that an enzyme molecule and a binder for it may be considered as specific binding partners, and that a fragment of a molecule of a molecule and a binder thereof may be considered to be specific liaison partners. Many molecules of enzyme and many fragments of enzymic molecules are available. By way of example, it is possible to use according to the invention any suitable molecule of cnzymc, any suitable fragment of an enzyme molecule, any suitable binder for an enzyme molecule or any binder
approprié pour un fragment d'une molécule d'enzyme. suitable for a fragment of an enzyme molecule.
La phosphatase alcalinc ct la peroxydase de raifort sont des exemples de molécules d'enzyme qui peuvent êtrc utilisées selon la présentc invention. Les anticorps dirigés contrc la phosphatae alcaline et la peroxydasc de raifort sont des Alkaline phosphatase and horseradish peroxidase are examples of enzyme molecules that can be used in the present invention. The antibodies directed against alkaline phosphatae and horseradish peroxydasc are
exemples de liant qui peuvent être utilisés selon la présente invention. examples of binder that can be used according to the present invention.
Il est à noter quc les molécules d'enzymc et les fragments de molécules It should be noted that enzymc molecules and fragments of molecules
d'enzyme peuvent être plus stables (par exemple moins sensibles à des modifi- may be more stable (eg less sensitive to changes in
cations inaccptables) lorsqu'ils sont liées à leurs liants respectifs (anticorps). inaccessible cations) when bound to their respective binders (antibodies).
Ainsi, par exemplc, il peut être avantageux dans certaines circonstances de munir une substance ou un article d'unc molécule d'enzyme liée à un liant d'une molécule d'enzyme, ou d'un fragment d'une moléculc d'enzyme lié à un liant pour le fragment de moléculc d'cnzymc, étant donné quc les molécules d'cnzymc li6es ou les fragments liés dc molécules d'enzyme pcuvcnt êtrc plus stables quc Ies formes non liées (par exemplc vis-à-vis du traitement ct du stockage). La détection d'une moléculc d'enzyme liée à son liant ou d'un fragment d'unc molécule d'enzymc lié à son liant peut êtrc réaliscée par exemplc par voie enzymologique. Thus, for example, it may be advantageous in some circumstances to provide a substance or article with a binder-bound enzyme molecule of an enzyme molecule, or a fragment of an enzyme molecule. bound molecules or enzyme molecule-linked fragments may be more stable than non-bound forms (for example, with respect to the treatment). storage). The detection of an enzyme molecule bound to its binder or a fragment of an enzymc molecule bound to its binder can be carried out for example enzymologically.
Ainsi, par exemplc, dans la description dc cettc invention, le terme Thus, for example, in the description of this invention, the term
"moléculc d'enzymec peut désigner une moléculc d'enzymc tellc quellc ou peut désigner unc moléculc d'cnzymc liée à un liant spécifique (anticorps) pour la moléculc d'enzymc, et l'cxprcssion 'fragment d'unc moléculc d'enzyme' peut désigner un fragment d'unc molécule d'enzymc tel quel ou peut désigner un fragment d'une molécule d'cnzymc lié à un liant spécifique (anticorps) pour le The enzymec molecule may refer to a specific enzyme molecule or may refer to a specific binding molecule (antibody) for the enzymic molecule, and to a fragment of an enzyme molecule. can designate a fragment of an enzymc molecule as it is or can designate a fragment of a molecule of cnzymc bound to a specific binder (antibody) for the
fragment de molécule d'enzyme.enzyme molecule fragment.
Selon la présente invention, une substance o un article peut êtrc muni d'un marqueur, ledit marqueur étant une moléculc d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un According to the present invention, a substance or an article may be provided with a label, said label being an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a molecule.
fragment d'une molécule d'enzyme, de toute manière appropriée. fragment of an enzyme molecule, in any appropriate manner.
Ainsi, par exemple, lorsqu'une substance est un fluide, tel qu'un liquide, un marqueur peut être introduit dans le fluide par une opération de mélange. A titre d'exemple, lorsque la substance est une pâte ou un solide (par exemple un produit chimique), un marqueur peut être introduit pendant la Thus, for example, when a substance is a fluid, such as a liquid, a marker may be introduced into the fluid by a mixing operation. By way of example, when the substance is a paste or a solid (for example a chemical), a marker may be introduced during
fabrication de la pâte ou du solide. manufacture of the paste or the solid.
Ainsi, par exemple, un marqueur qui comprend une moléculec d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une moléculc d'enzyme peut être Thus, for example, a label which comprises an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule may be
incorporé dans une substance.incorporated into a substance.
Lorsqu'un article doit être muni d'un marqueur, le marqueur peut être apporté de toute manière appropriée (par exemple par application à l'article). Ainsi, par exemple, une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule When an article is to be provided with a marker, the marker may be brought in any appropriate manner (eg by application to the article). Thus, for example, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of a molecule
d'enzyme peut tre appliqué à un article de toute manière appropriée. of enzyme can be applied to an article in any appropriate manner.
A titre d'exemple, un marqueur peut être incorporé dans une composition destinée à être appliquée à un article. Une telle composition peut être par exemple une encre, un milieu à base d'encre ou une composition d'encre, ou bien une composition de pointure destinée à être appliquée à un article par des moyens appropriés. Ainsi, par exemple, un marqueur qui comprend une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être incorporé dans une encre, un milieu à base d'encre, une composition d'encre ou une composition de peinture susceptible d'être appliquée à un article. L'encre ou le milieu à base d'encre peut être par exemple une encre invisible, un milieu à base For example, a marker may be incorporated into a composition for application to an article. Such a composition may be for example an ink, an ink-based medium or an ink composition, or a size composition intended to be applied to an article by appropriate means. Thus, for example, a label which comprises an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be incorporated into an ink, an ink-based medium, an ink composition, or a paint composition that can be applied to an article. The ink or the ink-based medium may be for example an invisible ink, a medium based on
d'encre invisible ou une composition d'encre invisible. invisible ink or an invisible ink composition.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est proposé une composition qui comprend une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme. La composition peut être par exemple une composition d'encre qui comprend une molécule d'enzyme, un fragment dune molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une According to another aspect of the present invention, there is provided a composition which comprises an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of a molecule enzyme. The composition may be, for example, an ink composition which comprises an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an
molécule d'enzyme.enzyme molecule.
On notera que les constituants d'une composition doivent être choisis de manière qu'il n'y ait pas d'interférence inacceptable entre le marqueur et les autres constituants de la composition, susceptible de provoquer une détérioration inacceptable des propriétés de la composition. En outre, les constituants de la composition ne doivent provoquer aucune détérioration inacceptable des propriétés du marqueur. Par ailleurs, le marqueur doit etre tel qu'il puisse être détecté après avoir été appliqué à un article et après exposition de l'article aux conditions qu'il peut rencontrer (par exemple expédition et/ou stockage). Il est à noter que la présente invention peut être utilisée pour munir une substance ou un article d'un marqueur de manière que la nature du marqueur ne soit pas connue des personnes non autorisées. En outre, on peut faire en sorte que la quantité de marqueur appliquée soit ignorée des personnes non autorisées. Si on le souhaite, on peut faire It should be noted that the constituents of a composition should be chosen so that there is no unacceptable interference between the label and the other constituents of the composition, which can cause an unacceptable deterioration of the properties of the composition. In addition, the constituents of the composition should not cause any unacceptable deterioration of the properties of the marker. Furthermore, the marker must be such that it can be detected after being applied to an article and after exposure of the article to the conditions it may encounter (eg shipping and / or storage). It should be noted that the present invention may be used to provide a substance or article with a marker so that the nature of the marker is not known to unauthorized persons. In addition, it can be ensured that the amount of marker applied is ignored by unauthorized persons. If you wish, we can do
en sorte que l'existence d'un marqueur soit ignorée des personnes non autorisées. so that the existence of a marker is ignored by unauthorized persons.
Lorsqu'un article est marqué, on peut faire en sorte que la position du marqueur When an article is marked, we can make sure that the position of the marker
soit ignorée d'une personne non autorisée. ignored by an unauthorized person.
Il importe de noter également qu'il suffit que la nature d'un marqueur soit connue seulement par des personnes essentielles car il n'est pas absolument nécessaire que les personnes impliquées dans l'application d'un marqueur sur une substance ou un article, dans les tests de contrôle de qualité ou dans les tests destinés à vérifier si un marqueur particulier est présent, connaissent la nature du marqueur (du fait qu'il n'est pas nécessaire que les réactifs utilisés dans les tests It is important to note also that it is sufficient that the nature of a marker is known only to essential persons because it is not absolutely necessary that the persons involved in the application of a marker on a substance or an article, in quality control tests or in tests to check whether a particular marker is present, know the nature of the marker (because the reagents used in the tests need not be
soient identifiés autrement que par des codes de référence par exemple). identified otherwise than by reference codes for example).
Selon la présente invention, une substance ou un article peut être muni d'un marqueur comprenant une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, en toute concentration appropriée. Une concentration appropriée peut tre telle, par exemple, que la quantité de marqueur présente rende difficile ou sensiblement impossible pour une personne non autorisée d'identifier le marqueur par des procédés "conventionnels" (par exemple par des procédés physicochimiques tels que la chromatographie) mais que la quantité de marqueur utilisée soit suffisante pour faciliter la détection par une personne autorisée à l'aide According to the present invention, a substance or article may be provided with a label comprising an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme. an enzyme molecule, in any appropriate concentration. An appropriate concentration may be such, for example, that the amount of label present makes it difficult or substantially impossible for an unauthorized person to identify the label by "conventional" methods (for example by physicochemical methods such as chromatography) but the quantity of marker used is sufficient to facilitate detection by a person authorized to
de réactifs de détection autorisés. authorized detection reagents.
A titre d'exemple, une composition pouvant être utilisée pour le marquage d'une substance ou d'un article peut contenir un marqueur en une By way of example, a composition that can be used for marking a substance or article may contain a marker in one
concentration de 0,1 à 80 000 fgl.concentration from 0.1 to 80,000 fgl.
La présente invention peut être utilisée pour le marquage à des fins appropriées quelconques. Ainsi, par exemple, le marquage peut être accompli pour qu'une substance ou un artidcle puisse être identifié de manière à authentifier la The present invention may be used for marking for any suitable purpose. Thus, for example, tagging can be accomplished so that a substance or artide can be identified to authenticate the
substance ou l'article.substance or article.
Ainsi, par exemple, la présente invention peut être utilisée pour l'identification d'une substance ou d'un article dans le but de distinguer une substance authentique ou un article authentique d'une substance ou d'un article de contrefaçon. A titre d'exemple également, la présente invention peut être utilis&ée pour identifier une substance ou un article dans le but de surveiller le mouvement d'une substance ou d'un article (par exemple dans une chaîne ou un réseau). Ainsi, par exemple, le mouvement d'une substance ou d'un article peut être surveillé dans le but de surveiller le fonctionnement d'une chaîne de distribution ou d'un réseau de distribution ou, par exemple, le mouvement d'aune substance ou d'un article peut être surveille dans le but de détecter le détournement de produits (par exemple par un agent intermédiaire dans une chaîne commerciale ou dans un réseau commercial). La présente invention peut être utilisée par exemple pour le marquage de toute substance appropriée ou de tout article approprié, par exemple un solide, un liquide ou d'autres substances ou articles appropris. La présente invention peut être utilisée par exemple pour marquer une substance ou un article qui a ét rendu Thus, for example, the present invention may be used for the identification of a substance or article for the purpose of distinguishing an authentic substance or an authentic article from a counterfeit substance or article. By way of example also, the present invention can be used to identify a substance or article for the purpose of monitoring the movement of a substance or article (e.g. in a chain or network). Thus, for example, the movement of a substance or article may be monitored for the purpose of monitoring the operation of a distribution chain or distribution network or, for example, the movement of a substance or an article may be monitored for the purpose of detecting the diversion of products (eg by an intermediate agent in a commercial chain or in a commercial network). The present invention may be used, for example, for the marking of any suitable substance or article, for example a solid, a liquid or other suitable substances or articles. The present invention may be used, for example, to mark a substance or article that has been rendered
approprié pour le marquage.suitable for marking.
On comprendra qu'en munissant une substance choisie ou un article choisi d'un marqueur choisi ou de marqueurs choisis, il peut être possible par exemple de distinguer cette substance ou cet article d'autres substances ou d'autres It will be understood that by providing a selected substance or a selected article with a chosen marker or selected markers, it may be possible, for example, to distinguish this substance or article from other substances or other substances.
articles au moyen d'un test permettant de détecter le ou les marqueurs choisis. articles by means of a test for detecting the chosen marker or markers.
Ainsi, par exemple, la présence d'un marqueur choisi ou de marqueurs choisis peut indiquer qu'une substance testée ou un article testé est la substance choisie ou l'article choisi tandis que l'absence d'un tel marqueur choisi ou de tels marqueurs choisis peut indiquer qu'une substance ou un article n'est pas la substance choisie Thus, for example, the presence of a selected marker or selected markers may indicate that a tested substance or test article is the selected substance or article selected while the absence of such a selected marker or such selected selected markers may indicate that a substance or article is not the substance of choice
ou l'article choisi.or the article chosen.
Les substances qui peuvent être marquées et les articles qui peuvent être marqués sont par exemple les parfums, les billets de banque, les oeuvres d'art, les documents de valeur réalisables, les articles de mode et de haute couture, les montres, les produits électriques, les livres, les passeports, les médicaments, tout produit de haute valeur (par exemple les produits de luxe), tout article à grand volume de vente, les articles de prestige de grande valeur, les formulations chimiques, les viandes et les produits à base de viande (par exemple les viandes et Substances that can be marked and items that can be marked are, for example, perfumes, banknotes, works of art, valuable documents, fashion and haute couture items, watches, products books, passports, drugs, any high-value products (eg luxury goods), high-volume items, valuable high-value items, chemical formulations, meats and products meat-based products (eg meat and
les aliments cachères), et les emballages pour différents produits. kosher foods), and packaging for different products.
Il est à noter que la présente invention peut être utilisée pour le marquage d'une substance ou d'un article d'une manière destinée à empêcher les ventes et les falsifications frauduleuses, les copies non autorisées et les produits faux. Un tel marquage peut être utilisé par exemple pour permettre à un fabriquant authentique d'identifier de manière non équivoque une substance ou un article produit par lui et de distinguer une telle substance ou un tel article d'une substance ou d'un article non authentique. Ceci permet à un fabriquant authentique de chercher à empêcher les pertes de revenus qui peuvent être provoquées par la présence de substances ou d'artidcles non authentiques dans un marché donné. Par exemple, les fabriquants peuvent être capables de décrouvrir des substances et des articles qui, bien qu'ils ne soient pas fournis par eux, portent leurs noms de marque It should be noted that the present invention may be used for marking a substance or article in a manner intended to prevent fraudulent sales and forgeries, unauthorized copies and false products. Such marking may be used, for example, to enable an authentic manufacturer to unambiguously identify a substance or article produced by him and to distinguish such a substance or article from a substance or non-genuine article. . This allows a genuine manufacturer to seek to prevent revenue losses that may be caused by the presence of non-genuine substances or artidcles in a given market. For example, manufacturers may be able to discover substances and articles that, although not supplied by them, bear their brand names.
et/ou leurs emballages.and / or their packaging.
Si on le souhaite, la présente invention peut être utilisée par exemple pour marquer une substance ou un article de manière à indiquer le numéro de lot If desired, the present invention may be used, for example, to mark a substance or article to indicate the batch number
et/ou la date limite d'utilisation.and / or the expiry date.
A titre dcexemple, un marqueur peut être appliqué à un article dans tout agencement approprié. Ainsi, par exemple, une composition (par exemple, une encre) contenant un marqueur comprenant une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être appliquée à un article sous forme d'un ensemble voulu de marques (par exemple des chiffres, des lettres, des formes ou For example, a marker may be applied to an article in any appropriate arrangement. Thus, for example, a composition (for example, an ink) containing a label comprising an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be applied to an article as a desired set of marks (eg, numbers, letters, shapes or
des dessins).drawings).
Le marquage des substances et des articles selon la présente invention peut être réalisé à titre d'exemple par: (a) mélange d'un marqueur avec une encre ou une composition de véhicule d'encre (par exemple à raison de 0,1-80 000 fg/l) et l'impression directement sur un article, ou (b) application d'une solution d'unm marqueur (par exemple dans l'eau ou dans une combinaison d'eau et de solvant organique) directement sur un article, (c) immersion d'une partie de la surface d'un article dans une solution d'un marqueur pour fixer (par exemple adsorber) le marqueur sur l'article, ou (d) mélange d'un marqueur avec une matière colorante ou une peinture destinée à être utilisée avec des articles ou des emballages, ou The marking of the substances and articles according to the present invention can be carried out by way of example by: (a) mixing a marker with an ink or ink vehicle composition (e.g. 80,000 fg / l) and printing directly on an article, or (b) applying a solution of a marker (eg in water or a combination of water and organic solvent) directly to a article, (c) immersing a portion of the surface of an article in a solution of a marker to fix (eg, adsorbing) the marker on the article, or (d) mixing a marker with a material dye or paint for use with articles or packaging, or
(c) addition d'un marqueur directement à des solutions ou formu- (c) adding a marker directly to solutions or formulas
lations de produits chimiques (par exemple médicaments, peintures, aliments, etc.), ou (t) mélange d'un marqueur avec une substance adhésive qui peut ensuite être utilisée pour fixer des étiquettes ou du papier à des articles, ou (g) inscription (par exemple au cours de l'impression) d'un document de certification qui doit accompagner les produits, ou (h) application d'une composition de véhicule d'encre à un article et traitement (par exemple par séchage) de la composition de véhicule d'encre pour former une couche hydrophobe solidement fixée et application d'un marqueur (par exemple en solution ou en suspension) à la couche hydrophobe de manière que le marqueur soit associé à la couche (par exemple par adsorption) et traitement (par exemple par séchage) pour appliquer un marqueur sur l'article, ou (i) activation (par exemple par oxydation avec le periodate) d'un constituant d'une composition de véhicule d'encre pour former des sites réactifs auxquels un marqueur peut être lié de manière covalente, application de la composition de véhicule d'encre à un article et traitement de la composition d'encre (par exemple par séchage) pour former une couche solidement fixée, et introduction d'un marqueur sur la couche de manière à fixer le marqueur à la couche par liaison covalente, ou (j) application d'une composition de véhicule d'encre à un article et traitement (par exemple par séchage) de la composition de véhicule d'encre pour former une couche solidement fixée, activation (par exemple par oxydation avec le periodate) de la couche pour produire sur celle-ci des sites réactifs auxquels un marqueur peut être lié de manière covalente afin de réaliser la fixation du marqueur à la couche et introduction du marqueur sur the use of chemicals (eg drugs, paints, food, etc.), or (t) mixing a marker with an adhesive substance which can then be used to attach labels or paper to articles, or (g) registration (for example during printing) of a certification document which must accompany the products, or (h) application of an ink vehicle composition to an article and treatment (for example by drying) of the ink vehicle composition for forming a firmly fixed hydrophobic layer and applying a marker (eg in solution or suspension) to the hydrophobic layer so that the label is associated with the layer (eg by adsorption) and treatment (eg, by drying) to apply a label to the article, or (i) activating (eg, periodate oxidizing) a constituent of an ink vehicle composition to form reactive sites to which a marker pe can be covalently bonded, applying the ink vehicle composition to an article and treating the ink composition (e.g., by drying) to form a securely attached layer, and introducing a marker onto the ink layer; to fix the label to the layer by covalent bonding, or (j) applying an ink vehicle composition to an article and treating (e.g., drying) the ink vehicle composition to form a layer securely fixed, activating (eg, periodate oxidizing) the layer to produce reactive sites thereon to which a label can be covalently bonded to effect binding of the label to the layer and introduction of the label onto the label;
la couche pour fixer le marqueur à la couche par liaison covalente. the layer to fix the marker to the layer by covalent bonding.
On notera qu'un marqueur tel que décrit ci-dessus aux points (a) à (j) peut comprendre une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme. Selon la présente invention, une molécule d'enzyme, un fragment d'une moléculc d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être détecté de toute manière appropriée. A titre d'exemple, une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être détecté in situ (par exemple tandis qu'il est encore fixé à un article). Ou bien encore, à titre d'exemple, une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être extrait d'une substance It will be appreciated that a label as described above at (a) to (j) may comprise an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule. According to the present invention, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be detected in any suitable manner. By way of example, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be detected in situ (by example while it is still attached to an article). Alternatively, by way of example, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be extracted of a substance
ou d'un article et soumis à une détection. or an article and subject to detection.
L'extraction peut être accomplie de toute manière appropriée. Extraction can be accomplished in any convenient way.
Par exemple, lorsqu'un tel marqueur doit être extrait d'un liquide, le liquide peut être évaporé pour laisser un résidu et le résidu peut être traité avec un milieu liquide approprié (par exemple une solution tampon) pour produire un For example, when such a label is to be extracted from a liquid, the liquid may be evaporated to leave a residue and the residue may be treated with a suitable liquid medium (eg a buffer solution) to produce a liquid.
échantillon liquide qui peut être soumis à une détection. liquid sample that can be subjected to detection.
A titre d'exemple encore, lorsqu'un marqueur doit être extrait d'une substance qui n'est pas un liquide, la substance peut être dissoute ou traitée d'une autre manière pour produire un liquide contenant le marqueur, lequel liquide peut ensuite être soumis à une détection ou traité de la manière décrite ci-dessus par évaporation et traitement avec un milieu liquide pour donner un échantillon liquide By way of example again, when a marker is to be extracted from a substance that is not a liquid, the substance may be dissolved or otherwise treated to produce a liquid containing the marker, which liquid may then be subjected to detection or treated in the manner described above by evaporation and treatment with a liquid medium to give a liquid sample
qui peut être soumis à une détection. which can be subjected to detection.
A titre d'exemple encore, un marqueur peut être extrait d'un article (par exemple pour donner un liquide contenant le marqueur) et soumis à une détection By way of example again, a marker can be extracted from an article (for example to give a liquid containing the marker) and subjected to detection.
de toute manière appropriée.in any appropriate way.
A titre d'exemple, on peut rencontrer des circonstances dans lesquelles une extraction par solvant peut ne pas être applicable pour récupérer des substances enzymatiquement actives. Cependant, lorsqu'une extraction par solvant est applicable, le solvant peut être retiré après l'extraction et un tampon approprié By way of example, circumstances may arise where solvent extraction may not be applicable to recover enzymatically active substances. However, when a solvent extraction is applicable, the solvent can be removed after extraction and an appropriate buffer
peut être ajouté (par exemple un tampon d'immunoanalyse tel que PBS pH 7, 4). can be added (for example an immunoassay buffer such as PBS pH 7.4).
On comprendra qu'il est possible de choisir tout solvant ou tout It will be understood that it is possible to choose any solvent or
système solvant dans la mesure o il convient pour la détection du marqueur. solvent system to the extent that it is suitable for the detection of the marker.
Ainsi, par exemple, un solvant ou un système solvant peut être choisi de manière Thus, for example, a solvent or a solvent system can be chosen so
que son utilisation n'entraîne pas des modifications inacceptables du marqueur. its use does not result in unacceptable changes to the marker.
Lorsqu'une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme a été extrait, il peut tre immobilisé de toute manière appropriée pour permettre sa détection (par exemple par un test de liaison à des protéines spécifiques (par exemple un processus d'immunoanalyse) ou par tout autre When an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule has been extracted, it can be immobilized anyway appropriate for its detection (for example by a specific protein binding assay (eg an immunoassay process) or by any other
processus de détection approprié (par exemple un procédé enzymologiquc). appropriate detection process (eg an enzymological process).
Ainsi, par exemple, un procédé chimique non spécifique peut étre utilisé pour immobiliser une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme sur un matériau support approprié (par exemple, sur du papier de nitrocellulose). Par exemple, une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d"enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être extrait, placé dans un milieu liquide approprié (par exemple une solution tampon), et la molécule d'enzyme, le fragment de molécule d'enzyme, le liant pour une molécule d'enzyme ou le liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être immobilisé sur un support approprié Thus, for example, a non-specific chemical method can be used to immobilize an enzyme molecule or binder for a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule, a fragment of a molecule of a molecule enzyme on a suitable carrier material (eg nitrocellulose paper). For example, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be extracted, placed in a suitable liquid medium (eg buffer solution), and the enzyme molecule, the enzyme molecule fragment, the binder for an enzyme molecule or the binder for a fragment of an enzyme molecule can be immobilized on a support appropriate
au moyen dun procédé chimique non spécifique. by means of a non-specific chemical process.
Ou bien encore, à titre d'exemple, une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être extrait, placé dans un milieu liquide approprié (par exemple une solution tampon) puis la molécule d'enzyme, le fragment d'une molécule d'enzyme, le liant pour une molécule d'enzyme ou le liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut tre immobilisé sur un matériau Alternatively, by way of example, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be extracted placed in a suitable liquid medium (for example a buffer solution) and then the enzyme molecule, the fragment of an enzyme molecule, the binder for an enzyme molecule or the binder for a fragment of a molecule of d enzyme can be immobilized on a material
support approprié (par exemple, le polystyrène) par adsorption non spécifique. appropriate carrier (eg, polystyrene) by non-specific adsorption.
A titre d'exemple encore, une interaction spécifique (par exemple liaison spécifique) peut être utilisée pour immobilisr une molécule d'enzyme extraite, un fragment d'une molécule d'enzyme extrait, un liant pour une molécule By way of example again, a specific interaction (e.g., specific binding) can be used to immobilize an extracted enzyme molecule, a fragment of an extracted enzyme molecule, a binder for a molecule
d'enzyme extrait ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme extrait. extracted enzyme or a binder for a fragment of an extracted enzyme molecule.
Ainsi, par exemple, un partenaire de réaction spécifique (anticorps) pour une molécule d'enzyme ou un partenaire de réaction spécifique (anticorps) pour un fragment d'une molécule d'enzyme, peut être utilisé pour réaliser la fixation à un matériau support au moyen d'une interaction spécifique avec une molécule Thus, for example, a specific reaction partner (antibody) for an enzyme molecule or a specific reaction partner (antibody) for a fragment of an enzyme molecule can be used to attach to a support material by means of a specific interaction with a molecule
d'enzyme correspondante ou un fragment de molécule d'enzyme correspondant. corresponding enzyme or a corresponding enzyme molecule fragment.
Par exemple, un liant (anticorps) pour une molécule d'enzyme, ou un liant (anticorps) pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être utilisé pour provoquer l'immobilisation d'une molécule d'enzyme ou d'un fragment d'une For example, a binder (antibody) for an enzyme molecule, or a binder (antibody) for a fragment of an enzyme molecule can be used to cause the immobilization of an enzyme molecule or a fragment of a
molécule d'enzyme sur un matériau de support. enzyme molecule on a support material.
Ou bien encore, à titre d'exemple, une molécule d'enzyme ou un fragment d'une molécule d'enzyme peut être utilisé pour réaliser la fixation à un matériau support d'un liant (qui est un anticorps dirigé contre une molécule d'enzyme), ou un fragment d'une molécule d'enzyme peut être utilisé pour réaliser la fixation à un matériau support d'un liant (qui est un anticorps dirigé contre un Alternatively, by way of example, an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule may be used to bind a support material to a binder (which is an antibody directed against a molecule of enzyme), or a fragment of an enzyme molecule can be used to effect binding to a support material of a binder (which is an antibody directed against a
fragment d'une molécule d'enzyme).fragment of an enzyme molecule).
Par exemple, une molécule d'enzyme ou un fragment d'une molécule d'enzyme peut être utilisé pour provoquer l'immobilisation, sur un matériau support, d'un liant (anticorps) pour une molécule d'enzyme ou d'un liant (anticorps) For example, an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule can be used to cause immobilization, on a support material, of a binder (antibody) for an enzyme molecule or a binder (antibody)
pour un fragment d'une molécule d'enzyme. for a fragment of an enzyme molecule.
On comprendra quun liant pour une molécule d'enzyme, un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, une molécule d'enzyme ou un fragment d'une molécule d'enzyme puisse être utilisé pour provoquer l'immobilisation d'une molécule d'enzyme, d'un fragent d'une molécule d'enzyme, d'un liant pour une molécule d'enzyme ou d'un liant pour un fragment dune molécule d'enzyme, It will be understood that a binder for an enzyme molecule, a binder for a fragment of an enzyme molecule, an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule can be used to cause the immobilization of a molecule. an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule,
respectivement, de toute manière appropriée. respectively, in any appropriate manner.
Ainsi, par exemple, un liant pour une molécule d'enzyme, un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, une molécule d'enzyme ou un fragment d'une molécule d'enzyme peut être associé à un matériau support avant ou après l'interaction spécifique avec une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'mne Thus, for example, a binder for an enzyme molecule, a binder for a fragment of an enzyme molecule, an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule may be associated with a carrier material before or after the specific interaction with an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a mne fragment
molécule d'enzyme, respectivement.enzyme molecule, respectively.
Un liant pour une molécule d'enzyme, un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, une molécule d'enzyme ou un fragment d'une molécule d'enzyme peut être associé directement à un matériau support (par exemple par liaison covalente) ou peut être associé indirectement avec un matériau support par l'intermédiaire d'autres espèces et d'autres liaisons (de nature spécifique ou non A binder for an enzyme molecule, a binder for a fragment of an enzyme molecule, an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule can be directly associated with a support material (for example by binding covalent) or may be indirectly associated with a carrier material via other species and other linkages (specific or non-specific
spécifique).specific).
Ainsi, par exemple, un partenaire de réaction qui est un liant peut être lié à un matériau support par un second liant (qui est un anticorps), lequel second liant est un liant pour le partenaire du réaction. Dans cette configuration, le second liant peut être fixé à un matériau support de toute manière appropriée et à tout moment approprié et peut être amené à subir une liaison spécifique avec le partenaire de réaction avant ou après que le partenaire de réaction a subi une interaction spécifique avec une molécule d'enzyme ou avec un fragment d'une Thus, for example, a reaction partner that is a binder can be bonded to a support material by a second binder (which is an antibody), which second binder is a binder for the reaction partner. In this configuration, the second binder can be attached to a support material in any suitable manner and at any convenient time and can be made to specifically bind to the reaction partner before or after the reaction partner has undergone a specific interaction. with an enzyme molecule or with a fragment of a
molécule d'enzyme.enzyme molecule.
Ou bien encore, à titre d'exemple, un liant pour une molécule d'enzyme, un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, une molécule d'enzyme ou un fragment d'une molécule d'enzyme peut être amené à être associé à un matériau support (avant ou après la réaction avec une moléculc d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme) au moyen d'un liant auxiliaire ou d'un système de ligand auxiliaire (par exemple au moyen d'un autre système Alternatively, for example, a binder for an enzyme molecule, a binder for a fragment of an enzyme molecule, an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule can be provided. to be associated with a carrier material (before or after the reaction with an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of a molecule of enzyme) by means of an auxiliary binder or an auxiliary ligand system (for example by means of another system
ligand-liant).ligand-binder).
Lorsqu'une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme a été immobilisé sur un matériau support, il peut être détecté de toute manière appropriée comme cela est connu dans le domaine immunologique et dans le domaine non immunologique. Ainsi, par exemple, il est possible d'utiliser un liant approprié pour une molécule d'enzyme, un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, une molécule d'enzyme ou un fragment d'une molécule d'enzyme, lequel liant pour une molécule d'enzyme, liant pour un fragment dune molécule d'enzyme, molécule d'enzyme ou fragment de molécule d'enzyme peut When an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule has been immobilized on a support material, it can be detected in any appropriate manner as is known in the immunological and non-immunological domains. Thus, for example, it is possible to use a suitable binder for an enzyme molecule, a binder for a fragment of an enzyme molecule, an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule, which binder for an enzyme molecule, binding for a fragment of an enzyme molecule, enzyme molecule or enzyme molecule fragment can
être amené à être associé à un marqueur capable de produire un signal délectable. to be associated with a marker capable of producing a delectable signal.
A titre d'exemple, tout marqueur approprié peut être utilisé selon la présente invention. Des exemples de marqueur comprennent les enzymes, les composés fluorescents, les composés chimiluminescents, les composés By way of example, any suitable marker may be used according to the present invention. Examples of labels include enzymes, fluorescent compounds, chemiluminescent compounds, compounds
bioluminescents, les radio-isotopes et les colorants. bioluminescent, radioisotopes and dyes.
Un signal produit par un marqueur peut être déterminé par tout procédé chimique ou biochimique approprié ou de toute manière appropriée. A titre d'exemple encore, un liquide ou échantillon de liquide contenant un marqueur peut être soumis à une détection par formation d'une mince couche liquide ou d'échantillon de liquide sur une surface solide appropriée et par séchage de cette couche pour former sur la surface solide une mince couche de produit qui doit être A signal produced by a marker can be determined by any suitable chemical or biochemical process or in any suitable manner. By way of example again, a liquid or liquid sample containing a marker may be detected by forming a thin liquid layer or liquid sample on a suitable solid surface and drying the layer to form on a suitable solid surface. the solid surface a thin layer of product that needs to be
soumis à une détection.subject to detection.
La surface solide peut être par exemple une lame de verre pour microscope, une baguette de verre ou une boîte de Petri. Lorque la surface solide estsous une forme appropriée (par exemple lame de microscope au baguette de verre), il est possible d'appliquer sur celle-ci une mince couche de liquide ou d'échantillon liquide par immersion de la surface solide dans le liquide ou The solid surface may be for example a microscope glass slide, a glass rod or a Petri dish. When the solid surface is in a suitable form (for example a microscope slide with a glass rod), it is possible to apply a thin layer of liquid or liquid sample to the surface by immersing the solid surface in the liquid or
l'échantillon liquide.the liquid sample.
Une mince couche de produit sur une surface solide appropriée qui peut être obtenue de la manière décrite précédemment peut être soumise à une détection de toute manière appropriée, par cxemplc par addition de réactifs d'identification ou par tout procédé approprié (par exemple par un procédé A thin layer of product on a suitable solid surface which can be obtained as described above can be detected in any suitable manner, for example by the addition of identifying reagents or by any suitable method (for example by a method
d'analyse ou par un procédé enzymologique). analysis or by an enzymological process).
A titre d'exemple encore, un marqueur dans un liquide ou un échantillon liquide peut être détecté par addition au liquide ou à l'échantillon By way of example again, a marker in a liquid or liquid sample may be detected by addition to the liquid or sample
liquide de réactifs d'identification appropriés. liquid of appropriate identification reagents.
La détection in situ d'une molécule d'enzyme, d'un fragment d'une molécule d'enzyme, d'un liant pour une molécule d'enzyme ou d'un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être réalisée à l'aide de tout processus approprié, par exemple à l'aide des processus connus dans le domaine In situ detection of an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be carried out using any appropriate process, for example using known processes in the field
immunologique ou dans le domaine non immunologique de liaison à des protéines. immunologically or in the non-immunological binding domain to proteins.
On comprendra que dans un processus in situ un article puisse agir luimême It will be understood that in an in situ process an article can act itself.
comme matériau support dans un processus de détection. as a support material in a detection process.
A titre d'exemple, la détection in situ d'une molécule d'enzyme, d'un fragment d'une molécule d'enzyme, d'un liant pour une molécule d'enzyme ou d'un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être réalisée à l'aide d'un liant pour une molécule d'enzyme, d'un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, d'une molécule d'enzyme ou d'un fragment d'une molécule d'enzyme qui peut être associé à un marqueur approprié. Par exemple, le marqueur peut être By way of example, the in situ detection of an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be made using a binder for an enzyme molecule, a binder for a fragment of an enzyme molecule, an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule that can be associated with a suitable marker. For example, the marker can be
détecté in situ.detected in situ.
Une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une moléculc d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une moléculc An enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of a molecule
d'enzyme peut être détecté par exemple par toute forme d'analyse appropriée. of enzyme can be detected for example by any suitable form of analysis.
Dans une forme d'analyse, il est possible d'utiliser une configuration d'analyse sandwich non compétitive (par exemple après extraction d'une molécule d'enzyme ou d'un fragment de molécule d'enzyme). Ainsi, par exemple, un anticorps contre une molécule d'enzyme ou contre un fragment d'une molécule d'enzyme (lequel anticorps peut être fixé ou non à un matériau support) peut être utilisé pour fixer une molécule d'enzyme ou un fragment d'une molécule d'enzyme à un matériau support, et un autre anticorps (qui peut être associé directement ou indirectement à un marqueur) dirigé contre la molécule d'enzyme ou contre le fragment de molécule d'enzyme peut être utilisé pour faciliter la détection de la In one form of analysis, it is possible to use a non-competitive sandwich analysis configuration (for example after extraction of an enzyme molecule or an enzyme molecule fragment). Thus, for example, an antibody against an enzyme molecule or against a fragment of an enzyme molecule (which antibody may or may not be attached to a support material) may be used to attach an enzyme molecule or a fragment from one enzyme molecule to a support material, and another antibody (which may be directly or indirectly associated with a label) directed against the enzyme molecule or against the enzyme molecule fragment can be used to facilitate the detection of
molécule d'enzymc ou du fragment de molécule d'enzyme. enzymc molecule or enzyme molecule fragment.
Puis, si on le souhaite, l'anticorps peut être dénaturé et la molécule d'enzyme ou le fragment de molécule d'enzyme peut être recueilli pour être utilisé dans une autre analyse (par exemplc compétitive) qui peut être utilisée pour Then, if desired, the antibody can be denatured and the enzyme molecule or enzyme molecule fragment can be collected for use in another assay (eg, competitive) that can be used to
confirmer les résultats de l'analyse non compétitive. confirm the results of the non-competitive analysis.
On comprendra que la possibilité de réaliser plus d'une analyse sur un échantillon donné puisse être avantageuse en permettant de confirmer les résultats de l'analyse et d'améliorer la fiabilité des résultats. On comprendra d'après ce qui précède que même si des molécules d'enzyme ou des fragments de molécules d'enzyme peuvent être dénaturés en étant introduits dans une substance ou un article, ils peuvent encore être détectables bien qu'ils puissent avoir perdu tout ou It will be understood that the possibility of performing more than one analysis on a given sample may be advantageous in allowing the results of the analysis to be confirmed and the reliability of the results to be improved. It will be understood from the foregoing that even though enzyme molecules or fragments of enzyme molecules may be denatured by being introduced into a substance or article, they may still be detectable even though they may have lost all or
partie de leur activité enzymatique. part of their enzymatic activity.
Ainsi, par exemple, des molécules d'cnzyme dénaturées ou des fragments de molécules d'enzyme dénaturés peuvent être reconnus par un anticorps Thus, for example, denatured enzyme molecules or fragments of denatured enzyme molecules may be recognized by an antibody
qui reconnaît aussi les molécules d'enzyme entières actives. which also recognizes the active whole enzyme molecules.
Ceci est possible du fait que la spécificité structurale peut être indé- This is possible because the structural specificity may be inde-
pendante de l'activité enzymatique. pending enzymatic activity.
Ainsi, par exemple, il est possible de conduire une immunoanalyse compétitive dans laquelle un marqueur, comprenant une molécule d'enzyme ou un fragment de molécule d'enzyme, entre en compétition avec des molécules d'enzyme actives (qui peuvent être utilisées comme marqueur) pour la liaison à un Thus, for example, it is possible to conduct a competitive immunoassay in which a marker, comprising an enzyme molecule or an enzyme molecule fragment, competes with active enzyme molecules (which can be used as a marker ) for the connection to a
anticorps (qui peut être placé sur un matériau support). antibody (which can be placed on a support material).
Bien que l'on se soit référé dans ce qui précède à une immunoanalyse compétitive en ce qui concerne la détection d'une molécule d'enzyme ou d'un fragment d'une molécule d'enzyme, on comprendra qu'une molécule d'enzyme ou un fragment dune molécule d'enzyme puisse être détecté de toute manière Although the foregoing has been referred to a competitive immunoassay with respect to the detection of an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule, it will be understood that a molecule of enzyme or a fragment of an enzyme molecule can be detected anyway
appropriée, par exemple au moyen d'une immunoanalyse non compétitive. appropriate, for example by means of a non-competitive immunoanalysis.
A titre d'exemple encore, un marqueur qui est une molécule d'enzyme (par exemple une molécule d'enzyme dénaturée) ou un fragment d'une molécule d'enzyme peut être détecté au moyen d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps (c'est-à-dire (Fab)2), qui a deux sites de liaison. Ainsi, par exemple, il peut se faire que l'un des sites de liaison se lie au marqueur (ledit marqueur étant une molécule d'enzyme (par exemple une molécule d'enzyme dénaturée) ou un fragment d'une molécule d'enzyme) et que l'autre site de liaison se lie à une By way of example, a marker which is an enzyme molecule (for example a denatured enzyme molecule) or a fragment of an enzyme molecule can be detected by means of an antibody or a fragment antibody (i.e. (Fab) 2), which has two binding sites. Thus, for example, it may be that one of the binding sites binds to the label (said label being an enzyme molecule (eg, a denatured enzyme molecule) or a fragment of an enzyme molecule ) and that the other binding site binds to a
molécule d'enzyme enzymatiquement active, ladite molécule d'enzyme enzymati- enzymatically active enzyme molecule, said enzymatic enzyme
quement active étant du mêmc type que celle qui est utilisée pour former le marqueur. La molécule d'enzyme enzymatiquement active peut ensuite être utilisée pour détecter le marqueur. Ainsi, le marqueur peut être détecté in situ au moyen de l'anticorps ou du fragment d'anticorps qui comporte deux sites de liaison et de la molécule d'enzyme enzymatiquement active, ou bien le marqueur peut être détecté en étant extrait et associé à un matériau support avant que l'anticorps ou fragment d'anticorps ayant deux sites de liaison et la molécule d'enzyme enzymatiquement active soient utilisés. La molécule d'enzyme enzymatiquement active peut être détectée de toute manière appropriée (par exemple par des procédés the same type as the one used to form the marker. The enzymatically active enzyme molecule can then be used to detect the marker. Thus, the marker can be detected in situ by means of the antibody or antibody fragment which has two binding sites and the enzymatically active enzyme molecule, or the marker can be detected by being extracted and associated with a carrier material before the antibody or antibody fragment having two binding sites and the enzymatically active enzyme molecule are used. The enzymatically active enzyme molecule can be detected in any suitable manner (for example by methods
enzymologiques tels que décrits ci-dessous). enzymological as described below).
On comprendra qu'une chaîne molécule d'enzyme - anticorps - It will be understood that a molecule chain of enzyme - antibodies -
enzyme ou fragment de molécule d'enzyme - anticorps - enzyme qui peut être formée au moyen d'un anticorps ayant deux sites de liaison peut être utilisée par exemple pour augmenter la sensibilité de détection. En outre, il peut être possible enzyme or enzyme molecule fragment - antibody - enzyme that can be formed by means of an antibody having two binding sites can be used for example to increase the detection sensitivity. In addition, it may be possible
par exemple d'utiliser une chaîne molécule d'enzyme - anticorps - ligand - for example to use a molecule chain of enzyme - antibodies - ligand -
anticorps - ligand ou une chaîne fragment de molécule d'enzyme - anticorps - antibodies - ligand or chain fragment of enzyme molecule - antibodies -
ligand - anticorps - ligand.ligand - antibody - ligand.
On comprendra aussi que si une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment dune molécule d'enzyme est utilisé comme marqueur, il est possible d'utiliser tout procédé de détection immunologique approprié pour détecter un tel It will also be understood that if an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule is used as a marker, it is possible to use any appropriate immunological detection method to detect such
marqueur, in situ ou après extraction. marker, in situ or after extraction.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est proposé une trousse de test pouvant être utilisée pour identifier une substance ou un article, laquelle tousse de test comprend un liant pour une molécule d'enzyme, un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, une molécule d'enzyme ou un According to another aspect of the present invention, there is provided a test kit that can be used to identify a substance or article, which cough test includes a binder for an enzyme molecule, a binder for a fragment of a molecule enzyme, an enzyme molecule or a
fragment d'une molécule d'enzyme.fragment of an enzyme molecule.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est proposé une composition pouvant être utilisée pour marquer une substance ou un article, laquelle composition comprend une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un According to another aspect of the present invention, there is provided a composition that can be used to label a substance or article, which composition comprises an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for a molecule of enzyme or a binder for a
fragment d'une molécule d'enzyme.fragment of an enzyme molecule.
A titre d'exemple, une composition selon l'aspect immédiatement précédent de la présente invention peut être une composition d'encre, une By way of example, a composition according to the immediately preceding aspect of the present invention may be an ink composition, a
composition de véhicule d'encre ou une composition de peinture. ink vehicle composition or paint composition.
Une composition de véhicule d'encre peut être une composition qui contient un mélange de substances rencontrées normalement dans les compositions d'encre, à l'exception d'un colorant. Une composition de véhicule d'encre peut An ink vehicle composition can be a composition that contains a mixture of substances normally encountered in ink compositions, except for a dye. An ink vehicle composition can
avoir été additionnée d'un colorant pour obtenir une encre colorée. have been added with a dye to obtain a colored ink.
Selon la présente invention, il est proposé une combinaison comprenant un marqueur associé à un agent solubilisant, ledit marqueur étant une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une According to the present invention, there is provided a combination comprising a marker associated with a solubilizing agent, said marker being an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for a
molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme. enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule.
L'agent solubilisant peut être un tensioactif. The solubilizing agent may be a surfactant.
Ainsi, dans un mode de réalisation de la présente invention, il est proposé une combinaison comprenant un marqueur associé à un tensioactif, ledit marqueur étant une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme. Une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être associé à un tensioactif de toute manière appropriée. Par exemple, un site réactif ou des sites réactifs d'un tensioactif peuvent être conjugués à une moléculc d'enzyme, un fragment d'une moléculc d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, ou à Thus, in one embodiment of the present invention, there is provided a combination comprising a surfactant-associated label, said label being an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for a molecule of an enzyme or a binder for a fragment of an enzyme molecule. An enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule may be associated with a surfactant in any suitable manner. For example, a reactive site or reactive sites of a surfactant can be conjugated to an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule, or a binder for a fragment of a molecule. a molecule of enzyme, or to
toute combinaison appropriée de ceux-ci. any appropriate combination of these.
On comprendra que la conjugaison puisse être réalisée par liaison covalente. Le polyéthylèneglycol est un exemple de tensioactif auquel une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut It will be understood that the conjugation can be performed by covalent bonding. Polyethylene glycol is an example of a surfactant to which an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can
être associé (par exemple conjugué). be associated (eg conjugate).
Une combinaison comprenant un marqueur selon la présente invention A combination comprising a marker according to the present invention
associé à un tensioactif peut être soluble dans les liquides aqueux et organiques. associated with a surfactant may be soluble in aqueous and organic liquids.
Ceux-ci peuvent être avantageux, par exemple lorsque l'on cherche à introduire un marqueur dans une encre qui comporte des constituants organiques (par exemple These can be advantageous, for example when seeking to introduce a marker in an ink which comprises organic constituents (for example
un solvant organique).an organic solvent).
On comprendra qu'une combinaison d'un marqueur associé à un It will be understood that a combination of a marker associated with a
tensioactif puisse être utilisée dans un marquage à l'aide de solvants à base d'eau. surfactant can be used in labeling with water-based solvents.
Selon la présente invention, il est proposé également une combinaison comprenant un marqueur associé à un milieu insolubilisant, ledit marqueur étant une molécule d'enzymc, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une According to the present invention, there is also provided a combination comprising a label associated with an insolubilizing medium, said label being an enzymic molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an
molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme. enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule.
Le milieu insolubilisant peut être par exemple un milieu qui est d'un type et d'une taille de particules tels qu'il ne se dissout pas dans les solvants organiques ou aqueux choisis, de sorte que le marqueur associé au milieu insolubi- lisant est rendu lui aussi sensiblement insoluble dans les solvants organiques ou The insolubilizing medium may be, for example, a medium which is of a type and size of particles such that it does not dissolve in the chosen organic or aqueous solvents, so that the label associated with the insolubilizing medium is rendered also substantially insoluble in organic solvents or
aqueux choisis.selected aqueous.
Le milieu insolubilisant peut être par exemple constitué par des microparticules de taille micronique ou submicronique (par exemple particules de latex, microparticules de polystyrène, particules de nitrocellulose et particules de poudre de verre). Des microparticules de taille micronique et submicronique sont The insolubilising medium may be for example constituted by microparticles of micron or submicron size (for example latex particles, polystyrene microparticles, nitrocellulose particles and particles of glass powder). Microparticles of micron and submicron size are
disponibles dans le commerce.commercially available.
A titre d'exemple, tout moyen approprié peut être utilisé pour associer By way of example, any appropriate means can be used to associate
un marqueur à un milieu insolubilisant. a marker to an insolubilizing medium.
Ainsi, par exemple, il est possible d'utiliser tout procédé de fixation approprié, par exemple les procédés qui sont connus dans la technique pour fixer Thus, for example, it is possible to use any suitable method of attachment, for example the methods which are known in the art for fixing
des subtances (par exemple des substances biochimiques) à des microparticules. substances (eg biochemicals) to microparticles.
L'adsorption et la liaison covalente sont des exemples de fixation. Adsorption and covalent bonding are examples of fixation.
Ainsi, par exemple, une combinaison comprenant un marqueur associé à un milieu insolubilisant peut comprendre un marqueur fixé à un milieu Thus, for example, a combination comprising a label associated with an insolubilizing medium may comprise a label attached to a medium
insolubilisant comprenant des microparticules. insolubilizer comprising microparticles.
A titre d'exemple, une combinaison d'un marqueur selon la présente invention et d'un milieu insolubilisant, laquelle combinaison peut être sensiblement insoluble dans les solvants organiques ou aqueux choisis, peut se révéler avantageuse dans certaines circonstances. Par exemple, une telle combinaison peut être sous forme dune suspension homogène dans des milieux organiques ou aqueux de viscosité élevée (par exemple solution d'hydroxypropylméthylcellulose à 0,8 %) et une telle suspension peut offrir des avantages par exemple en favorisant l'obtention de concentrations sensiblement uniformes de molécules d'enzyme, de fragments d'une molécule d'enzyme, d'un liant pour une molécule d'enzyme ou d'un liant pour un fragment d'une molécule By way of example, a combination of a label according to the present invention and an insolubilizing medium, which combination may be substantially insoluble in the selected organic or aqueous solvents, may be advantageous in some circumstances. For example, such a combination may be in the form of a homogeneous suspension in organic or aqueous medium of high viscosity (for example 0.8% hydroxypropylmethylcellulose solution) and such a suspension may offer advantages, for example by promoting substantially uniform concentrations of enzyme molecules, fragments of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of a molecule
d'enzyme, utilisés comme marqueur.of enzyme, used as a marker.
Compte tenu de ce qui précède, on comprendra que la présente invention peut permettre le marquage d'une substance ou d'un article au moyen In view of the foregoing, it will be understood that the present invention may allow the marking of a substance or article by means of
d'un marqueur qui est biodétectable. a marker that is biodegradable.
Lorsque des molécules d'enzyme ou des fragments de molécules d'enzymc ne sont pas dénaturés dans une mesure inacceptable lorsqu'ils sont combinés à une substance ou un article, les molécules d'enzyme ou les fragments de molécules d'enzyme peuvent êtrec détectés (par exemple in situ ou après extraction) au moyen d'un processus approprié et d'un substrat approprié. On s'est référé dans cc qui précède à la détection immunologiquc d'un When enzyme molecules or enzyme molecule fragments are not unacceptably denatured when combined with a substance or article, enzyme molecules or fragments of enzyme molecules may be detected (eg in situ or after extraction) by means of a suitable process and a suitable substrate. In the foregoing, reference has been made to the immunological detection of a
marqueur selon la présente invention. marker according to the present invention.
On comprendra également d'après cc qui précède que lorsqu'une molécule d'enzyme ou un fragment d'une molécule d'enzyme a une activité enzymatique appropriée, il est possible d'utiliser tout procédé enzymologique It will also be understood from the foregoing that when an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule has an appropriate enzymatic activity, it is possible to use any enzymological method.
approprié pour la détection en solution ou sur une surface solide. Suitable for detection in solution or on a solid surface.
D'après ce qui précède on comprendra qu'une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'um molécule d'enzyme peut être détecté par exemplc par tout procédé immunologique approprié et/ou par tout procédé enzymologique approprié. Ainsi, par exemple, une molécule d'enzyme qui a une activité enzymatique appropriée, ou un fragment d'une molécule d'cnzyme qui a une activité enzymatique appropriée, peut êtrec détecté (sur une surface solide ou en solution) par des procédés tels que les suivants, par exemple: (i) détection directe par application d'un substrat approprié dans un système tampon approprié (le substrat peut êtrc synthétique ou naturel. Les substrats synthétiques peuvent êtrc chromogènes (capables de donner des produits colorés solubles ou insolubles) ou fluorigènes (capables de donner des produits fluorescents solubles ou insolubles)); (ii) détection par application d'un substrat plus un mélange de substances chromogènes (l'action sur le substrat donne un produit (intermédiaire) qui agit sur la substance chromogène en la transformant en un produit coloré soluble ou insoluble); (iii) détection par des réactions enzymatiques couplées dans lesquelles une seconde enzyme (ou des enzymes) agit sur un produit provenant d'une première enzyme pour donner un produit final détectable (par exemple un produit coloré ou fluorescent soluble ou insoluble); (iv) détection par des procédés à cycles enzymatiques dans lesquels le produit d'une premie enzyme agit comme cofacteur pour un second système enzyme - substrat (le cofacteur peut être régénéré par un troisième système enzymatique, lequel cofacteur pénètre dans le second système enzymatique, etc. Les cycles enzymatiques constituent un procédé d'amplification biochimiquc qui peut permnnettre la détection de très faibles quantités d'une première enzyme). On comprendra que lorsqu'un anticorps bivalent forme un "pont" entre une enzyme immobilisée et une molécule d'enzyme homologue active, la molécule active peut être détectée par tout procédé approprié tel que ceux qui ont été décrits From the foregoing it will be understood that an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be detected for example, by any suitable immunological method and / or by any suitable enzymological method. Thus, for example, an enzyme molecule which has an appropriate enzymatic activity, or a fragment of a enzyme molecule which has an appropriate enzymatic activity, can be detected (on a solid surface or in solution) by methods such as the following, for example: (i) direct detection by application of a suitable substrate in a suitable buffer system (the substrate may be synthetic or natural Synthetic substrates may be chromogenic (capable of yielding soluble or insoluble color products) or fluorogens (capable of giving soluble or insoluble fluorescent products)); (ii) detection by application of a substrate plus a mixture of chromogenic substances (the action on the substrate gives a product (intermediate) which acts on the chromogenic substance transforming it into a colored soluble or insoluble product); (iii) detection by coupled enzyme reactions in which a second enzyme (or enzymes) acts on a product from a first enzyme to provide a detectable end product (e.g., soluble or insoluble color or fluorescent product); (iv) detection by enzymatic ring methods in which the product of a first enzyme acts as a cofactor for a second enzyme-substrate system (the cofactor can be regenerated by a third enzyme system, which cofactor enters the second enzyme system, etc. Enzyme cycles are a biochemical amplification process which can allow the detection of very small amounts of a first enzyme). It will be understood that when a divalent antibody forms a "bridge" between an immobilized enzyme and an active homologous enzyme molecule, the active molecule can be detected by any suitable method such as those described
précédemment dans les paragraphes (i) à (iv). previously in paragraphs (i) to (iv).
On comprendra que, par exemple, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être détecté (par exemple in situ ou après extraction) au moyen d'un procédé enzymologique à l'aide d'une molécule d'enzyme enzymatiquement active appropriée ou à l'aide d'un It will be understood that, for example, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be detected (e.g., in situ or after extraction) by means of an enzymological process at the same time. using an appropriate enzymatically active enzyme molecule or with the aid of a
fragment de molécule d'enzyme enzymatiquement actif approprié. Enzymatically active enzyme molecule fragment suitable.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est proposé une trousse de test pouvant être utilisée pour identifier une substancc ou un article, According to another aspect of the present invention, there is provided a test kit that can be used to identify a substance or article,
ladite trousse de test comprenant des réactifs choisis pour la détection enzymolo- said test kit comprising reagents selected for enzymological detection
gique d'une molécule d'enzyme, d'un fragment d'une molécule d'enzyme, d'un liant pour une molécule d'enzyme ou d'un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme. A titre d'exemple, les molécules d'enzyme en l'état, des fragments de molécules d'enzyme en l'état, un liant pour une moléculc d'enzyme en l'état ou un liant pour un fragment dmune molécule d'enzyme en l'état, peuvent être utilisés pour marquer une substance ou un article. Ou bien encore, des molécules d'enzyme, des fragments de molécules d'enzyme, un liant pour des molécules d'enzyme ou un liant pour des fragments de molécules d'enzyme peuvent être fixés à un matériau a molecule of an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule. By way of example, the enzyme molecules in the state, fragments of enzyme molecules as they are, a binder for an enzyme molecule in the state or a binder for a fragment of a molecule of enzyme, can be used to mark a substance or article. Alternatively, enzyme molecules, fragments of enzyme molecules, a binder for enzyme molecules or a binder for fragments of enzyme molecules may be attached to a material
support.support.
Si on le souhaite, plus d'un type de molécule d'enzyme, plus d'un type de fragment de molécule d'enzyme, plus d'un type de liant pour une molécule d'enzyme, plus d'un type de liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, ou tout autre combinaison appropriée de ceux-ci, peuvent être utilisés pour marquer If desired, more than one type of enzyme molecule, more than one type of enzyme molecule fragment, more than one type of binder for one molecule of enzyme, more than one type of binder for a fragment of an enzyme molecule, or any other suitable combination thereof, may be used to mark
une substance ou un articldc.a substance or article.
A titre d'exemple, l'utilisation de plus d'un type de molécule d'enzyme, de plus d'un type de fragment de molécule d'enzyme, de plus d'un type de liant pour une molécule d'enzyme ou de plus d'un type de liant pour un fragment d'une molécule d'enzymc, ou de toute combinaison appropriée de ceux-ci, peut S augmenter la difficulté éprouvée par une personne non autorisée pour mettre en By way of example, the use of more than one type of enzyme molecule, more than one type of enzyme molecule fragment, more than one type of binder for an enzyme molecule or of more than one type of binder for a fragment of an enzyme molecule, or any suitable combination thereof, may increase the difficulty experienced by an unauthorized person in
évidence leur présence et/ou leur identité ou pour les détecter. evidence of their presence and / or identity or to detect them.
A titre d'exemple, si on le souhaite, une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être utilisé en combinaison avec tout autre espèce identifiable appropriée. Ainsi, une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être utilisé pour former un premier marqueur, et un autre marqueur ou d'autres marqueurs peuvent être fournis par toute autre espèce identifiable appropriée (par exemple une espèce chimique ou By way of example, if desired, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule may be used in combination with any other suitable identifiable species. Thus, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be used to form a first marker, and a other marker or markers may be provided by any other suitable identifiable species (eg a chemical species or
une espèce biochimique ou une entit6 qui donne des espèces identifiables). a biochemical species or an entity that gives identifiable species).
On comprendra qu'une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, qui peut être détecté, peut être considéré par It will be understood that an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule, which can be detected, can be considered by
exemple comme une espèce identifiable. example as an identifiable species.
On comprendra que lorsqu'un fragment d'une molécule d'enzyme est une sous-unité d'une molécule d'enzyme, le fragment peut être détectable par des procédés immunologiques. Cependant, une telle sous-unité peut ne pas être détectable par des procédés enzymologiques. Pourtant, par exemple, le fragment It will be understood that when a fragment of an enzyme molecule is a subunit of an enzyme molecule, the fragment can be detectable by immunological methods. However, such a subunit may not be detectable by enzymological methods. Yet, for example, the fragment
peut etre rendu détectable par des moyens enzymologiqucs par addition à la sous- can be made detectable by enzymological means by addition to the sub-
unité d'une autre sous-unité ou d'autres sous-unités de molécule d'enzyme, selon unit of another subunit or other subunits of the enzyme molecule, according to
ce qui est approprié.which is appropriate.
Ainsi, l'addition d'une sous-unité ou de sous-unités de molécule Thus, the addition of a subunit or molecule subunits
d'enzyme peut faire partie d'un procédé de détection. of enzyme can be part of a detection method.
On comprendra également qu'une molécule d'enzyme ou un fiagment d'une molécule d'enzyme qui a une activité enzymatique peut être considéré comme une espèce catalytique du fait qu'une telle molécule d'enzyme ou un tel It will also be understood that an enzyme molecule or a fragment of an enzyme molecule which has enzymatic activity can be considered a catalytic species because such an enzyme molecule or such
fragment de molécule d'enzyme peut catalyser une réaction. Enzyme molecule fragment can catalyze a reaction.
A titre d'exemple, on peut noter que, facultativement, pour certaines applications, il peut être possible de faire en sorte qu'un marqueur soit fixé à un constituant d'une composition (par exemple un constituant d'une composition de By way of example, it may be noted that, optionally, for certain applications, it may be possible to arrange for a marker to be attached to a constituent of a composition (for example a constituent of a composition of
véhicule d'encre).ink vehicle).
Selon un autre aspect de la présente invention, il est proposé une substance marquée ou un article marqué avec un marqueur qui est une molécule d'enzyme, un fragment d'une moléculc d'enzyme, un liant pour une molécule According to another aspect of the present invention there is provided a labeled substance or article labeled with a marker which is an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for a molecule
d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme. of enzyme or a binder for a fragment of an enzyme molecule.
On comprendra également qu'un marqueur peut être détecté qualita- tivemcnt ou quantitativement et qu'une détection quantitative (qui peut être considérée par exemple comme une mesure) peut être réalisée en combinaison It will also be understood that a marker can be detected qualitatively or quantitatively and that quantitative detection (which may be considered, for example, as a measure) can be performed in combination
avec une courbe d'étalonnage.with a calibration curve.
La détection d'un marqueur peut être réalisée par toute technique appropriée telle que celles qui sont connues dans le domaine des analyses de liaison à des protéines (par exemplc analyse immunologiquc et analyse non immunologiquc) et dans le domaine de l'enzymologie (par exemple systèmes à The detection of a marker can be carried out by any suitable technique such as those known in the field of protein binding assays (eg immunoassay and non-immunological analysis) and in the field of enzymology (e.g. systems to
base de substrat).substrate base).
A titre d'exemplc, on comprendra que des espèces identifiables utilisées séparément peuvent aussi être détectées in situ ou après extraction, selon By way of example, it will be understood that identifiable species used separately can also be detected in situ or after extraction, according to
ce qui est approprié.which is appropriate.
Le terme "anticorps" tel qu'il est utilisé ici englobe les anticorps complets et les fragments d'anticorps tels que Fab et (Fab)2 de sorte que le terme anticorps tel qu'il est utilisé ici englobe les anticorps complets et les fragments The term "antibody" as used herein encompasses complete antibodies and antibody fragments such as Fab and (Fab) 2 so that the term antibody as used herein encompasses complete antibodies and fragments.
d'anticorps selon ce qui est approprié. of antibodies as appropriate.
On comprendra que les anticorps peuvent être préparés par tout procédéi approprié, par exemple par les proc6d/s connus pour la production It will be understood that the antibodies can be prepared by any suitable method, for example by methods known for the production
d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux. polyclonal or monoclonal antibodies.
Ainsi, par exemple, un liant comprenant un anticorps dirigé contre une molécule d'enzyme ou un liant comprenant un anticorps dirigé contre un fragment d'une molécule d'enzyme peut être préparé par production d'anticorps dirigés respectivement contre une molécule d'enzyme ou contre un fragment d'une Thus, for example, a binder comprising an antibody directed against an enzyme molecule or a binder comprising an antibody directed against a fragment of an enzyme molecule can be prepared by producing antibodies directed against an enzyme molecule respectively or against a fragment of a
molêculc d'enzyme.enzyme molecule.
On comprendra d'après ce qui précède que toute molécule d'enzyme appropriée ou tout fragment approprié de molécule d'enzyme peut être utilisé selon la présente invention. Lorsque cela est approprié, il est possible d'utiliser selon la présente invention une enzyme thermophile ou une enzyme qui est active dans des It will be understood from the foregoing that any suitable enzyme molecule or enzyme molecule fragment may be used according to the present invention. When appropriate, it is possible to use according to the present invention a thermophilic enzyme or an enzyme which is active in
milieux organiques.organic media.
Lorsqu'un matériau support est utilisé selon la présente invention, il est possible d'utiliser tout mat&ériau support tel que ceux qui sont connus dans la technique. Le polystyrène (qui peut être utilisé sous toute forme appropriée) et la nitrocellulose (qui peut être utilisée sous toute forme appropriée) sont des When a support material is used according to the present invention, it is possible to use any carrier material such as those known in the art. Polystyrene (which can be used in any suitable form) and nitrocellulose (which can be used in any suitable form) are
exemples de matériaux supports.examples of support materials.
La présente invention peut présenter l'avantage d'utiliser plus d'un procédé de détection (par exemple successivement) dans un processus de détection donné. Egalement, la présente invention peut présenter l'avantage d'une sensibilité de détection élevée grâce à l'utilisation dune combinaison d'une molécule d'enzyme ou d'un fragment de molécule d'enzyme et d'un partenaire de réaction pour celle-ci ou celui-ci, laquelle combinaison a une affinité élevée (à titre The present invention may have the advantage of using more than one detection method (for example successively) in a given detection process. Also, the present invention may have the advantage of high detection sensitivity through the use of a combination of an enzyme molecule or an enzyme molecule fragment and a reaction partner for that or this one, which combination has a high affinity (as a
d'exemple, des quantités de l'ordre du picogramme peuvent être détectées). for example, picogram quantities can be detected).
* D'après ce qui précède on comprendra qu'une molécule d'enzyme, un fragment d'une mol6cule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme, ou tout autre combinaison de ceux-ci, peut être utilisé seul pour réaliser le marquage. Ccpendant, si on le souhaite, une molécule d'enzyme, un fragment d'mne molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme peut être utilisé avec d'autres espèces identifiables (par exemple desFrom the above it will be understood that an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule, or any other combination of these can be used alone to carry out the marking. However, if desired, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule can be used with other identifiable species (eg
espèces identifiables séparées ou celles qui font partie dm'une entité ou d'entités). separate identifiable species or those that are part of an entity or entities).
Ainsi, si on le souhaite, une molécule d'enzyme, un fragment d'une molécule d'enzyme, un liant pour une molécule d'enzyme ou un liant pour un fragment d'une molécule d'enzyme selon la présente invention peut être utilisé avec une ou plusieurs espèces identifiables séparées ou avec une combinaison d'espèces identifiables séparées, par exemple un ligand (antigénique ou non antigénique), un liant (par exemple pour un ligand antigénique ou pour un ligant non antigénique), un ligand "masqué", un acide nucléique, ou une espèce capable de subir une interaction spécifique avec un acide nucléique ou avec une entité qui Thus, if desired, an enzyme molecule, a fragment of an enzyme molecule, a binder for an enzyme molecule or a binder for a fragment of an enzyme molecule according to the present invention may be used with one or more separate identifiable species or with a combination of separate identifiable species, for example a ligand (antigenic or non-antigenic), a binder (for example for an antigenic ligand or a non-antigenic ligand), a masked ligand ", a nucleic acid, or a species capable of specific interaction with a nucleic acid or with an entity that
fournit une multiplicité d'espèces identifiables. provides a multiplicity of identifiable species.
On peut citer par exemple la demande en instance de numéro de référence de mandataire P/60090/HRF au sujet des entités qui fournissent une multiplicité d'espèces identifiables concernant le marquage, la demande en instance de numéro de référence de mandataire P/60540/HRF au sujet des ligands "masqués" en ce qui concerne le marquage, la demande en instance de numéro de référence de mandataire HRF/60541/HRF au sujet des ligands et des liants en ce For example, there is the pending P / 60090 / HRF agency reference number for entities that provide a multiplicity of identifiable tagging species, the pending proxy reference number P / 60540 / HRF regarding "masked" ligands for tagging, the pending request for agent reference number HRF / 60541 / HRF for ligands and binders
qui concerne le marquage.concerning the marking.
La présente invention va maintenant être décrite de manière plus détaillée au moyen des exemples non limitatifs suivants: The present invention will now be described in more detail by means of the following nonlimiting examples:
Exemple 1Example 1
L'enzyme phosphatase alcaline (EC3.13.1) a été introduite dans les puits d'une microplaque de titrage en différentes quantités et soumise à une The enzyme alkaline phosphatase (EC3.13.1) was introduced into the wells of a titration microplate in different amounts and subjected to
détection enzymologiquc.enzymological detection.
Ainsi, différentes quantités de phosphatase alcaline (S.A. 2290 unités/mg) dans des échantillons de 100 d de solution aqueuse de tampon de revêtement (tétraboratc de sodium 50 mM pH 9,5 contenant 0,5 mM de MgCI2) ont été ajoutées aux puits d'une microplaque de titrage et laissées à la température ambiante pendant 4 h. Les puits ont ensuite été vidés et lavés (3 fois avec du bicarbonate de sodium 100 mM contenant 100 mM de NaCI à 0,05 % de Tween@ ). Par ailleurs, des échantillons ne contenant pas d'enzyme ont été Thus, different amounts of alkaline phosphatase (SA 2290 units / mg) in 100 d samples of aqueous coating buffer solution (50 mM sodium tetraborate pH 9.5 containing 0.5 mM MgCl 2) were added to the wells. of a titration microplate and left at room temperature for 4 h. The wells were then emptied and washed (3 times with 100 mM sodium bicarbonate containing 100 mM NaCl 0.05% Tween®). In addition, samples containing no enzyme were
introduits dans certains puits pour former des "témoins". introduced into certain wells to form "witnesses".
Pour réaliser la détection, une solution de substrat synthétique de phosphatase alcaline a été utilisée. Dans cet exemple, la solution de substrat To carry out the detection, a solution of synthetic substrate of alkaline phosphatase was used. In this example, the substrate solution
synthétique de phosphatase alcaline était une solution de sel disodiquc de p-nitro- synthetic alkaline phosphatase was a disodium salt solution of p-nitro-
phénylphosphate (pNPP) (6 mM) dans du tampon diéthanolamine à 10 % (pH 9, 8) phenylphosphate (pNPP) (6 mM) in 10% diethanolamine buffer (pH 9, 8)
contenant 0,5 mM de MgCI2.containing 0.5 mM MgCl2.
Ainsi, 100 d de la solution de substrat synthétique de phosphatase Thus, 100 d of the synthetic phosphatase substrate solution
alcaline ont été ajoutés à chacun des puits de la microplaque de titrage lavée. alkaline were added to each of the wells of the washed titration microplate.
On a observé le développement d'une couleur jaune en 3 à 4 minutes. The development of a yellow color was observed in 3 to 4 minutes.
La densité optique (DO) a été lue à 405 nm au bout de 15 minutes. Les résultats The optical density (OD) was read at 405 nm after 15 minutes. The results
sont présentés dans le tableau 1.are shown in Table 1.
Tableau 1Table 1
Quantité de phosphatase alcaline Densité optique (DO) à 405 nm ajoutée par puits (ng) Amount of Alkaline Phosphatase Optical Density (OD) at 405 nm added per well (ng)
3,003.00
3,003.00
12,5 2,5612.5 2.56
6,25 1,916.25 1.91
3,12 1,653.12 1.65
1,56 1,121.56 1.12
0,78 0,610.78 0.61
0 0,120 0.12
De la phosphatase alcaline (EC3.13.1) dans une solution de tampon de revêtement (voir l'exemple 1) (125 mg/ml) a été appliquée (250/d) aux surfaces extemrnes inférieures de récipients en polystyrène à bouchon vissé et a été amenée à sécher à l'air à la température ambiante pendant 16 h. Les surfaces ont ensuite été lavées pour retirer les produits faiblement fixés puis séchées. Une solution de substrat synthétique de phosphatase alcaline a ensuite été appliquée et, en quelques minutes, une couleur bleue a commencé à apparaître et un précipité bleu intense s'est formé. La solution de substrat synthétique de phosphatase alcaline utilisée dans cet cxemplc était une solution à 0,5 mg/ml de sel disodiquc de 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP) dans du tampon diéthanolaminc à 10 % (pH 9,8) contenant 0,5 mM de MgCI2. Alkaline phosphatase (EC3.13.1) in a coating buffer solution (see Example 1) (125 mg / ml) was applied (250 / d) to the bottom outer surfaces of polystyrene screw-top containers. It was allowed to air dry at room temperature for 16 hours. The surfaces were then washed to remove loose products and dried. A solution of synthetic substrate of alkaline phosphatase was then applied and in a few minutes a blue color began to appear and an intense blue precipitate formed. The synthetic alkaline phosphatase substrate solution used in this example was a 0.5 mg / ml solution of disodium 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) salt in 10% diethanolamine buffer (pH 9). 8) containing 0.5 mM MgCl 2.
Exemple 3Example 3
Dans cet exemple l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline In this example, the enzymatic activity of alkaline phosphatase
dénaturée a été étudiée.denatured has been studied.
Ainsi, différentes quantités de phosphatase alcaline (EC3.1.3.1) ont été introduites dans les puits d'une microplaque de titrage de la même manière que dans l'exemple 1. Du méthanol (100 d) a ensuite ét ajouté à chacun des puits dans une moitié de la microplaque de titrage et une solution de tampon de revêtement (voir l'exemple 1) a été ajoutée aux puits dans la seconde moitié de la microplaque Thus, different amounts of alkaline phosphatase (EC3.1.3.1) were introduced into the wells of a titration microplate in the same manner as in Example 1. Methanol (100 d) was then added to each of the well in one half of the assay microplate and a coating buffer solution (see Example 1) was added to the wells in the second half of the microplate
de titrage.titration.
Au bout de 1 heure, à la température ambiante, les puits ont été vidés et lavés trois fois. Puis, une solution de pNPP (voir exemplc 1) (100 sd) a été ajoutée After 1 hour, at room temperature, the wells were emptied and washed three times. Then, a solution of pNPP (see example 1) (100 sd) was added
à chacun des puits.at each well.
On a observé le développement d'une couleur jaune dans les puits dans lesquels du tampon de revêtement avait été introduit initialement, tandis qu'aucune couleur n'a été observée dans les puits traités au méthanol. La densité optique a été mesurée à 450 nm au bout de 15 min et les résultats sont présentés dans le tableau 2. La colonne A indique les résultats concernant les puits traités au méthanol et la The development of a yellow color was observed in the wells in which coating buffer had initially been introduced, while no color was observed in the methanol-treated wells. The optical density was measured at 450 nm after 15 min and the results are shown in Table 2. Column A shows the results for the methanol treated wells and the
colonne B indique les résultats concernant les autres puits. column B shows the results for the other wells.
Tableau 2Table 2
Quantité de phosphatase alcaline Densité optique (DO) à 405 nm ajoutée par puits (ng) Amount of Alkaline Phosphatase Optical Density (OD) at 405 nm added per well (ng)
A BA B
0,05 3,000.05 3.00
0,05 2,930.05 2.93
12,5 0,06 2,4612.5 0.06 2.46
6,26 0,05 1,956.26 0.05 1.95
3,12 0,06 1,343.12 0.06 1.34
1,65 0,06 0,971.65 0.06 0.97
0,78 0,06 0,540.78 0.06 0.54
ExuMple 4 De la phosphatase alcaline (EC3.1.3.1) a été ajoutée aux puits d'une microplaque de titrage comme dans l'exemple 3. La moitié des puits ont été traités avec du méthanol et l'autre moitié ont été traités avec du tampon comme dans EXAMPLE 4 Alkaline phosphatase (EC3.1.3.1) was added to the wells of a titration microplate as in Example 3. Half of the wells were treated with methanol and the other half were treated with buffer as in
l'exemple 3.Example 3
Pour étudier l'activité de liaison aux anticorps de la phosphatase alcaline dans les puits, on a utilisé un anticorps de lapin antiphosphatase alcaline dilué de manière appropriée dans du tampon de liaison (e tampon de liaison était du tampon Tris-HCI 50 mM (pH 7,4) contenant 0,1 M de NaCI, 0,2 % de gélatine, 0,001 % de thimérosal, 10 mg/ml de SAB (sérum albumine bovine) et 20 mg/l de To study the alkaline phosphatase antibody binding activity in the wells, an appropriately diluted alkaline rabbit antiphosphatase antibody was used in binding buffer (binding buffer was 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.1 M NaCl, 0.2% gelatin, 0.001% thimerosal, 10 mg / ml BSA (bovine serum albumin) and 20 mg / l
rhodamine base B.).rhodamine base B.).
L'anticorps a été préparé selon des processus g6n6raux connus pour produire des anticorps qui ont été adaptés pour produire l'anticorps parlticulier requis. The antibody has been prepared according to known general methods to produce antibodies that have been adapted to produce the required antibody.
Le signal a été développé avec un conjugu6 anticorps de chèvre anti- The signal was developed with a conjugate anti-goat antibody
lapin-peroxydase de raifort (HRR) (Sigma) et une solution de substrat de horseradish rabbit-peroxidase (HRR) (Sigma) and a substrate solution of
peroxydase (0,5 mg/ml de sel disodique de l'acide 2,2'-azino-bis(3-éthylbenzo- peroxidase (0.5 mg / ml disodium salt of 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzoic acid)
thiazoline-6-sulfonique (ABTS) dans du tampon ac6tate de sodium/acide citrique mM, pH 4,1 contenant 60id/100 ml de peroxyde dydrogène à 34 % v/v) selon des processus connus. Une couleur est apparue dans tous les puits. La densité optique a ét6 lue à 405 nm au bout de 30 min et les résultats sont présentés dans le tableau 3 dans lequel la colonne A indique les r6sultats concernant les puits trait6s thiazolin-6-sulfonic acid (ABTS) in sodium acetate / mM citric acid buffer, pH 4.1 containing 60 ug / 100 ml of 34% v / v hydrogen peroxide) according to known procedures. A color appeared in all the wells. The optical density was read at 405 nm after 30 min and the results are shown in Table 3 in which column A shows the results for treated wells.
au méthanol et la colonne B indique les résultats concernant les autres puits. with methanol and column B shows the results for the other wells.
Tableau 3Table 3
Quantit6 de phosphatase alcaline Densit6 optique (DO) à 405 nm ajoutée par puits (ng) Amount of Alkaline Phosphatase Optical Density (OD) at 405 nm added per well (ng)
A BA B
2,96 3,002.96 3.00
2,13 2,562.13 2.56
12,5 1,87 2,1212.5 1.87 2.12
6,26 1,12 1,326.26 1.12 1.32
3,12 0,86 0,973.12 0.86 0.97
1,65 0,45 0,651.65 0.45 0.65
0,78 0,24 0,360.78 0.24 0.36
Une comparaison des r6sultats obtenus dans les exemples 3 et 4 r6vèle que, bien que la phosphatase alcaline dénaturé par le méthanol présente peu ou pas d'activit6 enzymatique (colonne A, tableau 2), la phosphatase alcaline A comparison of the results obtained in Examples 3 and 4 reveals that, although methanol-denatured alkaline phosphatase has little or no enzymatic activity (column A, Table 2), alkaline phosphatase
dénaturée conserve une activité de liaison aux anticorps. Denatured retains antibody binding activity.
Exemple 5Example 5
De la phosphatase alcaline (EC3.13.1) a été introduite dans les puits d'une microplaque de titrage comme dans l'exemple 1, traitée au méthanol (voir exemple 3) puis mise à réagir avec un anticorps de lapin antiphosphatase alcaline (voir exemple 4). Le sérum provenant d'un lapin non immunisé a été ajouté à une série de puits témoins contenant les mêmes quantités de phosphatase alcaline que Alkaline phosphatase (EC3.13.1) was introduced into the wells of a titration microplate as in Example 1, treated with methanol (see Example 3) and then reacted with an alkaline rabbit antiphosphatase antibody (see example 4). Serum from a non-immune rabbit was added to a series of control wells containing the same amounts of alkaline phosphatase as
les autres puits et traités au méthanol comme les autres puits. other wells and treated with methanol as the other wells.
Après un lavage, un excès de phosphatase alcaline native (c'est-à-dire enzyme active non dénaturée) a été ajouté aux puits (dans Tris 50 mM (pH 7,8) contenant 10 mg/ml de SAB et 0,5 mM de MgC12) qui ont été laissés au repos pendant 30 min. A la suite d'un lavage pour retirer l'enzyme non liée, une solution de BCIP (voir exemple 2) a été ajoutée aux puits et on a noté que, dans les puits qui avaient été traités avec l'anticorps de lapin anti-phosphatase alcaline, il est apparu une couleur bleue (dont l'intensité était liée à la quantité de phosphatase alcaline introduite dans les puits) alors que les puits témoins ne présentaient aucun After washing, an excess of native alkaline phosphatase (i.e., undenatured active enzyme) was added to the wells (in 50 mM Tris (pH 7.8) containing 10 mg / ml BSA and 0.5 mM MgCl2) which were allowed to stand for 30 min. Following washing to remove the unbound enzyme, a BCIP solution (see Example 2) was added to the wells and it was noted that in the wells that had been treated with the rabbit anti- alkaline phosphatase, a blue color appeared (the intensity of which was related to the amount of alkaline phosphatase introduced into the wells) whereas the control wells showed no evidence of
développement de couleur.color development.
Dans les puits traités avec l'anticorps de lapin anti-phosphatase alcaline, l'anticorps s'était lié à la phosphatase alcaline adsorbée et à l'enzyme active en fixant ainsi l'enzyme active à la microplaque de titrage de manière In the rabbit anti-alkaline phosphatase treated wells, the antibody bound to adsorbed alkaline phosphatase and the active enzyme thereby binding the active enzyme to the assay microplate in a controlled manner.
qu'elle puisse être détectée au moyen d'une solution de substrat. it can be detected by means of a substrate solution.
Excmhl 6 De la phosphatase alcaline (EC3.13.1) a été ajoutée à une composition de véhicule d'encre du commerce et mélangée pour produire un mélange homogène comprenant une composition de véhicule d'encre marquée contenant EXAMPLE 6 Alkaline phosphatase (EC3.13.1) was added to a commercial ink vehicle composition and blended to produce a homogeneous mixture comprising a labeled ink vehicle composition containing
environ 50 /g/ml de phosphatase alcaline. about 50 / g / ml of alkaline phosphatase.
La composition de véhicule d'encre à laquelle la phosphatase alcaline a The ink vehicle composition to which alkaline phosphatase has
été ajoutée était un liquide contenant un mélange de substances trouvées norma- was added was a liquid containing a mixture of substances found normal-
lement dans les formulations d'encre à séchage rapide, à l'exception d'un colorant. in quick-drying ink formulations, except for a dye.
Cinquante microlitres de composition de véhicule d'encre marquée ont été ajoutés aux puits d'une microplaque de titrage et amenés à sécher à 3TC dans un incubateur pendant 2 h. Certains puits de la microplaque de titrage ont été additionnés uniquement de composition de véhicule d'encre non marquée (en la même quantité que la composition de véhicule d'encre marquée contenue dans les autres puits) et traités de la même manière que les puits contenant la composition Fifty microliters of labeled ink vehicle composition was added to the wells of a titration microplate and allowed to dry at 3TC in an incubator for 2 h. Some wells of the titration microplate were added with only unlabelled ink vehicle composition (in the same amount as the labeled ink vehicle composition contained in the other wells) and treated in the same manner as the wells containing the composition
de véhicule d'encre marquée, pour donner des puits témoins. of marked ink vehicle, to give control wells.
Un anticorps de lapin anti-phosphatase alcaline (100/A), dilué de manière approprié dans du tampon de liaison (voir l'exemple 4), a été ajouté à tous les puits. Au bout de 30 min de repos à la température ambiante, les puits ont été vidés et lavés trois fois. Un conjugué anticorps de chèvre antilapin - peroxydase de raifort (100 l) a été ajouté aux puits et, au bout de 1 h d'incubation, les puits ont été lavés (trois fois) et une solution de substrat de peroxydase (voir exemple 4) a Rabbit anti-alkaline phosphatase antibody (100 / A), suitably diluted in binding buffer (see Example 4), was added to all wells. After standing for 30 minutes at room temperature, the wells were emptied and washed three times. Antilapin-horseradish peroxidase goat antibody conjugate (100 l) was added to the wells and after 1 hour of incubation, the wells were washed (three times) and a peroxidase substrate solution (see Example 4). ) at
été ajoutée.been added.
Au bout de 10 min de réaction, on a observé l'apparition d'une couleur dans les puits dans lecsquels la composition de v6hicule d'encre marquée avait été introduite initialement. Au bout de 30 min de réaction, les solutions réactionnclles résultantes ont 6té transférées dans une microplaque de titrage non utilisée et la densité After 10 minutes of reaction, the appearance of color in the wells in which the labeled ink vehicle composition was initially introduced was observed. After 30 minutes of reaction, the resulting reaction solutions were transferred to an unused titration microplate and the density
optique (DO) a été mesurée à 405 nm. Optical (OD) was measured at 405 nm.
La DO était de 0,65 pour les puits dans lesquels la composition d'encre The OD was 0.65 for the wells in which the ink composition
marquée avait été introduite initialement et de 0,16 pour les puits t6moins. marked was introduced initially and 0.16 for the control wells.
Exemple 7Example 7
Une composition de véhicule d'encre du commerce a été appliquée à des boîtes de Petri en matière plastique et amenée à sécher à l'air pour former des A commercial ink vehicle composition was applied to plastic Petri dishes and air-dried to form moldings.
couches fixées à la surface des boîtes de Petri. layers attached to the surface of the Petri dishes.
De la phosphatase alcaline (EC.13.1) (200 #l à 125 ngWml) dans un tampon de revêtement (voir exemple 1) a été appliqu6e aux couches d'encre sèche et amenée à sécher à l'air à hla température ambiante. Puis, les boîtes de Petri ont été placées dans un incubateur à 37C pendant 10 min. Une solution de pNPP (voir exemple 1) a été appliquée auxsurfaces des boîtes de Petri auxquelles la Alkaline phosphatase (EC.13.1) (200 μl at 125 ngW / ml) in a coating buffer (see Example 1) was applied to the dry ink layers and allowed to air dry at room temperature. Then, the Petri dishes were placed in an incubator at 37C for 10 min. A solution of pNPP (see Example 1) was applied to the surfaces of the Petri dishes to which the
composition de véhicule d'encre et l'enzyme avaient 6té appliqu6es. Ink vehicle composition and enzyme had been applied.
Une couleur jaune a 6té observée immédiatement dans les boîtes. Cet exemple démontre que les couches de composition de véhicule d'encre sont capables d'adsorber des espèces enzymatiques actives et que les espèces A yellow color was immediately observed in the boxes. This example demonstrates that the ink vehicle composition layers are capable of adsorbing active enzymatic species and that the species
enzymatiques restent actives après le séchage. Enzyme remain active after drying.
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