FR2684378A1 - Procede de dosage de l'activite sod utilisant la braziline ou l'un de ses derives, necessaires pour sa mise en óoeuvre, composes derives de la braziline et leur preparation. - Google Patents

Abstract

Le procédé selon l'ivention de dosage de l'activité SOD dans un milieu liquide utilise l'activation de l'autoxydation, par l'activité SOD, d'un réactif de (CF DESSIN DANS BOPI) PO3 R6 , R2 = H, alkyle (1 à 6 C), COR5 , SO2 R5 , PO2 R5 , CO2 R6 , SO3 R6 ou PO3 R6 , R3 = H ou OR4 , avec R4 = H, alkyle (1 à 6 C), benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle, p-carbométhoxybenzyle, vinyle, triméthylsilyle, COR5 , SO2 R5 , PO2 R5 , CO2 R6 , SO3 R6 , PO3 R6 , COR8 , CO2 R7 , CON(R8 , R9 ), NO2 , SO2 R8 , PO3 R8 ou PO2 N (R8 , R9 ), R5 = CF3 , CF2 R7 ou p-nitrophényle, R6 = H, CF3 , CF2 R7 ou p-nitrophényle, R7 = alkyle (1 à 6 C), benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle ou p-carbométhoxybenzyle, R8 = H, alkyle (1 à 6 C), benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle ou p-carbométhoxybenzyle, et R9 = H, alkyle (1 à 6 C), benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle ou p-carbométhoxybenzyle. Application au dosage de l'activité SOD dans un échantillon, notamment biologique, en particulier à l'aide d'une seule mesure et d'une courbe d'étalonnage.

Description

Procédé de dosage de l'activité SOD utilisant la braziline ou ltun de ses dérivés, nécessaires pour sa mise en oeuvre, composés dérivés de la braziline et leur préparation.

La présente invention concerne le dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD).

Elle a plus particulièrement pour objet un nouveau procédé de dosage de l'activité SOD, notamment dans des échantillons biologiques, à l'aide de la braziline ou de l'un de ses dérivés définis plus loin, des nécessaires ou kits pour la mise en oeuvre de ce procédé et des nouveaux dérivés de la braziline utilisables dans ce procédé ainsi que leur préparation.

Les tissus des organismes aérobies et ceux de l'organisme humain en particulier, sont le siège d'une production continue d ion superoxyde 2--, qui résulte du processus de respiration cellulaire, ainsi que de nombreuses voies métaboliques essentielles.

Cette production de superoxyde augmente fortement lorsque ces organismes sont soumis à un "stress oxydant" d'origine toxicologique (hyperoxie, irradiation, intoxication par des xénobiotiques générateurs de radicaux libres, notamment) ou physiopathologique (inflammation, ischémie, reperfusion post-ischémique, notamment).

I1 est admis par ltensemble de la communauté scientifique que 1 ion superoxyde est très toxique, bien que les mécanismes sous-jacents à cette toxicité restent sujets à controverse (référence 1).

Pour se protéger contre les effets délétères de l'ion superoxyde, les organismes aérobies possèdent des systèmes enzymatiques, les superoxyde dismutases (SOD), qui catalysent la dégradation de l'ion superoxyde selon la réaction de dismutation suivante

Compte tenu du rôle protecteur majeur de cette réaction de dismutation vis-à-vis de la toxicité de l'ion superoxyde, l'activité catalytique des SOD intra- et extracellulaires conditionne la survie des tissus d'un organisme aérobie (références 2 à 5).

Une méthode de dosage de l'activité SOD serait un outil analytique d'intérêt majeur pour les chercheurs biologistes comme pour les laboratoires de Chimie Clinique, à condition d'être sensible, spécifique, rapide et peu complexe.

De nombreuses méthodes de dosage de l'activité SOD ont été publiées et critiquées (références 6 à 10), mais il est généralement admis qu'il n'existe toujours pas de compromis satisfaisant entre fiabilité et complexité des méthodes existantes car la mesure d'une activité SOD pose deux problèmes majeurs qu'aucune des méthodes publiées à ce jour n'a permis de résoudre de façon simple.

Le premier problème est celui de la décomposition spontanée de l'unique substrat, l'ion superoxyde, qui est très rapide à pH voisin de 7, et qui bien que fortement ralentie, reste significative à pH 9, pH au-delà duquel certains types de SOD naturelles sont rapidement inactivées.

L'obtention d'une concentration stationnaire suffisamment stable requiert donc la présence d'une source dynamique de superoxyde dans la solution de dosage.

Les sources électrolytiques requièrent un équipement complexe et une préextraction du catalyseur SOD, ce qui est prohibitif en Chimie Clinique.

Les sources photochimiques telles que la riboflavine conduisent à des méthodes non standardisables et de mise en oeuvre complexe.

Les sources enzymatiques telles que la xanthine oxydase requièrent des solutions à préparer extemporanément.

Elles sont chères, source d'artéfacts et difficilement automatisables.

Les sources purement chimiques se réduisent à des composés autoxydables tels que la 6-hydroxydopamine, le pyrogallol, l'hydroxylamine ou l'ion sulfite, dont l'autoxydation est généralement inhibée par la SOD.

Ces réactifs chimiques donnent rarement des résultats précis et sensibles sur extraits biologiques bruts, et ils requièrent la préparation extemporanée d'une solution anaérobie de réactif; leur utilisation est donc difficilement automatisable.

Le second problème tient au fait qu'il est difficile de mesurer directement (dosage "direct") la disparition du substrat superoxyde 02 e - en fonction du temps, ou l'apparition de ses produits de dismutation, liteau oxygénée
H202 (peroxyde d'hydrogène) et l'oxygène, compte tenu des concentrations et des pH accessibles dans les conditions d'un dosage d'activité SOD.

La seule méthode tectrophotométrique "directe" est celle de MARKLUND (référ-nces 11 et 12) qui mesure la vitesse de disparition de l'ion superoxyde à pH 9,5, ce qui ne permet pas le dosage de toutes les SOD naturelles.

Cette méthode requiert un spectrophotomètre rapide. Les fortes concentrations de superoxyde et la longueur d'onde (250 nm) utilisées rendent la méthode peu précise, ce qui oblige l'expérimentateur à faire plusieurs mesures pour obtenir une valeur moyenne. De plus, il est nécessaire d'ajouter de la catalase pour éviter l'inactivation de la
SOD-Cu/Zn, et il faut repréparer une nouvelle solution de superoxyde de potassium immédiatement avant chaque dosage.

Cette méthode spectrophotométrique directe est donc délicate à mettre en oeuvre, et il ne semble pas possible de l'améliorer de façon significative.

Le corollaire est que les méthodes populaires, c' est-à-dire auxquelles on a le plus souvent recours, sont généralement indirectes : elles reposent sur la compétition entre l'activité SOD que l'on cherche à mesurer, et la réaction de l'ion superoxyde avec un piégeur chromogène tel que le cytochrome C ferrique ou le nitrobleu de tétrazolium (NBT), dont le produit réactionnel peut être mesuré par spectrophotométrie UV/visible. Un piègeur chimiluminescent, tel que le luminol ou la lucigénine, peut également être utilisé avec une plus grande sensibilité de la mesure, mais les problèmes d'interférences et de disponibilité instrumentale excluent l'utilisation de telles méthodes par un laboratoire non spécialiste.

Outre la spécificité souvent insuffisante des réactifs chromogènes vis-à-vis du superoxyde, le principal inconvénient des dosages par compétition est qu'ils requièrent une linéarisation des valeurs d'inhibition (par la
SOD), sur 5 ou 6 prises d'échantillons de dilutions croissantes.

Enfin, on connaît un certain nombre d'immunodosages de SOD-Cu/Zn ou de SOD-Mn.

Certains sont très sensibles, mais ils ne renseignent pas sur l'activité enzymatique de l'échantillon qui dépend notamment du degré d'inactivation éventuelle de l'enzyme. Ils sont par ailleurs longs à mettre en oeuvre et relativement complexes.

Artéfacts de mesure et démultiplication du dosage sont donc intrinsèquement liés à toutes les méthodes spectrophotométriques accessibles à la plupart des laboratoires, ce qui ne satisfait pas les besoins des laboratoires de recherche et reste incompatible avec les impératifs de standardisation de la Chimie Clinique.

Si l'on a recours à la spectrophotométrie
UV/visible, il semble difficile, voire impossible, de mettre au point une méthode de dosage qui soit à la fois sensible, plus spécifique, plus simple et plus fiable que les méthodes existantes, sans avoir recours au suivi en cinétique d'une réaction activée par l'activité SOD plutôt qu'à celui d'une réaction inhibée par l'activité SOD ou à une méthode "directe".

A cet égard, une méthode récente (références 13 et 14), utilisant un colorant autoxydable, l'hématoxyline, se distingue des autres, dans la mesure où elle exploite une activation de l'autoxydation du réactif par l'activité SOD.

En effet, I'hématoxyline s'autoxyde à pH > 6,5 (référence 13). La vitesse d'autoxydation augmente d'un facteur proche de 100 entre pH 7 et 9. La SOD inhibe cette autoxydation à pH < 8,1, alors qu'elle l'active à pH > 8,1.

Cette observation a conduit à la mise au point d'un dosage, basé sur le suivi spectrophotométrique de la formation d'hématéine à 560 nm, qui est accélérée par la SOD à pH alcalin. La mise en oeuvre de cette méthode est délicate du fait de l'instabilité du réactif et elle reste tributaire d'une phase de préparation de l'échantillon (dialyse) pour éliminer les interférences dues à la présence de composés réducteurs, comme par exemple le glutathion.

Par ailleurs, l'instabilité du produit d'oxydation mesuré, l'hématéine, et la faible sensibilité du dosage (à pH > 8,1), liée en partie à la décomposition de l'hématéine, mais également à la présence de deux sites d'oxydation (catéchols) potentielle, limitent l'intérêt et l'exploitation de cette méthode.

En conclusion, la méthode à l'hématoxyline, bien que présentant un certain intérêt, présente des inconvénients rhédibitoires qui ne permettent pas son utilisation générale pour le dosage de l'activité SOD, en particulier dans des échantillons biologiques.

La présente invention a notamment pour buts de - disposer d'un réactif qui soit éventuellement protégé de l'oxydation hors des conditions de mesure, et dont le produit d'autoxydation soit stable pendant la mesure - augmenter la sensibilité du dosage par rapport à une me- thode utilisant l'hématoxyline (dans des conditions d'activation de l'autoxydation) - éliminer les interférences éventuelles les plus probables telles que celles liées à la présence de mercaptans comme le glutathion, par exemple - mettre au point un procédé utilisant un milieu réactionnel de pH inférieur ou égal à 9, de façon à permettre un dosage de l'activité des SOD connues, sans risque d'inactivation rapide.

Ces buts sont atteints selon l'invention qui est essentiellement basée sur l'utilisation, au lieu de l'hématoxyline, de lar braziline ou l'un de ses dérivés définis plus loin dont les produits d'autoxydation sont beaucoup plus stables que l'hématéine, dans un procédé de dosage dont le principe repose sur une activation de l'autoxydation de ces composés par l'activité SOD et qui permet d'avoir une mesure spécifique et sensible de cette activité.

L'invention fournit également de nouveaux réactifs dérivés de la braziline qui, dans le milieu de dosage s'hydrolysent en braziline ou en un dérivé de celle-ci et constituent des réactifs chimiques stables hors des conditions de mesure.

L'invention fournit également un procédé de stabilisation d'une solution-mère de braziline ou de l'un de ses dérivés définis ci-après, au moyen de dérivés du bore, en particulier l'acide borique et ses dérivés tels que 1 'acide phénylborique.

Enfin, selon l'une de ses variantes, l'invention fournit un procédé qui utilise un réactif rapide des groupements thiols éventuellement présents dans l'échantillon à doser tel que notamment un échantillon biologique, qui per met d Hz é1 d'éliminer les interférences dues à ces groupements thiols, en particulier celles qui sont dues à la présence de glutathion ou d'albumine dans l'échantillon.

Selon l'un de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un milieu liquide, procédé qui utilise l'activation de l'autoxydation d'un réactif par l'activité
SOD, caractérisé en ce que ledit réactif est un composé répondant à la formule générale I

dans laquelle
R1 = hydrogène, COR5, S02R5, Po2R5, C02R6, S03R6 ou Po3R6,
R2 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), COR5,
So2R5, P02R5, Co2R6, S03R6 ou Po3R6,
R3 : hydrogène ou OR4, avec
R4 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone),
benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle, p
carbométhoxybenzyle, vinyle, triméthylsilyle, COR5,
S02R5, Po2R5, C02R6, S03R6, P03R6, COR8, C02R7,
CON(R8,R9), N02, S02R8, P53R8 ou P02N(R8,R9),
R5 = CF3, CF2R7 ou p-nitrophényle,
R6 = hydrogène, CF3, CF2R7 ou p-nitrophényle,
R7 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle, p
nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle ou p-carbo
méthoxybenzyle,
R8 = hydrogénée, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone),
benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle ou
p-carbométhoxybenzyle, et
R9 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbonate),
benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle ou
p-carbométhoxybenzyle.

Dans la formule générale I ci-dessus, lorsque R1 et
R2 représentent l'hydrogène et R3 représente OR4 avec R4 = hydrogène, le composé en question est la braziline qui est un produit commercial.

Les composés de formule générale I autres que la braziline (R1 = R2 = hydrogène et R3 = OH) sont nouveaux.

Ces composés peuvent être classés en quatre séries.

Les composés de la première série qui répondent à la formule générale I, dans laquelle
R1 = R2 = hydrogène,
R3 = hydrogène ou OR4, avec
R4 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle, p
nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle, p-carbomé
thoxybenzyle, vinyle, triméthylsilyle, COR8, C02R7,
CON(R8,R9), NO2, S02R8, Po3R8, P02N(R8,R9) et
R7, R8 et R9 sont définis comme précédemment, peuvent être synthétisés à partir de la braziliner selon le schéma réactionnel suivant

<SEP> OH
<tb> <SEP> KO <SEP> lÀ
<tb> <SEP> I)o
<tb> <SEP> H <SEP> OH
<tb> <SEP> OH
<tb> <SEP> 8nC1
<tb> <SEP> OBrI
<tb> <SEP> iÉ <SEP> OH
<tb> <SEP> OH
<tb> <SEP> R4X <SEP> < R3= <SEP> OR4 > <SEP> < R3= <SEP> H > <SEP> PhOCS > CI
<tb> <SEP> I <SEP>
<tb> N <SEP> 0fr' <SEP> OSn
<tb> Eno <SEP> N <SEP> EnO
<tb> <SEP> OR4 <SEP> Eno <SEP> i) <SEP> O
<tb> <SEP> O%ÉOPh
<tb> <SEP> Reflux
<tb> H2/Pd-C
<tb> <SEP> 2/ <SEP> HZ/Pd-C
<tb> <SEP> OH <SEP> OH
<tb> <SEP> NIÉ <SEP> N
<tb> HO <SEP> HO <SEP> iÉÂ
<tb> Hv10"
<tb> <SEP> Brazilane
<tb>
Dans ce schéma - Bn représente un groupe protecteur des OH phénoliques tel que le groupe benzyle, - R4X' représente un agent alkylant.

Après avoir protégé les 3 hydroxyles phénoliques sous forme par exemple d'éther benzylique, le groupement alcool tertiaire est éliminé sous forme de phénylthionocarbonate par exemple ou bien alkylé à l'aide de divers agents alkylants tels que, par exemple, le tétrafluoroborate de triméthyloxonium, l'iodure de méthyle, le bromure de benzyle, le chlorure de vinyle, le chlorure de trialkylsilane, ou bien acylé à l'aide de divers agents acylants tels que, par exemple le chlorure d'acétyle, un chloroformiate d'alkyle, un chlorure de dialkylcarbamate, ou bien nitré, ou bien phosphorylé avec par exemple un chlorure d'alkylphosphonate, ou bien encore sulfoné avec par exemple un chlorure d'alkylsulfonate tel que le chlorure de tosyle.

Le produit désiré est obtenu après déprotection par hydrogénation catalytique, notamment en présence de palladium sur charbon, concomittante à une réduction dans le cas du brazilane.

Les exemples 1 à 3 de la partie expérimentale qui suit illustrent la préparation de composés de ce type.

Les composés de la deuxième série qui répondent à la formule générale I, dans laquelle
R1 = R2 = COR5, S02R5, PG2R5, CO2R6, SO3R6 ou Po3R6, et
R3 = hydrogène ou OR4, avec R4 = hydrogène, COR5, S02R5,
P02R5, C02R6, S03R6 ou P03R6,
R5 et R6 étant définis comme précédemment, peuvent être synthétisés selon la procédure générale suivante
La braziline ou son dérivé (R3=H), en solution dans un solvant fraîchement distillé, comme par exemple le dichlorométhane, est mis en réaction avec le chlorure d'acide, comme par exemple le chlorure de p-nitrosulfonyle, ou l'anhydride d'acide, comme par exemple l'anhydride trifluorométhylsulfonique ou 1 'anhydride trifluoroacétique, correspondant à l'ester désiré.

L'exemple 4 de la partie expérimentale qui suit illustre la préparation d'un composé de ce type dans lequel
R1 = R2 = trifluoroacétyle et R3 = OR4, avec R4 = trifluoroacétyle.

Les composés de la troisième série qui répondent à la formule générale I, dans laquelle
R1 = R2 = COR5, S02R5, PG2R5, C02R6, SO3R6 ou Po3R6, et
R3 = OR4,
R4 ayant les significations indiquées précédemment, à l'exception de l'hydrogène, COR5, S02R5, Po2R5, C02R6, SO3R6 et Po3R6, et R5 et R6 étant définis comme précédemment, peuvent être synthétisés selon la procédure générale suivante
De la braziliner en solution dans un solvant fraîchement distillé, comme par exemple le dichlorométhane, est mise en réaction avec le chlorure d'acide, comme par exemple le chlorure de p-nitrobenzènesulfonyle ou le chlorosulfonate de trifluorométhyle, ou l'anhydride d'acide, comme par exemple l'anhydride trifluorométhanesulfonique ou l'anhydride trifluoroacétique, correspondant à l'ester désiré. Puis, le groupement alcool tertiaire est alkylé à l'aide d'un agent alkylant, tel que le tétrafluoroborate de triméthyloxonium, l'iodure de méthyle, le bromure de benzyle, le chlorure de vinyle, un chlorure de trialkylsilane, ou bien acylé à l'aide d'un agent acylant, comme par exemple le chlorure d'acétyle, un chloroformiate d'alkyle, un chloroforamidate d'alkyle, ou bien nitré, ou bien phosphorylé avec par exemple un phosphochlorure d'alkyle, ou bien encore sulfoné avec par exemple un sulfochlorure d'alkyle tel que le chlorure de tosyle, choisi selon la signification de R4.

On peut également utiliser une braziline déjà substituée de façon appropriée sur le groupement alcool tertiaire et la soumettre à la réaction d'estérification.

Les composés de la quatrième série qui répondent à la formule générale I, dans laquelle
R1 = hydrogène,.COR5, S02R5, Po2R5, C02R6, S03R6, ou Po3R6,
R2 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), et
R3 = hydrogène ou OR4,
R4, R5 et R6 étant définis comme précédemment.

peuvent être préparés selon la procédure générale suivante
La braziline ou un de ses dérivés, dans lequel
R1 = R2 = hydrogène et R3 est différent de OH, est protégé sur ses deux hydroxyles catécholiques par un pont méthylène, par exemple au moyen de formaldéhyde. Le dérivé obtenu est alkylé sur son hydroxyle non protéger, au moyen d'un agent alkylant tel que par exemple un halogénure d'alkyle, puis déprotégé en milieu acide et éventuellement estérifié.

L'exemple 5 de la partie expérimentale qui suit illustre la préparation d'un composé de ce type dans lequel
R1 = hydrogène, R2 = méthyle et R3 = OH.

Tous ces dérivés de la braziline sont obtenus par modification chimique de ses groupements hydroxyles.

Les modifications apportées permettent - d'une part, de moduler la sensibilité du dosage de l'activité SOD (première, troisième et quatrième séries), - d'autre part, de disposer de composés stables vis-à-vis de l'autoxydation, lors de leur conservation et qui redonneront la braziline ou une braziline modifiée en position 3, moins de 20 secondes après leur mise en solution dans les conditions opératoires du dosage de l'activité SOD (deuxième et troisième séries, ainsi que quatrième série quand R1 ne représente pas l'hydrogène).

Lorsque le dosage de l'activité SOD doit être réalisé dans un milieu renfermant un ou plusieurs composés comprenant un ou plusieurs groupements thiol, tel que notamment un milieu biologique, le pouvoir réducteur de ces derniers est susceptible de provoquer des interférences qu'il convient d'éliminer.

Selon l'invention, on a trouvé que de telles interférences pouvaient être facilement évitées en ajoutant au milieu dans lequel le dosage est effectué au moins un réactif choisi parmi les composés de types pyridinium et quinoléinium dont l'utilisation en tant que "piégeurs de mer captans" fait 1 l'objet ou j et de la demande de brevet français déposée parallèlement au nom de BIOXYTECH et qui a pour titre :" Réactifs piégeurs de mercaptans, leur préparation et leurs applications".

Ces réactifs répondent aux critères suivants - spécificité vis-à-vis des mercaptans dans les conditions opératoires utilisées, - rapidité de réaction, - non-interférence avec les autres réactifs utilisés dans le dosage de l'activité SOD.

Plus précisément, selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un milieu liquide contenant un ou plusieurs mercaptan(s), notamment un milieu biologique, procédé qui utilise l'activation de l'autoxydation d'un réactif par l'activité SOD, caractérisé en ce que ledit réactif est un composé répondant à la formule générale I définie ci-dessus et en ce que le milieu contient en outre une quantité, capable de piéger totalement lesdits mercaptans par S-alkylation, d'au moins un composé répondant à la formule générale Il

dans laquelle ::
z1 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyle, p
nitrobenzyle, phényle, o,p-dinitrophényle,
-CH2-COOH ou -CH2-CH2-COOH;
Z4 = hydrogène et
Z5 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de
carbone) ou
Z4 et Z5 forment ensemble, avec les deux atomes de
carbone intermédiaires, un cycle phényle;
X = halogénure, sulfonate, fluorosulfonate, phospho
nate, tétrafluoroborate ou tosylate; et soit z2 = vinyle, et
Z3 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone)
(composés 2-vinyliques), soit Z3 : vinyle, et
z2 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone)
6composés 4-vinyliques).

Ces composés sont en partie connus ou peuvent être synthétisés par analogie à des procédés utilisés pour la synthèse de composés connus.

Ainsi les composés 2-vinyliques peuvent être synthétisés comme suit.

Le dérivé initial (pyridine ou quinoléine substituée) est soumis à la méthode de Comins (référence 15), à l'aide de bromure de vinyl-magnésium. Le composé ainsi obtenu est oxydé avec, par exemple, de la tétrachloro-1,4- benzoquinone (parachloranil) ou du soufre Sg. L'alkylation de l'azote hétérocyclique est réalisée à l'aide d'un agent alkylant, par exemple le tétrafluoroborate de triméthyloxonium, le sulfate de méthyle, le bromure de benzyle, le fluorodinitrobenzène, l'iodoacétate de sodium ou le 3-bromopyruvate de sodium, choisi selon la signification de Z1.

L'exemple 6 de la partie expérimentale qui suit illustre la préparation d'un composé de ce type.

Par ailleurs, les composés 4-vinyliques peuvent être synthétisés comme suit.

L'aldéhyde hétérocyclique correspondant (fonction aldéhyde, -CHO, en position 4) est soumis à la réaction de
Wittig, avec, par exemple, le bromure de triphénylméthylphosphonium, ou à la réaction de Peterson, avec, par exemple, le chlorométhyltriméthylsilane. L'alkylation de l'azote hétérocyclique est réalisée à l'aide d'un agent alkylant, par exemple le tétrafluoroborate de triméthyloxonium, le sulfate de méthyle, le bromure de benzyler le fluorodinitrobenzène, l'iodoacétate de sodium ou le 4bromopyruvate de sodium, choisi selon la signification de Z1.

L'exemple 7 de la partie expérimentale qui suit illustre la préparation d'un composé de ce type.

Le procédé selon l'invention, notamment lorsqu'il met en oeuvre au moins un "piégeur de mercaptans" défini cidessus, permet de doser l'activité SOD de tout catalyseur de type SOD en milieu aqueux, à l'aide d'une seule mesure d'absorption UV/visible. Sa simplicité de mise en oeuvre est nettement supérieure à celle des méthodes spectrophotométriques préalablement décrites.

Ce nouveau procédé de dosage constitue donc un outil de choix pour les recherches biologiques en général ainsi qu'en Chimie Clinique, en particulier pour l'élaboration de nécessaires ou kits de dosage.

Dans ce dernier cas, ce dosage est susceptible d'apporter une information médicalement utile dans des états physiopathologiques tels que les maladies à composante inflammatoire ou ischémique, les états de choc, les états infectieux, les maladies systémiques et les maladies autoimmunes, les tumeurs, les états de malnutrition, les maladies associées au vieillissement, les affections dégénératives, les anémies hémolytiques et les syndrômes d'intoxication par des polluants de l'environnement ou par des médicaments.

Les échantillons humains auxquels le dosage peut être appliqué sont notamment les érythrocytes, le plasma sanguin, les plaquettes, les globules blancs, le liquide synovial, le liquide céphalo-rachidien, l'urine ou tout extrait tissulaire.

De plus, cette méthode de dosage peut être mise en oeuvre pour effectuer les études de pharmacocinétique nécessaires au développement et à l'utilisation de nouveaux médicaments présentant une activité SOD.

Cette méthode de dosage peut également être utilisée pour le contrôle de qualité de préparations cosmétiques ou pharmaceutiques présentant une activité SOD.

D'une façon générale cette méthode de dosage peut être utilisée par les chercheurs, sur tout échantillon biologique ou toute solution artificielle susceptible de présenter une activité SOD.

Selon un mode préféré de réalisation, le procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase d'un échantillon, notamment biologique, repose sur une mesure spectrophotométrique de la vitesse d'autoxydation d'un composé de formule générale I ci-dessus, en l'absence et en présence dudit échantillon.

Plus précisément, selon un mode préféré de réalisation, l'invention a pour objet un procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 10) déterminer la vitesse maximale d'autoxydation Vs d'un composé de formule générale I en présence de l'échantillon, au moyen de l'évolution de l'absorbance en fonction du temps, à la longueur d'onde caractérisant l'apparition du produit d'autoxydation du composé de formule générale I utilisé, dans un milieu réactionnel tamponné à une valeur de pH de 8,0 à 9,0, en déclenchant la réaction par ajout d'un aliquot d'une solution-mère du composé de formule générale I 20) déterminer, dans les mêmes conditions, la vitesse maximale d'autoxydation Vc du même composé en l'absence de l'échantillon ; et 30) déterminer la concentration en SOD de l'échantillon au moyen de la différence des mesures effectuées et d'une courbe d'étalonnage établie dans les mêmes conditions opératoires.

Le milieu réactionnel est avantageusement constitué par un tampon aminé, comme par exemple le 2-amino-2méthyl-1,3-propanediol (AMPD), contenant de l'acide diéthylènetriaminepenta-acétique (DTPA) 0,1 mM et permettant de fixer le pH à une valeur comprise dans la gamme de 8,0 à 9,0, à la température de mesure, par exemple par un ajout de soude ou d'acide chlorhydrique, selon la nature du tampon considéré.

Ce milieu réactionnel doit être équilibré à la température de travail et saturé d'air à cette température.

La température de travail choisie, par exemple 370C, doit être maintenue constante pendant les mesures.

La réaction est déclenchée par l'ajout dans le mi lieu réactionnel (avec ou sans SOD) d'un aliquot d'une solution-mère de composé de formule générale I dans une solution aqueuse ou dans un solvant organique miscible à l'eau, tel que par exemple l'acétonitrile, le diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde. Dans le cas de la braziline ou de l'un de ses dérivés de la première ou de la quatrième série, définies ci-dessus, cette solution-mère doit être préparée en anaérobiose, sauf, comme il est décrit plus loin, si un dérivé du bore est utilisé dans la préparation de cette solution.

Après homogénéisation de la solution l'évolution de l'absorbance est enregistrée en fonction du temps, à la longueur d'onde caractérisant l'apparition du produit d'autoxydation du réactif utilisé (539 nm, par exemple, pour la braziline), afin de déterminer la vitesse maximale d'autoxydation.

La détermination de l'activité SOD dans un échantillon biologique est effectuée en déterminant la différence des vitesses mesurées en présence (Vs) et en l'absence de l'échantillon (VC). Cette différence peut être reportée par exemple en ordonnée d'une courbe d'étalonnage qui a été établie dans les mêmes conditions opératoires à partir, par exemple, d'un standard de SOD.

Cette courbe d'étalonnage peut être tracée en représentant, en fonction de la concentration du standard utilisé, la variation de la différence de vitesse d'autoxydation mesurée en présence et en absence de ce standard.

Toutefois, selon un mode préféré de mise en oeuvre, cette courbe d'étalonnage est tracée en représentant la variation de l'inverse de la différence des vitesses en question, en fonction de l'inverse de la concentration en standard.

Selon l'intensité de l'activité SOD à mesurer, la sensibilité du dosage dans la gamme de pH utilisée (8,0 à 9,0) est adaptable en modifiant par exemple un ou plusieurs des paramètres suivants : concentration en composé de formule générale I choisi, concentration du tampon et tempé rature de mesure.

L'acide borique est un exemple de dérivé du bore qui peut être utilisé pour moduler également la vitesse d'autoxydation du composé de formule générale I utilisé, dans le but de diminuer cette vitesse.

En outre, si la solution-mère d'un composé de formule générale I de la première ou de la quatrième série, définies ci-dessus (OH catécholiques non protégés) est préparée en présence d'un tel dérivé du bore, il est possible de s'affranchir d'une préparation anaérobie de la solution-mère du réactif pour une utilisation pendant un temps donné, qui dépend notamment des concentrations respectives du réactif et du dérivé du bore, de la nature de celui-ci et des conditions de stockage de la solution-mère de réactif. Ainsi, une solution aqueuse de braziline préparée avec de l'acide borique, telle que le rapport des concentrations en acide borique et en braziline soit égal à 75, est stable au moins un mois en aérobiose, si la solution est conservée entre 0 et 40C.

L'existence, dans un échantillon, notamment biologique, de composés interférant avec le dosage se manifeste le plus souvent par une diminution de la vitesse mesurée en présence de l'échantillon par rapport à celle mesurée en son absence.

Dans le cas d'interférences liées à la présence de mercaptans, tels que par exemple le glutathion, l'introduction dans le milieu réactionnel d'un "réactif piégeur de mercaptans" tel que défini plus haut est alors nécessaire.

Ainsi le tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-2vinylpyridinium (composé de l'exemple 6), par exemple sera incorporé à une concentration cinquante fois supérieure à celle du glutathion pour le dosage de l'activité SOD dans un lysat érythrocytaire.

Si l'existence, dans un échantillon, notamment biologique, d'un composé susceptible d'introduire une activation artéfactuelle de l'autoxydation du composé de formule générale I est suspectée, une combinaison telle que celle décrite ci-dessous, qui fait intervenir une seconde mesure effectuée dans des conditions d'inhibition de l'autoxydation, doit être entreprise.

De même, dans le cas de l'exploration de milieux, notamment biologiques, présentant une faible activité SOD, la sensibilité et la précision du dosage peuvent être accrues en combinant à la mesure faite dans des conditions d'activation de l'autoxydation, une mesure effectuée dans des conditions d'inhibition de l'autoxydation.

L'invention a donc également pour objet un procédé du type décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comporte également une mesure effectuée dans des conditions d'inhibition de l'autoxydation.

Le milieu réactionnel utilisé pour cette seconde mesure se distingue du milieu décrit précédemment par l'emploi d'un tampon à un pH compris dans la gamme de 7,2 à 7,8, notamment un tampon phosphate constitué par exemple par un mélange adéquat de dihydrogénophosphate de potassium, d'hydrogénophosphate dipotassique, toutes choses étant égales par ailleurs.

On mesure, dans ces conditions opératoires, la vitesse maximale d'autoxydation du composé de formule générale
I utilisé en absence (V' C) et en présence de l'échantillon (V's). La détermination de l'activité SOD dans l'échantillon est alors obtenue au moyen de (VS - VC - V'S + V'C).

Comme précédemment, la valeur obtenue peut être reportée en ordonnée d'une courbe d'étalonnage, qui a été établie dans les mêmes conditions expérimentales.

La nouvelle méthode de dosage selon l'invention utilisant la braziline ou l'un de ses dérivés de formule générale I est, de par son principe, une méthode de mesure spécifique de l'activité SOD. Elle est sensible, rapide et d'une mise en oeuvre aisée, et est de plus entièrement automatisable ; elle est donc adaptée au traitement de grandes séries d'échantillons, comme cela peut être le cas en Chimie
Clinique.

De plus, les interférences liées à la présence de mercaptans, fréquemment rencontrés dans les échantillons biologiques, sont facilement éliminées par l'utilisation d'au moins un "réactif piégeur de mercaptans" tel que défini plus haut, sans autre phase supplémentaire de traitement de l'échantillon.

Enfin, les conditions opératoires très modulables de ce procédé de dosage lui confèrent une souplesse d'emploi permettant de l'adapter à des échantillons, notamment biologiques, très divers et donc de prendre en compte les besoins particuliers éventuels de certains utilisateurs, comme cela est le cas en recherche.

Des exemples d'application du nouveau procédé de dosage de l'activité SOD à l'aide de braziline et de trois de ses dérivés dans le cas d'un lysat érythrocytaire sont donnés, à titre illustratif, dans la partie expérimentale qui suit.

L'invention a également pour objet un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé de dosage de la SOD selon 1' invention.

Ce nécessaire ou kit comprend essentiellement, en tant que réactif, un composé de formule générale I, telle que définie ci-dessus sous sa forme la plus large.

Selon un mode avantageux de réalisation, le nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé de dosage de l'activité SOD selon 1 invention comprend en outre un ou plusieurs composé(s) piégeur(s) de mercaptans, de formule générale II, telle que définie ci-dessus.

Selon un mode préféré de réalisation, l'invention a également pour objet un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé de dosage de l'activité SOD selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement - un composé de formule générale I en solution ou en
poudre, en présence d'acide borique ou d'un dérivé de ce
dernier, - un ou plusieurs composé(s) piégeur(s) de mercaptans de
formule générale II, en solution ou en poudre, et - un tampon à base de AMPD, tamponnant dans la gamme de pH
de 8,0 à 9,0.

PARTIE EXPERIMENTALE
I Préparation de dérivés de la braziline
Exemple 1 : Préparation de la 3-O-méthylbraziline Svnthèse de la 5',6',7-tri-O-benzvlbraziline
Une solution de braziline monohydratée (304 mg; 1,0 mmole; ALDRICH) dans de l'acétone (2,5 ml) contenant du bromure de benzyle (0,4 ml; 3,36 mmoles; JANSSEN) et du carbonate de potassium anhydre (1,06 g; 7,68 mmoles; OSI), sous atmosphère inerte, est chauffée à reflux pendant 15 h.

Le mélange réactionnel est de couleur violette. Une solution de soude (5 ml, 0,5 N) est additionnée, et la solution ainsi obtenue est agitée pendant 1 h à température ambiante. Le milieu réactionnel est extrait par de l'acétate d'éthyle (2x10 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées à l'eau (2x5 ml) et séchées sur MgSO4. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = hexane/AcOEt, 3/1).

Rendement = 530 mg (95,3 %).

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CDC13)
2,45 ppm (s, 1H); 2,83 ppm (d, 1H, J=16,0 Hz); 3,18 ppm
(d, îHr J=16,0 Hz); 3,78 ppm (d, 1H, J=11,3 Hz); 4,02
ppm (d, 1H, J=11,3 Hz); 4,09 ppm (s, 1H); 5,04 ppm (s,
2H); 5,09 ppm (s, 2H); 5,11 ppm (s, 2H); 6,55 ppm (d,
lH,J=2,6 Hz); 6,71 ppm (dd, 1H, J=2,6-8,5 Hz); 6,80 ppm
(s,lH); 6,88 ppm (s, 1H); 7,17 ppm (d, 1H, J=8,5 Hz);
7,42 ppm (m, 15H).

* SM (IE, 70eV) :(M+) = 556(2), 466(1), 181(2), 108(3), 91(100)
IE = impact électronique.

Synthèse de la 5',6',7-tri-O-benzyl-3-O-méthylbraziline
Dans une solution de 5',6',7-tri-O-benzylbraziline (530 mg; 0,95 mmole) dans du DMSO sec (4 ml), on introduit de la potasse en poudre (210 mg; 3,80 mmoles), sous atmosphère inerte, à température ambiante. De l'iodure de méthyle (0,12 ml; 1,90 mmoles) est alors ajouté au milieu réactionnel qui est agité 30 minutes dans ces conditions.

Après addition d'eau (5 ml), la solution est extraite avec de l'acétate d'éthyle (15 ml). La phase organique est séchée sur MgSO4. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = hexane/AcOEt, 2/1).

Rendement = 510 mg (94 %).

Le produit est recristallisé dans un mélange hexane/AcOEt (3/1).

Caractéristiques physiques
* pF = 99,5-100,50C.

* RMN 1H (200 MHz, CDCl3)
2,70 ppm (d, 1H, J=15,8 Hz); 3,22 ppm (d, 1H,
J=15,8 Hz); 3,38 ppm (s, 3H); 3,67 ppm (d, 1H,
J=11,9 Hz); 4,20 ppm (s, 1H); 4,26 ppm (d, 1H,
J=11,9 Hz), 5,03 ppm (s, 2H); 5,07 ppm (s, 2H);
5,11 ppm (s, 2H); 6,54 ppm (d, 1H, J=2,6 Hz); 6,68 ppm
(dd, lHr J=2,6-8,5 Hz); 6,78 ppm (s,lH); 6,88 ppm (s,
1H); 7,17 ppm (d, 1H, J=8,5 Hz); 7,42 ppm (m, 15H).

* SM (1Er 70eV) : (M+) = 570(45), (M±91) = 479(12), 91(100)
Synthèse de la 3-O-méthylbraziline
Une solution de 5',6',7-tri-O-benzyl-3-O-méthyl- braziline (160 mg; 0,28 mmole) dans un mélange AcOEt/MeOH (5/2) contenant du palladium à 10 % sur charbon (20 mg) est purgée pendant 15 minutes par un courant d'hydrogène. La suspens ion est hydrogénée pendant 5 h à température ambiante sous agitation. Elle est ensuite filtrée sous atmosphère inerte. Le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit désiré cristallise progressivement.

Rendement = 81 mg (96 %).

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
2,68 ppm (d, 1H, J=15,6 Hz); 3,08 ppm (d, 1H,
J=15,6 Hz); 3,28 ppm (s, 3H); 3,52 ppm (d, 1H,
J=12,1 Hz); 4,03 ppm (s, 1H); 4,24 ppm (d, 1H,
J=12,1 Hz); 6,28 ppm (d, 1H, J=2,5 Hz); 6,48 ppm (dd,
îHr J=2,5-8,5 Hz); 6,64 ppm (s, 1H); 6,71 ppm (s, 1H);
7,18 ppm (d, 1H, J=8,5 Hz); 7,79 ppm (s, 1H); 7,85 ppm
(s, 1H); 8,43 ppm (s, 1H).

* SM (IE, 70eV): 300(5), 268(4), 110(6), 84(41), 66(49).

Exemple 2 : Préparation du brazilane
(R1 = R2 = R3 = H).

Synthèse de la 5' 6', 7-tri-O-benzyl-3-O-phényloxythiono- carbonylbraziline
A une solution de 5',6',7-tri-O-benzylbraziline (280 mg, 0,50 mmole) dans 3 ml de THF, refroidie à -780C, est additionnée goutte à goutte, sous azote et sous agitation, une solution de méthyllithium (0,4 ml d'une solution 1,6 M dans le cyclohexane, JANSSEN). L'agitation est maintenue 10 minutes à cette température, puis 1 heure à température ambiante. Le mélange réactionnel est de nouveau refroidi à -780C et du chlorothionocarbonate de phényle (0,21 ml, 0,75 mmole, ALDRICH) est additionné goutte à goutte. On laisse le mélange réactionnel revenir à la température ambiante et on l'agite pendant 1 heure.

L'hydrolyse est réalisée à l'aide de chlorure d'ammonium puis le produit est extrait par de l'acétate d'éthyle (2x10 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée en chlorure de sodium (2x10 ml) , puis séchées sur MgSO4. Le solvant est évaporé sous vide. L'huile jaune ainsi obtenue est chromatographiée sur colonne de silice MERCK F254. Le produit désiré, élué par un mélange éther/hexane (1/5) r est obtenu avec un rendement de 83 % (280 mg d'un solide incolore).

Caractéristiques physiques
*RMN 1H (200 MHz, CDC13) :
3,51 ppm (d, 1H, J = 16,50 Hz); 3,71 ppm (d, 1H, J =
16,50 Hz); 3,75 ppm (d, 1H, J = 12,17 Hz); 4,58 ppm (s,
1H); 5,05 ppm (s, 4H); 5,09 ppm (s, 2H); 5,27 ppm (d,
1H, J = 12,17 Hz); 6,57 ppm (d, 1H, J = 2,56 Hz); 6,69
ppm (dd, 1H, J = 2,56-8,45 Hz); 6,78 ppm (s, 1H); 6,88
ppm (s, 1H); 7,06 ppm (d, 2H, J = 7,30 Hz); 7,19 ppm (d,
1H, J = 8,45 Hz); 7,24-7,46 ppm (m, 18H).

* SM (IE, 70eV) : (M±PhOC(OH)=S)=538(3); 447(1,5);
419(3); 91(100); 60(80).

Synthèse de la 5' 6' ,7-tri-O-benzvlanhydrobraziline
Une solution du dérivé thionocarbonate précédemment obtenu (100 mg, 0,15 mmole) dans 3 ml de toluène sec est chauffée au reflux pendant 2 heures. Le solvant de la solution légèrement jaunâtre ainsi obtenue est évaporé sous vide. Le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 et élué par un mélange éther/hexane (1/5). Le produit désiré est obtenu avec un rendement de 82 % (64 mg).

Caractéristiques physiques
* pF = 142-1440C (acétate d'éthyle/hexane, 1/4).

* RMN 1H (200 MHz, CDC13)
3,30 ppm (s, 2H); 5,05 ppm (s, 2H); 5,12 ppm (s, 2H);
5,17 ppm (s, 2H); 5,21 ppm (s, 2H); 6,58 ppm (s, 1H);
6,60 ppm (dd, 1H, J = 2,50-8,41 Hz); 7,13 ppm (s, 1H);
7,30-7,50 ppm (m, 17H).

* SM (IE, 70eV); 538(12), 447(3), 419(6), 91(100).

Synthèse du brazilane
Une solution du dérivé précédent (92 mg, 0,17 mmole) dans 5 ml d'acétate d'éthyle est hydrogénée en présence de palladium sur charbon (à 10 %, 30 mg, ALDRICH) sous une pression de 8 bars pendant 3 heures à température ambiante. La suspension est filtrée et le solvant est évaporé sous vide. Le produit désiré est obtenu après purification par chromatographie sur colonne de silice MERCK
F254 avec un éluant éther/hexane (1/1). Rendement = 69 %.

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
2,47 ppm (dd, 1H, J = 2,38-15,46 Hz); 2,80 ppm (m, 1H);
3,03 ppm (dd, 1H, J = 7,32-15,46 Hz); 3,47 ppm (t, 1H,
J = 10,62 Hz); 4,02 ppm (dd, 1H, J = 4,48-10,62 Hz);
4,06 ppm (d, 1H, J = 7,34 Hz); 6,25 ppm (d, 1H, J = 2,52
Hz); 6,45 ppm (dd, 1H, J = 2,52-8,34 Hz); 6,67 ppm (s,
1H); 6,80 ppm (s, 1H); 7,20 (d, 1H, J = 8,34 Hz); 7,55
ppm (s, 1H); 7,61 ppm (s, 1H); 8,15 ppm (s, 1H).

* SM (IE, 70eV) : 270(100), 253(31), 240(18), 205(22),
161(39), 115(25), 101(24).

Exemple 3 : Préparation de la 3-O-terbutyloxy
carbonylbraziline
Synthèse de la 5' 6', 7-tri-O-benzyl-3-O-terbutyloxycarbonyl- braziline
A une solution de 5',6',7-tri-O-benzylbraziline (160 mg, 0,29 mmole) et de diméthylaminopyridine (71 mg, 0,58 mmole, JANSSEN) dans 5 ml de dichlorométhane, on ajoute du diterbutyldicarbonate (100 W1, 0,44 mmole, ALDRICH) à la température ambiante, sous azote. Le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures et est ensuite chauffé au reflux pendant 18 heures. Le solvant est évaporé sous vide. Le produit désiré est obtenu après purification par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 avec un éluant : acétate d'éthyle/hexane (1/4). Rendement = 71 %.

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CDC13)
1,43 ppm (s, 9H); 3,24 ppm (d, 1H, J = 16,45 Hz); 3,44
ppm (d, 1H, J = 16,45 Hz); 3,65 ppm (d, 1H, J = 12,18
Hz); 4,38 ppm (sl, 1H); 4,65 ppm (dd, 1H, J = 1,67-12,18
Hz); 5,06 ppm (s, 2H); 5,09 ppm (s, 4H); 6,50 ppm (d, 1H, J = 2,62 Hz); 6,72 ppm (dd, 1H, J = 2,62-8,60 Hz); 6,99
ppm (s, 1H); 7,02 ppm (s, 1H); 7,28-7,40 ppm (m, 16H).

* SM (DIC, NH3) : (M++18) = 674.

DIC = désorption par ionisation chimique.

Synthèse de la 3-O-terbutyloxycarbonylbraziline
Une solution du dérivé précédent (150 mg, 0,20 mmole) dans 5 ml d'acétate d'éthyle est agitée en présence de palladium sur charbon (10 %, 20 mg, ALDRICH) à température ambiante sous pression d'hydrogène (5 bars) pendant 7 heures. La suspension est filtrée puis le filtrat est évaporé à sec. Le produit désiré est obtenu après purification par chromatographie sur colonne de silice MERCK
F254 avec un éluant : acétate d'éthyle/hexane (2/3).

Rendement = 61 %.

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
1,43 ppm (s, 9H); 3,17 ppm (d, 1H, J = 16,45 Hz); 3,32
ppm (d, 1H, J = 16,45 Hz); 3,60 ppm (d, 1H, J = 12,20
Hz); 4,27 ppm (s, 1H); 4,66 ppm (dd, 1H, J = 1,65-12,20
Hz); 6,33 ppm (d, îHr J = 2,60 Hz); 6,54 ppm (dd, 1H, J
= 2,60-8,56 Hz); 6,68 ppm (s, 1H); 6,72 ppm (s, 1H);
7,28 ppm (d, 1H, J = 8,56 Hz); 7,74 ppm (s, 2H); 8,28
ppm (s, 1H).

*SM (DIC, NH3) : (M++1) = 387; (M++18) = 404.

Exemple 4 : Préparation de la tétra-3,5l,6',7-O-
trifluoroacétylbraziline.

De l'anhydride trifluoroacétique (1 ml, 7,08 mmoles, JANSSEN) est mélangé avec de la braziline monohydratée (45 mg, 0,15 mmole; ALDRICH) sous atmosphère inerte et à température ambiante. La suspension est agitée dans ces conditions pendant 20 heures. Au cours du temps, la suspension s'homogénéise. L'anhydride trifluoroacétique en excès et l'acide trifluoroacétique sont évaporés à sec sous pression réduite pour conduire au produit désiré.

Caractéristique physiques
RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
3,70 ppm (d, îHr J = 16,92 Hz); 3,92 ppm (d, 1H, J =
16,92 Hz); 4,02 ppm (d, 1H, J = 13,18 Hz); 4,83 ppm (dd,
1H, J = 1,92-13,18 Hz); 5,01 ppm (s, 1H); 7,02 ppm (d,
1H, J = 2,44 Hz); 7,13 ppm (dd, 1H, J = 2,44-8,52 Hz);
7,67 ppm (s, 1H); 7,74 ppm (s, 1H); 7,79 ppm (d, 1H,
J = 8,52 Hz).

Exemple 5 : Préparation de la 7-O-méthylbraziline
Synthèse de la 5',6'-O-méthvlènebraziline
Une solution de fluorure de potassium anhydre (145 mg, 2,5 mmoles, JANSSEN) et de monohydrate de braziline (152 mg, 0,5 mmole, ALDRICH) dans 1 ml de diméthylformamide est chauffée et agitée sous azote à 1200C. Du dibromométhane (39 Al, 0,55 mmole, JANSSEN) est ajouté. Après 18 heures d'agitation à cette température, le mélange réactionnel est refroidi à OOC et 4 ml d'eau sont additionnés. Le mélange est extrait avec de l'acétate d'éthyle (2x5 ml). Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec de l'eau puis avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium et séchées sur Na2SO4. Le solvant est évaporé sous vide.Le produit désiré est obtenu après purification par chromato graphie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = acétate d'éthyle/hexane : 1/1).

Rendemant : 42 %.

Le produit est recristallisé dans un mélange acétate d'éthyle/hexane (1/1).

Caractéristiques physiques
* pF = 264,50C (décomposition).

* RMN 1H (200 MHz, DMSO d6)
2,81 ppm (d, 1H, J = 16,3 Hz); 2,86 ppm (d, 1H, J = 16,3
Hz); 3,64 ppm (d, 1H, J = 11,8 Hz); 3,82 ppm (d, îHr
J = 11,8 Hz); 3,88 ppm (s, 1H); 5,36 ppm (s, 1H); 5,91
ppm (s, 1H); 5,93 ppm (s, 1H); 6,18 ppm (d, 1H, J = 2,4
Hz); 6,40 ppm (dd, 1H, J = 2,4-8,2 Hz); 6,74 ppm (s,
1H); 6,87 ppm (s, 1H); 7,22 ppm (d, 1H, J = 8,20 Hz);
9,26 ppm (s, 1H).

* SM (IE, 70eV) : 298(100), 280(62), 279(79), 241(28), 149(58).

Synthèse de la 7-O-méthyl-5',6 '-0-méthylènebraziline:
A une solution de 5',6'-O-méthylènebraziline (79 mg, 0,27 mmole) dans 2 ml d'acétone sont ajoutés du carbonate de potassium (183 mg, 1,33 mmoles, OSI) et de l'iodure de méthyle (35 Fl, 0,53 mmole, LANCASTER). Le mélange est chauffé au reflux sous azote pendant 24 heures sous agitation. Puis, après retour à température ambiante, la suspension est filtrée. Le filtrat est évaporé à sec et le produit désiré est obtenu après purification par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = acétate d'éthyle/hexane; 1/4).Rendement = 65 %.

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CDC13)
2,58 ppm (s, 1H); 2,80 ppm (d, 1H, J = 16,45 Hz); 3,17
ppm (d, 1H, J = 16,45 Hz); 3,76 ppm (s, 3H); 3,79 ppm
(d, 1H, J = 11,8 Hz); 4,00 ppm (d, 1H, J = 16,45 Hz);
4,04 ppm (s, 1H); 5,86 ppm (m, 2H); 6,48 ppm (d, 1H, J =
2,4 Hz); 6,62 ppm (dd, 1H, J = 2,4-8,2 Hz); 6,68 ppm (s,
1H); 6,72 ppm (s, 1H); 7,24 ppm (d, 1H, J = 8,20 Hz).

Synthèse de la 7-O-méthylbraziline
A une solution de 7-O-méthyl-5',6'-O-méthylènebraziline (50 mg, 0,16 mmole) dans 2 ml de chlorure de méthylène est additionnée goutte à goutte, sous azote et agitation, une solution de trichlorure de bore (0,25 ml d'une solution 1M dans le chlorure de méthylène 0,25 mmole) . Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 20 heures. Du méthanol absolu (60 Fl) est ajouté lentement puis le solvant est évaporé sous vide. Le résidu est repris par de l'acétate d'éthyle (5 ml) et lavé à l'eau. La phase organique est séchée sur Na2SO4 et le solvant est évaporé sous vide. Le produit désiré est obtenu après purification par chromatographie sur colonne de silice
MERCK F254 (éluant = acétate d'éthyle/hexane : 1/1).

Rendement = 44 %.

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
2,80 ppm (d, lHr J = 16,5 Hz); 3,00 ppm (d, îHr J =
16,50 Hz); 3,70 ppm (s et d, 4H); 3,93 ppm (d, 1H, J =
11,30 Hz); 3,98 ppm (s, 1H); 4,48 ppm (s, 1H); 6,37 ppm
(d, 1H, J = 2,4 Hz); 6,56 ppm (dd, 1H, J = 2,4-8,30 Hz);
6,63 ppm (s, 1H); 6,77 ppm (s, 1H); 7,26 ppm (d, 1H, J =
8,30 Hz); 7,59 ppm (s, 1H); 7,64 ppm (s, 1H).

* SM (IE, 70eV) : 300(100), 282(59), 281(63), 243(45),
176(13), 165(10), 141(20).

II. Préparation de "piégeurs de mercaptans"
Exemple 6 : Préparation du tétrafluoroborate de
1,4,6-triméthyl-2-vinylpyridinium
Synthèse de la 4,6-diméthyl-2-vinylpyridine
A une solution de 2,4-diméthylpydirine (20 g; 0,186 mole; LANCASTER), dans 200 ml de THF fraîchement distillé, refroidie à -200C et sous atmosphère inerte, on ajoute du chlorure de benzoyle (29,12 g; 0,186 mole;
JANSSEN) dans 100 ml de THF. Le mélange réactionnel est agité à cette température pendant 20 minutes. Puis du bromure de vinylmagnésium (186 ml d'une solution 1,0 M dans le THF) est additionné et la solution est agitée à température ambiante pendant 0,5 h. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu est repris par 300 ml d'éther terbutylméthylique.Après lavage du milieu réactionnel avec une solution saturée de NH4Cl, la phase organique est séchée sur MgSO4 et le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = hexane/AcOEt, 9/1).

Rendement = 39,5 g (83 %), huile incolore.

Le produit précédent est repris par 500 ml de toluène et additionné de p-chloranil(tétrachloro-l,4- benzoquinone) (41,7 g; 0,169 mole), puis chauffé à reflux pendant 2 h. Le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite, puis additionné d'une solution de soude (260 ml, 2N) . Le produit est extrait par de l'éther terbutylméthylique (300 ml) et purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = hexane/AcOEt, 9/1)
Rendement = 11,1 g (54,2 %), huile jaune pâle.

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
2,20 ppm (s, 3H); 2,50 ppm (s, 3H); 5,25-5,45 ppm (dd,
2H, J = 11,9-18,7 Hz); 6,60-6,90 ppm (m, 3H).

* SM (DIC, NH3) : MH+ = 134(100).

DIC = désorption par ionisation chimique.

Synthèse du tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-2 vinylpvridinium:
A une solution de 4,6-diméthyl-2-vinylpyridine (0,61 g; 4,13.10-3 mole) dans 4,0 ml de chlorure de méthylène sous atmosphère inerte on ajoute, en une portion, du tétrafluoroborate de triméthyloxonium (0,50 g; 3,76.10-3 mole). La suspension est laissée réagir pendant 2 h à 250C.

La suspension est filtrée et le produit est séché sous vide.

Rendement = 0,162 g (18 %), cristaux blancs.

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
2,60 ppm (s, 3H); 2,85 ppm (s, 3H); 4,20 ppm (s, 3H);
6,00 ppm (d, 1H, J=12,8 Hz); 6,25 ppm (d, 1H,
J=19,2 Hz); 7,27 ppm (dd, 1H, J=12,8-19,2 Hz); 7,82 ppm
(s, 1H); 7,95 ppm (s, 1H).

* SM (IE, 70eV): (M+) 148(10); 147(18); 133(34);
121(100); 106(25); 91(31); 77(52); 49(77).

* Microanalyse
Calculé (%) : C 51,10; H 6,00; N 6,00
Trouvé (%) : C 49,80; H 6,08; N 5,96.

Exemple 7 : Préparation du tétrafluoroborate de 1
méthyl-4-vinylquinoléinium
Synthèse de la 4-vinylquinoléine
Une solution de 4-quinoléinecarboxaldéhyde (5 g; 3,18.10-2 mole) dans 32 ml de benzène, sous atmosphère inerte, contenant de l'iodure de triphénylméthylphosphonium (26 g; 6,36.10-2 mole) est ajoutée à une solution de soude (96 ml; 5N). Le système biphasique est agité à 450C pendant 30 minutes. Après décantation, la phase aqueuse est extraite par de l'acétate d'éthyle (3x100 ml). Les phases organiques sont réunies et lavées par une solution d'HCl 1N (2x30 ml), puis la phase aqueuse est neutralisée par du NaHCO3 et extraite par du chlorure de méthylène (3x100 ml). La phase organique est séchée sur MgSO4.Le produit désiré est purifié par chromatographie sur colonne de silice MERCK F254 (éluant = cyclohexane/AcOEt, 8/2).

Rendement = 2,8 g (60 %).

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CDC13)
5,60 ppm (d, 1H, J=10 Hz); 5,95 ppm (d, 1H,
J=14 Hz);7,30-7,55 ppm (m, 4H); 7,60-7,75 ppm (t, 1H,
J=4 Hz);8,07 ppm (t, 2H, J=6 Hz); 8,85 ppm (d, 1H,
J=4 Hz).

Synthèse du tétrafluoroborate de 1-méthyl-4-vinyl quinoléinium
A une solution de 4-vinylquinoléine (0,72 g; 4,64.10-3 mole) dans un mélange acétonitrile/acétone (2,5/1) est ajouté sous atmosphère inerte, en une portion, du tétrafluoroborate de triméthyloxonium (1,58 g; 10,7.10-3 mole). La suspension est laissée réagir pendant 1 h à 250C.

Le solvant est évaporé sous pression réduite, le résidu est repris par du 2-propanol (25 ml) puis agité pendant 30 minutes à température ambiante. Après addition d'éther éthylique (25 ml), la suspension est filtrée. Le produit désiré est séché sous vide.

Rendement = 0,93 g (60,4 t).

Caractéristiques physiques
* RMN 1H (200 MHz, CD3COCD3)
4,30 ppm (s, 3H); 6,25 ppm (d, 1H, J=12,5 Hz); 6,65 ppm
(d, 1H, J=17,5 Hz); 7,85-8,00 ppm (dd, 1H, J=12,5
17,5 Hz); 8,10 ppm (d, 1H, J=7 Hz); 8,35 ppm (dd, 2H,
J=10-10 Hz); 8,57 ppm (d, 1H, J=10 Hz); 8,72 ppm (d,
1H, J=10 Hz); 9,35 ppm (d, 1H, J=7 Hz).

* SM (FAB) glycérol-NOBA : ion positif M+ = 170(100)
ion négatif M- = 87(100).

FAB = bombardement par atomes rapides (Fast Atom
Bombardment).

NOBA = alcool méta-nitrobenzylique.

* Microanalyse
Calculé (%) : C 56,00; H 4,60; N 5,40.

Trouvé (%) : C 55,56; H 4,35; N 4,12.

III. Exemples d'applications
Les protocoles opératoires décrits ci-après sont des exemples d'application du procédé de dosage utilisant respectivement la braziline, le brazilane, la 3-O-méthylbraziline et la tétra-3,5',6', 7-O-trifluoroacétylbraziline pour mesurer l'activité SOD dans un lysat érythrocytaire.

Exemple 8 : Procédure de dosage utilisant la
braziline
On utilise un coffret contenant les réactifs décrits ci-dessous. Ce coffret de réactifs doit être stocké à une température comprise entre 0 et 40C.

Description des réactifs R1 : Solution de braziline 2.10-3 M dans le mélange
DMSO/H2O, 50/50 (v/v) contenant de l'acide borique
0,15 M.

(A conserver entre 0 et 40C pendant les mesures; stable
environ 1 mois après préparation, dans les conditions
de stockage mentionnées ci-dessus)
R2 : Solution de tétrafluoroborate de 1,4,6-triméthyl-
2-vinylpyridinium 5.10-2 M dans du DMSO contenant 25 %
(p/v) d'éthylène-glycol.

(A conserver entre 0 et 40C pendant les mesures; stable
au moins 1 mois après préparation).

E : Ethanol absolu/chloroforme, 62,5/37,5 (v/v).

(A conserver entre 0 et 40C pour la préparation de
l'échantillon).

T : Tampon AMPD 0,05 M/HCl pH = 8,8, contenant du DTPA
0,1 mM.

(Laisser équilibrer à l'air et à 370C avant les mesures)
Préparation de l'échantillon
On centrifuge au moins 100 Al de sang total à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes. On élimine le surnageant.

On lave le culot érythrocytaire avec une solution de chlorure de sodium à 0,9 % (refroidie entre 0 et 40C) puis on centrifuge à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes. On élimine le surnageant. On reprend le culot érythrocytaire avec 4 fois son volume d'eau distillée refroidie entre 0 et 40C et on mélange.

A 125 Fl de ce lysat érythrocytaire au 1/5ème, on ajoute 200 Wl du mélange E, (refroidi entre 0 et 40C). On mélange et centrifuge à 40C et 3000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant ainsi obtenu, débarrassé de l'hémoglobine, servira au dosage (il doit être conservé à 40C pour les mesures).

Procédure de dosage :
Les mesures sont effectuées à 370C dans un spectrophotomètre dont les cuves de mesure sont thermostatées.

Le mélange réactionnel correspondant à chaque dosage est préparé extemporanément selon les proportions données dans le tableau ci-dessous pour des cuves de 1 ml.

Chaque réaction est déclenchée par l'ajout de 10 Wl de réactif R1. Après homogénéisation du milieu, l'évolution de l'absorbance est enregistrée immédiatement et suivie pendant 1 min 30 s.

La mesure d'absorbance est effectuée à 539 nm dans des cuves de 1 cm de trajet optique, contre de l'air.

Pour chaque mesure, le milieu réactionnel défini dans le tableau ci-dessous doit être incubé pendant 1 minute à 370C avant ajout du réactif R1.

<tb>

<SEP> TEMPO <SEP> IONS <SEP> ECHANTILLONS
<tb> <SEP> R2 <SEP> 20 <SEP> pl <SEP> 20 <SEP> Rl <SEP>
<tb> Ethanol <SEP> à <SEP> 50 <SEP> %
<tb> (v/v)
<tb> dans <SEP> l'eau <SEP> 40 <SEP> pl <SEP>
<tb> distillée
<tb> ECHANTILLONS <SEP> 40 <SEP> fl <SEP>
<tb> <SEP> T <SEP> 930 <SEP> Rl <SEP> 930 <SEP> Rl <SEP>
<tb>
Pour chacune des mesures, on détermine la vitesse maximale d'autoxydation, exprimée en unités d'absorbance par minute, en soustrayant la valeur d'absorbance relevée au bout de 20 s de celle relevée au bout de 80 s, ce qui correspond à une phase d'oxydation linéaire de la braziline.

Expression des résultats
Dans les conditions de ce dosage, une unité d'activité SOD (U) correspond à une augmentation de la formation de braziléine (produit d'autoxydation de la braziline), par rapport au témoin, de 0,5 mole.l-1.min-1.

Soient VC et Vs les vitesses correspondant respectivement au témoin et à l'échantillon, l'activité SOD de celui-ci est calculée en en reportant l'inverse de la différence (Vs-Vc) en
ordonnée de la courbe d'étalonnage représentée sur la
figure 1 annexée, dans laquelle l'inverse de la
concentration en SOD, exprimé en ml/U, est porté en
abscisse et l'inverse de la différence (Vs-Vc), ex
primé en min/variation de ltabsorbance (min/ abs.),
est porté en ordonnée;
20 en déterminant la valeur de l'abscisse correspondante
sur cette courbe d'étalonnage; et
30 en multipliant l'inverse de la valeur de cette
abscisse par le facteur de dilution, soit ici 250,
pour exprimer les résultats en U/ml d'érythrocytes.

Les résultats peuvent être exprimés également par
exemple en U/ml de sang total ou en U/mg de protéines
érythrocytaires.

Remarques
Le contrôle de la procédure de dosage peut être effectué en dosant l'activité SOD d'un lysat érythrocytaire au 1/5ème, préparé comme décrit précédemment et conservé à -700C sous forme d'aliquots pour servir de témoin.

L'activité SOD est stable au moins 6 mois à -700C.

Le dosage doit être effectué sur un aliquot décongelé extemporanément.

EXEMPLE 9 : Procédure de dosage utilisant le brazilane (composé de 1 l'exemple 2)
Le coffret de réactifs utilisé contient les mêmes réactifs que celui de l'exemple 8, à ceci près que le réactif R1 est remplacé par le réactif D1 défini ciaprès Dl : Solution de brazilane 2.10-3 M dans le mélange
DMSO/H2O, 50/50 (v/v) contenant de l'acide borique
0,15 M. (conditions de conservation comme dans
l'exemple 8).

Préparation de l'échantillon
Comme dans l'exemple 8.

Procédure de dosage
On procède comme dans l'exemple 8, si ce n'est que chaque réaction est déclenchée par l'ajout de 10 Al de réactif D1 et que l'évolution de l'absorbance est suivie pendant 1 min à 520 nm au lieu de 1 min 30 s à 539 nm et que la vitesse maximale d'autoxydation, exprimée en unités d'absorbance par minute, est obtenue en soustrayant la valeur d'absorbance relevée au bout de 20 s de celle relevée au bout de 50 s (au lieu de 80 s), ce qui correspond à une phase d'oxydation linéaire du brazilane.

Expression des résultats
Elle est obtenue comme dans l'exemple 8, en utilisant la courbe d'étalonnage représentée sur la figure 2 annexee.

Exemple 10 : Procédure de dosage utilisant la 3-O
méthylbraziline
Le coffret de réactifs utilisé contient les memes réactifs que dans l'exemple 8, à ceci près que R1 est remplacé par D2 défini ci-dessous.

D2 : Solution de 3-O-méthylbraziline 2.10-3 M dans le
mélange DMSO/H2O, 50/50 (v/v) contenant de l'acide
borique 0,15 M.

(A conserver entre 0 et 40C pendant les mesures;
stable au moins 1 mois après préparation, dans les
conditions de stockage mentionnées ci-dessous).

Ce coffret doit être stocké à une température comprise entre 0 et 40C.

Préparation de l'échantillon
La préparation de l'échantillon est identique à celle décrite dans l'exemple 8.

Procédure de dosage
Les mesures d'absorbance sont effectuées à 541 nm.

A cette exception près, la procédure de dosage est identique à celle décrite dans l'exemple 8.

L'expression des résultats est identique à celle décrite dans l'exemple 8 à l'aide d'une courbe d'étalonnage spécifique de la 3-O-méthylbraziline.

Exemple 11 : Procédure de dosage utilisant la tétra-3,5l,6l,7-O-trifluoroacétylbraziline
Le coffret de réactifs utilisé contient les réactifs R2 et E de celui utilisé dans l'exemple 8. Les réactifs R1 et T sont remplacés respectivement par les réactifs D3 et T1 décrits ci-après.

Ce coffret de réactifs doit être stocké à une température comprise entre 0 et 40C.

D3 : Solution de tétra-3,5',6',7-O-trifluoroacétyl-
braziline 2.10-3 M dans l'acétonitrile.

T1 : Tampon AMPD 0,05 M/HCl pH = 8,8, contenant du DTPA
0,1 mM et de l'acide borique 1,5 mM.

(On laisse équilibrer à l'air et à 370C avant les mesures)
Préparation de l'échantillon
La préparation de l'échantillon est identique à celle décrite dans l'exemple 8.

Procédure de dosage
Après ajout de 10 Fl du réactif D3 et homogénéisation du milieu réactionnel, l'évolution de l'absorbance à 539 nm est enregistrée immédiatement et suivie pendant 1 minute et 30 secondes.

La procédure de dosage est par ailleurs identique à celle décrite dans l'exemple 8.

Expression des résultats
L'expression des résultats est identique à celle décrite dans l'exemple 8, en utilisant la même courbe d'étalonnage.

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Claims (12)

REVENDICATIONS

1.- Procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un milieu liquide, procédé qui utilise l'activation de l'autoxydation d'un réactif par l'activité SOD, caractérisé en ce que ledit réactif est un composé répondant à la formule générale I

dans laquelle

R1 = hydrogène, COR5, S02R5, Po2R5, Co2R6, S03R6 ou Po3R6,

R2 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), COR5,

S02R5, Po2R5, CO2R6, S03R6 ou Po3R6,

R3 : hydrogène ou OR4, avec

R4 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone),

benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle, p

carbométhoxybenzyle, vinyle, triméthylsilyle, COR5,

S02R5, Po2R5, C02R6, SO3R6, Po3R6, COR8, C02R7,

CON(R8,R9), NO2, S02R8, Po3R8 ou P02N(R8,R9),

R5 = CF3, CF2R7 ou p-nitrophényle,

R6 = hydrogène, CF3, CF2R7 ou p-nitrophényle,

R7 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone), benzyler p

nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle ou p-carbo

méthoxybenzyle,

R8 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone),

benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle ou

p-carbométhoxybenzyle, et

R9 = hydrogène, alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbone),

benzyle, p-nitrobenzyle, p-diméthylaminobenzyle ou

p-carbométhoxybenzyle.

2.- Procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un milieu liquide contenant un ou plusieurs mercaptan(s), notamment un milieu biologique, procédé qui utilise l'activation de l'autoxydation d'un réactif par l'activité SOD, caractérisé en ce que ledit réactif est un composé répondant à la formule générale I définie ci-dessus et en ce que le milieu contient en outre une quantité, capable de piéger totalement lesdits mercaptans par S-alkylation, d'au moins un composé répondant à la formule générale Il

dans laquelle

Z1 = alkyle (avec 1 à 6 atomes de carbonate), benzyle, p

nitrobenzyle, phényle, o,p-dinitrophényle,

-CH2-COOH ou -CH2-CH2-COOH;;

Z4 = hydrogène et

Z5 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de

carbone) ou

Z4 et Z5 forment ensemble, avec les deux atomes de

carbone intermédiaires, un cycle phényle;

X = halogénure, sulfonate, fluorosulfonate, phospho

nate, tétrafluoroborate ou tosylate; et soit z2 = vinyle, et

Z3 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de

carbone); soit Z3 : vinyle, et

z2 = hydrogène ou alkyle (avec 1 à 6 atomes de

carbone).

3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il repose sur une mesure spectrophotométrique de la vitesse d'autoxydation d'un composé de formule générale I, en l'absence et en présence de l'échantillon à doser.

4.- Procédé de dosage de l'activité superoxyde dismutase (SOD) dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à 10) déterminer la vitesse maximale d'autoxydation Vs d'un composé de formule générale I en présence de l'échantillon, au moyen de l'évolution de l'absorbance en fonction du temps, à la longueur d'onde caractérisant l'apparition du produit d'autoxydation du composé de formule générale I utilisé, dans un milieu réactionnel tamponné à une valeur de pH de 8,0 à 9,0, en déclenchant la réaction par ajout d'un aliquot d'une solution-mère du composé de formule générale I 20) déterminer, dans les mêmes conditions, la vitesse maximale d'autoxydation Vc du même composé en l'absence de l'échantillon ; et 30) déterminer la concentration en SOD de l'échantillon au moyen de la différence des mesures effectuées et d'une courbe d'étalonnage établie dans les mêmes conditions opératoires.

5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend l'ajout d'un dérivé du bore, notamment l'acide borique, pour moduler la vitesse d'autoxydation du composé de formule générale I.

6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on utilise une solution aqueuse d'un composé de formule générale I en présence d'un dérivé du bore, notamment l'acide borique pour stabiliser le composé de formule générale I hors des conditions de mesure.

7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'on combine à la mesure faite dans des conditions d'activation de l'autoxydation du composé de formule générale I, une mesure effectuée dans des conditions d'inhibition de cette autoxydation, dans une gamme de pH de 7,2 à 7,8.

8.- Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement, en tant que réactif, un composé de formule générale I.

9.- Nécessaire ou kit selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un ou plusieurs composé(s) piégeur(s) de mercaptans de formule générale II.

10.- Nécessaire ou kit selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement - un composé de formule générale I en solution ou en

poudre, en présence d'acide borique ou d'un dérivé de ce

dernier, - un ou plusieurs composé(s) piégeur(s) de mercaptans de

formule générale II, en solution ou en poudre, et - un tampon à base de AMPD, tamponnant dans la gamme de pH

de 8,0 à 9,0.

11.- Composés de formule générale I dans laquelle

R1 à R3 sont définis comme à la revendication 1, étant entendu que lorsque R1 = R2 = hydrogène, R3 ne peut représenter OH.

12.- Préparation du composé de formule générale I dans laquelle R1 = R2 = R3 = H, ou brazilane, caractérisé en ce qu'il comprend essentiellement les étapes consistant à

- protéger la braziline sur ses hydroxyles phénoliques,

- transformer l'hydroxyle alcoolique en un groupe

permettant son élimination, et

- réduire et déprotéger le produit résultant.