FR2639230A1 - Produit antifongique inhibant la (beta)(1-3) glucane synthase, son procede d'obtention et ses applications notamment en therapeutique - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet un produit antifongique inhibant l'activité de la beta(1-3)glucane synthase qui est de nature protéique ou lié à une protéine, a une masse moléculaire supérieure à 5000 Daltons et peut être obtenue par : - culture d'Entomophtorales formant des protoplastes; - élimination du milieu de culture; - broyage des protoplastes; - centrifugation et; - isolement à partir du surnageant.
Description
La présente invention concerne un produit antifongique inhibant la synthèse des P(1-3) glucanes.
utilisable en thérapeutique humaine et vétérinaire ainsi que dans l'agriculture ou d autres domaines de l'industrie où se pose un problème de lutte contre les champignons.
On connait relativement peu d'agents antifongiques pour le traitement des mycoses localisées ou systémiques.
Récemment on a découvert des agents antifon giques capables d'inhiber la 0(1-3) glucane synthase.
telle la cilofungine active sur les germes Candida albicans. Candida trooicalis et de façon plus modérée sur Toruloosis qlabrata. (Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, Sep. 1988, p. 1331-1334, vol. 32. N: 9).
Chemotherapy, Sep. 1988, p. 1331-1334, vol. 32. N: 9).
La ss (1-3) glucane synthase est une enzyme qui intervient dans la synthèse de la paroi de tous les champignons dont la paroi est constituée de z (1-3) glucane. L'inhibition de cette enzyme permet de s'opposer au développement de ces champignons.
Le but de la présente invention est de fournir un nouvel agent inhibiteur de la (1-3) glucanie synthase capable d'inhiber la croissance de certains types de champignons et possédant un spectre plus large que la cilofungine.
A cet effet, la présente invention a pour objet un antifongique inhibant 1 activité de la 9 (1-3) glucane synthase, qui est de nature protéique ou lié à une protéine, a une masse moléculaire supérieure à 5000 Daltons et peut etre obtenu par
- culture d'Entomophtorales formant des protoplastes
- elimination du milieu de culture
- broyage des protoplastes
- centrifugation
- et isolement à partir du surnageant.
- culture d'Entomophtorales formant des protoplastes
- elimination du milieu de culture
- broyage des protoplastes
- centrifugation
- et isolement à partir du surnageant.
Avantageusement, le produit antifongique est obtenu à partir de Entomoohtora muscae.
Un autre aspect de l'invention est de fournir un procédé pour l'obtention du produit antifongique selon l'invention, caractérisé en ce que
- l'on cultive des Entomophtorales produisant des protoplastes sur un milieu approprié
- on élimine le milieu de culture
- on broye les protoplastes
- on centrifuge et isole le produit à partir du surnageant.
- l'on cultive des Entomophtorales produisant des protoplastes sur un milieu approprié
- on élimine le milieu de culture
- on broye les protoplastes
- on centrifuge et isole le produit à partir du surnageant.
Comme milieu de culture on utilise de pré- fèrence dans le cas d'Entomophtora muscae un milieu
GLEN comprenant 0,4Z de glucose: 0,65% d'hydrolysat de lactalbumine; 0,51 d'extrait de levure; 0,77X de chlorure de sodium. les pourcentages étant exprimés en poidsivolume (A. Beauvais et 3.P. Latgé, Journal of
Invertebrate Pathology 51, 175-178 (1988).
GLEN comprenant 0,4Z de glucose: 0,65% d'hydrolysat de lactalbumine; 0,51 d'extrait de levure; 0,77X de chlorure de sodium. les pourcentages étant exprimés en poidsivolume (A. Beauvais et 3.P. Latgé, Journal of
Invertebrate Pathology 51, 175-178 (1988).
Quand d'autres espèces d'Entomophtorales que
EntomoDhtora muscae sont utilisées, telle Entomoohtora aulicae, il est nécessaire d'ajouter au milieu de culture du sérum foetal de veau à une concentration minimale d'au moins 57 (poids/volume).
EntomoDhtora muscae sont utilisées, telle Entomoohtora aulicae, il est nécessaire d'ajouter au milieu de culture du sérum foetal de veau à une concentration minimale d'au moins 57 (poids/volume).
En raison de son activité inhibitrice sur la
(1-31 glucane synthase. le produit selon l inven- tion peut être utilisé pour inhiber le développement de champignons.
(1-31 glucane synthase. le produit selon l inven- tion peut être utilisé pour inhiber le développement de champignons.
Il peut etre utilisé en particulier en thérapeutique. notamment pour lutter contre les infections mycosiques.
La présente invention a en conséquence également pour objet une composition thérapeutique com prenant à titre de principe actif le produit antifon gique selon l'invention.
La composition thérapeutique selon la présente invention peut être utilisée notamment pour le traitement des mycoses à AsDernillus fumicatus et à
Candida albicans.
Candida albicans.
Les compositions thérapeutiques selon l'in- vention peuvent être administrées à l'homme ou aux animaux par voie topique, orale ou parentérale.
Pour l'administration par voie topique elles peuvent se présenter sous forme de crèmes. laits dermiques, pulvérisations ou lotions. Pour l'administration par voie orale, elles peuvent se présenter sous forme de comprimés, gélules, capsules. Pour l'administration par voie parentérale elles peuvent se présenter sous forme de solutions ou suspensions injectables.
Le produit antifongique selon l'invention peut également être utilisé pour lutter contre le développement des champignons phytopathogénes sur les plantes cultivées.
On décrira ci-après plus en détail l'obten- tion du produit antifongique selon l'invention, ses caractéristiques et ses propriétés
a) Obtention du Droduit antifonqlaue
Des protoplastes sont obtenus à partir d-En- tomoDhtora muscae mises en culture dans un milieu GLEN comme décrit précédemment.
a) Obtention du Droduit antifonqlaue
Des protoplastes sont obtenus à partir d-En- tomoDhtora muscae mises en culture dans un milieu GLEN comme décrit précédemment.
Après trois jours de culture à 24 C, le milieu de culture est éliminé par centrifugation à 5000g pendant 3 minutes. Le culot est ensuite lavé au tampon phosphate 1OmM, pH 7,8, contenant du saccharose îM.
Les protoplastes sont alors remis en suspension dans un tampon Tris-HCl 50mM pH 7,8, EDTA 1mM et broyés à l'homogénéiseur POTTER en verre à piston pen dant 3 minutes.
Le broyat est centrifuge à 33000g pendant I heure et on recueille le surnageant (S 33 k).
La fraction S 33 k obtenue après centrifugation est totalement stable pendant 4 jours minimum à 24 C ou à 37 C et pendant 15 mn à 60'C. Elle peut etre conservée à - 20-C sans perte d'activité.
Il est possible de récupérer le produit inhibiteur de la ss(1-3) glucane synthase après précipitation à l'acétone à 90% de la fraction S 33 k suivie d'une filtration sur gel de Sephadex G25 ce qui atteste de la nature protéique ou liée à une protéine du produit inhibiteur et laisse présager une masse moléculaire supérieure à 5000.
Pour préparer une solution aqueuse du produit selon l'invention, on filtre la fraction S 33 k sur colonne Sephadex G25 puis la dialyse pendant 24 heures sous eau jusqu'à élimination du tampon.
On lyophilise la solution ainsi obtenue, puis on dilue 1,5mg de lyophilisat dans Iml de milieu approprié.
La solution est filtrée sur filtres Millipore stériles (diamètre des pores 0,2 micromètres). La concentration finale en protéines de la solution après filtration est de 0,1 mg/ml.
Il est à noter qu'on a également trouvé le produit actif dans le culot de centrifugation.
On pense qu'une fraction du produit reste liée aux membranes après broyage et centrifugation et précipite donc avec celles-ci dans le culot.
b) Propriétés du produit antifoncioue 1') Activité inhibitrice du produit antifoncigue selon l'invention sur la F (1-3) clucane svnthase.
L'activité inhibitrice de la fraction S 33 k est testée sur la p(1-3) glucane synthase présente dans le mycélium de Asperaillus fumigatus et sur celle présente dans les corps hyphaux (eléments mycéliens avec paroi) de 2 espèces d'Entomophtorales : Entomo phtora aulicae et Conidiobolus obscurus dans les conditions suivantes : on ajoute la fraction S 33 k correspondant à 10 g de protéines à 15 pl d'extrait de
ss (1-3) glucane synthase correspondant à une quantité de 50 à 100 yg de protéines.Au bout de 20 minutes d'incubation à 20'C, on ajoute le milieu réactionnel de la ss(1-3) glucane synthase comprenant
- Tris HCl 50 mM pH 7,8
- EDTA 1 mM
- Saccharose 1 M
- NaF 0,2 M
- cellobiose 3 mM
- glucose-6-phosphate 3 mM
- tartrate de sodium 3 mM
- CaCl2 0,1mM
- amylase 2 mg/ml
- serum albumine bovine 3 mg/ml
- Uridine diphospho glucose contenant 3 uM
d'(uridine 14C) - glucose 2,5mM Les t(1-3) glucanes synthétisés sont récu- pérés par filtration, lavés à l'eau et leur teneur en radioactivité est mesurée au compteur à scintillation puis comparée à un essai témoin réalisé en l'absence de produit selon l'invention.
ss (1-3) glucane synthase correspondant à une quantité de 50 à 100 yg de protéines.Au bout de 20 minutes d'incubation à 20'C, on ajoute le milieu réactionnel de la ss(1-3) glucane synthase comprenant
- Tris HCl 50 mM pH 7,8
- EDTA 1 mM
- Saccharose 1 M
- NaF 0,2 M
- cellobiose 3 mM
- glucose-6-phosphate 3 mM
- tartrate de sodium 3 mM
- CaCl2 0,1mM
- amylase 2 mg/ml
- serum albumine bovine 3 mg/ml
- Uridine diphospho glucose contenant 3 uM
d'(uridine 14C) - glucose 2,5mM Les t(1-3) glucanes synthétisés sont récu- pérés par filtration, lavés à l'eau et leur teneur en radioactivité est mesurée au compteur à scintillation puis comparée à un essai témoin réalisé en l'absence de produit selon l'invention.
Les résultats montrent que l'activité de la t(1-3) glucane synthase des trois espèces étudiées est réduite d'environ 507..
2 ) Activité antifonaioue du produit selon l'invention
On étudie l'activité antifongique du produit selon l'invention sur la régénération d'une paroi par les protoplastes d'AsDeraillus fumiaatus, et sur la croissance des levures Candida albicans à 24 C.
On étudie l'activité antifongique du produit selon l'invention sur la régénération d'une paroi par les protoplastes d'AsDeraillus fumiaatus, et sur la croissance des levures Candida albicans à 24 C.
Ces deux espèces provoquent chez l'homme des pathologies mycologiques respectivement l'aspergillose et la candidose.
On ajoute 1 ml de la solution obtenue en a) après lyophilisation. redissolution et filtration de la fraction S 33 k contenant 0.1 mg de protéines, à protoplastes ou levures et on incube les cultures pendant 12 à 24 heures à 24 C puis on les observe au microscope optique.
Parallèlement. on incube les cultures témoins dans les mêmes conditions avec 1 ml de milieu contenant 0,1 mg de sérum albumine bovine.
Les cellules sont comptées à la cellule de Malassez. La régénération des protoplastes est réalisée dans le milieu Sabouraud contenant 1 M de sorbitol et la croissance des levures dans le milieu de
Sabouraud.
Sabouraud.
Les résultats montrent. en présence du produit selon l'invention une inhibition de la régé nération des protoplastes et une inhibition de la croissance des levures d'environ 507..
Claims (8)
1. Produit antifongique inhibant l'activité de la (1-3)glucane synthase, qui est de nature pro téique ou lié à une protéine, a une masse moléculaire superieure à 5000 Daltons et peut être obtenu
- par culture d'Entomophtorales formant des protopla stes
- élimination du milieu de culture
- broyage des protoplastes
- centrifugation
- et isolement à partir du surnageant.
2. Produit antifongique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'Entomophtora muscae.
3. Procédé pour l'obtention d'un produit antifongique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que
- l'on cultive des Entomophtorales produisant des protoplastes sur un milieu approprié,
- on élimine le milieu de culture,
- on broye les protoplastes,
- on centrifuge
- et isole le .produit à partir du surnageant
4. Procédé pour l'obtention du produit antifongique selon la revendication 3, caractérisé en ce que le milieu approprie est un milieu GLEN contenant en poids/volume 0,4' de glucose: 0,65 d'hydrolysat de lactalbumine; 0,5X d'extrait de levure; 0,772 de chlorure de sodium.
5. Composition thérapeutique comprenant à titre de principe actif un produit selon la revendication 1 ou la revendication 2.
6. Composition thérapeutique pour le traitement des mycoses à Ascergillus fumiaatus et Candida albicans comprenant à titre de principe actif un produit selon la revendication 1 ou la revendication 2.
7. Utilisation du produit antifongique selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour lutter contre le développement des champignons.
8. Utilisation du produit antifongique selon la revendication 7 pour lutter contre le développement des champignons phytopathogènes sur les plantes cul tivées.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8815281A FR2639230B1 (fr) | 1988-11-23 | 1988-11-23 | Produit antifongique inhibant la (beta)(1-3) glucane synthase, son procede d'obtention et ses applications notamment en therapeutique |
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| FR8815281A FR2639230B1 (fr) | 1988-11-23 | 1988-11-23 | Produit antifongique inhibant la (beta)(1-3) glucane synthase, son procede d'obtention et ses applications notamment en therapeutique |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2639230A1 true FR2639230A1 (fr) | 1990-05-25 |
| FR2639230B1 FR2639230B1 (fr) | 1991-02-15 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| FR8815281A Expired - Fee Related FR2639230B1 (fr) | 1988-11-23 | 1988-11-23 | Produit antifongique inhibant la (beta)(1-3) glucane synthase, son procede d'obtention et ses applications notamment en therapeutique |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2639230B1 (fr) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0763046A1 (fr) * | 1994-05-26 | 1997-03-19 | Merck & Co. Inc. | Adn codant pour le gene 1 de synthese du glucane |
| AP962A (en) * | 1997-11-24 | 2001-05-04 | Cont Asphalt Ltd | Bitumen container. |
-
1988
- 1988-11-23 FR FR8815281A patent/FR2639230B1/fr not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 68, 1968, page 7415, résumé no. 76911x, Columbus, Ohio, US; A.G. JOENSSON: "Protease production by species of Entomophthora", & APPL. MICROBIOL. 16(3), 450-7 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0763046A1 (fr) * | 1994-05-26 | 1997-03-19 | Merck & Co. Inc. | Adn codant pour le gene 1 de synthese du glucane |
| EP0763046A4 (fr) * | 1994-05-26 | 1999-06-02 | Merck & Co Inc | Adn codant pour le gene 1 de synthese du glucane |
| AP962A (en) * | 1997-11-24 | 2001-05-04 | Cont Asphalt Ltd | Bitumen container. |
Also Published As
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| FR2639230B1 (fr) | 1991-02-15 |
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| Date | Code | Title | Description |
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| ST | Notification of lapse |