FR2664602A1 - Automate de synthese simultanee de plusieurs peptides identiques ou differents en phase solide et procede automatique de synthese mis en oeuvre par ledit automate. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un automate de synthèse simultanée de plusieurs peptides identiques ou différents en phase solide ainsi qu'un procédé automatique de synthèse mis en œuvre par ledit automate. Automate de synthèse, caractérisé en ce qu'il est principalement constitué, d'une part, par au moins deux réacteurs (2, 2') indépendants reliés, chacun, à un module (3) de préparation et de distribution des acides aminés, commandé par un automate programmable (4), d'autre part, par des modules (5 et 6) de sélection et de distribution respectivement de réactifs de déprotection et de solvants de lavage également reliés auxdits réacteurs (2, 2') et, enfin, un dispositif de distribution (7) d'azote sous différentes pressions permettant les transferts des différents fluides et comportant, notamment, une centrale de bullage (8) pour l'agitation du contenu des réacteurs (2, 2'), les transferts de fluides et, par conséquent, les différentes phases de la synthèse, étant contrôlés au moyen de vannes commandées également par un automate programmable (10).

Description

Automate de synthèse simultanée de plusieurs peptides
identiques ou différents en phase solide et procédé automatique de synthèse mis en oeuvre par ledit automate
La présente invention concerne la synthèse chimique de peptides, et a pour objet un automate de synthèse simultanée de plusieurs peptides identiques ou différents en phase solide ainsi qu'un procédé automatique de synthèse mis en oeuvre par ledit automate.

Durant ces dernières années, la demande en peptides de synthèse a connu une croissance considérable et ce du fait, notamment d'une banalisation des peptides comme réactifs biologiques dans des domaines divers tels que, par exemple, l'immunologie et l'immunodiagnostic, et, plus généralement, la biologie moléculaire.

Or, on utilise actuellement dans la plupart des unités de production de peptides, soit des mono-synthétiseurs entièrement automatiques, relativement peu productifs, soit des procédés manuels, qui nécessitent un personnel spécialisé à plein temps.

Par le brevet français n" 2 582 655, on ccnnaît un multi-synthétiseur de peptides en phase solide à fonctionnement semi-automatique, présentant plus de deux voies de synthèse simultanée et utilisant la technique de synthèse développée par Merrifield. Néanmoins, ce dernier nécessite la présence permanente d'un personnel spécialisé dans la chimie des peptides pour l'activation et l'addition des acides aminés aux stades essentiels de la synthèse (couplages). De ce fait, la production de peptides au moyen dudit multi-synthétiseur est limitée à environ une centaine d'unités de vingt acides aminés par an. Par ailleurs, comme indiqué dans le document précité, ledit multi-synthétiseur ne peut mettre en oeuvre qu'une seule chimie de synthèse, soit BOC, soit Fmoc.

I1 existe, en outre, encore d'autres techniques de synthèse simultanée de plusieurs peptides telles que, notamment, celles mises au point par M. Geysen et R.

Houghten, mais elles sont toutes réalisées entièrement manuellement et n'autorisent aucune automatisation.

Le problème posé à la présente invention est donc de concevoir un automate de synthèse simultanée de plusieurs peptides identiques ou différents en phase so- lide, mettant en oeuvre un procédé de synthèse entièrement automatisé, permettant la production en continu de peptides de synthèse, sans intervention d'un personnel spécialisé, ou non, au cours de la synthèse, tout en présentant une qualité de synthèse d'un niveau élevé.

Ledit automate permettra de fabriquer des peptides en très grande nombre, donc à faible coût, et pourra être mis en oeuvre par un personnel ne possédant aucune notion de la chimie des peptides. Par ailleurs, l'automate conforme à l'invention devra pouvoir mettre en oeuvre indifféremment, soit un protocole de déprotection en chimie BOC, soit un protocole de déprotection en chimie Fmoc.

A cet effet, la présente invention a pour objet un automate de synthèse simultanée de plusieurs peptides identiques ou différents en phase solide, caractérisé en ce qu'il est principalement constitué, d'une part, par au moins deux réacteurs indépendants reliés, chacun, à un module de préparation et de distribution des acides aminés, commandé par un automate programmable, d'autre part, par des modules de sélection et de distribution respectivement de réactifs de déprotection et de solvants de lavage également reliés auxdits réacteurs et, enfin, un dispositif de distribution d'azote sous différentes pressions permettant les transferts des différents fluides et comportant, notamment, une centrale de bullage pour l'agitation du contenu des réacteurs, les transferts de fluides et, par conséquent, les différentes phases de la synthèse, étant contrôlés au moyen de vannes commandées également par un automate programmable.

Le procédé de synthèse mis en oeuvre par l'automate conforme à l'invention repose sur la technique de synthèse proposée par B. Merrifield et déjà décrite dans le brevet français n" 2 582 655.

Cette dernière consiste, notamment, à ajouter séquentiellement des acides aminés, selon une séquence prédéterminée correspondant au peptide à fabriquer, sur une chaîne en croissance dont l'extrémité C-terminale est fixée à un support solide insoluble tel que, par exemple, une résine de polystyrène polymérisé, toutes les réactions relatives à une voie de synthèse ayant lieu dans un même récipient et les excès de réactifs étant éliminés par simples filtrations et lavages.

En ce qui concerne le protocole de déprotection, il peut être réalisé soit en chimie BOC selon la technique développée par B. Merrifield, soit en chimie
Fmoc, mise au point par R. Sheppard.

En chimie BOC, le groupement protecteur temporaire de la fonction amine est le t-Butyloxycarbonyle, les groupements fonctionnels secondaires étant protégés durant toute la durée de la synthèse par des dérivés de type benzyle et débloqués, uniquement lors de la libération finale du peptide de la résine, au moyen d'acide fluorhydrique.

Par contre, en chimie Fmoc, le groupement protecteur temporaire de la fonction amine est le fluorenylméthyloxycarbonyle, les groupements protecteurs des fonctions secondaires étant du type tertiobutyle. Le groupement Fmoc est éliminé par un traitement à la pipéridine, suivi de plusieurs étapes de lavage à la dimé- thylformamide. En fin de synthèse, le peptide est libéré et les fonctions secondaires déprotégées par traitement à l'acide trifluoroacétique.

En ce qui concerne la condensation des acides aminés, et à la différence du brevet précité, le réactif de couplage utilisé (également appelé activateur dans la présente demande) est soit du benzotriazol-l-yl-oxy-trispyrrolidino-phosphoniumhexafluorophosphate (PyBop) décrit en 1989 par Coste et al., soit du (2-lH-benzotriazol-l-yl)-1, 1, 3, 3 -tétraméthyl-uronium (HBTU) dont l'utilisation a été proposée par Dourtoglu et al. en 1984, ou encore un produit dérivé, permettant d'activer l'acide aminé à coupler sur l'automate de synthèse en présence d'une base telle que la diisopropylethylamine (DIEA) ou la
N-méthyl-morpholine (NMM), par l'exploitation d'une propriété importante du PyBop et de 1'HBTU dans le cadre de l'invention, à savoir, la possibilité de leur conditionnement sous forme de poudre.

L'invention sera mieux comprise grâce à la description ci-après, qui se rapporte à un mode de réalisation préféré, donné à titre d'exemple non limitatif, et expliqué avec référence aux dessins schématiques annexés dans lesquels:
la figure 1 est une vue simplifiée en perspective d'un automate de synthèse conforme à l'invention ;
la figure 2 est un schéma bloc symbolique de l'automate représenté à la figure 1, mais pour lequel une seule voie de synthèse a été prise en considération;
la figure 3 est un schéma de principe fluidique correspondant à l'automate représenté à la figure 2
la figure 4 est une vue en coupe d'un ensemble réacteur-injecteur faisant partie de l'automate conforme à 1 invention; ;
la figure 5 est une vue en coupe de la centrale de bullage faisant partie de l'automate conforme à l'invention
la figure 6 est un schéma bloc de principe d'un dispositif de préparation et de distribution des acides aminés faisant partie de l'automate représenté à la figure 1
la figure 7 est une vue en perspective d'un dispositif de prélèvement faisant partie du dispositif de préparation et de distribution des acides aminés représenté à la figure 6
la figure 8 est une vue en perspective à une échelle différente d'un dispositif mobile de stockage et de présentation séquentielle de cartouches faisant partie de l'automate représenté à la figure 1
la figure 9 est une vue de dessous d'un dispositif de déplacement en rotation d'un barillet faisant partie du dispositif représenté à la figure 8
la figure 10 est un schéma symbolique d'une première variante de réalisation du bloc de distribution multivoies faisant partie du dispositif représenté à la figure 6, et
la figure 11 est un schéma symbolique d'une seconde variante de réalisation de bloc de distribution multivoies.

Conformément à l'invention, et comme le montrent notamment les figures 1 à 3 des dessins annexés, l'automate de synthèse est principalement constitué, d'une part, par au moins deux réacteurs 2, 2' indépendants reliés, chacun, à un module 3 de préparation et de distribution des acides aminés, commandé par un automate programmable 4, d'autre part, par des modules 5 et 6 de sélection et de distribution respectivement de réactifs de déprotection et de solvants de lavage également reliés auxdits réacteurs 2, 2' et, enfin, un dispositif de distribution 7 d'azote sous différentes pressions permettant les transferts des différents fluides et comportant, notamment, une centrale de bullage 8 pour l'agitation du contenu des réacteurs 2, 2', les transferts de fluides et, par conséquent, les différentes phases de la synthèse, étant contrôlés au moyen de vannes 9 commandées également par un automate programmable 10.

Selon une première caractéristique de l'invention, représentée à la figure 2 des dessins annexés, les deux automates programmables 4 et 10 sont indépendants entre eux, mais assujettis à une console 11 de contrôle de l'automate de synthèse 1 et d'interfaçage entre ledit automate 1 et l'utilisateur, ladite console 11 mettant en oeuvre et contrôlant les phases consécutives de la synthèse selon des données préprogrammées.

A cet effet, la console 11 met en oeuvre un programme permettant, d'une part, de réaliser, par l'intermédiaire des automates programmables 4 et 11, un contrôle opérationnel du fonctionnement de l'ensemble de l'automate de synthèse 1, d'autre part, de gérer les séquences des peptides en fabrication, les volumes de solvants à utiliser et les consommations en réactifs et, enfin, d'analyser en temps réel, les contenus des diverses mémoires de travail et l'évolution des différents paramètres de la synthèse.

Comme le montre plus particulièrement la figure 3 des dessins annexés, la multiplication des voies de distribution des différents fluides circulant dans l'automate 1 à travers des tuyaux de liaison 12 est réalisée au moyen de distributeurs 13 comportant des canaux de distribution radiaux 14 débouchant dans un unique canal central 15 ouvert à au moins l'une de ses extrémités, les interconnections entre trois tuyaux de liaison 12 étant réalisées au moyen de raccords en Té 16.

Le schéma fluidique de la figure 3 est plus particulièrement adapté à un automate 1 à quatre voies de synthèse indépendantes, c'est-à-dire comportant quatre réacteurs 2, 2' indépendants, comme le montrent les sorties de certains distributeurs 13 non connectés.

Selon une caractéristique de l'invention et comme le montre la figure 4 des dessins annexés, chaque réacteur 2, 2' est constitué, d'une part, par un corps principal 17 relié au module 3 de préparation et de distribution des acides aminés par un orifice d'injection latéral 18 et surmonté par un injecteur 19 à entrées multiples et à distribution radiale, et, d'autre part, par une embase amovible 20, fixée à l'extrémité inférieure dudit corps principal 17 et connectée, grâce à un orifice inférieur 21 et par l'intermédiaire, successive ment d'un raccord en Té 16 et de distributeurs 13 correspondant, respectivement à un circuit 22 d'évacuation des résidus et à la centrale de bullage 8.

Afin d'empêcher une évacuation de la résine support et des chaînes peptidiques en formation lors des phases de lavage, tout en permettant la vidange des solvants et l'agitation par bullage du contenu des réacteurs 2, 2', un filtre jetable 23 est disposé dans l'embase amovible 20, ledit filtre 23 consistant avantageusement en un tissé de filaments de polytétrafluoroéthylène. Le filtre 23 utilisé est avantageusement un filtre 23 du type connu sous la désignation K 1064-322 par la société NORTON Matériaux Avancés et présentant des perforations d'un diamètre de 30 à 60 micromètres.

Le corps principal 17, l'embase amovible 20 et l'injecteur 19 sont préférentiellement réalisés en polytétrafluoromonochloroéthylène.

Conformément à une caractéristique de l'invention, également représentée à la figure 4 des dessins annexés, l'injecteur 19 se présente sous la forme d'un corps cylindrique 24 comportant, d'une part, un canal central 25 traversant calibré, débouchant, à l'extrémité inférieure de l'injecteur 19, dans des canaux radiaux de distribution 26, d'autre part, trois entrées radiales 27, 28 et 29 reliées audit canal central 25 et, enfin, un canal excentré 30 indépendant dudit canal central 25, relié à une quatrième entrée radiale 31 et débouchant sur la face inférieure de l'injecteur 19.

Après l'assemblage étanche de l'ensemble embase 20 - corps principal 17 - injecteur 19, préférentiellement par vissage, l'injection de solvant de lavage à travers les canaux de distribution radiaux 26 permet de nettoyer de manière efficace et uniforme les parois intérieures du réacteur 2, 2' correspondant.

Comme le montre la figure 3 des dessins annexés, le module 5 de sélection et de distribution des réactifs de déprotection, relié aux réacteurs 2, 2' par deux entrées distinctes 28 et 29 des injecteurs 19, est constitué par deux circuits indépendants 32, 33 d'alimentation des réacteurs 2, 2' en fluides à partir de bouteilles 34, 35 mises sous pression d'azote, correspondant chacun à une voie d'alimentation soit en acide trifluoroacétique lors d'un protocole de déprotection
BOC, soit en pipéridine lors d'un protocole de déprotection Fmoc, et comportant chacun, notamment, un distributeur 13 pour l'alimentation des différents réacteurs 2, 2' et un circuit 36 d'évacuation des résidus, notamment à travers un récipient 37 contenant du méthanol, la quantité de réactifs de déprotection injectée dans les réacteurs étant contrôlée par l'automate programmable 10 par la commande des temps d'ouverture des vannes 9 concernees.

Selon une autre caractéristique de l'invention, représentée aux figures 1 à 3 des dessins annexés, le module 6 de sélection et de distribution des solvants de lavage est principalement constitué par un magasin 38 de bouteilles de solvants 39 à 42 pouvant être mises sous pression d'azote de manière sélective, la distribution desdits solvants étant effectuée au moyen d'un sélecteur de sortie 43 alimentant un distributeur 13, le volume de solvant de lavage à injecter dans chaque réacteur 2, 2' étant déterminé au moyen d'un doseur volumétrique 44, contrôlé par l'automate programmable 10 et relié directement au canal central 25 de l'injecteur 19 correspondant. Le niveau de solvant dans le doseur volumétrique 44 est avantageusement lu par l'automate programmable 10 au moyen d'un dispositif optoélectronique.

L'automate de synthèse 1 conforme à l'invention comporte également un circuit de détente 45 des réacteurs 2, 2' et, le cas échéant, des doseurs volumétriques 44, présentant au moins autant de tuyaux de liaison 12 que l'automate de synthèse 1 comprend de réacteurs 2, 2', chacun desdits tuyaux 12 étant relié à 1 ' entrée radiale 31 d'un injecteur 19, la détente s'effectuant à travers un flacon 46 contenant une solution de neutralisation et connecté à une hotte d'évacuation 47.

Le dispositif 7 de distribution d'azote, tel que représenté à la figure 3 des dessins annexés, alimente, à partir d'une bouteille d'azote 48 sous forte pression et par l'intermédiaire, notamment d'un détendeur primaire 49 et, le cas échéant, de distributeurs 13, de raccords en Té 16 et d'ensembles détendeur secondaire 50 - filtres 51, 52, d'une part, les dispositifs 5, 6 de sélection et de distribution des réactifs de déprotection et des solvants de lavage (sous 400 mbars environ), d'autre part, des circuits 53, 54 permettant les vidanges des doseurs volumétriques 44 et des réacteurs 2, 2' (sous 450 mbars), et, enfin, sous une pression de 1200 mbars, un détendeur très basse pression 55 relié aux modules 3 de préparation et de distribution des acides aminés, ainsi que la centrale de bullage 8.

Les filtres 51 et 52 se présentent respectivement sous la forme d'un filtre 51 à tamis moléculaire et d'un filtre 52 à papier du type WHATMAN. L'alimentation en azote sous pression (à 250 mbars environ) du circuit 32 de distribution d'acide trifluoroacétique s'effectue, en outre, préférentiellement, à travers une bouteille 56 de pastilles de potasse, permettant de neutraliser les diffusions en retour d'acide trifluoroacétique.

Conformément à une autre caractéristique de l'invention, représentée à la figure 5 des dessins annexés, la centrale de bullage 8 est essentiellement constituée par un détendeur-régulateur 57 muni d'un accu-tampon 58 de sortie et, par un bloc de commande 59 pneumatique, lesdits éléments 57, 58 et 59 étant assemblés en une structure coaxiale permettant de délivrer une pression d'azote constante, indépendamment du nombre de réacteurs 2, 2' à alimenter.Le bloc de commande pneumatique 59 comporte, d'une part, un bouton de réglage 60 de la pression moyenne délivrée par la centrale de bullage 8, d'autre part, une entrée de commande 61 per mettant le réglage du niveau de pression de bullage par action sur un piston supérieur 62 et une entrée de commande 63 pour la génération d'impulsions de pression par action directe sur un piston inférieur 64 et, enfin, une vis de réglage 65 fixant l'écart de pression entre deux pressions d'azote pour le bullage, fournies sélectivement par la centrale de bullage 8 suivant la nature du solvant résidant dans les réacteurs 2, 2' à alimenter.

Le détendeur-régulateur 57 est avantageusement un détendeur-régulateur fabriqué sous la référence 444.438 par la Société INTERTECHNIQUE. I1 est alimenté par l'orifice 66 d'alimentation principale de la centrale de bullage 8 et communique directement avec l'accu-tampon 58 muni d'un orifice 67 de distribution d'azote très basse pression. La pression d'azote délivrée par la centrale de bullage 8 est déterminée par le déplacement relatif du piston inférieur 64, dont la position détermine la pression exercée par le ressort 68 sur la membrane 69 du détendeur-régulateur 57. Le déplacement de la membrane 69 autorise l'établissement à travers l'orifice 66 d'alimentation principale, d'un débit d'azote vers l'accu-tampon 58.Dès que la pression interne atteint, au niveau de la membrane 69, une valeur suffisante pour annuler la pression du ressort 68, le débit d'azote est coupé. I1 en résulte une régulation de la pression d'azote délivrée par la centrale de bullage 8 autour de la valeur de consigne, fixée par le déplacement relatif du piston supérieur 62.

Ainsi la centrale de bullage 8 présente l'avantage, d'une part, de fournir deux pressions de bullage différentes, calibrées par les déplacements relatifs des pistons 62 et 64, et stables quel que soit le nombre de réacteurs 2, 2' alimentés, et, d'autre part, de pouvoir délivrer des impulsions de pression réglables en durée et en intensité.

La pression de bullage inférieure est avantageusement de 20 millibars et la pression de bullage supérieure de 30 millibars.

L'azote très basse pression délivré par la centrale de bullage 8 est tout d'abord stocké dans un accumulateur général 70, avant d'être distribué vers les différents réacteurs 2, 2' (Figure 3).

Comme le montrent les figures 1 et 6 des dessins annexés, chaque module 3 de préparation et de distribution des acides aminés se compose, d'une part, d'un dispositif mobile 71 de stockage et de présentation séquentielle de cartouches 72 d'acides aminés et d'activateur en poudre, d'autre part, d'un dispositif 73 de prélèvement des acides aminés et, enfin, par un bloc de distribution multivoies 74 permettant l'injection de solvants de couplage, issus de bouteilles 75 à 77 sous très basse pression et disposées dans un magasin 78 correspondant, dans le réacteur 2, 2' et les cartouches 72, et le transfert desdites cartouches 72 vers ledit réacteur 2, 2', des acides aminés solubilisés et activés.

Selon une caractéristique de l'invention, représentée à la figure 7 des dessins annexés, les cartouches 72 présentent une section transversale en forme de secteur angulaire et un fond 79 de forme pyramidale renversée, la face supérieure desdites cartouches 72 étant pourvue d'un septum 80.

En ce qui concerne le dispositif de prélèvement 73, il est principalement constitué par une potence support 81 munie, à son extrémité libre, d'un microvérin pneumatique 82 à double effet et par un bras mobile 83, actionné par ledit microvérin 82 et pourvu de deux aiguilles creuses 84 et 85 de longueurs différentes permettant, après leur introduction contrôlée dans une cartouche 72, suite à un actionnement correspondant du microvérin 82 et au perçage consécutif du septum 80 par lesdites aiguilles 84 et 85, de solubiliser entièrement le mélange acide aminé + activateur contenu dans la cartouche 72 et d'injecter la solution d'acide aminé activé obtenue, dans le réacteur 2, 2' grâce, notamment, au bloc de distribution multivoies 74.Ainsi, l'aiguille creuse longue 84 sert à la fois à l'injection de solvant de couplage dans la cartouche 72 et au transfert de la solution d'acide aminé activé de la cartouche 72 vers le réacteur 2, 2' correspondant, l'aiguille creuse courte 85 réalisant, selon le cas, la mise sous pression d'azote ou la mise en détente de ladite cartouche 72.

Conformément à une caractéristique de l'invention, et comme le montre la figure 8 des dessins annexés, le dispositif mobile 71 de stockage et de présentation séquentielle de cartouches 72 s'étend sous le dispositif de prélèvement 73 et est essentiellement composé d'un plateau circulaire 86 mobile en rotation autour de son axe de symétrie, et de barillets 87 à cartouches 72, de forme cylindrique, également mobiles en rotation autour de leur axe de symétrie, et disposés de manière équiangulaire sur ledit plateau 86, les dispositifs de déplacement en rotation 88 et 89 respectivement des barillets 87 et du plateau 86 étant commandés par l'automate programmable 10.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le plateau circulaire 86 porte avantageusement trois barillets 87, chacun desdits barillets 87 étant constitué, d'une part, par un flasque inférieur 90 directement actionné par le dispositif de déplacement en rotation 88 et, d'autre part, par un flasque supérieur 91 en forme de roue à rayons permettant le logement et le maintien de cartouches 72 correspondantes, ces deux flasques 90 et 91 étant reliés par un axe central 92.

Selon une autre caractéristique de l'invention, représentée aux figures 8 et 9 des dessins annexés, le dispositif de déplacement en rotation 88 d'un barillet 87 se présente sous la forme d'un mécanisme de roue à rochet solidaire du flasque inférieur 90 par sa roue 93, entraîné en une rotation pas à pas au moyen d'un vérin 94 agissant sur une denture extérieure 95 de ladite roue 93 et verrouillé dans les positions d'arrêt grâce à un cliquet à bille 96 coopérant avec un crantage intérieur 97 de ladite roue 93, le plateau circulaire 86 étant déplacé en rotation au moyen d'un moteur lent 98 entraînant l'arbre 99 supportant ledit plateau 86 par l'intermédiaire d'une courroie crantée 100, ledit plateau 86 étant arrêté dans des positions prédéterminées grâce à un dispositif de barrière optique 101.Ainsi, le plateau 86 effectue des mouvements de rotation limités dont les valeurs angulaires correspondent à l'écart angulaire entre les barillets 87, de manière à ce que, à chaque arrêt du plateau 86 un barillet 87 soit aligné avec le dispositif de prélèvement 73 correspondant, les cartouches 72 d'un barillet 87 étant présentées de manière séquentielle à la verticale des aiguilles 84 et 85.

Afin de permettre l'identification des barillets 87 et des cartouches 72 par le manipulateur réalisant le chargement de l'automate de synthèse 1 et par l'automate programmable 10, chaque cartouche 72 est pourvue sur sa face tournée vers l'extérieur d'un marquage littéral 102 et d'un marquage en code barre 103, correspondant à l'acide aminé contenu dans ladite cartouche 72, chaque barillet 87 étant également repéré au moyen d'un tel double marquage 102', 103', en fonction de la priorité de vidage dudit barillet 87, disposé sur le pourtour du plateau circulaire 86.

Dans ce cas, l'automate programmable 10 est muni d'un dispositif 104 de lecture code barre, lui permettant de contrôler, en association avec la console 11, le déroulement de la synthèse et d'éliminer, le cas échéant, les effets de manipulations préparatoires erronées.

En effet, avant chaque phase de couplage d'un nouvel acide aminé, l'automate programmable 10 pourra identifier l'acide aminé contenu dans la cartouche 72 destinée à être utilisée pour le nouveau couplage, communiquer le résultat à la console Il qui effectuera une comparaison dudit acide aminé contenu dans la cartouche 72 avec l'acide aminé devant être normalement couplé suivant la séquence préprogrammée du peptide à réaliser. En cas de non correspondance, l'automate programmable 10 pourra soit enclencher un programme de recherche, soit arrêter la synthèse sur la voie correspondante.

Conformément à un premier mode de réalisation, représenté à la figure 10 des dessins annexés, le bloc de distribution multivoies 74 est réalisé au moyen d'une structure de vannes à deux voies 105 et à trois voies 106, connectées entre elles.

Selon un mode de réalisation préféré de 1 'in- vention, et ccmme le montre schématiquement la figure 11 des dessins annexés, le bloc de distribution multivoies 74 est réalisé au moyen d'un dispositif 107 de distribution à trois voies et d'un dispositif 108 de distribution à sept voies. Ce deuxième mode de réalisation, du fait de sa structure monolithique, présente des volumes de ccntamination résiduelle pratiquement nuls. Lesdits dispositifs 107 et 108 se présentent sous la forme d'un assemblage de vannes à membrane 109 reliées entre elles, au niveau de leurs corps, par un unique canal de distribution 110.De tels dispositifs de distribution multivoies 107, 108 sont décrits de manière plus détaillée dans une demande de brevet français correspondante, déposée le 12 juillet 1990 au nom du Centre National de la
Recherche Scientifique, les inventeurs étant Messieurs
J. NEIMARK et J. PONSIGNON.

Le sélecteur de sortie 43 des solvants de lavage pourra également, de manière avantageuse, être réalisé au moyen d'un dispositif de distribution multivoies comportant un nombre de voies correspondant.

L'invention a également pour objet un procédé de synthèse de peptides en phase solide, mis en oeuvre par l'automate de synthèse 1 et consistant, après chargement, d'une part, de la résine support pourvue du premier acide aminé de la séquence dans les réacteurs 2, 2' et, d'autre part, des barillets 87 au moyen de cartouches 72 correspondantes, à effectuer, de manière automatique et répétitive, sous le contrôle de la console 11 et des automates 4 et 10, des cycles de couplage d'acides aminés sur les chaînes résidants dans les réacteurs 2, 2', soit en chimie BOC, soit en chimie
Fmoc.

Conformément à une première variante de réalisation de l'invention, le procédé de synthèse en chimie
BOC consiste, pour chaque cycle de couplage, à réaliser les étapes suivantes, notamment par actionnement de vannes 9 correspondantes et sous le contrôle des automates programmables 4 et 10 - lavage du réacteur 2 au moyen de dichlorométhane et, simultanément, injection de N-méthylpyrrolidone dans la cartouche 72 contenant l'acide aminé à coupler et bullage au moyen du détendeur très basse pression 55 pour opérer une solubilisation du mélange poudreux de la cartouche 72 - injections consécutives dans le réacteur 2 d'un volume de dichlorométhane et de deux volumes d'acide trifluoroacétique - purge et évacuation des résidus du circuit 32 d'alimentation en acide trifluoroacétique - bullage du contenu du réacteur 2 afin de favoriser l'opération de déprotection et vidange consécutive du réacteur 2 - répétition des trois étapes précédentes, mais en réa- lisant une opération de bullage de durée plus importante - lavage du réacteur 2 au moyen de dichlorométhane - évacuation des résidus de dichlorométhane du circuit d'alimentation correspondant par refoulement - lavage du réacteur 2 par l'intermédiaire d'isopropa nol - évacuation des résidus d'isopropanol du circuit d'alimentation correspondant par refoulement - lavage du réacteur 2 au moyen de dichlorométhane - répétition de l'étape précédente et injection consécutive d'une faible quantité de N-méthylpyrrolidone dans le réacteur 2 à partir du module 3 de préparation et de distribution des acides aminés - évacuation des résidus de dichlorométhane du circuit d'alimentation correspondant par refoulement - lavage du réacteur 2 au moyen de N-méthylpyrrolidone ou de diméthylformamide - remplissage du doseur volumétrique en
N-méthylpyrrolidone - injection de la solution d'acide aminé activé de la cartouche 72 dans le réacteur 2 - bullage de courte durée du contenu du réacteur 2 et injection de diisopropyléthylamine à 10 % de
N-méthylpyrrolidone dans le réacteur 2 - bullage de longue durée du contenu du réacteur 2 et, simultanément, instillation de N-méthylpyrrolidone dans ledit réacteur 2, et lavages de la cartouche 72 et du module 3 de préparation et de distribution des acides aminés, à savoir, deux lavages consécutifs au moyen de méthanol et un lavage au moyen de N-méthylpyrrolidone - vidange du réacteur 2 - lavage du réacteur 2 au moyen de N-méthylpyrrolidone issue du doseur volumétrique 44 préalablement rempli et du module 3 de préparation et de distribution des acides aminés - évacuation des résidus de N-méthylpyrrolidone du circuit d'alimentation correspondant par refoulement - double lavage du réacteur 2 par du dichlorométhane - positionnement du dispositif de prélèvement 73 et du dispositif mobile 71 de stockage et de présentation séquentielle des cartouches 72 en vue du prochain cycle de couplage.

Chaque phase de lavage des réacteurs 2 ou des cartouches 72 comporte en fait trois étapes, à savoir, injection du solvant dans le réacteur 2 ou la cartouche 72, bullage d'environ une minute et vidange dudit réacteur 2 ou de ladite cartouche 72.

Lors de l'injection de solvant de lavage dans le réacteur 2, la quantité de solvant à injecter est déterminée au moyen du doseur volumétrique 44 correspondant.

En chimie Fmoc, la diméthylformamide remplace le dichlorométhane, l'isopropanol et la
N-méthylpyrrolydone dans les opérations de dissolution du mélange poudreux dans les cartouches 72, de lavages du réacteur 2 et du module 3 de préparation et de distribution des acides aminés et comme diluant de la diisopropyléthylamine. Le solvant de déprotection utilisé est la pipéridine, dilué de moitié avec de la diméthylformamide lors de son utilisation.

Les étapes du cycle de couplage en chimie Fmoc sont identiques dans leur constitution et leur enchaînement à celles du cycle de couplage en chimie BOC, à l'exception des lavages du réacteur 2 effectués après la phase de déprotection, à savoir les trois lavages au dichlorométhane et le lavage à l'isopropanol, remplacés par six lavages à la diméthylformamide.

Le procédé de synthèse décrit ci-dessus est relatif à un procédé à simple couplage. I1 est également possible de mettre en oeuvre un procédé à double couplage permettant d'obtenir une réaction de couplage plus complète et donc un rendement proche de 100 %. Enfin, en travaillant avec des quantités de réactifs (acides aminés + activateur) en excès molaire de dix par rapport à la quantité molaire de peptides fabriqués, on atteint le rendement d'un procédé à double couplage en mettant en oeuvre un procédé du type simple couplage.

Grâce à l'invention, il est, par conséquent, possible de réaliser un automate de synthèse de peptides en phase solide permettant de réaliser automatiquement, en production continue et simultanément sur un nombre variable de voies de synthèse indépendantes, un très grand nombre de peptides (environ 1000 unités de 24 acides aminés par an pour un automate de synthèse 1 à quatre voies), et ce, avec un rendement élevé, sans nécessiter de personnel qualifié pour sa mise en oeuvre, et se présentant sous la forme d'un appareil de dimensions réduites.

Par ailleurs7 ledit automate de synthèse 1 permet de mettre en oeuvre indifféremment un procédé de synthèse en chimie BOC ou en chimie Fmoc.

Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux dessins annexés. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers éléments ou par substitution d'équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.

Claims (24)

REVENDICATIONS

1. Automate de synthèse simultanée de plusieurs peptides identiques ou différents en phase solide, caractérisé en ce qu'il est principalement constitué, d'une part, par au moins deux réacteurs (2, 2') indépendants reliés, chacun, à un module (3) de préparation et de distribution des acides aminés, commandé par un automate programmable (4), d'autre part, par des modules (5 et 6) de sélection et de distribution respectivement de réactifs de déprotection et de solvants de lavage également reliés auxdits réacteurs (2, 2') et, enfin, un dispositif de distribution (7) d'azote sous différentes pressions permettant les transferts des différents fluides et comportant, notamment, une centrale de bullage (8) pour l'agitation du contenu des réacteurs (2, 2'), les transferts de fluides et, par conséquent, les différentes phases de la synthèse, étant contrôlés au moyen de vannes (9) commandées également par un automate programmable (10).

2. Automate selon la revendication 1, caractérisé en ce que les deux automates programmables (4 et 10) sont indépendants entre eux, mais assujettis à une console (11) de contrôle de l'automate de synthèse (1) et d'interfaçage entre ledit automate (1) et l'utilisateur, ladite console (11) mettant en oeuvre et contrôlant les phases consécutives de la synthèse selon des données préprogrammées.

3. Automate selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la multiplication des voies de distribution des différents fluides circulant dans l'automate (1) à travers des tuyaux de liaison (12) est réalisée au moyen de distributeurs (13) comportant des canaux de distribution radiaux (14) débouchant dans un unique canal central (15) ouvert à au moins l'une de ses extrémités, les interconnections entre trois tuyaux de liaison (12) étant réalisées au moyen de raccords en Té (16).

4. Automate selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que chaque réacteur (2, 2') est constitué , d'une part, par un corps principal (17) relié au module (3) de préparation et de distribution des acides aminés par un orifice d'injection latéral d'injection (18) et surmonté par un injecteur (19) à entrées multiples et à distribution radiale7 et, d'autre part, par une embase amovible (20) fixée à l'extrémité inférieure dudit corps principal (17) et connectée, grâce à un orifice inférieur (21) et par l'intermédiaire, successivement, d'un raccord en Té (16) et de distributeurs (13) correspondant, respectivement à un circuit (22) d'évacuation des résidus et à la centrale de bullage (8).

5. Automate selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'un filtre jetable (23) est disposé dans l'embase amovible (20), ledit filtre (23) consistant avantageusement en un tissé de filaments de polytétrafluoroéthylène.

6. Automate selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que l'injecteur (19) se présente sous la forme d'un corps cylindrique (24) comportant, d'une part, un canal central (25) traversant, calibré débouchant, à l'extrémité inférieure de l'injecteur (19), dans des canaux radiaux de distribution (26), d'autre part, trois entrées radiales (27, 28 et 29) reliées audit canal central (25) et, enfin, un canal excentré (30) indépendant dudit canal central (25), relié à une quatrième entrée radiale (31) et débouchant sur la face inférieure de l'injecteur (19).

7. Automate selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le module (5) de sélection et de distribution des réactifs de déprotection, relié aux réacteurs (2, 2') par deux entrées distinctes (28 et 29) des injecteurs (19), est constitué par deux circuits indépendants (32, 33) d'alimentation des réacteurs (2, 2') en fluides à partir de bouteilles (34, 35) mises sous pression d'azote, correspondant chacun à une voie d'alimentation soit en acide trifluoroacétique lors d'un protocole de déprotection BOC, soit en pipéridine lors d'un protocole de déprotection Fmoc, et comportant chacun, notamment, un distributeur (13) pour l'alimentation des différents réacteurs (2, 2') et un circuit (36) d'évacuation des résidus.

8. Automate selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le module (6) de sélection et de distribution des solvants de lavage est principalement constitué par un magasin (38) de bouteilles de solvants (39 à 42) pouvant être mises sous pression d'azote de manière sélective, la distribution desdits solvants étant effectuée au moyen d'un sélecteur de sortie (43) alimentant un distributeur (13), le volume de solvant de lavage à injecter dans chaque réacteur (2, 2') étant déterminé au moyen d'un doseur volumétrique (44), contrôlé par l'automate programmable (10) et relié directement au canal central (25) de l'injecteur (19) correspondant.

9. Automate selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte un circuit de détente (45) des réacteurs (2, 2') et, le cas échéant, des doseurs volumétriques (44), présentant au moins autant de tuyaux de liaison (12) que l'automate de synthèse (1) comprend de réacteurs (2, 2'), chacun desdits tuyaux (12) étant relié à l'entrée radiale (31) d'un injecteur (19), la détente s'effectuant à travers un flacon (46) contenant une solution de neutralisation et connecté à une hotte d'évacuation (47).

10. Automate selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le dispositif (7) de distribution d'azote alimente, à partir d'une bouteille d'azote (48) sous forte pression et par l'intermédiaire, notamment d'un détendeur primaire (49) et, le cas échéant, de distributeurs (13), de raccords en Té (16) et d'ensembles détendeur secondaire (50) filtres (51, 52), d'une part, les dispositifs (5, 6) de sélection et de distribution des réactifs de déprotection et des solvants de lavage, d'autre part, des circuits (53, 54) permettant les vidanges des doseurs volumétriques (44) et des réacteurs (2, 2'), et, enfin, un détendeur très basse pression (55) relié aux modules (3) de préparation et de distribution des acides aminés, ainsi que la centrale de bullage (8).

11. Automate selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la centrale de bullage (8) est essentiellement constituée par un détendeur-régulateur (57) muni d'un accu-tampon (58) de sortie et, par un bloc de commande (59) pneumatique, lesdits éléments (57, 58 et 59) étant assemblés en une structure coaxiale permettant de délivrer une pression d'azote constante, indépendamment du nombre de réacteurs (2, 2') à alimenter.

12. Automate selon la revendication 11, caractérisé en ce que le bloc de commande pneumatique (59) comporte, d'une part, un bouton de réglage (60) de la pression moyenne délivrée par la centrale de bullage (8), d'autre part, une entrée de commande (61) permettant le réglage du niveau de pression de bullage par action sur un piston supérieur (62) et une entrée de commande (63) pour la génération d'impulsions de pression par action directe sur un piston inférieur (64) et, enfin, une vis de réglage (65) fixant l'écart de pression entre deux pressions d'azote pour le bullage, fournies sélectivement par la centrale de bullage (8) suivant la nature du solvant résidant dans les réacteurs (2, 2') à alimenter.

13. Automate selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que chaque module (3) de préparation et de distribution des acides aminés se compose, d'une part, d'un dispositif mobile (71) de stockage et de présentation séquentielle de cartouches (72) d'acides aminés et d'activateur en poudre, d'autre part, d'un dispositif (73) de prélèvement des acides aminés et, enfin, par un bloc de distribution multivoies (74) permettant l'injection de solvants de couplage, issus de bouteilles (75 à 77) sous très basse pression et disposées dans un magasin (78) correspondant, dans le réacteur (2, 2') et les cartouches (72) et le transfert desdites cartouches (72) vers ledit réacteur (2, 2'), des acides aminés solubilisés et activés.

14. Automate selon la revendication 13, caractérisé en ce que les cartouches (72) présentent une section transversale en forme de secteur angulaire et un fond (79) de forme pyramidale renversée, la face supérieure desdites cartouches (72) étant pourvue d'un septum (80).

15. Automate selon l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisé en ce que le dispositif (73) de prélèvement est principalement constitué par une potence support (81) munie, à son extrémité libre, d'un microvérin pneumatique (82) à double effet et par un bras mobile (83), actionné par ledit microvérin (82) et pourvu de deux aiguilles creuses (84 et 85) de longueurs différentes permettant, après leur introduction contrôlée dans une cartouche (72), suite à un actionnement correspondant du microvérin (82) et au perçage consécutif du septum (80) par lesdites aiguilles (84 et 85), de solubiliser entièrement le mélange acide aminé + activateur contenu dans la cartouche (72) et d'injecter la solution d'acide aminé activé obtenue, dans le réacteur (2, 2') grâce, notamment, au bloc de distribution multivoies (74).

16. Automate selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le dispositif mobile (71) de stockage et de présentation séquentielle de cartouches (72) s'étend scus le dispositif de prélèvement (73) et est essentiellement composé d'un plateau circulaire (86) mobile en rotation autour de son axe de symétrie, et de barillets (87) à cartouches (72), de forme cylindrique, également mobiles en rotation autour de leur axe de symétrie, et disposés de manière équiangulaire sur ledit plateau (86), les dispositifs de déplacement en rotation (88 et 89) des barillets (87) et du plateau (86) étant commandés par l'automate programmable (10).

17. Automate selon la revendication 16, caractérisé en ce que le plateau circulaire (86) porte avantageusement trois barillets (87), chacun desdits barillets (87) étant constitué, d'une part7 par un flasque inférieur (90) directement actionné par le dispositif de déplacement en rotation (88) et, d'autre part, par un flasque supérieur (91) en forme de roue à rayons permettant le logement et le maintien de cartouches (72) correspondantes, ces deux flasques (90 et 91) étant reliés par un axe central (92).

18. Automate selon l'une quelconque des revendications 16 et 17, caractérisé en ce que le dispositif de déplacement en rotation (88) d'un barillet (87) se présente sous la forme d'un mécanisme de roue à rochet solidaire de flasque inférieur (90) par sa roue (93), entraîné en une rotation pas à pas au moyen d'un vérin (94) agissant sur une denture extérieure (95) de ladite roue (93) et verrouillé dans les positions d'arrêt grâce à un cliquet à bille (96) coopérant avec un crantage intérieur (97) de ladite roue (93), le plateau circulaire (86) étant déplacé en rotation au moyen d'un moteur lent (98) entraînant l'arbre (99) supportant ledit plateau (86) par l'intermédiaire d'une courroie crantée (100), ledit plateau (86) étant arrêté dans des positions prédéterminées grâce à un dispositif de barrière optique (101).

19. Automate selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que chaque cartouche (72) est pourvue sur sa face tournée vers l'extérieur d'un marquage littéral (102) et d'un marquage en code barre (103), correspondant à l'acide aminé contenu dans ladite cartouche (72), chaque barillet (87) étant également repéré au moyen d'un tel double marquage (102', 103'), en fonction de la priorité de vidage dudit barillet (87) et disposé sur le pourtour du plateau circulaire (86).

20. Automate selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'automate programmable (10) est muni d'un dispositif (104) de lecture code barre, lui permettant de contrôler, en association avec la console (11), le déroulement de la synthèse et d'éliminer, le cas échéant, les effets de manipulations préparatoires erronées.

21. Automate selon l'une quelconque des revendications 13 à 20, caractérisé en ce que le bloc de distribution multivoies (74) est réalisé au moyen d'une structure de vannes à deux voies (105) et à trois voies (106), connectées entre elles.

22. Automate selon l'une quelconque des revendications 13 à 20, caractérisé en ce que le bloc de distribution multivoies (74) est réalisé au moyen d'un dispositif (107) de distribution à trois voies et d'un dispositif (108) de distribution à sept voies.

23. Procédé de synthèse de peptides en phase solide, mis en oeuvre par l'automate de synthèse selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé en ce qu'il consiste, après chargement, d'une part, de la résine support pourvue du premier acide aminé de la séquence dans les réacteurs (2, 2') et, d'autre part, des barillets (87) au moyen de cartouches (72) correspondantes, à effectuer, de manière automatique et répétitive, sous le contrôle de la console (11) et des automates programmables (4 et 10), des cycles de couplage d'acides aminés sur les chaînes résidants dans les réacteurs (2, 2'), soit en chimie BOC, soit en chimie

Fmoc.

24. Procédé de synthèse, selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il consiste, en chimie BOC, à réaliser, pour chaque cycle de couplage, les étapes suivantes, notamment par actionnement de vannes programmables (9) correspondantes et sous le contrôle des automates (4 et 10) - lavage du réacteur (2) au moyen de dichlorométhane et, simultanément, injection de N-méthylpyrrolidone dans la cartouche (72) contenant l'acide aminé à coupler et bullage au moyen du détendeur très basse pression (55) pour opérer une solubilisation du mélange poudreux de la cartouche (72) - injections consécutives dans le réacteur (2) d'un volume de dichlorométhane et de deux volumes d'acide trifluoroacétique - purge et évacuation des résidus du circuit (32) d'alimentation en acide trifluoroacétique - bullage du contenu du réacteur (2) afin de favoriser l'opération de déprotection et vidange consécutive du réacteur (2) - répétition des trois étapes précédentes, mais en réa- lisant une opération de bullage de durée plus importante - lavage du réacteur (2) au moyen de dichlorométhane - évacuation des résidus de dichlorométhane du circuit d'alimentation correspondant par refoulement - lavage du réacteur (2) par l'intermédiaire d'isopropanol - évacuation des résidus d'isopropanol du circuit d'alimentation correspondant par refoulement - lavage du réacteur (2) au moyen de dichlorométhane - répétition de l'étape précédente et injection consécutive d'une faible quantité de N-méthylpyrrolidone dans le réacteur (2) à partir du module (3) de préparation et de distribution des acides aminés - évacuation des résidus de dichlorométhane du circuit d'alimentation correspondant par refoulement - lavage du réacteur (2) au moyen de N-méthylpyrrolidone ou de diméthylformamide - remplissage du doseur volumétrique en

N-méthylpyrrolidone - injection de la solution d'acide aminé activé de la cartouche (72) dans le réacteur (2) - bullage de courte durée du contenu du réacteur (2) et injection de diisopropyléthylamine à 10 % de

N-méthylpyrrolidone dans le réacteur (2) - bullage de longue durée du contenu du réacteur (2) et, simultanément, instillation de N-méthylpyrrolidone dans ledit réacteur (2), et lavages de la cartouche (72) et du module (3) de préparation et de distribution des acides aminés, à savoir, deux lavages consécutifs au moyen de méthanol et un lavage au moyen de N-méthylpyrrolidone - vidange du réacteur (2) - lavage du réacteur (2) au moyen de N-méthylpyrrolidone issue du doseur volumétrique (44) préalablement rempli et du module (3) de préparation et de distribution des acides aminés - évacuation des résidus de N-méthylpyrrolidone du circuit d'alimentation correspondant par refoulement - double lavage du réacteur (2) par du dichlorométhane - positionnement du dispositif de prélèvement (73) et du dispositif mobile (71) de stockage et de présentation séquentielle des cartouches (72) en vue du prochain cycle de couplage.