FR2681600A1 - Antigenes specifiquement reconnus par des anticorps specifiques de la polyarthrite rhumatouide, leurs proteines constitutives, leur preparation et leurs applications. - Google Patents

Abstract

La présente Invention a pour objet des antigènes extraits d'épithéliums malpighiens de mammifère, notamment d'épithélium œsophagien de rat ou d'épiderme humain, spécifiquement reconnus par les autoanticorps présents chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, ainsi que les protéines antigéniques constitutives desdits antigènes. L'Invention concerne l'utilisation de ces antigènes et protéines pour la préparation de compositions antigéniques et leurs applications notamment pour le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde.

Description

La présente Invention a pour objet des antigènes extraits dgépithéliums malpighiens de mammifères et reconnus spécifiquement par les autoanticorps présents chez les patients atteints- de polyarthrite rhumatoide (PR).

L'Invention est plus précisément relative d'une part à un antigène extrait d'épiderme humain et d'autre part à un antigène extrait d'épithélium oesophagien de rat, ainsi qu'aux protéines antigéniques les constituant.

L'Invention concerne également les anticorps reconnaissant ces antigènes, ainsi que les compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence d'autoanticorps et les compositions immunogènes pour la préparation d'immunsérums et de vaccins, comprenant lesdits antigènes ou protéines.

L'Invention concerne aussi un procédé de diagnostic de la PR mettant en oeuvre lesdits antigènes ou protéines.

La PR est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques. Elle atteint environ 2 % de la population des pays développés.

La PR est évolutive, invalidante et pose des problèmes de diagnostic difficiles dans ses formes de début, alors même quelle appelle des traitements spécifiques. En dehors des signes cliniques et radiologiques, le rhumatologue ne dispose actuellement que de tests biologiques peu spécifiques pour son diagnostic. Les plus utilisés d'entre-eux sont le test de Waaler-Rose et le test au latex, qui détectent le facteur rhumatoide dans 7 PR sur 10. Cependant, la spécificité de ces tests est très mauvaise puisque ces facteurs sont détectés dans la plupart des autres pathologies autoimmunes et même chez des individus sains.

La présence d'autoanticorps dirigés contre des composants cellulaires est la caractéristique générale des maladies autoimmunes telles que la PR, le lupus érythémateux disséminé (LED), la sclérodermie (SCL) ou la polymyosite. Parmi les nombreux types d'autoanticorps identifiés dans ces maladies, ceux spécifiquement présents chez les malades atteints de PR et réagissant avec un antigène épithélial oesophagien ont été décrits pour la première fois par B.J.J. Young et al. dans Br. Med. J.

2:97-99, 1979. Ces autoanticorps ont été improprement dénommés "anticorps antikératines".

Ces autoanticorps spécifiques de la PR ont été jusqu'à présent détectés et titrés par immunofluorescence indirecte (IFI) sur cryocoupes transversales d'oesophage de rat. G. Serre et al. dans Rev. Rhum. 53(11):607-614 (1986) ont montré que l'antigène défini par ces autoanticorps est caractéristique des épithéliums malpighiens cornifiés. Présent principalement dans le Stratum corneum de ces épithéliums, il est exprimé dans l'épiderme humain.

Les travaux effectués par la Demanderesse dans le domaine de la différenciation épidermique et malpighienne, notamment la production d'anticorps monoclonaux pour la définition de nouveaux antigènes de différenciation et l'étude des autoanticorps humains contre ces mêmes antigènes, lui ont permis de montrer que les anticorps anti-Stratum corneun d'oesophage de rat sont d'authentiques autoanticorps, qui ne reconnaissent pas les kératines humaines ou murines, mais d'autres antigènes exprimés dans l'épithélium oesophagien murin et l'épiderme humain.

Des travaux plus poussés ont permis à la
Demanderesse d'extraire, de purifier et de caractériser biochimiquement ces antigènes ainsi que les protéines les constituant, spécifiquement reconnus par les autoanticorps sériques présents chez les malades atteints de
PR.

L'Invention concerne en conséquence un antigène de différenciation terminale présent dans les épithéliums malpighiens de mammifères, spécifiquement reconnu par les autoanticorps- présents chez les patients atteints de PR, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes - il est de nature protéique, - un traitement par une nucléase ne modifie pas son immunoréact ivité, - un traitement par l'éthanol ne modifie pas son
immunoréactivité, - un traitement par l'acide trichloroacétique (TCA) ne
modifie pas son immunoréactivité, - il est hydrosoluble.

Parmi les épithéliums malpighiens, on peut citer l'épiderme, les épithéliums qui tapissent les muqueuses des voies aéro-digestives supérieures (telles que muqueuses jugale, gingivale, linguale et palatine) ainsi que les muqueuses génitales et anales.

Les travaux ayant mené à la présente Invention ont plus particulièrement concerné l'épithélium oesophagien de rat et l'épiderme humain.

Un premier antigène spécifiquement reconnu par les autoanticorps présents chez les malades atteints de
PR a été extrait de l'épiderme humain.

Cet antigène est caractérisé par les propriétés suivantes - après électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) en
conditions natives, il se sépare en plusieurs protéines
antigéniques qui migrent comme des témoins dont les
poids moléculaires sont compris entre 80 et 400 kD
environ, les protéines les plus immunoréactives se
situant dans les zones comprises entre environ 80 et
120 kD - après isoélectrofocalisation (IEF), il se dissocie en
plusieurs protéines antigéniques dont les points
isoélectriques (pHi) varient de 5,8 à 7,4.

Cet antigène est aussi caractérisé par les propriétés suivantes - après électrophorèse bidimensionnelle du type
IEF, suivie d'une migration en PAGE en présence de
dodécyl sulfate de sodium (SDS), il apparaît comme une
protéine antigénique de poids moléculaire apparent
moyen d'environ 40 kD dont les pHi varient de 5,8 à
7,4.

Cet antigène est encore caractérisé par la propriété suivante - il présente des propriétés immunologiques et bio
chimiques en commun avec la filaggrine humaine et
correspond à un fragment de protéolyse de la
profilaggrine, précurseur de la filaggrine.

La Demanderesse a également extrait d'épithélium oesophagien de rat un second antigène spécifiquement reconnu par les autoanticorps présents chez les patients atteints de PR.

Cet antigène présente les propriétés suivantes - après électrophorèse en PAGE-SDS, il se sépare en les
deux protéines antigéniques suivantes * une première protéine de poids moléculaire moyen
apparent d'environ 210 kD, * une deuxième protéine de poids moléculaire moyen
apparent compris entre environ 90 et 130 kD, - après électrophorèse en PAGE en conditions natives,
il se sépare en les trois protéines antigéniques sui
vantes * une première protéine qui migre comme un témoin dont
le poids moléculaire est de 440 kD environ, * une deuxième protéine qui migre comme un témoin dont
le poids moléculaire est de 232 kD environ, * une troisième protéine qui migre entre deux témoins
dont les poids moléculaires sont environ de 140 kD et
67 kD.

Cet antigène est encore caractérisé par les propriétés suivantes - après électrophorèse bidimensionnelle du type
IEF, suivie d'une migration en PAGE-SDS, il se dissocie
en les trois protéines antigéniques suivantes * une première protéine de poids moléculaire moyen appa
rent d'environ 210 kD dont les pHi varient d'environ
5,85 à 6,85, * une deuxième protéine de poids moléculaire moyen appa
rent compris entre environ 90 et 130 kD dont les pHi
varient d'environ 5,85 à 7,35, * une troisième protéine dont le poids moléculaire moyen
apparent diminue d'environ 120 à 67 kD pendant que son
pHi varie d'environ 5 à 7,5.

- après chromatographie séquentielle de gel filtration
et d'interaction hydrophobe puis analyse en PAGE-SDS,
cet antigène se sépare en les deux fractions protéiques
antigéniques suivantes * une première fraction très hydrophobe contenant la pro
téine de poids moléculaire moyen apparent d'environ
210 kD et la protéine de poids moléculaire moyen
apparent compris entre environ 90 et 130 kD, * une deuxième fraction moins hydrophobe que la première
contenant une protéine de poids moléculaire moyen
apparent compris entre environ 120 et 67 kD.

Les protéines constitutives de ces antigènes ont été purifiées et testées avec les autoanticorps présents chez les patients atte-ints de PR. il apparaît que ces protéines présentent isolément des propriétés immunologiques au moins équivalentes à celles des antigènes dont elles sont issues.

L'Invention concerne en conséquence également les trois protéines mises en évidence après électrophorèse bidimensionnelle du type IEF suivie d'une migra tion en PAGE-SDS, de l'antigène extrait de l'épithélium oesophagien de rat.

Ces trois protéines ont également été mises en évidence dans les fractions protéiques obtenues après chromatographie séquentielle de gel filtration et interaction hydrophobe de l'antigène extrait d'épithélium oesophagien de rat, puis électrophorèse en conditions dénaturantes.

La première de ces trois protéines présente un poids moléculaire moyen apparent d'environ 210 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 6,85 ; la deuxième présente un poids moléculaire moyen apparent compris entre 90 et 130 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 7,35 ; la troisième présente un poids moléculaire moyen apparent compris entre 67 et 120 kD et des pHi variant d'environ 5 à 7,5.

L'Invention concerne aussi la protéine mise en évidence après électrophorèse bidimensionnelle du type
IEF suivie d'une migration en PAGE-SDS, de l'antigène extrait d'épiderme humain. Cette protéine a un poids moléculaire d'environ 40 kD et des pHi variant d'environ 5,8 à 7,4.

Les antigènes et les protéines précédemment décrits sont particulièrement utiles pour la préparation de compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence d'autoanticorps dans un échantillon biologique d'un patient atteint de PR.

Ces compositions permettent la formation d'un complexe antigène-anticorps entre les protéines ou antigènes de l'invention et les autoanticorps présents dans un échantillon biologique, tel que le sérum d'un sujet atteint de PR ; ces compositions et les antigènes qu'elles contiennent sont donc particulièrement intéressants pour le diagnostic in vitro de la PR.

Un test par immunotransfert pour la détection des autoanticorps anti-Stratum corneum de classe G, spécifiques de la PR a été mis au point.

Ces autoanticorps étaient antérieurement détectés par IFI sur cryocoupes d'oesophage de rat.

Un protocole d'immunotransfert, réalisé à partir d'un extrait antigénique épithélial oesophagien murin, a été optimisé pour obtenir une meilleure définition des bandes immunoréactives et une meilleure sensibilité, puis trois configurations, différentes, soit par la méthode de séparation des protéines antigéniques (électrophorèse en conditions natives ou dénaturantes), soit par la dilution des sérums analysés, ont été validées sur le plan diagnostique avec une large série de sérums représentatifs de la pathologie rhumatologique.

il est apparu que dans ces trois conditions, la sensibilité diagnostique du test oscillait autour de 50% pour une spécificité voisine de 95%, lorsque seule la présence ou l'absence d'immunoréactivité était prise en compte.

Par contre, la protéine antigénique migrant entre deux témoins de masses molaires 140 kD et 67 kD après séparation de l'antigène en conditions natives, reconnue beaucoup plus spécifiquement par les sérums de patients atteints de PR, a permis la détection des sérums avec une sensibilité de 68% pour une spécificité de 99%, performance très supérieure à celle de l'IIF qui présente une sensibilité de 43% pour une spécificité de 99%.

Une approche parallèle conduite avec l'antigène extrait d'épiderme humain a permis de montrer que la protéine de 40 kD, seule forme immunoréactive dans ce tissu, permettait d'obtenir des performances diagnostiques équivalentes à celles de la protéine antigénique murine migrant entre deux témoins de masses molaires 140 kD et 67 kD.

L'Invention a également trait à des anticorps formés contre les antigènes et protéines de l'invention, anticorps qui peuvent correspondre à des antisérums ou à des anticorps monoclonaux, produits par tout hybridome préparé selon les méthodes classiques de fusion cellulaire entre des cellules spléniques activées in vitro par l'antigène ou provenant d'un animal immunisé contre l'une des protéines antigéniques de l'invention et des cellules d'une lignée myélomateuse.

L'Invention est aussi relative à un procédé de purification des autoanticorps spécifiquement présents chez les patients atteints de PR, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes - la mise en contact d'un fluide biologique d'un patient
atteint de PR avec au moins un antigène ou au moins une
protéine, tels que définis dans ce qui précède, dans
des conditions permettant la formation de complexes
immunologiques avec lesdits anticorps, - l'isolement desdits complexes du milieu réactionnel, - la séparation des autoanticorps des complexes immuno
logiques.

L'Invention concerne enfin un procédé de diagnostic in vitro de la PR dans un fluide biologique, comprenant au moins les étapes suivantes - la mise en contact de ce fluide biologique avec au
moins un antigène ou une protéine selon l'invention,
éventuellement marqué, ou un conjugué de cet antigène
ou protéine avec une molécule porteuse, dans des condi
tions permettant la formation d'un complexe immunolo
gique avec les autoanticorps.éventuellement présents - la détection dans le fluide biologique de la présence
du complexe immunologique, par des méthodes physiques
ou chimiques.

Le procédé de diagnostic précédent peut être mis en oeuvre grâce à un nécessaire ou kit comprenant - au moins un antigène ou une protéine selon l'invention,
éventuellement marqué, ou un conjugué de cet antigène
ou protéine avec une molécule porteuse - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à
la réaction immunologique avec les autoanticorps éven
tuellement présents dans un échantillon biologique - un ou plusieurs réactifs pour la détection du complexe
immunologique formé - le cas échéant, des échantillons de référence, tels
qu'un sérum négatif et un sérum positif.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui sont illustrés par les figures en annexe étant entendu que ces exemples ne sauraient être interprétés comme tendant à réduire la portée des Revendications.

EXEMPLE 1 - CARACTERISATION DE L'ANTIGENE EXTRAIT
D'EPITHELIDN OESOPHAGIEN DE RAT
I - MATERNEL ET METHODE
A - EXTRACTION DES PROTEINES EPITHELIALES
1) Préparation de l'énithélium oesonhaaien nar clivaae chorio-écithélial
L'oesophage de rat est composé de trois tuniques principales qui sont, de l'extérieur vers l'intérieur : une couche conjonctive (l'adventice), une couche musculaire (la musculeuse), une couche composée d'un chorion recouvert par un épithélium malpighien cornifié (la muqueuse).

Après élimination, par dissection, de l'adventice et de la musculeuse, l'épithélium est séparé mécaniquement du chorion (clivage chorio-épithélial) après un choc thermique successivement à 4 C puis à 57 C en milieu liquide (KH2/K2H-PO4 8,5 mM; NaCl 150 mM; acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) 5 mM ; phénylméthyl sulfonylfluoride < PMSF) 4 mM; pH 7,4). Les épithéliums clivés sont conservés hydratés par un volume minimal de
PBS (KH2/K2H-P04 8,5 mM; NaCl 150 mM; pH 7,4) avant de subir un contrôle histologique permettant de vérifier l'absence de chorion contaminant.

2) Extraction des protéines étithéliales
a) Tampons et séquences d'extraction
L'antigène de l'invention étant exclusivement épithélial, c'est à partir du seul épithélium que sont réalisées les extractions.

A partir d'épithéliums clivés, l'extraction des protéines épithéliales est réalisée successivement par broyage au potter puis agitation à 4 Celsius.

Des protocoles classiques (W.W. Franke et al.,
J. Mol. Biol., 153:933-959, 1981 - T.T Sun and H. Green,
J. Biol. Chem. 253(6):2053-2060, 1978) adaptés à l'extraction séquentielle des protéines à partir de tissus épithéliaux et notamment de l'épiderme, ont été tout d'abord utilisés. Puis des extractions en une seule étape ont ensuite été testées. Différents milieux d'extraction correspondant à des tampons Tris-HCl additionnés ou non de sels (KC1, NaCl), de détergents (Triton, Nonidet P40 [NP4O]), d'agents dénaturants (urée, SDS) et d'agents réducteurs (bêta-mercaptoéthanol [2-ME]) ont ainsi été testés.

Au cours des extractions fractionnées, l'antigène a été retrouvé exclusivement dans la fraction correspondant soit à un tampon Tris de faible force ionique, soit à un tampon Tris salin (TBS) additionné d'EDTA et de Triton. Ceci a permis de confirmer que l'antigène n'est pas une cytokératine, de montrer qu'il est extractible en absence d'urée et d'agents réducteurs et qu'il est hydrosoluble.

Cependant, en comparant les diverses techniques d'extraction, l'intensité de l'immunoréactivité est apparue supérieure en présence de NP40. Un milieu d'extraction constitué de TBS + inhibiteurs + NP40 à 0,5 % apparaît donc comme le plus efficace.

Lors de la purification de l'antigène, l'intense absorption du NP40 à 280 nm interfère avec celle des protéines, notamment en chromatographie de gel filtration. Un tampon TBS + inhibiteur sans NP40 peut être utilisé pour l'extraction de l'antigène en préalable à des travaux de purification.

b) Ont imisat ion des conditions nhvsiaues
d'extraction
Afin d'optimiser la procédure d'extraction, certains paramètres physiques ont été explorés de manière systématique. il s'agit de la température, de la durée, du type de broyage, du type d'agitation et de l'action d'inhibiteurs enzymatiques.

- Brovage :
Il a été effectué soit au potter électrique à haute vitesse, soit de façon plus douce, au potter manuel. L'efficacité de l'extraction a été dans les deux cas à peu près équivalente. Le potter électrique est cependant préféré car il permet le broyage d'un plus grand nombre d'oesophages.

- Sonication :
L'optimisation de l'extraction par des sonications de durée variable, après potterisation a été testée. Elle s'est avérée très faible. La sonication n'est donc pas nécessaire.

- Agitation :
Agitation douce et agitation rapide ont été comparées. Une agitation rapide en présence d'un détergent entraînant la formation - de mousse provoque une suroxygénation du milieu susceptible d'altérer l'antigène. En fait, la qualité de l'extraction a été identique dans les deux cas. Une agitation douce a cependant été retenue pour préserver au maximum l'antigène.

- Température :
Température ambiante et température de 4-Celsius ont été comparées. De meilleurs résultats ont été obtenus avec des extractions-conduites à 4-Celsius.

- Durée :
Des extractions sous agitation de 15 minutes, 2 heures et 17 heures ont été comparées. Bien que l'augmentation du temps d'extraction augmente faiblement la quantité d'antigène extrait, une durée de 15 minutes a été retenue pour minimiser le risque d'altération de l'antigène.

- Inhibiteurs :
L'effet protecteur pour l'antigène des inhibiteurs suivants a été testé - Inhibiteur de la prolifération bactérienne
Azide de sodium, - Inhibiteur d'enzymes lytiques
protéases (aprotinine, PMSF), phosphatases (NaF, PCMB
(acide parachloromercuribenzolque)), glycosidases
(déoxymannojirimycine, déoxyj irimycine).

Des extractions sans inhibiteurs ont été réalisées notamment lorsque l'extrait était destiné à la caractérisation biochimique de l'antigène par action de différentes enzymes ; aucune modification de l'antigène n'a été constatée en absence dinhibiteur.

- Protocole d'extraction optimisé
L'étude des paramètres précédents a permis de déterminer le protocole d'extraction optimisé ci-après - Substrat : épithélium d'oesophage de rat obtenu par
clivage chorio-épithélial. - - Tampon : Tris-HCl 40 mM
NaCl 150 mM
EDTA 10 mM
pH 7,4 - Inhibiteurs :Azide de sodium 0,1 %
PMSF 1 mM
Aprotinine 2 Rg/ml - Rapport substrat/tampon
500 1 de tampon par épithélium oesophagien - Conditions
Broyage : potter électrique, 15 minutes
Température de broyage : 4iCelsius
Agitation après broyage : 15 minutes à 4iCelsius - Concentration protéique totale de l'extrait
5 à 8 mg/ml - Conservation de l'extrait brut
-20 ou -40'Celsius
- Prétaration à partir de muqueuse
oesochaaienne totale
Dans un but de simplification de la procédure d'extraction, l'extraction de l'antigène à partir de muqueuse oesophagienne totale a été étudiée. Une simple dissection de la muqueuse sans clivage chorio-épithélial a été réalisée. La contamination protéique de l'extrait ainsi induite a été étudiée.

Des extractions parallèles, soit à partir de muqueuses, soit à partir d'épithéliums clivés ont été effectuées.

L' analyse en PAGE-SDS des protéines extraites montre que la présence du chorion n'entraîne pas de contamination protéique majeure dans la zone de masse molaire de l'antigène. Après immunotransfert de la fraction épithélio-choriale extraite par broyage, l'antigène est parfaitement détectable.

c) Concentration de l'extrait brut
L'antigène étant--faiblement représenté dans l'extrait brut (moins de 1 % des protéines totales), une étape de concentration des extraits s'avère nécessaire, surtout lorsque ceux-ci doivent être analysés par électrophorèse miniaturisée de type système "Phastsystem Pharmacia < dépôts de l'ordre du microlitre).

Parmi les diverses techniques de concentration testées, celle consistant à concentrer les extraits par précipitation au TCA 10 % a été retenue. Cette technique facile à mettre en oeuvre ne produit aucune altération de l'antigène puisque la réponse immunologique est parfaitement conservée en immunotransfert.

De la même façon, des précipitations par l'éthanol ou le sulfate d'ammonium ainsi que la lyophilisation contrôlée n'induisent aucune altération sensible de l'antigène et sont donc parfaitement utilisables.

B - ELECTROPHORESES
Quels que soient les milieux d'extraction étudiés (comme décrit ci-avant), les protéines solubles sont séparées par PAGE puis électro-transférées sur nitrocellulose.

1) Séparation car IEF horizontale Gel : 9 X 15 cm, 4% acrylamide contenant des ampholines
formant un gradient de pH de 3,5 à 9,5.

. Echantillon déposé : extrait brut préparé selon le pro
tocole précédent, concentré par précipitation au TCA à
10% et repris dans l'eau.

2) Electrothorèses monodimensionnelles - Electrophorèse verticale classique selon la méthode
décrite par Laemmli (Nature, 227 : 680-685, 1970) Gel : 10 X 10 cm, 7% acrylamide.

Tampon de migration : Tris 25 mM, glycine 192 mM,
SDS 1%, pH 8,3.

Echantillon déposé : extrait brut lyophilisé et repris
en Tris-HCl 10 mM pH 7,4, SDS 2%, 2ME 1%, bleu de
bromophénol 0,1%, glycérol 10%.

- Electrophorèse horizontale miniaturisée en conditions
dénaturantes.

Gel : 4 X 4 cm, 7,5% acrylamide.

Tampon Tris 200 mM, Tricine 200 mM, SDS 0,55%, pH 8,1.

. Echantillon déposé : extrait brut concentré par préci
pitation au TCA 10% et repris en Tris-HCl 10 mM,
pH 7,4, SDS 2%, 2-ME 1%, Bleu de bromophénol 0,1%.

- Electrophorèse horizontale miniaturisée en conditions
natives.

Gel : 4 X 4 cm, gradient de8 à 25% en acrylamide.

Tampon de migration : Tris 250 mM, L-Alanine 880 mM,
pH 8,8.

Echantillon déposé : extrait brut concentré par préci
pitation au TCA 10% et repris soit dans l'eau, soit en
tampon Tris-HCl 200 mM à différents pH.

3) Electrothorèses bidimensionnelles
IEF/PAGE-SDS - Première dimension : IEF horizontale.

Gel : 4 X 4 cm, 4% acrylamide, gradient de pH 3,5 à
9,5.

. Echantillon déposé : extrait brut concentré par préci
pitation à l'éthanol (4 volumes) et repris dans l'eau.

- Deuxième dimension : électrophorèse dénaturante comme
décrite précédemment.

. Echantillon déposé : piste gel IEF incubée en Tris
112 mM, acide acétique 112 mM, SDS 2,5%, 2-ME 1%.

C - IMMUNODETECTION
L'immunodétection de l'antigène est réalisée à l'aide de sérums humains, provenant de patients atteints de PR, dans lesquels les autoanticorps anti-Stratum corneum d'oesophage de rat ont été préalablement titrés par IFI semiquantitative et affectés d'une valeur-titre de 0 à 8 : paramètre GIFOR (G-Immunofluorescence
Oesophage de Rat). La valeur-seuil, GIFOR = 2, qui correspond à une spécificité diagnostique pour la PR supérieure à 99 % permet de classer les sérums de malades en deux groupes : GIFOR+ et GIFOR- < C.Vincent et al., Ann.

Rheum. Dis. 48:712-722, 1989).

Dans les sérums choisis, on a également pris en compte le paramètre immunologique suivant : le titre des autoanticorps anticytokératines épidermiques de classe G déterminé en ELISA (GELISA) (G.Serre et al.,
J. invest. Dermatol. 88:21-27, 1987). Ces autoanticorps réagissent en immunotransfert avec les cytokératines humaines contaminantes éventuellement présentes dans l'extrait et dues à la desquamation naturelle des manipulateurs. Les sérums utilisés ont été choisis pour constituer également deux groupes, GELISA+ et GELISA-, en fonction du titre élevé (absorbance > 0,6) ou faible (absorbance < 0,2) de ces autoanticorps naturels.Au total, les quatre sous-groupes de sérums de PR suivants ont été utilisés
- GIFOR+/GELISA+
- GIFOR+/GELISA
- GIFOR-/GELISA+
- GIFOR-/GELISA
Enfin, des sérums témoins provenant d'individus normaux ou de patients atteints d'affections rhumatologiques non rhumatoldes ainsi que des anticorps monoclonaux murins spécifiques des cytokératines humaines ont été inclus dans les tests (G.Serre et al., Colloque
INSERM, John Libbey Eurotext, Vol. 171:524, 1988).

Après PAGE des protéines, immunotransfert sur membrane de nitrocellulose et incubation avec les sérums humains ou les anticorps monoclonaux, un second anticorps, correspondant à des fragments F(ab) '2 de chèvre anti-IgG (gamma) humaines ouFab de mouton anti-IgG (H+L) de souris, marqué à la peroxydase, est incubé avec la membrane et la formation du complexe antigène-anticorps est révelée par mise en évidence de l'activité peroxydasique, par H202 et 4-chloro-l-naphtol.

Dans ces conditions expérimentales, l'antigène est repérable en immunotransfert par une immunoréactivité spécifique des sérums de PR GIFOR+. Les autoanticorps naturels anticytokératines se traduisent, seulement lorsque l'antigène a été préalablement séparé en PAGE
SDS, par la présence de bandes immunoréactives situées autour de 65-67 Kd, présentes dans les seuls sérums
GELISA+, plus ou moins intenses en fonction de leur titre et totalement indépendantes de la valeur de GIFOR.

D - CHROMATOGRAPHIE
Les molécules antigéniques ont été séparées dans différentes fractions après chromatographie séquentielle gel filtration/interaction hydrophobe. Ces fractions ont été analysées par. PAGE-SDS et PAGE en conditions natives.

E - DIGESTION ENZYMATIQZE
1) Protéinase K
Deux extraits d'épithélium d'oesophage de rat en tampon TBS/NP40 sont précipités au TCA 10% et les protéines reprises dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,5 CaC12 10 mM. Un des extraits est additionné de protéinase
K (préincubée pendant 1 heure à 37 C pour éliminer d'autres hydrolases éventuellement présentes dans la préparation commerciale) à la concentration finale de 50 g/ml. Les deux échantillons sont ensuite incubés pendant 1 heure à 37 C puis analysés comparativement en immunotransfert après migration en PAGE en conditions natives ou en PAGE-SDS.

2) Nucléase
Deux extraits d'épithélium d'oesophage de rat en tampon TBS/NP40 sont précipités au TCA 10%. L'un d'eux est hydrolysé par 2 U/l - de nucléase de microccoque (hydrolyse de 1'ADN et de 1'ARN) en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, CaCl2 5 mM. Le deuxième échantillon, non traité, sert de témoin. Les deux préparations sont incubées pendant 1 heure à 37 C puis analysées comparativement en immunotransfert après migration en PAGE en conditions natives ou en PAGE-SDS.

F - DEGLYCOSYLATION
1) Oxvdation à l'acide nerlodiaue
Le protocole de WOODWARD et COLL. (J. IMM.

METH. 78:143-153, 1985) a été utilisé ; ce protocole permet l'oxydation periodique d'un échantillon préalablement transféré sur une membrane de nitrocellulose, l'oxydation periodique pouvant être suivie d'une immunodétection.

Un extrait d'épithélium d'oesophage de rat est transféré après migration en PAGE-SDS. La membrane de nitrocellulose est découpée en plusieurs pistes qui sont soumises à une oxydation periodique (incubation en tampon acétate de sodium 50 mM pH 4,4, periodate de sodium 20 mM, pendant 1 heure à l'obscurité et à température ambiante) suivie d'une réduction au borohydrure de sodium (NaBH4) 50 mM en PBS pH 7,4 pendant 30 minutes à température ambiante). Des échantillons témoins ne subissant aucun traitement chimique ou subissant uniquement la réduction ont été inclus. L'ensemble des échantillons est ensuite immunodétecté.

2) Traitement car l'acide
trifluorométhanesulfoniaue (TFMS)
L'utilisation du TFMS, selon la méthode de
EDGE et Coll. (ANAL. BIOCHEM. 118:131-137, 1981), permet une déglycosylation quasi-totale des glycoprotéines tout en conservant leur axe peptidique. Cette méthode a été appliquée à une glycoprotéine témoin, la fétuine bovine, et à des extraits d'épithélium d'oesophage de rat contenant l'antigène. Les extraits sont dialysés contre de l'eau puis lyophilisés. Leur traitement est réalisé par addition d'un mélange (66/33-V/V) de TFMS et d'anisole (agent protecteur de l'axe peptidique) et incubation sous agitation après saturation en azote de l'atmosphère des tubes.Le protocole de référence a été optimisé en faisant varier différents paramètres - proportion de mélange TFMS/anisole par rapport à la
masse de protéines traitée : 33 à 266 111 de mélange par
mg de protéine totale de l'extrait oesophagien.

- température : 0 C, 4 C ou température ambiante.

- Durée de l'incubation : 1, 3 ou 24 heures.

Dans tous les cas, après incubation, l'arrêt de la réaction est effectué par addition de 2 volumes d'éther glacial et de 3 volumes d'un mélange pyridine/eau (50/50-V/V). Le précipité de trifluorométhanesulfonate de pyridinium, soluble dans la phase éthérée, a été éliminé avec elle. Après une nouvelle extraction par l'éther glacial, la phase aqueuse a été dialysée contre de l'eau.

Les échantillons ont ensuite été lyophylisés, séparés par
PAGE, transférés, puis immunodétectés.-
3) Traitement car la Peptide N-alvcosidase F
(PNGase F)
La PNGase F, également commercialisée sous le nom de Glycopeptidase F ou de N-Glycanase, hydrolyse la liaison amide existant entre le résidu asparaginyl d'une glycoprotéine et le N,N'-diacétyl-chitobiose de la structure commune à tous les oligosaccharides N-liés.

La fétuine contient trois chaînes oligosaccharidiques N-liées dont l'élimination par la PNGase F entraîne une diminution de masse molaire facilement visualisable en PAGE-SDS (S. HIRANI et al., ANAL. BIOCHEM.

162:485-492, 1987).

La fétuine bovine (2 mg/ml) et un extrait lyophilisé d'épithélium oesophagien de rat t8 mg/ml de protéine) sont dénaturés pendant 5 mn à 90'C avec du SDS à 2% et du 2-ME 0,05 M. Puis les protéines sont placées dans un milieu réactionnel de composition suivante - NP40 1,25% (protection de L'enzyme vis-à
vis de l'action dénaturante du SDS), - phosphate de potassium 166 mM pH 8 (conservation du pH
optimal de l'enzyme), - 1,10-orthophénantroline 10 mM (inhibiteur de protéases)
solubilisé dans du méthanol à la concentration finale
de 10%, - PNGase F 0,3 U/R1.

Dans ce milieu réactionnel, les concentrations finales respectives du SDS et du 2-ME sont de 0,166 % et 16 mM. L'incubation est de 24 heures à 37 C.

Des témoins "fétuine" et "extrait antigénique" incubés sans enzyme sont inclus dans le protocole. Après hydrolyse et concentration par précipitation au TCA, les échantillons sont séparés pa-r PAGE, transférés et immunodétectés.

G - REACTIVITE AVEC DIFFERENTES LECTINES
Les Inventeurs ont cherché à confirmer la nature glycoprotéique de l'antigène en détectant spécifiquement certains sucres par des lectines couplées à la peroxydase. Deux lectines végétales : la lectine de germe de blé (WGA) et la concanavaline A (ConA) ont été choisies pour leur spécificité différente (I.J. GOLSTEIN et
R.D. PORETZ, The Lectins : properties, functions and applications in biology and medicine) - la WGA reconnaît des résidus de (D-N acétylglucosamine
avec les affinités croissantes suivantes
(1) GlcNAc < < GlcNAcssl-4GlcNAc < GlcNAcS1-4 GlcNAcgl-4GlcNAc
et se fixe également avec une moindre affinité sur les
résidus d'acide sialique.

- La Con A s'associe aux sucres suivants, classés par
affinité croissante
(2) aGlcNAc < aGlc < oMan < Manal-2Man < ManaL-2Manal-2Man les protéines de deux extraits antigéniques, bruts ou purifiés, sont transférées sur nitrocellulose après migration en PAGE monodimensionnelle ou IEF/PAGE-SDS. Les bandes de nitrocellulose ont été incubées avec la Con A et la WGA couplées à la peroxydase aux concentrations minimales respectives de 20 et 15 g/ml (J.C.S. CLEGG,
ANAL. BIOCHEM 127:389-394, 1982 et W.F. GLASS et al.,
ANAL.BIOCHEM. 115:219-224, .1981). L'incubation est réalisée dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 200 mM, CaC12 lmM, MnCl2 1 mM et Tween 0,1% pendant 1 heure à 37 C et 1 nuit à 4 C. Celle-ci est précédée et suivie d'étapes de lavages dans le même tampon. Différents agents de saturation supplémentaires comme la gélatine ou la sérum-albumine bovine oxydée par un traitement à l'acide periodique ne permettent pas d'amplifier la réponse obtenue lors de l'utilisation du seul Tween.

Après le dernier lavage, l'association lectine-antigène est révélée par mise en évidence de l'activité peroxydasique par H202 et 4-chloro-1-naphtol comme lors des immunodétections.

II - CARACTERISATION PHYSICOCHIMIQUE DE L'ANTIGENE
La caractérisation physico-chimique de l'antigène a été effectuée à partir d'extraits bruts d'épithélium d'oesophage de rat, puis à partir de fractions antigéniques purifiées. Dans les deux cas, après séparation électrophorétique, les protéines ont été transférées puis immunodétectées par des sérums de patients atteints de PR.

A - MASSE MOLAIRE
La figure 1 représente l'analyse en immunotransfert d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat séparé par PAGE-SDS. L'extrait brut est concentré dix fois par précipitation au TCA à 10%, repris en tampon de
Laemmli, séparé par PAGE-SDS (7,5%), transféré sur nitrocellulose et immmunodétecté avec des sérums de PR GIFOR + (pistes 1-12) et GIFOR - (pistes 13,14) dilués au 1/100 "T0,, représente un témoin négatif incubé avec l'anticorps secondaire seul et "PM" représente des marqueurs de poids moléculaire. L'antigène se présente sous la forme d'une bande immunoréactive étroite correspondant à une protéine de masse molaire moyenne d'environ 210 kD et d'une zone immunoréactive large et étalée correspondant à une protéine de masse molaire moyenne comprise entre 90 et 130 kD.

B - POINTS ISOELECTRIQUES
L'extrait brut est concentré cinq fois par précipitation au TCA à 10%, repris dans l'eau, séparé par
IEF (pHi 3,5 à 9,5), transféré puis immunodétecté avec des sérums de patients atteints de PR, GIFOR + et
GIFOR -. Les molécules antigéniques présentent une dis tribution très hétérogène, les protéines de l'extrait brut reconnues spécifiquement par la plupart des sérums
GIFOR + se répartissent en un faisceau de bandes fines dont les points isoélectriques varient de 5,2 à 7,5.

C - CARACTERISTIQUE DE MIGRATION EN CONDITIONS
NATIVES
La figure 2 représente l'immunotransfert d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat repris en milieu acide et séparé par PAGE en conditions natives. L'extrait brut concentré dix fois par précipitation au TCA à 10%, est repris dans l'eau (pH inférieur à 4), séparé par PAGE en conditions natives (8-25*), transféré puis immunodétecté avec des sérums de PR GIFOR + (pistes 1-4) dilués au 1/100 ; "Tg" représente un témoin négatif incubé avec l'anticorps secondaire seul.Dans ces conditions de reprise de l'échantillon à pH acide, l'immunotransfert effectué avec quatre sérums de patients atteints de PR fait apparaître trois zones immunoréactives correspondant respectivement à des protéines migrant comme des témoins de poids moléculaire 440 kD, 232 kD et entre des témoins de 140 kD et 67 kD, lesquelles sont reconnues avec une affinité variable selon les sérums.

D - ELECTROPHORESE BIDIMENSIONNELLE
IEF/PAGE-SDS
Cette technique qui combine IEF dans la première dimension et PAGE-SDS dans la deuxième permet de déterminer simultanément les points isoélectriques et les masses molaires des diverses molécules antigéniques, de confirmer leur grande hétérogénéité de charge et de montrer leur grande hétérogénéité de masse.

La figure 3 représente l'immunotransfert d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat séparé par électrophorèse bidimensionnelle (IEF/PAGE-SDS). L'extrait brut concentré 20 fois par précipitation à l'éthanol puis repris dans l'eau, est séparé par IEF (pHi 5 à 8) puis par PAGE-SDS (7,5%), transféré puis immunodétecté avec deux sérums de patients atteints de PR GIFOR + (1,2) dilués au 1/100. La zone immunoréactive de 90 à 130 kD présente des pHi variant de 5,85 à 7,35, ceux de la bande de 210 kD varient de 5,85 à 6,85. Une troisième population immunoréactive, en forme de "virgule" migre de 120 à 67 kD tandis que ces pHi se répartissent de manière continue entre 5 et 7,5.Les molécules antigéniques de masse molaire inférieures à 90 kD, clairement détectées après électrophorèse bidimensionnelle, n'apparaissent en électrophorèse monodimensionnelle qu'avec des sérums de titre élevé, sous la forme d'une extension de l'immunoréactivité vers les zones de faible poids moléculaire. La plus grande quantité d'antigène déposée en
IEF/PAGE-SDS, permettant une meilleure sensibilité d'immunodétection, explique cette apparente discordance.

E - (IARACTERISTIQWS DE SEPARATION C HROMAT OGRAPH I QUE
La figure 4 représente la séparation en chromatographie d'interaction hydrophobe d'une solution antigénique prépurifiée d'un extrait brut par chromatographie de gel filtration sur superose 12 (profil d'élution suivi par mesure de l'absorbance à 280 nm). Des fractions immunoréactives ainsi prépurifiées sont séparées sur
Phényl-Superose (Tracé 2 = Tampon d'équilibre : phosphate 50 mM, (NH4)2So4 1,7 M, ~~ pH 7 ; Tampon d'élution phosphate 50 mM, pH 7 ; volume injecté : 3,6 ml ; Débit 0,5 ml/mn ; DO 280 nm pleine échelle (Tracé 1) : 0,05.

Les profils d'élution et l'étude par immunotransfert des différentes fractions antigéniques se sont avérés très reproductibles au cours de multiples purifications. La répartition des molécules antigéniques dans les différentes fractions a donc pu être modelisée.

La figure 5 représente la modélisation des profils d'immunoréactivité des fractions antigéniques purifiées par chromatographie séquentielle gel filtration/interaction hydrophobe, obtenue après PAGE-SDS (1) ou PAGE en conditions natives (2). Les différences d'intensité des bandes ou zones immunoréactives reflètent la richesse relative en protéines antigéniques de chaque fraction (A-H).

En électrophorèse dénaturante, la bande à 210 kD (fractions F, G et H), la large bande mal limitée de 90 à 130 kD (fractions D, E, F, G et H) et une bande de 67 à 90 kD (fractions C, D et E) ont été visualisées.

En électrophorèse en conditions natives, la bande fine à 440 kD (fractions F, G et H), la bande à 232 kD (fractions C, D, E, F, G et H) et la large bande entre les témoins de 140 kD et 67 kD (fractions B, C, D et E) ont été retrouvées.

La comparaison des molécules antigéniques analysées en PAGE-SDS dans les différentes fractions purifiées (Figure 5) et des molécules identifiées après électrophorèse bidimensionnelle (IEF/PAGE-SDS) dans un extrait brut, comme indiqué à la figure 3, renseigne sur leur hydrophobicité respective
- La bande à 210 kD dont les pHi varient de 5,85 à 6,85, est retrouvée dans les fractions obtenues en fin d'élution (fractions F, G et H), elle est donc très hydrophobe.

- La zone diffuse de 90 à 130 kd, dont les pHi se situent de 5,85 à 7,35, présente le même profil d'élution que la bande à 210 kD (fractions E, F, G et H) et donc la même hydrophobicité.

- Par contre, la population en forme de "vir gaulez qui présente des pHi plus étalés de 5 à 7,5, est retrouvée majoritairement en. début d'élution (fractions
B, C, D et E) et présente donc un caractère moins hydrophobe que les deux molécules précédentes.

III - CARACTERISATION BIOCHIMICUE DE L'ANTIGENE
A - LES MOLéCULES ANTIGENIQUES SONT DE NATURE PROTéIQUE
La figure 6 représente l'analyse en immunotransfert des protéines d'un extrait antigénique digéré (b) ou non (a) par la protéinase K, séparé par PAGE en conditions natives (8-25%), transféré puis immunodétecté avec trois sérums de patients atteints de PR GIFOR + (pistes 1-3) et un sérum de patient atteint de PR GIFOR (piste 4) ; Tg représente un témoin négatif incubé avec l'anticorps secondaire seul.

Les colorations au Rouge Ponceau des bandes de nitrocellulose correspondant aux échantillons traités montrent la digestion totale des protéines de l'extrait.

L'immunodétection après PAGE en conditions natives montre que l'immunoréactivité spécifique des sérums GIFOR + disparaît lorsque l'échantillon est préalablement digéré par la protéinase K. L'immunodétection après transfert des échantillons séparés en PAGE-SDS a confirmé ce résultat.

La nature protéique des molécules porteuses de l'antigénicité étant affirmée, les Inventeurs ont entrepris de déterminer s'il s'agissait d'homo- ou d'hétéroprotéines, quelles associations et/ou substitutions de l'antigène étaient susceptibles de rendre compte de la diversité de points isoélectrique et de masse molaire apparente et quelle était la nature biochimique du ou des épitopes reconnus.

B - LES PROTEINES ANTIGENIQUES NE SONT PAS
ASSOCIEES A DES ACIDES NUCLéIQUES
L'association éventuelle de l'antigène avec des acides nucléiques a été étudiée. La figure 7 représente en (1) l'analyse d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat traité (b) ou non (a) par la nucléase de microccoque puis analysé par électrophorèse en gel d'agarose 1% suivie d'une coloration au bromure d'éthidium, "M" représente un marqueur de taille en kilopaires de bases.

Après séparation des échantillons par électrophorèse en gel d'agarose --1%, l'absence d'acides nucléiques dans l'échantillon traité prouve l'efficacité de la digestion enzymatique.

La figure 7 représente en (2) l'analyse par immunotransfert après PAGE en conditions natives (8-25%), réalisée avec trois sérums de patients atteints de PR
GIFOR + (pistes 1-3) et un sérum de PR GIFOR - (piste 4) ; Tg représente un témoin négatif incubé avec l'anticorps secondaire seul.

L'immunodétection après PAGE en conditions natives montre l'insensibilité des protéines antigéniques au traitement par la nucléase tant du point de vue de leur immunoréactivité avec les sérums de patients de PR que de celui de leur masse molaire apparente, prouvant qu'elles ne sont pas associées à des acides nucléiques.

C - LES PROTEINES ANTIGENIQUES SONT-ELLES DES
GLYCOPROTEINES ?
Les glycoprotéines présentent souvent une forte hétérogénéité de points isoélectriques et un taux inconstant de fixation du SDS qui rend médiocre leur résolution en PAGE-SDS. Les protéines antigéniques présentant également ces caractéristiques, les Inventeurs ont cherché leur éventuelle substitution par des résidus glucidiques. Dans ce but, des techniques visant soit à altérer les molécules de sucres éventuellement portées par l'axe peptidique, soit à débarrasser la partie protéique de ses résidus glycaniques, ont été utilisées.

1) Destruction d'éventuels énitotes
alucidipues car l'acide neriodicue
La figure 8 représente l'immunodétection d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat qui, après séparation par PAGE-SDS (7,5%) et transfert a été - incubé pendant lh30 en tampon PBS (témoin)
"incubation" : piste a), - incubé pendant 1h en tampon acétate de sodium, puis ré
duit pendant 30 minutes au borohydrure de sodium
témoin "réduction" : piste b), - oxydé par l'acide periodique en tampon acétate de so
dium pendant 1h puis réduit pendant 30 minutes au boro
hydrure de sodium ("essai" = piste c),
trois sérums de PR GIFOR + (pistes 1-3), deux sérums de
PR GIFOR - (pistes 4, 5) et deux sérums de contrôle
(pistes 6, 7) ont été utilisés ; NTo représente un
témoin négatif incubé avec l'anticorps secondaire seul.

Le traitement par l'acide periodique n'a en rien modifié les protéines spécifiquement reconnues par les sérums de patients atteints de PR. Trois interprétations de ce résultat sont possibles - les protéines antigéniques sont des glycoprotéines mais
les sucres sensibles à une oxydation periodique
qu'elles portent ne sont pas impliqués dans le ou les
épitopes majoritairement reconnus par les autoanticorps
spécifiques de la PR.

- les protéines antigéniques sont des glycoprotéines mais
les sucres qu'elles portent de par leur nature et/ou
leur type d'enchaînement sont insensibles à une oxyda
tion periodique (l'acide periodique clive la liaison
entre deux carbones vicinaux portant initialement soit
chacun une fonction alcool, soit l'un une fonction
alcool et l'autre une fonction acide ou cétone ou amine
primaire ou secondaire).

- les protéines antigéniques ne sont pas des
glycoprotéines.

Afin de trancher entre ces trois possibilités, les Inventeurs ont utilisé une méthode de déglycosylation totale puis cherché des modifications de la masse ou de l'immunoréactivité des protéines antigéniques.

2) Déalvcosvlatlon
Deux types principaux de lien permettent l'association d'un oligosaccharide à un axe peptidique la liaison O-glycosidique qui permet l'association d'un oligosaccharide à un résidu Sérine ou Thréonine (et rarement hydroxylysine) par l'intermédiaire d'une galactosamine N-acétylée et la liaison N-glycosidique qui rattache un oligosaccharide à un résidu asparagine par l'intermédiaire d'une glucosamine N-acétylée.

Pour déglycosyler les glycoprotéines, deux types de traitement peuvent être appliqués - des traitements aspécifiques permettant d'éliminer tous
les types de radicaux glucidiques, qu'ils soient liés à
la protéine par une liaison N- ou une liaison
O-glycosidique. C'est le cas par exemple du traitement
chimique par l'acide trifluorométhanesulfonique (TFMS); - des traitements spécifiques de l'un ou l'autre de ces
types de liaison. C'est le cas de la i-élimination par
la soude pour les liaisons O-glycosidiques et d'un cer
tain nombre d'hydrolyses enzymatiques plus ou moins
spécifiques de la nature chimique du sucre N-lié pour
les liaisons N-glycosidiques.

a) Traitement asDécifique Dar le TFMS
L'analyse par immunotransfert après PAGE-SDS (7,5e) d'un extrait antigénique traité par le TFMS et d'un extrait incubé dans l'eau montre que les protéines antigéniques présentent une légère diminution de masse molaire apparente par rapport à l'échantillon témoin.

Bien que faible cette différence d'environ 10 à 20 kD est observée pour toutes les conditions de traitement et retrouvée dans deux expériences distinctes. L'analyse en immunotransfert après IEF des protéines d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat traité par le TFMS montre que l'immunoréactivité spécifique des sérums de patients atteints de PR sur les échantillons témoins s'étale dans une zone de pHi d'environ 5,2 à 7,5. Après traitement par le TFMS, les protéines immunodétectées par les sérums de patients atteints de PR ont présenté des pHi plus basiques compris entre 6 et 8.

Ce changement de pHi et de masse molaire apparente des protéines antigéniques est en faveur d'une substitution glycanique des molécules. Cependant la persistance d'une mauvaise définition en PAGE-SDS et d'une large gamme de pHi en IEF suggère que les protéines antigéniques pourraient être substituées aussi par d'autres radicaux non glucidiques et/ou que les effets observés pourraient être dus au clivage d'une liaison peptidique particulièrement fragile.

Toutefois, la conservation de l'immunoréactivité après traitement par le TFMS est un argument fort en faveur de la nature non glucidique du ou des épitopes reconnus par les autoanticorps spécifiques de la PR.

b) Traitement spécifique car la PNGase F
Afin de confirmer les résultats obtenus avec le TFMS, les Inventeurs ont entrepris des expériences de déglycosylation par l'enzyme PNGase F qui élimine spécifiquement les sucres N-liés.

La déglycosylation par la PGNase F a été effectuée sur un extrait antigénique brut après dialyse contre de l'eau et lyophilisation. L'analyse de cet extrait par immunodétection en PAGE-SDS et transfert ne fait apparaître aucune différence entre l'antigène témoin et l'antigène traité par la PNGase F. Deux interprétations de ce résultat sont possibles - l'antigène n'est pas substitué par des
N-oligosaccharides, - les oligosaccharides branchés à des résidus asparagine
de la protéine ont une structure chimique originale qui
les empêche d'être clivés par la PNGase F.

Cependant, une seule analyse monodimensionnelle ne permet pas d'affirmer clairement l'insensibilité à la PNGase F des protéines antigéniques puisque celles ci se superposent partiellement, comme le montre l'analyse en électrophorèse bidimensionnelle.

3) Détection des sucres tar des lectines
La réactivité éventuelle de l'antigène avec la lectine de germe de blé (WGA.) ou la concanavaline A (ConA) a été testée par "affinodétection" sur nitrocellulose et comparée aux profils d'immunodétection spécifiques des sérums de PR.

Les protéines de l'extrait antigénique brut d'oesophage de rat, reconnues après PAGE-SDS ou PAGE en conditions natives, par un sérum de patient atteint de
PR, ont été différentes des protéines reconnues par les lectines. Cependant, des zones communes de réactivité, en particulier au niveau de la protéine de 210 kD en
PAGE-SDS, suggère que la WGA et la ConA reconnaissent une partie de l'antigène. Des fractions antigéniques purifiées par chromatographie de gel filtration ont été analysées dans les mêmes conditions. Cette expérience a confirmé que des glycoprotéines de même poids moléculaire que certaines protéines antigéniques étaient reconnues par la ConA et que le profil de réactivité de la WGA semblait se rapprocher de celui d'un sérum de patient atteint de PR.

L'affinité des lectines vis-à-vis des protéines antigéniques d'oesophage de rat a été confirmée par analyse après IEF/PAGE-SDS de l'extrait antigénique brut.

La figure 9 représente la détection des protéines d'un extrait antigénique brut, après électrophorèse bidimensionnelle (IEF, point isoélectrique 5 à 8/PAGE-SDS 7,5%) et transfert sur nitrocellulose, avec - en (1) : un sérum de patient atteint de PR, GIFOR -, - en (2,3) : des sérums de patient atteint de PR,
GIFOR +, - en (4) : la ConA, - en (5) : la WGA, afin d'amplifier la réactivité, trois dépôts d'extrait antigénique ont été effectués sur le gel d'IEF. Une fraction de l'antigène (bande à 210 kD et zone immunoréactive entre 90 et 130 kD) déposée côté anode y a précipité, produisant une réactivité artéfactuelle dans la zone des pHi acides.

Cette étude a permis de montrer que les molécules reconnues par la ConA étaient différentes de l'antigène, mais que la WGA s'associait spécifiquement aux protéines antigéniques de 90-130 kD et 210 kD. Les protéines immunoréactives en forme de "virgule" s'étalant de 120 kD à 67 kD avec des pHi de 5 à 7,5 ne présentent, par contre, aucune réactivité vis-à-vis de la WGA.

EXEMPTE 2 - CARACTERISATION DE L'ANTIGENE EXTRAIT DE
L'EPIDERME HUMAIN
I - MATERIEL ET METHODE
A - PATIENTS ET SéRUMS
La présente étude a été réalisée à partir de 64 sérums de patients atteints de diverses maladies rhumatologiques parfaitement caractérisées sur les plans clinique et biologique. Parmi ces 64 sérums, 45 proviennent de patients atteints d'une PR définie selon les cri tères de l'"American Rheumatism Association". 32 sérums provenant de sujets sains, hommes et femmes, ont été utilisés à titre de contrôle.

Deux anticorps monoclonaux (AcM), l'un spécifique des cytokératines humaines dénommé F 12-19 (Anticytokeratin Ref. 220-81, Dept. Biosoft CLONATEC), l'autre spécifique de la filaggrine humaine dénommé AKH-1 (Réf.

catalogue BT - 576, Biomedical Technologies Inc.) ont été utilisés.

B - EXTRACTION DES PROTEINES EPIDERMIQUES
Des fragments de peau recueillis après chirurgie plastique mammaire et abdominale ou après circoncision ont été conservés à -80'C. L'épiderme a été séparé mécaniquement du derme, selon la méthode décrite par
Kassis et Sondergaard (ARCH. DERMATOL. RES. 273 301-306, 1982), par un traitement thermique à 4 C puis à 57'C en tampon PBS (KH2/K2H-P04 8,5 mM ; NaCl 150 mM) contenant de 1'EDTA 5 mM et du PMSF 0,5 mM, puis broyé mécaniquement en tampon Tris-HCl 40 mM pH 7,4
NaCl 150 mM ; EDTA 10 mM ; NP40 0,5%, ci-après dénommé tampon A.

Après centrifugation à 12 000 g pendant 15 minutes, le surnageant a été séparé du culot contenant les cytokératines épidermiques.

En outre, d'autres extractions ont été réalisées selon le même protocole mais dans un tampon Tris-HCl 20 mM pH 7,4 ; PMSF 0,5 mM, ci-après dénommé tampon B.

Les différentes fractions ont été conservées à -20'C,
C - ELECTROPHORESES
Les protéines des diverses fractions ont été analysées par IEF à l'équilibre ou avant l'équilibre (NEpHGE), ou par PAGE-SDS ou PAGE en conditions natives.

Des électrophorèses bidimensionnelles ont également été réalisées.

Les protéines ont parfois été précipitées par 4 volumes d'éthanol ou par le TCA à 15% final, afin d'en augmenter la concentration.

D - IMK(7NODETECTION
Les protéines ont été transférées sur membrane de nitrocellulose selon la technique décrite par TOWBIN et al. (PNAS 76 : 4350-4354, 1979). Les sérums ont été utilisés dilués du 1/10 au 1/100 après incubation des bandelettes de nitrocellulose en PBS, Tween-20 0,05%.

L'incubation en présence des sérums a été poursuivie pendant 1 heure à 37 C puis 12 heures à 4 C.

Les anticorps monoclonaux AKH-1 (dilué au 1/100) ou F12-19 (dilué au 1/500) ont été incubés pendant 2 heures à 37 C. Après lavages, les bandelettes de nitro cellulose ont été révélées par des anticorps secondaires, anti-IgG humaines ou murines, marqués à la peroxydase.

E - TRAITEMENTS ENZYMATIQWS
L'extrait épidermique concentré (80 g/ 1) a été traité par la protéinase K (1 mg/ml, 30 minutes, 37 C en présence de SDS 1%) ou par la nucléase de microccoque (100 U/ml, 30 minutes, 37 C dans un tampon
Tris-HCl 30 mM, CaC12 5mM, pH8).

F - IMMUNOPRECIPITATION
L'extrait épidermique préadsorbé sur Protéine
A-Sépharose a été incubé à 37 C pendant 2h en présence de l'anticorps AKH-1 ou F12-19 et de NaCl, 1 M final.

Les complexes anticorps-antigène formés ont été ensuite recueillis par la protéine A-Sépharose puis analysés par immunotransfert après PAGE-SDS.

G - PURIFICATION DES CYTOKERATINES
Les cytokératines uréosolubles ont été purifiées à partir d'épiderme mammaire selon la méthode décrite par T.T SUN et H. GREEN (J. Biol. Chem. 252 2053-2060, 1978).

H - PURIFICATION DE LA FILAGGRINE HUMAINE
La filaggrine a été extraite à partir de peau mammaire selon la technique décrite par LYNLEY et DALE (B.B.A 774 : 28-35, 1983) avec les modifications suivantes : l'extrait épidermique en urée 6M, préparé en absence d'agent réducteur, a été purifié sur chromatographie FPLC avec une résine échangeuse d'anions. Les protéines cationiques non retenues ont été précipitées par 4 volumes d'acétone, redissoutes dans un petit volume de tampon contenant 1,5% de SDS.et 2,58 de 2-ME et déposées au sommet d'un gel préparatif PAGE-SDS de 10 cm de hauteur. Ce gel a ensuite été transféré sur une membrane du type Immobilon-PVDF commercialisée par la Société
MILLIPORE. La zone correspondant à la filaggrine a été repérée par immunodétection avec l'anticorps AKH-1 et découpée ; la filaggrine a alors été éluée par 0,3 ml/cm2 de tampon d'élution (Tris-HCl 50 mM pH 8,8 ; SDS 2%
Triton X-100 18) et concentrée par précipitation.

I - PURIFICATION DE L'ANTIGENE
20 cm2 d'épiderme mammaire ont été broyés au potter électrique dans le tampon A. L'homogénat a été centrifugé pendant 15 minutes à 10 000 g et le surnageant précipité par le TCA (15% final). Le précipité a été resolubilisé dans un petit volume de Tris-HCl 30 mM pH8, CaC12 5mM ; la fraction soluble a été clarifiée par centrifugation, additionnée de SDS 1,5% et 2ME 2,5* et déposée au sommet d'un gel préparatif SDS de 10 cm de hauteur. L'antigène a alors été purifié, par élution, comme décrit ci-dessus pour la filaggrine, la zone correspondant à l'antigène étant repérée par immunodétection avec un sérum de PR.

II
A - CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE ET
BIOCHIMIQUE DE L'ANTIGèNE
Afin de caractériser l'antigène reconnu par les sérums de PR, un extrait épidermique mammaire a été préparé par homogénéisation d'épiderme mammaire dans le tampon A, en présence d'un détergent non ionique (NP40).

Cet extrait soluble a été analysé par immunodétection après PAGE et transfert des protéines sur nitrocellulose.

La figure 10 représente l'analyse en immunotransfert de l'extrait NP40 précédent avec des sérums de
PR et des sérums de contrôle. L'extrait NP40 (8 mg/ml) a été précipité par TCA, repris en tampon Tris-CaC12 en le concentrant 7 fois puis analysé par immunotransfert après
PAGE-SDS (gradient 8-25%). Les sérums ont été dilués au 1/10 en PBS-Tween 20 à 0,05%.Les sérums 1 et 3 proviennent de patients atteints de myélome malin, le sérum 2 provient d'un patient atteint de maladie de SHARP, le sérum 4 provient d'un patient atteint d'arthrose, le sérum 5 provient d'un patient atteint de polymyosite, le sérum 6 provient d'un patient atteint de maladie de
PAGET, les sérums 7 à 21 proviennent de patients atteints de PR et les sérums 22 à 38 proviennent de sujets sains "T0Z est un témoin négatif incubé seulement avec l'anticorps anti-Ig humaines, marqué.

La plupart des sérums de patients atteints de
PR (808) ont reconnu une protéine présentant en PAGE-SDS un poids moléculaire d'environ 40 kD. Sa migration n'a pas été modifiée par l'omission de l'agent réducteur (2
ME) dans le tampon d'échantillon, ce qui indique que cette molécule ne contient probablement pas de pont disulfure. Au contraire, 89% des sérums de patients atteints d'une maladie rhumatologique non-rhumatolde et aucun des sérums de contrôle n'ont reconnu cet antigène.

Une protéine de 68 kD a été détectée non spécifiquement par une large proportion de sérums appartenant à tous les groupes testés et donc vraisemblablement par des autoanticorps naturels.

La figure 11 représente l'analyse en immunotransfert de l'extrait antigénique NP40 précédent, traité ou non par une nucléase (1) ou une protéase (2). En (1), l'extrait NP40 d'épiderme mammaire a été précipité par le
TCA, repris en tampon Tris-CaC12 puis traité avec (+) ou sans (-) nucléase microccocale (100 U/ml) pendant 30 minutes à 37 C. En (2), un extrait NP40 d'épiderme humain identique au précédent a été précipité par le TCA puis repris dans le SDS 1% et traité sans (-) ou avec (+) 10 mg/ml de protéinase K pendant 30 minutes à 37 C. Dans tous les cas, les protéines ont été séparées en PAGE-SDS (8-25e), transférées puis immunodétectées avec des sérums de contrôle (a) et des sérums de patients atteints de PR (b) dilués au 1/100.La disparition de la région immunoréactive après un traitement de l'extrait par la protéinase K confirme la nature protéique de la molécule porteuse du ou des épitopes reconnus par les autoanticorps, alors que cette région n'a pas été modifiée après une digestion des acides nucléiques par la nucléase de Microcoque.

La figure 12 représente l'analyse de l'antigène par électrophorèse en - conditions natives ; cette analyse a consisté à précipiter l'extrait NP40 d'épiderme humain par 1'méthanol, puis à effectuer une immunodétection après PAGE en conditions natives (8-25*) et transfert sur nitrocellulose avec des sérums de patients atteints de PR (pistes 1-4 et 8-9) et de sérums témoins (pistes 5-7), dilués au 1/100. L'antigène humain se sépare en plusieurs protéines antigéniques dont la migration est similaire à celle de témoins dont les poids moléculaires sont compris entre 80 et 400 kD, les protéines les plus immunoréactives se situant dans les zones comprises entre 80 et 120 kD.

La figure 13 représente l'analyse de l'antigène par IEF. Les protéines de l'extrait NP40 d'épiderme mammaire ont été précipitées par 1'méthanol, séparées par
IEF (pHi 3 à 9), transférées sur nitrocellulose puis immunodétectées avec des sérums de patients atteints de
PR (pistes 5-12) et des sérums témoins (pistes 1-4) dilués au 1/100. L'antigène humain présente une distribution très hétérogène de pHi, ceux-ci variant de 5,8 à 7,4. Cette hétérogénéité de pHi a été vérifiée en électrophorèse bidimensionnelle < IEF/PAGE-SDS). La protéine reconnue spécifiquement par les sérums de patient atteints de PR, après transfert d'un tel gel, montre une image caractéristique en forme de "virgule", le poids moléculaire apparent diminuant au fur et à mesure que le pHi devient plus basique.

La figure 14 représente l'analyse de l'antigène en gel bidimensionnel IEF/PAGE-SDS ; les protéines de l'extrait NP40 d'épiderme mammaire ont été précipitées par l'éthanol, séparées par IEF (pHi 5 à 8) suivie de
PAGE-SDS (12,5*), transférées sur nitrocellulose et immunodétectées par un sérum de patient atteint de PR et un sérum de contrôle.

L'hétérogénéité marquée de l'antigène, aussi bien en masse qu'en pHi, indique probablement la présence d'isoformes modifiées ; elle suggère qu'il pourrait être glycosylé et/ou phosphorylé. Cependant un traitement par la peptide N-glycosidase-F n'a modifié ni sa migration ni son immunoréactivité après PAGE-SDS.

B - HYDROSOLUEILITE DE L'ANTIGENE
5 cm2 d'épiderme mammaire ont été broyés mécaniquement dans le tampon A ou dans le tampon B. Les homogénats ont ensuite été centrifugés 10 minutes à 10 000 g et une quantité égale des protéines solubles des deux surnageants a été précipitée par l'éthanol puis séparée par PAGE en conditions natives (8-25%), transférée sur nitrocellulose puis immunodétectée avec des sérums de patients atteints de PR et des sérums de contrôle. Cette étude indique que l'antigène est extrait non seulement en présence d'un détergent (tampon A) mais également en son absence (tampon B). En outre, l'antigène est toujours retrouvé majoritairement dans les fractions solubles et présents dans les culots en très faible quantité. Ces résultats indiquent que l'antigène humain, comme celui d'oesophage de rat, est une molécule très hydrosoluble.

C - EXPRESSION DE L'ANTIGENE DANS DIFFERENTS
TERRITOIRES ANATOMIQUES EPIDERMIQUES
L'analyse par immunotransfert des protéines d'un extrait NP40 d'épiderme abdominal et d'épiderme préputial indique que l'antigène associé à la PR est présent dans l'épiderme humain indépendamment du sexe et du territoire anatomique (sein, abdomen ou prépuce), ainsi que de l'âge (enfants et adultes). L'antigène étant histologiquement localisé dans le Stratum corneum, il est légitime de penser que son abondance dépendra de l'épaisseur de celui-ci qui varie suivant le territoire anatomique.

D - IDENTIFICATION DE L'ANTIGèNE
L'antigène reconnu par les sérums de malades atteints de PR n'est pas une cytokératine épidermique humaine.

La figure 15 représente - en (a) : un extrait NP40 d'épiderme mammaire immuno
détecté, après PAGE-SDS (8-25%) et transfert sur nitro
cellulose, avec un sérum de patient atteint de PR, pré
incubé d'une part avec le tampon d'extraction (piste
1), avec l'extrait lui-même (piste 2) et avec une frac
tion insoluble enrichie en cytokératines épidermiques
(piste 3).

- en (b) : les cytokératines uréosolubles immuno
détectées, après PAGE-SDS (8-25*) et transfert, avec
l'AcM anti-cytokératines F12-19 préincubé soit avec le
tampon d'extraction (piste 1), soit avec l'extrait épi
dermique (piste 2), soit avec une fraction enrichie en
cytokératines (piste 3), soit avec les cytokératines
uréosolubles (piste 4).

- en (c) : les protéines de l'extrait d'épiderme (piste
5), de la fraction enrichie en cytokératines (piste 6)
et les cytokératines uréosolubles pures (piste 7) sépa
rées par PAGE-SDS (8-25%), transférées et immuno
détectées avec 1'AcM anti-cytokératines F12-19.

L'immunoréactivité des sérums de patients atteints de PR n'a pas été inhibée par une préincubation de ceux-ci sur des cytokératines épidermiques (enrichies ou purifiées) alors qu'elle a disparu en présence d'extrait hydrosoluble de peau. De même, l'anticorps monoclonal F12-19 n'a reconnu en immunotransfert, aucune protéine de l'extrait antigénique.

La forme caractéristique en virgule de l'antigène en gel bïdimensionnel et son poids moléculaire apparent en PAGE-SDS sont voisins de ceux de la filaggrine, protéine qui apparaît dans le Stratum granulosum au cours de la différenciation épidermique (SARRET et al., Path.

Biol. 37:297-303, 1989). Les Inventeurs ont donc cherché à déterminer si la filaggrine et l'antigène de l'invention étaient identiques et si les sérums de malades atteints de PR contenaient des autoanticorps anti-filaggrine.

La figure 16 représente l'analyse d'un immunotransfert des protéines d'un extrait d'épiderme mammaire séparées en (A) par PAGE-SDS (12,5*), en (B) par PAGE en conditions natives et en (C) par IEF (pHi 3 à 9), puis transférées sur nitrocellulose et immunodétectées par des sérums de patients atteints de PR (pistes 1, 3, 6, 7 et 8), l'AcM anti-filaggrine AKH-1 (piste 2), un AcM de contrôle (piste 4) et un sérum de contrôle (piste 5). Ces protéines ont été séparées en triplica (D) par NEpHGE suivi de PAGE-SDS (8-25%) puis transférées sur nitrocellulose et colorées au Rouge Ponceau (a) ou immunodétectées par l'anticorps monoclonal AKH-1 (b), et par un sérum de patient atteint de PR (c). L'antigène est reconnaissable à sa forme caractéristique en *virgule".

L'anticorps monoclonal anti-filaggrine humaine
AKH-1 reconnaît spécifiquement en immunotransfert une protéine épidermique humaine soluble en présence de NP40, présentant les mêmes caractéristiques de migration en conditions d'électrophorèse dénaturante ou native que l'antigène de la PR. Après IEF et gel bidimensionnel, l'antigène et la protéine reconnus en immunotransfert par
AKH-1 présentent une image identique.

Les Inventeurs ont alors cherché à déterminer si l'anticorps monoclonal AKH-1 pouvait immunoprécipiter l'antigène à partir de l'extrait épidermique en NP40.

La figure 17 présente l'analyse comparative des protéines d'un extrait épidermique NP40, préadsorbé sur protéine A-Sépharose, les protéines étant séparées par PAGE-SDS (12,5*) avant immunoprécipitation avec l'AcM AKH-1 (représentées par "Totale" à la figure 17) ou
après immunoprécipitation avec 1'AcM AKH-1 (représentées par "IP AKH-1" à la figure 17), ou avec l'AcM de contrôle
G36 (représentées par "IP G36" à la figure 17). Après transfert sur nitrocellulose, ces protéines ont été immunodétectées avec les anticorps AKH-1, G36, un sérum de patient atteint de PR (PR), un sérum de contrôle (CO) ou avec les seuls anticorps secondaires anti-Ig de souris (Tg S) et anti-Ig humaines (Tg h).Les protéines présentes dans les surnageants des fractions immunoprécipitées avec G36 (représentées par Surin G36" à la figure 17) et AKH-1 (représentées par Surn AKH-1" à la figure 17) ont été analysées de la même façon après précipitation par le TCA.

Ces résultats montrent que AKH-1 a effectivement immunoprécipité une protéine épidermique de même poids moléculaire que l'antigène de la PR, cette molécule étant d'ailleurs reconnue spécifiquement en immunotransfert par les sérums de patients atteints de PR.

Cette iltirnunoprécipitation a été réalisée en présence de
NaCl 1 M, ce qui rend peu probable une co-immunoprécipitation dûe à une association entre les deux protéines (filaggrine et antigène). Afin de vérifier que les protéines de l'extrait reconnu par AKH-1 et par les sérums de patient atteint de PR étaient les mêmes, les surnageants d'une immunoprécipitation par l'AcM antifilaggrine ont été subséquemment analysés par immunotransfert avec un sérum de patients atteints de PR. La figure 17 montre que l'extrait a été épuisé (partiellement ou totalement) en antigène et en filaggrine par l'AcM anti-filaggrine. A l'inverse, les sérums de patients atteints de PR. n'ont pas immunoprécipité l'antigène.Ce résultat négatif peut être dû à une faible affinité des autoanticorps pour l'antigène, à une trop faible quantité d'autoanticorps dans le sérum ou à une non reconnaissance par ceux-ci de l'antigène sous sa forme native. Cette dernière hypothèse est peu probable puisque l'antigène est immunodétectable sur nitrocellulose après électrophorèse en conditions natives.

Afin de confirmer que la filaggrine et l'antigène de la PR ont au moins en commun l'épitope détecté par l'AcM AKH-1, l'antigène a été purifié par élution à partir d'une membrane de transfert. La figure 18 représente l'analyse par PAGE-SDS et immunotransfert des protéines des diverses fractions au cours de la purification. Les protéines totales d'un extrait d'épiderme humain (piste 1), les protéines solubles après précipitation de l'extrait par le TCA (piste 2) et celles de la fraction antigénique purifiée finale (piste 3) ont été séparées par PAGE-SDS (12,5%), transférées sur nitrocellulose et colorées à l'amido-black- (Amido) ou immunodétectées avec un sérum de patient atteint de PR (PR), un sérum de contrôle (CO), un AcM anti-filaggrine (AKH-1) et un AcM de contrôle (G36).

Les protéines majeures, solubles après précipitation au TCA, apparaissent sous la forme d'un doublet de poids moléculaire (PM) apparent d'environ 40 kD. Ce doublet est la principale bande immunoréactive reconnue par un sérum de patient atteint de PR. Cette protéine a alors été purifiée à partir d'un gel PAGE-SDS préparatif par transfert puis élution. L'antigène de la PR a été spécifiquement immunodétecté après PAGE-SDS, par l'AcM anti-filaggrine AKH-1.

De façon à vérifier que les sérums de patients atteints de PR reconnaissaient également la filaggrine humaine et donc que celle-ci était étroitement apparentée à l'antigène, les Inventeurs ont purifié la filaggrine selon la méthode décrite par LINLEY et DALE (BBA 744:28-35, 1983). La figure 19 représente l'analyse de la filaggrine humaine purifiée, analysée par PAGE-SDS (12,5%), transférée sur nitrocellulose et immunodétectée avec des sérums de patients atteints de PR (pistes 1-4), un sérum de contrôle (piste 5), un AcM de contrôle (piste 6) et 1'AcM AKH-1 (piste 7) ou colorée par le Rouge
Ponceau (piste 8). La figure 19 montre que les sérums de patients atteints de PR reconnaissent spécifiquement la filaggrine humaine.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Antigène de différenciation terminale des épithéliums malpighiens de mammifères, spécifiquement reconnu par les autoanticorps présents chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoide, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes - il est de nature protéique, - un traitement par une nucléase ne modifie pas son

immunoréactivité, - un traitement par l'éthanol ne modifie pas son

immunoréactivité, - un traitement par l'acide trichloroacétique ne modifie

pas son immunoréactivité, - il est hydrosoluble.

2. Antigène selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est extrait d'épiderme humain.

3. Antigène selon la Revendication 2, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes - après électrophorèse en conditions natives, il se

dissocie en plusieurs protéines antigéniques qui

migrent comme des témoins dont les poids moléculaires

sont compris entre environ 80 et 400 kD, les protéines

les plus immunoréactives se situant dans les zones

comprises entre environ 80 et 120 kD, - après isoélectrofocalisatiosn, il se dissocie en plu

sieurs protéines antigéniques dont les pHi varient de

5,8 à 7,4.

4. Antigène selon l'une des Revendications 2 à 3, caractérisé en ce qu'après électrophorèse bidimensionnelle du type isoélectrofocalisation suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, il apparaît comme une protéine antigénique de poids moléculaire apparent moyen d'environ 40 kD dont les pHi varient de 5,8 à 7,4.

5. Antigène selon l'une des Revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il présente des propriétés immunologiques et biochimiques en commun avec la filaggrine humaine et correspond à un fragment de protéolyse de la profilaggrine, précurseur de la filaggrine.

6. Antigène selon--la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est extrait d'épithélium oesophagien de rat.

7. Antigène selon la Revendication 6, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes - après électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS, il

se sépare en les deux protéines antigéniques

suivantes

* une première protéine de poids moléculaire moyen

apparent d'environ 210 kD,

* une deuxième protéine de poids moléculaire moyen

apparent compris entre environ 90 et 130 kD, - après électrophorèse en gel de polyacrylamide en condi

tions natives, il se sépare en les trois protéines

antigéniques suivantes

* une première protéine qui migre comme un témoin dont

le poids moléculaire est d'environ 440 kD,

* une deuxième protéine qui migre comme un témoin dont

le poids moléculaire est d'environ 232 kD,

* une troisième protéine qui migre entre deux témoins

dont les poids moléculaires sont environ de 140 kD et

de 67 kD.

8. Antigène selon l'une des Revendications 6 à 7, caractérisé en ce qu'après électrophorèse bidimensionnelle du type isoélectrofocalisation suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, il se dissocie en les trois protéines antigéniques suivantes - une première protéine de poids moléculaire moyen appa

rent d'environ 210 kD dont les pHi varient d'environ

5,85 à 6,85, - une deuxième protéine de poids moléculaire moyen appa

rent compris entre environ 90 et 130 kD dont les pHi

varient d'environ 5,85 à 7,35, - une troisième protéine dont le poids moléculaire moyen

apparent diminue d'environ 120 à 67 kD pendant que son

pHi varie d'environ 5 à 7,5.

9. Antigène selon l'une des Revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'après chromatographie de gel filtration et interaction hydrophobes, puis analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, il se sépare en les deux fractions protéiques antigéniques suivantes - une première fraction très hydrophobe contenant une

protéine de poids moléculaire moyen apparent d'environ

210 kD et une protéine de poids moléculaire moyen appa

rent compris entre environ 90 et 130 kD, - une deuxième fraction moins hydrophobe que la première

contenant une protéine de poids moléculaire moyen appa

rent compris entre environ 120 et 67 kD.

10. Protéine de l'antigène extrait d'épithélium d'oesophage de rat selon la Revendication 8, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire moyen d'environ 210 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 6,85.

11. Protéine de l'antigène extrait d'épithélium d'oesophage de rat selon la Revendication 8, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire moyen compris entre 90 et 130 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 7,35.

12. Protéine de l'antigène extrait d'épithélium d'oesophage de rat selon la Revendication 8, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire moyen compris entre 67 et 120 kD et des pHi variant d'environ 5 à 7,5.

13. Protéine de l'antigène extrait d'épiderme humain selon la Revendication 4, caractérisée en ce qu'elle présente un poids moléculaire d'environ 40 kD et des pHi variant d'environ 5,8 à 7,4.

14. Composition antigénique pour le diagnostic de la présence d'autoanticorps dans un échantillon biologique d'un patient atteint de polyarthrite rhumatoide, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène selon l'une des Revendications 1 à 9 ou une protéine selon l'une des Revendications 10 à 13.

15. Antisérum caractérisé en ce qu'il reconnait un antigène selon l'une des Revendications 1 à 9 ou une protéine selon l'une des Revendications 10 à 13.

16. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il reconnait un antigène selon l'une des

Revendications 1 à 9 ou une protéine selon l'une des

Revendications 10 à 13.

17. Procédé de purification des autoanticorps spécifiquement présents chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoide caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes - la mise en contact d'un fluide biologique d'un patient

atteint de polyarthrite rhumatoïde avec au moins un

antigène selon l'une des Revendications 1 à 9 ou au

moins une protéine selon l'une des Revendications 10 à

13, dans des conditions permettant la formation de com

plexes immunologiques avec lesdits anticorps, - l'isolement desdits complexes du milieu réactionnel

et/ou la séparation des autoanticorps des complexes

immunologiques.

18. Procédé de diagnostic in vitro de la polyarthrite rhumatoîde dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes - la mise en contact de cet échantillon biologique avec

au moins un antigène selon l'une des Revendications 1 à

9, ou au moins une protéine selon l'une des Revendica

tions 10 à 13, éventuellement marqué, ou encore un

conjugué de cet antigène ou de cette protéine avec une

molécule porteuse, dans des conditions permettant la

formation d'un complexe immunologique avec les auto

anticorps éventuellement présents; - la détection dans cet échantillon biologique de la pré

sence du complexe immunologique, par des méthodes phy

siques ou chimiques.

19. Nécessaire pour le diagnostic in vitro de la polyarthrite rhumatoide à partir d'un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins un antigène selon l'une des Revendications 1 à

9 ou au moins une protéine selon l'une des Revendica

tions 10 à 13, éventuellement marqué, ou un conjugué de

cet antigène ou protéine avec une molécule porteuse - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à

la réaction immunologique avec les autoanticorps éven

tuellement présents dans ledit échantillon biologique - un ou plusieurs réactifs pour la détection du complexe

immunologique formé - le cas échéant, des échantillons de référence, tels

qu'un sérum négatif et un sérum positif.