FR2684375A1 - Reactifs piegeurs de mercaptans, leur preparation et leurs applications. - Google Patents

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Abstract

Les réactifs piégeurs de mercaptans selon l'invention répondent à la formule générale I: (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle: Z1 = alkyle (1 à 6 C), benzyle, p-nitrobenzyle, phényle, o,p-dinitrophényle, -CH2 -COOH ou -CH2 -CH2 -COOH; Z4 = hydrogène et z5 = hydrogène ou alkyle (1 à 6 C), ou Z4 et Z5 forment ensemble, avec les deux atomes de carbone intermédiaires, un cycle phényle; X = halogénure, sulfonate, fluorosulfonate, phosphonate, tétrafluoroborate ou tosylate; et soit Z2 vinyle, et Z3 hydrogène ou alkyle (1 à 6 C); soit Z3 vinyle, et Z2 hydrogène ou alkyle (1 à 6 C). Application au piégeage des mercaptans susceptibles d'interférer avec une entité chimique ou biologique, notamment au cours d'un dosage de celle-ci.

Description

Réactifs piégeurs de mercaptans, leur préparation et leurs applications.
La présente invention concerne le "piégeage", par S-alkylation, des mercaptans, c'est-à-dire des entités comprenant un ou plusieurs groupement(s) thiol(s), présents dans des milieux aqueux et susceptibles d'interférer avec le dosage de composés chimiques ou biologiques contenus dans ces milieux.
Elle a plus particulièrement pour objet des composés hétérocycliques azotés, vinyliques, utilisables en tant que piégeurs de mercaptans, leur préparation et leurs applications.
Les deux caractéristiques essentielles du groupement thiol des mercaptans sont
- un pouvoir réducteur élevé, d'une part;
- un caractère nucléophile marqué, d'autre part.
C'est grâce à ces propriétés chimiques que les mercaptans physiologiques, en général, et le glutathion réduit (GSH), en particulier, participent à la protection cellulaire (référence 1).
En contrepartie, les mercaptans interfèrent fortement avec la plupart des mesures biochimiques mettant en jeu des intermédiaires réactionnels de nature radicalaire et/ou électrophile. De telles mesures effectuées en présence de mercaptans sont alors difficiles, voire impossibles.
C'est le cas, en particulier, du dosage de l'activité d'enzymes d'oxydo-réduction, comme par exemple la superoxyde dismutase (SOD) ou la catalase, et de nombreuses oxydoréductases à cytochrome ou à co-enzyme flavinique, entre autres, ou du dosage des disulfures tels que le glutathion disulfure (GSSG) ou des disulfures mixtes de protéines (PSSR), ou encore du dosage de certains médicaments tels que anthracyclines ou hydroquinones, par exemple.
Il est donc nécessaire de disposer de moyens tels que des réactifs d'alkylation par exemple, permettant de piéger ces mercaptans, c'est-à-dire d'inactiver leur groupement thiol dans le cadre du dosage.
Pour être utilisables de façon satisfaisante dans des dosages spectrophotométriques, de tels réactifs doivent présenter simultanément un certains nombre de caractéristiques. Ils doivent en particulier être
- rapides : leur temps de réaction totale doit être inférieur à 10 minutes;
- exhaustifs : tous les mercaptans susceptibles d'interférer dans le dosage considéré doivent être piégés;
- spécifiques du groupement thiol dans les conditions opératoires utilisées;
- solubles : leur solutilité en milieu aqueux, biologique en particulier, doit être supérieure ou égale à 10-2 mole/l; - spectrophotométriquement transparents : leur spectre d'absorption doit être dépourvu de recouvrement avec celui du ou des chromophore(s) permettant d'effectuer la mesure.
Un certain nombre de composés réagissant avec le groupement thiol des mercaptans ont déjà été décrits, et ce, par exemple, dans un but de mise en évidence qualitative ou quantitative des mercaptans (références 2, 3a et 3b). Ce sont, pour les principaux
* Des dérivés de l'acide iodoacétique : ils ont une spécificité relativement faible et leur réactivité est lente. De plus, ces réactifs sont généralement instables à la lumière.
* Des réactifs possédant une double liaison électrophile activée (accepteurs de Michaël) : ils comprennent
- les dérivés du maléimide : leur spécificité n'est pas meilleure que celle des réactifs précédents, ils sont souvent lacrymogènes et peu solubles dans l'eau;
- les énones (référence 4) : elles réagissent lentement avec les nucléophiles azotés ou oxygénés, mais plus rapidement avec les nucléophiles soufrés; elles présentent généralement les mêmes inconvénients majeurs que les réactifs précédents, en particulier une solubilité dans l'eau très limitée.
D'autres réactifs, non spectrophotométriquement transparents aux longueurs d'ondes utilisées pour la plupart des mesures colorimétriques évoquées précédemment, incluent
* Des réactifs halogénoaromatiques activés ces réactifs, du type 2,4-dinitrochlorobenzène (DNCB) ou 2,4-dinitrofluorobenzène (DNFB) (référence 5) ne sont pas spécifiques des groupements thiols à pH alcalin; ils sont peu solubles en milieu aqueux à forte concentration.
* Les monohalogénobimanes (référence 6) ils peuvent réagir avec d'autres nucléophiles que les groupements thiols, tels que par exemple les amines; leur photosensibilité ainsi que celle de leurs produits de réaction impliquent des précautions d'emploi qui alourdissent le protocole expérimental.
Par ailleurs, leur cinétique de réaction assez lente à pH < 8 ne permet pas de les utiliser comme piégeurs rapides de mercaptans.
* Des dérivés du benzoxa-1,3-diazole, en particulier le 7-chloro-2-benzoxa-l, 3-diazole-4-sulfonate (SBD-C1) et le 7-fluoro-2-benzoxa-1, 3-diazole-4-sulfonate (SBD-F) qui requièrent un temps de réaction important et un pH alcalin (références 7 et 8).
Parmi ces composés, seules deux familles de réactifs précités ont été utilisées pour piéger des mercaptans
* le maléimide et ses dérivés (références 9a et 9b) : ils sont peu réactifs, souvent fluorescents, lacrymogènes et surtout peu solubles en milieu aqueux. Dans le cas du N-éthylmaléimide (NEM), il est souvent nécessaire d'éliminer l'excès de réactif car il interfère avec le dosage, par exemple celui du glutathion disulfure, ce qui alourdit considérablement la procédure et la rend peu précise.
* la 2-vinylpyridine et la 4-vinylpyridine (référence 10) : ce sont des réactifs lents, peu solubles en milieu aqueux, même à pH acide. Un tel réactif doit être additionné en très large excès (dans un rapport supérieur à 1000). A ces concentrations élevées, ces composés ne sont pas dénués d'effets 'tsecondaires" sur des échantillons biologiques, ce qui exclut le plus souvent une mesure fiable d'activités enzymatiques, en particulier.
L'invention a pour but de fournir des réactifs piégeurs de mercaptans qui ne présentent pas les inconvénients des réactifs connus jusqu a présent et qui en particulier soient rapides, exhaustifs, spécifiques du groupement thiol, solubles en milieu aqueux et spectrophotométriquement transparents, selon les définitions de ces termes données plus haut.
Ces buts sont atteints selon l'invention qui, sous l'un de ses aspects, fournit des réactifs piégeurs de mercaptans répondant à la formule générale I dans laquelle
Figure img00040001
z1 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle,
p-nitrobenzyle, phényle, o,p-dinitrophényle,
-CH2-COOH ou -CH2-CH2-COOH;
Z4 = hydrogène et
Z5 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de
carbone), ou
Z4 et Z5 forment ensemble, avec les deux atomes de carbone
intermédiaires, un cycle phényle;
X = halogénure, sulfonate, fluorosulfonate,
phosphonate, tétrafluoroborate ou tosylate; et soit z2 = vinyle, et
Z3 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone)
(composés 2-vinyliques); soit Z3 = vinyle, et
z2 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone)
(composés 4-vinyliques).
Ces réactifs permettent de piéger les mercaptans présents dans tout échantillon biologique aqueux ou toute solution aqueuse artificielle.
L'originalité de ces réactifs réside, d'une part, dans le fait qu'ils permettent d'alkyler totalement, rapidement et spécifiquement, dans les conditions opératoires utilisées, notamment dans les dosages, les groupements thiols en milieu aqueux grâce au centre électrophile de type vinylpyridinium qui caractérise leur structure et, d'autre part, dans le fait qu'ils sont stables et non chromogéniques entre 400 et 800 nm.
L'utilisation de ces réactifs est donc particulièrement intéressante dans toute situation où un ou des mercaptan(s) interfère(nt) dans un dosage, comme c'est le cas par exemple du glutathion réduit pour un dosage de l'activité superoxyde dismutase d'un échantillon biologique, ou encore pour le dosage plasmatique de disulfures.
En effet, l'introduction, dans la solution à doser, d'au moins l'un des réactifs selon l'invention permet de s'affranchir de toute phase de préparation de cet échantillon (extraction, précipitation, chromatographie, dialyse), sans par ailleurs perturber la mesure, et permet en particulier d'effectuer une mesure spectrophotométrique dans le domaine visible du spectre d'absorption.
Ces nouveaux réactifs chimiques piégeurs de mercaptans présentent donc l'intérêt de pouvoir considérablement simplifier la mise en oeuvre de dosages effectués en milieu aqueux pour lesquels il est nécessaire de s'affranchir de la réactivité des mercaptans interférentiels. De plus, du fait de leur grande réactivité et de l'absence d'absorption par les adduits formés dans une gamme étendue de longueurs d'ondes analytiquement exploitables, ces réactifs sont tout à fait adaptés pour compléter le (ou les) réactif(s) nécessaire(s) à la mesure d'un paramètre donné par spectrophotométrie d'absorption, et en particulier pour l'élaboration de nécessaires ou kits de dosage utilisables pour les recherches biologiques en général, ainsi qu'en Chimie Clinique.
Certains des composés répondant à la formule générale I ci-dessus, bien que n'ayant encore jamais été proposés en tant que réactifs piégeurs de mercaptans, sont des composés chimiques connus (cas où Z1 = alkyle et soit Z1 = vinyle, Z3 = Z4 = Z5 = hydrogène, soit Z3 = vinyle, z2 = Z4 = Z5 = hydrogène). Toutefois, la plupart d'entre eux sont nouveaux.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet les composés répondant à la formule I
Figure img00060001

dans laquelle z1 à Z5 et X sont définis comme précédemment, étant entendu
que Z1 est différent d'alkyle
- soit lorsque z2 = vinyle, et Z3, Z4 et Z5
représentent simultanément 1 'hydrogène;
- soit lorsque Z3 = vinyle, et 22, z4 et Z5
représentent simultanément 1 'hydrogène.
Ces composés sont nouveaux.
Les composés de formule générale I, et en particulier les composés nouveaux définis ci-dessus, peuvent être préparés selon les procédures générales décrites cidessous, par vinylation de l'hétérocycle et alkylation de l'azote des composés hétérocycliques correspondants, ncn vinyliques et non substitués sur l'azote, et par ailleurs substitués de façon appropriée, connus ou préparés par analogie à des procédés connus d'obtention de tels composés.
Ainsi, les composés de type 2-vinylique (z2 = vinyle et Z3 = hydrogène ou alkyle) peuvent être préparés comme suit.
Le composé de départ (pyridine ou quinoléine substitués) est soumis à la méthode de Comins (références 11 et 12) à l'aide de bromure de vinylmagnésium. Le produit ainsi obtenu est oxydé avec, par exemple, de la tétrachloro1,4-benzoquinone (parachloranil) ou du soufre Sg, pour conduire au produit aromatique correspondant. L'alkylation de l'azote hétérocyclique de ce produit est réalisée à l'aide d'un agent alkylant approprié tel que par exemple le tétrafluoroborate de triméthyloxonium, le sulfate de méthyle, le bromure de benzyle, le fluorodinitrobenzène, l'iodoacétate de sodium ou le 3-bromopyruvate de sodium.
Remarque : Dans le cas de la préparation de composés de type pyridinium, le produit A obtenu selon la méthode de Comins est le produit de rétro Diels-Alder du produit d'addition du groupement vinyle sur le pyridinium correspondant. Il se recyclise à haute température, lors de l'oxydation pour donner un produit B.
Le schéma réactionnel qui suit est destiné à illustrer le procédé décrit ci-dessus dans le cas de la préparation du tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-2- vinylpyridinium (composé de l'exemple 3 de la partie expérimentale qui suit).
Figure img00080001
<tb> <SEP> A <SEP> 1/PhOCOC1 <SEP> < <SEP> / <SEP> sg' <SEP> parachloranil
<tb> <SEP> 2/vinylMgBr <SEP> C02Ph <SEP> PhCH3,reflux
<tb> <SEP> A
<tb> X <SEP> Me30+, <SEP> BF4- <SEP> < <SEP> Ns
<tb> <SEP> B <SEP> |
<tb>
Par ailleurs, les composés de type 4-vinylique (z2 = hydrogène ou alkyle et Z3 = vinyle) peuvent être préparés comme suit.
L'aldéhyde hétérocyclique correspondant (fonction aldéhyde en position 4 du cycle pyridine) est soumis à la réaction de Wittig, avec, par exemple, le bromure de triphénylméthylphosphonium, ou à la réaction de Peterson, avec, par exemple, le chlorométhyltriméthylsilane pour conduire à un produit intermédiaire C. L'alkylation de l'azote hétérocyclique du produit C est réalisée à l'aide d'un agent alkylant approprié tel que par exemple le tétrafluoroborate de triméthyloxonium, le sulfate de méthyle, le bromure de benzyle, le fluorodinitrobenzène, l'iodoacétate de sodium ou le 3-bromopyruvate de sodium.
Le schéma réactionnel qui suit est destiné à illustrer le procédé décrit ci-dessus dans le cas de la préparation du tétrafluoroborate de 1,2-diméthyl-4vinylquinoléinium (composé de l'exemple 5 de la partie expérimentale qui suit).
Figure img00090001
<tb> <SEP> cF.a <SEP> f
<tb> <SEP> M <SEP> M <SEP> (Ph)3P+CH3 <SEP> M <SEP> M
<tb> <SEP> Base <SEP> Base
<tb> <SEP> C
<tb> <SEP> M
<tb> Me30+,BF4- <SEP> M <SEP> M
<tb> <SEP> >
<tb>
La préparation des composés de formule générale
I sera illustrée, à titre non limitatif, par la description des exemples 1 à 5 de la partie expérimentale de la présente description.
Selon encore un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de piégeage du ou des mercaptan(s) contenu(s) dans un milieu essentiellement aqueux, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à dissoudre dans ce milieu une quantité d'un ou plusieurs réactif(s) piégeur(s) de mercaptans selon l'invention, suffisante pour piéger totalement le- ou lesdits mercaptans, et à laisser incuber la solution obtenue pendant une durée suffisante pour piéger totalement le- ou lesdits mercaptans par Salkylation.
La durée d'incubation dépend essentiellement de la composition du mélange obtenu après addition du ou des réactif(s) mais est généralement inférieure à 10 minutes.
Le réactif "piégeur de mercaptans" peut être incorporé au milieu aqueux à partir, par exemple, d'une solution-mère aqueuse concentrée de ce réactif, tamponnée ou non, ou dans un solvant organique miscible à l'eau tel que, par exemple, l'acétonitrile, le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde.
Afin que la réaction de piégeage, dans des conditions données, reste optimale et afin d'éviter une hydrolyse rapide du réactif et/ou la dénaturation de composés biologiques, il est préférable que la préparation d'une solution-mère aqueuse du réactif soit effectuée extemporanément, d'une part, et dans des conditions non alcalines, d'autre part.
Ainsi par exemple, le réactif l-méthyl-2vinylpyridinium, à une concentration de 10-2 M dans l'eau distillée entre O et 40C, est stable environ quatre heures et le réactif tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-2vinylpyridinium, à une concentration de 5.10-2 M dans le diméthylsulfoxyde à température ambiante, est stable au moins 1 mois.
La réactivité chimique intrinsèque des composés utilisés selon la présente invention est indépendante du pH.
Le temps de réaction correspondant à un piégeage total est fonction, à un pH donné, du pKa de la ou des fonction(s) thiol du ou des mercaptan(s) (dont la réactivité intrinsèque est fonction du pH), de la nature du ou des réactif(s), des concentrations relatives en réactif(s) et en mercaptan(s) et de la température.
Les conditions du piégeage peuvent donc être modulées en modifiant un ou plusieurs des paramètres suivants
- pH,
- nature et concentration du ou des réactif(s),
- température, ceci en fonction de la nature chimique et de la concentration du ou des mercaptan(s) à piéger, d'une part, et d'éventuelles contraintes expérimentales liées au type de mesure à effectuer ultérieurement, d'autre part.
En ce qui concerne le pH, ainsi par exemple, le temps de réaction correspondant au piégeage total du glutathion réduit par le 1-méthyl-2-vinylpyridinium, dans un rapport de 5 moles de réactif pour 1 mole de glutathion, est égal à 20 minutes à pH = 6,6 (tampon phosphate 50 mM) et il est inférieur à 3 minutes à pH = 7,3 (tampon phosphate 50 mM) ou à pH = 8,7 (tampon borate 20 mM), à température ambiante. Cette même réaction est "immédiate" (moins de 20 secondes) à pH = 9,7 (tampon borate 20 mM).
Si on utilise un isomère de position du réactif cité précédemment, tel que le 1-méthyl-4-vinylpyridinium, le temps de réaction est de 50 minutes à pH = 7,6 (tampon phosphate 50 mM) et est inférieur à 10 minutes à pH = 8,7 (tampon phosphate 50 mM) ou à pH = 9,7 (tampon borate 20 mM), toutes choses étant égales par ailleurs.
En ce qui concerne la nature du réactif, par exemple, le tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-2vinylpyridinium doit être incorporé au milieu réactionnel à une concentration cinq fois plus importante que le 1-méthyl2-vinylpyridinium pour piéger totalement et rapidement le glutathion réduit, présent dans une solution aqueuse tamponnée à pH = 8,8 (tampon 2-amino-2-méthyl-1,3propanediol 50 mM/HCl), à 370C.
Les réactifs utilisés selon l'invention permettent donc de piéger facilement et rapidement tout mercaptan en milieu aqueux avec une souplesse d'emploi offrant la possibilité d'adapter l'utilisation d'un ou plusieurs de ces réactifs selon les situations rencontrées dans la Recherche en Biologie, où un ou plusieurs mercaptans interfèrent avec le marqueur biochimique considéré.
En outre, les caractéristiques spectrophotométriques de ces réactifs, et de leurs adduits avec des mercaptans, permettent de les associer à des procédures de dosage mettant en oeuvre une mesure spectrophotométrique à une longueur d'onde supérieure ou égale à 300 nm ou 350 nm pour les séries vinylpyridinium et vinylquinoléinium, respectivement.
Combinée à un piégeage rapide des mercaptans, cette propriété confère aux réactifs selon l'invention un très grand intérêt pour simplifier des procédures de dosage dans des échantillons biologiques où un ou plusieurs mercaptan(s) pertube(nt) les mesures s'il(s) n'est (ne sont) pas éliminé(s), comme ctest le cas par exemple du glutathion réduit lors du dosage de l'activité superoxyde dismutase dans n importe quel échantillon, ou encore du dosage de disulfures, par exemple ceux du plasma sanguin. En effet, selon l'art antérieur, dans de tels cas, la préparation de l'échantillon (dialyse, extraction, chromatographie) alourdit la méthode de dosage de façon incompatible avec le traitement de grandes séries d'échantillons telles que, par exemple, celles auxquelles doit faire face l'analyste en
Chimie Clinique.A cet égard, l'utilisation d'un ou plusieurs des réactifs piégeurs de mercaptans selon l'invention peut compléter avantageusement un nécessaire ou kit de dosage colorimétrique.
Un exemple de piégeage d'un mercaptan interférant dans un dosage est présenté à titre illustratif et aucunement limitatif dans la partie expérimentale qui suit, dans le cadre d'un dosage de l'activité superoxyde dismutase dans un lysat érythrocytaire à l'aide de braziline, en présence de glutathion réduit (exemple 6).
Selon encore un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un nécessaire ou kit pour le dosage colorimétrique d'une entité chimique ou biologique en présence d'un ou plusieurs mercaptan(s) susceptible(s) d'interférer avec ladite entité dans le cadre dudit dosage, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité d'au moins un réactif piégeur de mercaptans selon l'invention, suffisante pour piéger totalement le- ou lesdits mercaptans.
PARTIE EXPERIMENTALE
I. Préparation de réactifs piégeurs de mercaptans
Exemple 1 : Préparation du tétrafluoroborate de 1 méthyl-2-vinylpyridiniurn.
Dans un ballon de 250 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation à 100C, 19 mmoles de 2-vinylpyridine (JANSSEN) dans 50 ml d'acétonitrile. 35 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) sont ajoutées, par petites portions, en 10 minutes à température ambiante. L'agitation est maintenue 30 minutes dans ces conditions puis le solvant est évaporé sous vide. Le produit brut est recristallisé dans le 2-propanol. Le produit désiré (2,4 g) est obtenu avec un rendement de 61 %.
Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
4,48 ppm (s, 3H); 6,14-6,20 ppm (d, 1H, J = 12,5 Hz);
6,45-6,54 ppm (d, 1H, J = 17,5 Hz); 7,30-7,45 ppm (dd,
1H, J = 12,5-17,5 Hz); 8,05 ppm (t, 1H, J = 4 Hz); 8,39
ppm (d, 1H, J = 10 Hz); 8,60 ppm (t, 1H, J = 4 Hz); 8,95
ppm (d, 1H, J = 7,5 Hz).
* SM (FAB) glycérol-NoBA : ion positif M+ = 120(100)
ion négatif M- = 87(100).
FAB = bombardement par atomes rapides (Fast Atom
Bombardment)
NOBA = alcool méta-nitrobenzylique.
EXEMPLE 2 : Préparation du tétrafluoroborate de 1
méthyl-4-vinylpyridinium.
Dans un ballon de 250 ml muni d'une agitation, d'un thermomètre, et sous courant d'azote, on dissout sous agitation à 100C, 19 mmoles de 4-vinylpyridine (JANSSEN) dans 100 ml d'acétonitrile. 36 mmoles de tétrafluoroborate de triméthyloxonium (LANCASTER) sont ajoutées, par petites portions, en 10 minutes à température ambiante. L'agitation est maintenue 2 heures dans ces conditions puis le solvant est évaporé sous vide. Le produit brut est recristallisé dans le 2-propanol. Le produit désiré (2,0 g) est obtenu avec un rendement de 51 %.
Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
4,50 ppm (s, 3H); 6,0 ppm (d, 1H, J = 12 Hz); 6,55
6,65 ppm (d, 1H, J = 18 Hz); 7,0-7,17 ppm (dd, 1H, J =
12-18 Hz); 8,25 ppm (d, 2H, J = 7 Hz); 9,90 ppm (d,
2H, J = 7 Hz).
* SM (FAB) glycérol-NOBA : ion positif M+ = 120(100)
ion négatif M- = 87(100).
Exemple 3 : Préparation du tétrafluoroborate de 1,4, 6-triméthyl-2-srinylpyridinium
Synthèse du produit A
A une solution de 2,4-diméthylpydirine (20 g; 0,186 mole ; LANCASTER), dans 200 ml de THE fraîchement distillé, refroidie à -200C et sous atmosphère inerte, on ajoute du chloroformiate de phényle (29,12 g; 0,186 mole
JANSSEN) dans 100 ml de THF. Le mélange réactionnel est agité à cette température pendant 20 minutes. Puis du bromure de vinylmagnésium (186 ml d'une solution 1 M dans le
THF ; ALDRICH) est additionné et la solution est agitée à température ambiante pendant 0,5 h. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu est repris par 300 ml d'éther terbutylméthylique.Après lavage du milieu réactionnel avec une solution saturée de NH4C1, la phase organique est séchée sur MgSO4 et le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK
F 254 (éluant = hexane/AcOEt, 9/1).
Rendement = 39,5 g (83 %), huile incolore.
Synthèse du produit B (4a6-diméthzr1-2-vinylpyridine)
Le produit A est repris par 500 ml de toluène et additionné de p-chloranil (41,7 g; 0,169 mole ; LANCASTER), puis chauffé à reflux pendant 2 h. Le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite, puis additionné d'une solution de soude (260 ml, 2N). Le produit est extrait par de l'éther terbutylméthylique (300 ml) et purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = hexane/AcOEt, 9/1).
Rendement = 11,1 g (54,2 %), huile jaune pâle.
Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
2,20 ppm (s, 3H); 2,50 ppm (s, 3H); 5,25-5,45 ppm (dd,
2H, J = 11,9-18,7 Hz); 6,60-6,90 ppm (m, 3H).
* SM (DIC/NH3) : MH+ = 134(100).
DIC : désorption par ionisation chimique.
Synthèse du tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-2vinylpyridinium:
A une solution du produit B (0,61 g; 4,1 mmoles) dans 4,0 ml de chlorure de méthylène sous atmosphère inerte, on ajoute, en une portion, du tétrafluoroborate de triméthyloxonium (0,50 g; 3,76.10-3 mole ; LANCASTER). La suspension est laissée réagir pendant 2 h à 250C. La suspension est filtrée et le produit est séché sous vide.
Rendement = 0,162 g (18 %), cristaux blancs.
Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
2,60 ppm (s, 3H); 2,85 ppm (s, 3H); 4,20 ppm (s, 3H);
6,00 ppm (d, 1H, J=12,8 Hz); 6,25 ppm (d, 1H,
J=19,2 Hz); 7,27 ppm (dd, 1H, J=12,8-19,2 Hz); 7,82 ppm
(s, 1H); 7,95 ppm (s, 1H).
* SM (IE, 70eV): 148(10); 147(18); 133(34); 121(100);
106(25); 91(31); 77(52); 49(77).
IE = impact électronique
* Microanalyse
Calculé (e) : C 51,10; H 6,00; N 6,00
Trouvé (%) : C 49,80; H 6,08; N 5,96.
Exemple 4 : Préparation du tétrafluoroborate de 1 méthyl-4-vinylquinollinium.
Synthèse du produit C (4-vinylquinoléine)
Une solution de 4-quinoléine-carboxaldéhyde (5 g; 3,18.10-2 mole ; ALDRICH) dans 32 ml de benzène, sous atmosphère inerte, contenant de l'iodure de triphénylméthylphosphonium (26 g; 6,3 mmoles ; ALDRICH) est additionnée à une solution de soude (96 ml; 5N). Le système biphasique est agité à 450C pendant 30 minutes. Après décantation, la phase aqueuse est extraite par de l'acétate d'éthyle (3x100 ml).
Les phases organiques sont réunies et lavées par une solution d'HCI 1N (2x30 ml), puis la phase aqueuse est neutralisée par du NaHCO3 et extraite par du chlorure de méthylène (3x100 ml). La phase organique est séchée sur
MgSO4. Le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = cyclohexane/AcOEt, 8/2).
Rendement = 2,8 g (60 %).
Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CDCl3)
5,60 ppm (d, 1H, J=10 Hz); 5,95 ppm (d, 1H,
J=14 Hz); 7,30-7,55 ppm (m, 4H); 7,60-7,75 ppm (t, 1H,
J=4 Hz); 8,07 ppm (t, 2H, J=6 Hz); 8,85 ppm (d, 1H,
J=4 Hz).
Synthèse du tétrafluoroborate de 1-méthvl-4-vinylquino- leinium :
A une solution du produit C (0,72 g; 4,64.10-3 mole) dans un mélange acétonitrile/acétone (2,5/1) est ajouté sous atmosphère inerte, en une portion, du tétrafluoroborate de triméthyloxonium (1,58 g; 10,7.10-3 mole
LANCASTER). La suspension est laissée réagir pendant 1 h à 250C. Le solvant est évaporé sous pression réduite, le résidu est repris par du 2-propanol (25 ml) puis agité pendant 30 minutes à température ambiante. Après addition d'éther éthylique (25 ml), la suspension est filtrée. Le produit désiré est séché sous vide.
Rendement = 0,93 g (60,4 %).
Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
4,30 ppm (s, 3H); 6,25 ppm (d, 1H, J=12,5 Hz); 6,65 ppm
(d, 1H, J=17,5 Hz); 7,85-8,00 ppm (dd, 1H, J=12,5
17,5 Hz); 8,10 ppm (d, 1H, J=7 Hz); 8,35 ppm (dd, 2H,
J=10-10 Hz); 8,57 ppm (d, 1H, J=10 Hz); 8,72 ppm (d,
1H, J=10 Hz); 9,35 ppm (d, 1H, J=7 Hz).
* SM (FAB) glycérol-NOBA : ion positif M+ = 170(100),
ion négatif M- = 87(100).
* Microanalyse
Calculé (%) : C 56,00; H 4,60; N 5,40
Trouvé (%) : C 55,56; H 4,35; N 4,12.
Exemple 5 : Préparation du tétrafluoroborate de 1,2
diméthyl-4-vinylquinoléinium
Une procédure similaire à celle de l'exemple 4, à partir de 2-méthyl-4-quinoléinecarboxaldéhyde permet d'aboutir au composé désiré avec un rendement de 58 %.
Caractéristiques physiques
*RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
2,77 ppm (s, 3H); 4,21 ppm (s, 3H); 6,18 pm (d, 1H, J =
12,1 Hz); 6,56 ppm (d, 1H, J = 17,0 Hz); 7,80-8,00 ppm
(dd, 1H, J = 12,1-17,0 Hz); 8,13 ppm (s, 1H); 8,37 ppm
(dd, 2H, J = 10-10 Hz) ; 8,50 ppm (d, 1H, J = 10 Hz);
8,65 ppm (d, 1H, J = 10 Hz).
* SM (FAB) glycérol-NOBA : ion positif M+ = 184(100)
ion négatif M- = 87(100).
* Microanalyse
Calculé (%) : C 84,80; H 7,60; N 7,60
Trouvé (%) : C 84,23; H 7,52; N 7,26.
II. Application Exemple 6 : Utilisation zut du tétrafluoroborate de
1,4,6-triméthyl-2-vinylpyridinium (composé de
l'exemple 3) dans le cadre du dosage de
l'activité SOD dans un échantillon biologique.
Dans cet exemple, l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un échantillon biologique est dosée selon le procédé spectrophotométrique faisant l'objet de la demande de brevet français déposée parallèlement par la Société
BIOXYTECH et ayant pour titre "Procédé de dosage de l'activité SOD utilisant la braziline ou l'un de ses dérivés, nécessaires pour sa mise en oeuvre, composés dérivés de la braziline et leur préparation".
Dans un dosage de ce type qui utilise l'autoxydation d'un composé de type braziline pour donner un chromophore, la présence de mercaptans tels que par exemple le glutathion réduit, interfère avec le dosage. Pour éliminer les interférences dues aux mercaptans et obtenir ainsi une mesure fiable, selon une procédure de mise en oeuvre simple et rapide, on utilise avantageusement l'un des réactifs piégeurs de mercaptans selon la présente invention.
On utilise un coffret contenant les réactifs décrits ci-dessous. Ce coffret de réactifs doit être stocké à une température comprise entre 0 et 40C.
Description des réactifs R1 : Solution de braziline 2.10-3 M dans le mélange
DMSO/H2O, 50/50 (v/v) contenant de l'acide borique
0,15 M.
(A conserver entre 0 et 40C pendant les mesures; stable
environ 1 mois après préparation, dans les conditions
de stockage mentionnées ci-dessus)
R2 : Solution de tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-2
vinylpyridinium 5.10-2 M dans du DMSO contenant 25 %
(p/v) d'éthylène-glycol.
(A conserver entre 0 et 40C pendant les mesures; stable
au moins 1 mois après préparation).
E : Ethanol absolu/chloroforme, 62,5/37,5 (v/v).
(A conserver entre 0 et 40C pour la préparation de
l'échantillon).
T : Tampon AMPD 0,05 M/HCl pH = 8,8, contenant du DTPA
0,1 mM.
(Laisser équilibrer à l'air et à 370C avant les mesures)
Préparation de l'échantillon
On centrifuge au moins 100 Fl de sang total à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes. On élimine le surnageant.
On lave le culot érythrocytaire avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 % (refroidie entre 0 et 40C) puis on centrifuge à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes. On élimine le surnageant. On reprend le culot érythrocytaire avec 4 fois son volume d'eau distillée refroidie entre 0 et 40C et on mélange.
A 125 Rl de ce lysat érythrocytaire au 1/5ème, on ajoute 200 pl du mélange E, (refroidi entre 0 et 40C). On mélange et centrifuge à 4 C ét 3000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant ainsi obtenu, débarrassé de l'hémoglobine, servira au dosage (il doit être conservé à 40C pour les mesures)
Procédure de dosage
Les mesures sont effectuées à 370C dans un spectrophotomètre dont les cuves de mesure sont thermostatées.
Le mélange réactionnel correspondant à chaque dosage est préparé extemporanément selon les proportions données dans le tableau ci-dessous pour des cuves de 1 ml.
Chaque réaction est déclenchée par l'ajout de 10 Al de réactif R1. Après homogénéisation du milieu, l'évolution de l'absorbance est enregistrée immédiatement et suivie pendant 1 min 30 s.
La mesure d'absorbance est effectuée à 539 nm dans des cuves de 1 cm de trajet optique, contre de l'air.
Pour chaque mesure, le milieu réactionnel défini dans le tableau ci-dessous doit être incubé pendant 1 minute à 370C avant ajout du réactif R1.
Figure img00190001
<tb>
<SEP> TEMPO <SEP> IONS <SEP> ECHANTILLONS
<tb> <SEP> R2 <SEP> 20 <SEP> l <SEP> 20 <SEP> l <SEP>
<tb> Ethanol <SEP> à <SEP> 50 <SEP> % <SEP> (v/v)
<tb> dans <SEP> l'eau <SEP> 40 <SEP> 1 <SEP>
<tb> distillée
<tb> ECHANTILLONS <SEP> 40 <SEP> Ul <SEP>
<tb> <SEP> T <SEP> 930 <SEP> ,LLl <SEP> 930 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Pour chacune des mesures, on détermine la vitesse maximale d'autoxydation, exprimée en unités d'absorbance par minute, en soustrayant la valeur d'absorbance relevée au bout de 20 s de celle relevée au bout de 80 s, ce qui correspond à une phase d'oxydation linéaire de la braziline.
Expression des résultats
Dans les conditions de ce dosage, une unité d'activité SOD (U) correspond à une augmentation de la formation de braziléine (produit d'autoxydation de la braziline), par rapport au témoin, de 0,5 pLmole.l-l.mole-1.
Soient VC et Vs les vitesses correspondant respectivement au témoin et à l'échantillon, l'activité SOD de celui-ci est calculée
10 en reportant l'inverse de la différence (Vs-Vc) en
ordonnée d'une courbe d'étalonnage dans laquelle
l'inverse de la concentration en SOD, esprimé en
ml/U, est porté en abscisse et l'inverse de la
différence (Vs-Vc), exprimé en min/variation de
l'absorbance, est porté en ordonnée;
2 en déterminant la valeur de l'abscisse correspondante
sur cette courbe d'étalonnage; et
30 en multipliant l'inverse de la valeur de cette
abscisse par le facteur de dilution, soit ici 250,
pour exprimer les résultats en U/ml d'érythrocytes.
Les résultats peuvent être exprimés également par
exemple en U/ml de sang total ou en U/mg de protéines
érythrocytaires.
Remarques
Le contrôle de la procédure de dosage peut être effectué en dosant l'activité SOD d'un lysat érythrocytaire au 1/5ème préparé comme décrit précédemment et conservé à -700C sous forme d'aliquots pour servir de témoin.
L'activité SOD est stable au moins 6 mois à -700C.
Le dosage doit être effectué sur un aliquot décongelé extemporanément.
Il convient de noter que la mesure, par cette méthode, de l'activité SOD dans un échantillon de ce type ne peut être réalisée sans élimination ou piégeage des mercaptans qu'il contient.
L'utilisation d'un composé selon l'invention pour piéger les mercaptans de l'échantillon à doser permet d'éviter d'avoir recours, pour leur élimination, à un pré- traitement complexe, tel que par exemple une dialyse, qui alourdit considérablement la mise en oeuvre et ne permet pas de traiter un grand nombre d'échantIllons.
Il convient en outre de souligner que l'application décrite dans cet exemple est parfaitement automatisable, ce qui représente un avantage considérable en
Chimie Clinique.
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Claims (7)

REVENDICATIONS
1.- Réactifs piégeurs de mercaptans, caractérisés en ce qu ils répondent à la formule générale I
Figure img00240001
dans laquelle
z1 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle,
p-nitrobenzyle, phényle, o,p-dinitrophényle,
-CH2-COOH ou -CH2-CH2-COOH;
Z4 = hydrogène et
Z5 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de
carbone), ou
Z4 et Z5 forment ensemble, avec les deux atomes de carbone
intermédiaires, un cycle phényle;
X = halogénure, sulfonate, fluorosulfonate,
phosphonate, tétrafluoroborate ou tosylate; et soit z2 = vinyle, et
Z3 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de
carbone); soit Z3 = vinyle, et
z2 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de
carbone).
magnésium; - oxyder le produit ainsi obtenu; et - alkyler le produit d'oxydation au moyen d'un agent d'alkylation approprié.
la méthode de Comins au moyen de bromure de vinyl
2. Procédé de préparation des composés de formule générale I dans laquelle z2 = vinyle, et Z3 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), et Z1, z4, Z5 et X sont définis comme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à - soumettre la pyridine ou la quinoléine correspondante à
3.- Procédé de préparation des composés de formule générale I dans laquelle Z3 = vinyle et z2 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone) et Z1, z4, Z5 et X sont définis comme à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à - soumettre l'aldéhyde hétérocyclique correspondant, dans
lequel la fonction aldéhyde est en position 4 du cycle
pyridine, à la réaction de Wittig ou à la réaction de
Peterson au moyen d'un réactif approprié, et - alkyler le produit résultant au moyen d'un agent
d'alkylation approprié.
4.- Procédé de piégeage du ou des mercaptan(s) contenu(s) dans un milieu essentiellement aqueux, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à dissoudre dans ce milieu une quantité d'un ou plusieurs réactif(s) piégeur(s) de mercaptans selon la revendication 1, suffisante pour piéger totalement le- ou lesdits mercaptans, et à laisser incuber la solution obtenue pendant une durée suffisante pour piéger totalement le- ou lesdits mercaptans par S-alkylation.
5.- Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le ou les réactif(s) piégeur(s) de mercaptans est (sont) incorporé(s) au milieu aqueux à partir d'une solution-mère aqueuse concentrée, tamponnée ou non, ou dans un solvant organique miscible à l'eau.
6.- Nécessaire ou kit pour le dosage colorimétrique d'une entité chimique ou biologique en présence d'un ou plusieurs mercaptan(s) susceptible(s) d'interférer avec ladite entité dans le cadre dudit dosage, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité d'au moins un réactif piégeur de mercaptans de formule générale I, suffisante pour piéger totalement le- ou lesdits mercaptan(s).
7.- Composés de formule générale I, dans laquelle z1 à Z5 et X sont définis comme à la revendication 1, étant
entendu que Z1 est différent d'alkyle - soit lorsque z2 = vinyle, et Z3, Z4 et Z5 repré
sentent simultanément l'hydrogène ; - soit lorsque Z3 = vinyle, et 22, z4 et Z5 repré
sentent simultanément lthydrogène.
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