FR2601032A1 - Procedes de preparation d'un inoculum microbien et de culture de microorganismes inclus, inoculum obtenu et son application - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PREPARATION D'UN INOCULUM MICROBIEN CARACTERISE EN CE QU'IL COMPREND LES ETAPES SUCCESSIVES SUIVANTES : ON INCLUT LES MICROORGANISMES DANS UNE MATRICE DE POLYMERE,LES MATRICES DE POLYMERE INCLUANT LES MICROORGANISMES OBTENUES A L'ISSUE DE "L'ETAPE A" SONT INCUBEES DANS UN MILIEU PERMETTANT LA CROISSANCE DESDITS MICROORGANISMES JUSQU'A LA FORMATION DE COLONIES A L'INTERIEUR DESDITES MATRICES,LES MATRICES DE POLYMERE INCLUANT LES COLONIES DE MICROORGANISMES OBTENUES AU COURS DE "L'ETAPE B" SONT DESHYDRATEES.
Description
La présente invention concerne un procédé de culture de microorganismes ainsi qu'un procédé de fabrication d'un inoculum à partir des microorganismes obtenus.
Plus particulièrement, la présente invention concerne la production d'inoculums nécessaires à l'horticulture et à la foresterie (par exemple l'obtention en pépinière des plants inoculés de Casuarina, aulne, Hippophaé, Elaeagnus).
Parmi les microorganismes utilisables à titre d'inoculum, il faut citer les actinomycètes appartenant au groupe des Frankia (symbiotes des plantes actinorhiziennes fixatrices d'azote) et les rhizobiums.
Certains microorganismes, notamment les Frankia, présentent la particularité de produire une très faible biomasse lorsqu'on les cultive suivant les méthodes usuelles.
Cette très faible production de biomasse constitue un grave handicap, à la fois dans le domaine industriel et dans le domaine de la recherche fondamentale.
C'est pourquoi la présente invention propose un procédé de culture de microorganisme et de fabrication d'un inoculum permettant la production de biomasses beaucoup plus importante que celles qui sont obtenues actuellement, ainsi que les processus permettant de satisfaire aux besoins industriels des horticulteurs par exemple.
En effet, compte tenu de leur utilisation, les inoculums bactériens destinés à l'horticulture ou à la foresterie doivent remplir certaines conditions
- Ils doivent tout d'abord être constitués d'un support défini et assurant une bonne protection des microorganismes considérés
- ils doivent être faciles à stocker, à expédier et à utiliser
- enfin, permettre, lors de leur application, une très large dissémination des microorganismes au niveau des sites d'infection des plantes hôtes.
- Ils doivent tout d'abord être constitués d'un support défini et assurant une bonne protection des microorganismes considérés
- ils doivent être faciles à stocker, à expédier et à utiliser
- enfin, permettre, lors de leur application, une très large dissémination des microorganismes au niveau des sites d'infection des plantes hôtes.
Plus particulièrement, la présente invention concerne des inoculums constitués de microorganismes inclus dans des matrices polymères. De tels procédés ont déjà été décrits, notamment dans les demandes de brevet français suivantes : 77 10254 - 79 28956 - 81 04474 - 83 02847.
Toutefois, aucun de ces procédés ne permet de remplir de façon totalement satisfaisante les conditions évoquées précédemment.
Pour ce faire, la présente invention propose un procédé de culture de microorganismes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une culture biphasique dans laquelle a) on cultive les microorganismes-sur un milieu nutritif
solide ("étape a") b) après culture, on fragmente ce milieu solide colonisé
par les microorganismes ("étape b") ; c) on ensemence avec les fragments obtenus à"l'étape b"
un milieu nutritif liquide ("étape c") et on incube à
28-300C. Cette étape correspond à la culture biphasique.
solide ("étape a") b) après culture, on fragmente ce milieu solide colonisé
par les microorganismes ("étape b") ; c) on ensemence avec les fragments obtenus à"l'étape b"
un milieu nutritif liquide ("étape c") et on incube à
28-300C. Cette étape correspond à la culture biphasique.
Après croissance des microorganismes, on récupère
ceux-ci.
ceux-ci.
Ce procédé est en particulier utilisable pour la préparation d'Actinomycétes b croissance lente, notammentceux appartenant au groupe des Frankia.
Le procédé selon la présente invention met à profit le fait que certains microorganismes, en particulier les Frankia, croissent beaucoup mieux au niveau d'une interface solide/liquide qu'au sein d'un milieu liquide.
Ainsi, par exemple, une culture biphasique liquide/ solide.avec des fragmentsde gélose permet, non seulement l'adhésion de Frankia à leur surface en raison du caractère thigmotrope de ce microorganisme (caractère observé chez certains autres microorganismes ainsi que cela a déjà été signalé), mais également la pénétration de Frankia à l'intérieur de ces supports. Le milieu liquide participe, non seulement à la réalisation de l'interface solide/liquide favorable au développement microbien, mais constitue aussi la réserve de nutriments.
Les milieux nutritifs solides ou liquides peuvent avoir sensiblement les mêmes compositions et constituent, pour l'essentiel, des milieux connus ou des milieux dérivés de milieux connus contenant du carbone, de l'azote, du phosphore, des oligoéléments et autres
éléments assurant la croissance du microorganisme qu'on entend cultiver.
éléments assurant la croissance du microorganisme qu'on entend cultiver.
L'obtention d'un milieu solide peut être réalisée en utilisant de la gélose, mais autres composants peuvent être utilisés pour obtenir un milieu solide.
"L'étape a"peut être conduite dans un récipient du type boîte de Petri. Après culture le milieu solide est fragmenté par des moyens appropriés puis dispersé dans un milieu nutritif liquide. En fin de croissance, les micro organismes obtenus sont récupérés par des techniques connues telles que la centrifugation.
On a constaté, en outre, que l'adjonction au milieu nutritif de charbon activé, en particulier lorsque l'adjonction est effectuée au niveau du milieu solide ("étape a"), permet d'augmenter notablement la biomasse.
Afin d'améliorer encore la qualité de l'inoculum final, on opère de préférence de la façon suivante a) on inclut les microorganismes dans une matrice de
polymère, b) ces matrices incluant les microorganismes obtenus à
l'issue de "l'étape a" sont incubées dans un milieu
permettant la croissance desdits microorganismes
jusqu'à la formation de colonies à l'intérieur desdites
matrices, c) les matrices de polymère incluant les colonies de
microorganismes obtenues au cours de "l'étape b" sont
déshydratées.
polymère, b) ces matrices incluant les microorganismes obtenus à
l'issue de "l'étape a" sont incubées dans un milieu
permettant la croissance desdits microorganismes
jusqu'à la formation de colonies à l'intérieur desdites
matrices, c) les matrices de polymère incluant les colonies de
microorganismes obtenues au cours de "l'étape b" sont
déshydratées.
Les matrices de polymère qui peuvent être mises en oeuvre sont connues de l'homme de métier et figurent notamment dans les brevets mentionnés précédemment. Il pourra s'agir, en particulier, de billes d'alginate de calcium qui sont particulièrement bien appropriées à l'obtention d'un inoculum microbien.
On sait que les microorganismes inclus incubés dans un milieu permettant la croissance sont capables de poursuivre leur croissance à l'intérieur de leur matrice de polymère. On a observé maintenant qu'ils étaient capables, dans cette matrice de polymère, de former des microcolonies, ce qui présente de nombreux avantages. Tout d'abord, on obtient un inoculum b forte densité, mais également la structure fine en microcolonie présente comme avantage de protéger l'inoculum lors de son stockage.
De préférence, pour le stockage, ces matrices de polymère sont déshydratées sans entre fractionnées. Ainsi, lorsque l'on prépare des billes d'alginate de calcium, celles-ci ne sont pas fragmentées mais déshydratées telles quelles.
Dans un mode de réalisation préféré, les microorganisme s inclus dans la matrice de polymère sont obtenus par le procédé décrit précédemment. Les fragments, par exemple de gélose, contenant les microorganismes tels que
Frankia, sont incorporés dans la matrice de polymère, par exemple l'alginate de calcium.
Frankia, sont incorporés dans la matrice de polymère, par exemple l'alginate de calcium.
Enfin, lorsque l'inoculum microbien préalablement déshydraté doit être appliqué in situ, on le réhydrate avec un tampon, par exemple un tampon phosphate,-jusqu'a obtention d'un gel. Ce gel se prête particulièrement bien à la dissémination des microorganismes dans le sol.
Le procédé décrit précédemment permet d t obtenir un inoculum qui, après déshydratation, peut être stocké et transporté sans difficulté, qui présente une biomasse importante et qui peut être dispersé très aisément sous forme du gel.
Les exemples ci-dessous permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
Les milieux de culture utilisés dans ces exemples ont les compositions suivantes 1. Milieu Qmod (Lalonde et Calvert, 1979)
Composants Concentration
K2HP04 0,3 g
NaH2PO4 0,2 g
MgS04 7H20 0,2 g
KCl 0,2 g
Extrait de levure 0,5 g
Peptone 5,0 g
Citrate ferrique 1 ml
(solution à 1 t)
Solution d'oligoéléments * 1 ml
Lécithine 5 mg
Eau distillée 1 1
pH ajusté à 6,8 * Solution d'oligoéléments (g/l)
H3Bo3 : 1,5 ; MnS047H20 : 0,8 ; ZnS047H20 : 0,6
CuSO47H2O : 0,1 ; (NH4)6Mo70244H20 : 0t2 ;
CoS047H20 : 0,01.
Composants Concentration
K2HP04 0,3 g
NaH2PO4 0,2 g
MgS04 7H20 0,2 g
KCl 0,2 g
Extrait de levure 0,5 g
Peptone 5,0 g
Citrate ferrique 1 ml
(solution à 1 t)
Solution d'oligoéléments * 1 ml
Lécithine 5 mg
Eau distillée 1 1
pH ajusté à 6,8 * Solution d'oligoéléments (g/l)
H3Bo3 : 1,5 ; MnS047H20 : 0,8 ; ZnS047H20 : 0,6
CuSO47H2O : 0,1 ; (NH4)6Mo70244H20 : 0t2 ;
CoS047H20 : 0,01.
2. Milieu Qmod + charbon activé (Diem et Dommergues, 1985)
Milieu Qmod précédent
additionné de charbon activé
à la dose de 150 mg/l 3. Milieu BAP (Murry et al., 1984)
Composants Concentration
K2HP04 0,591 g
KH2P04 0,952 g
NH4Cl 0,267 g
MgS04 7H20 0,095 g
CaCl2 2H20 0,010 g
FeNa EDTA 0,010 g
Pyruvate de sodium 1,1 g
Solution d'oligoéléments * 1 ml
Solution de vitamines ** 1 ml
Eau distillée 1 1
pH ajusté à 6,3
* Solution d'oligoéléments (g/l)
H3Bo3 : 2,86 t MnC124H20 : 2,27 ; ZnS047H20 : 0,22
CuS045H20 : 0,08 ; Na2MoO42H20 : 0,025
CoS047H20 : 0,001.
Milieu Qmod précédent
additionné de charbon activé
à la dose de 150 mg/l 3. Milieu BAP (Murry et al., 1984)
Composants Concentration
K2HP04 0,591 g
KH2P04 0,952 g
NH4Cl 0,267 g
MgS04 7H20 0,095 g
CaCl2 2H20 0,010 g
FeNa EDTA 0,010 g
Pyruvate de sodium 1,1 g
Solution d'oligoéléments * 1 ml
Solution de vitamines ** 1 ml
Eau distillée 1 1
pH ajusté à 6,3
* Solution d'oligoéléments (g/l)
H3Bo3 : 2,86 t MnC124H20 : 2,27 ; ZnS047H20 : 0,22
CuS045H20 : 0,08 ; Na2MoO42H20 : 0,025
CoS047H20 : 0,001.
** Solution de vitamines (mg/l)
Thiamine HCl : 10 ; acide nicotinique : 50 ;
pyridoxine HCl : 50 t biotine : 225
acide folique : 10 ; pantothénate de calcium : 10
riboflavine : 10.
Thiamine HCl : 10 ; acide nicotinique : 50 ;
pyridoxine HCl : 50 t biotine : 225
acide folique : 10 ; pantothénate de calcium : 10
riboflavine : 10.
4. Milieu YEM (Yeast extract-mannitol)
Composants Concentration
K2HP04 0,5 g
MgSO4 7H20 0,2 g
NaCl 0,1 g
Yeast extract (Difco) 1,0 g
Mannitol 10,0 g
Eau distillée 1 l 5. Milieu YEM modifié
Même composition que précédemment sauf
K2HP04 qui est utilisé à la concentration de 0,1 g/l
Sur les figures,
- la figure 1 représente l'effet de l'adjonction de charbon actif au milieu de culture sur la croissance de
Frankia :
la : milieu Qmod seul
lb : même milieu avec charbon actif (0,01 t) ; les
points noirs (flèches) apparaissant sur les
boîtes de Petri @ont les colonies de Frankia
(la poudre de charbon n'est pas visible à
cette échelle).
Composants Concentration
K2HP04 0,5 g
MgSO4 7H20 0,2 g
NaCl 0,1 g
Yeast extract (Difco) 1,0 g
Mannitol 10,0 g
Eau distillée 1 l 5. Milieu YEM modifié
Même composition que précédemment sauf
K2HP04 qui est utilisé à la concentration de 0,1 g/l
Sur les figures,
- la figure 1 représente l'effet de l'adjonction de charbon actif au milieu de culture sur la croissance de
Frankia :
la : milieu Qmod seul
lb : même milieu avec charbon actif (0,01 t) ; les
points noirs (flèches) apparaissant sur les
boîtes de Petri @ont les colonies de Frankia
(la poudre de charbon n'est pas visible à
cette échelle).
- la figure 2 représente des billes d'alginate colonisées A l'intérieur par des Frankia :
2a : vue de trois billes (diamètre réel : environ
5 mm)
2b : vue agrandie d'une bille où les colonies de
Frankia (diamètre réel de chaque colonie
100 - 200 Fm) apparaissent comme des taches
circulaires noires à bord diffus , autour de
certaines colonies on observe des amas de
points noirs qui sont des sporanges formés
pendant la croissance de Frankia à l'intérieur
de la bille; les sporanges (flèches) sont des
structures typiques de Frankia ;
EXEMPLE 1 - PROCEDE DE CULTURE EN DEUX ETAPES ET EN MILIEU
BIPHASIQUE DE CERTAINS ACTINOMYCETES A CROISSANCE
LENTE APPARTENANT AU GROUPE DES FRANKIA
La culture se fait en trois étapes :
"Etape a" - On cultive Frankia en boîte de
Petri (10 cm) dans un milieu gélosé pendant 2 à 3
semaines. Pour ce faire, on ensemence, dans la
masse, 10 ml de milieu nutritif gélosé à 1,5 t
fondu à 400C avec 1 ml d'une suspension de Frankia
obtenue par homogénéisation d'une culture de
Frankia. Après 2 - 3 semaines
d'incubation à 300C, les colonies de Frankia se
sont développées dans la gélose (500 à 2 000
colonies par boîte).Chacune de ces plaques de
gélose envahies de colonies de Frankia est
détachée de sa boîte de Petri et introduite stérilement dans une fiole contenant 50 ml d'eau et un barreau magnétique.
2a : vue de trois billes (diamètre réel : environ
5 mm)
2b : vue agrandie d'une bille où les colonies de
Frankia (diamètre réel de chaque colonie
100 - 200 Fm) apparaissent comme des taches
circulaires noires à bord diffus , autour de
certaines colonies on observe des amas de
points noirs qui sont des sporanges formés
pendant la croissance de Frankia à l'intérieur
de la bille; les sporanges (flèches) sont des
structures typiques de Frankia ;
EXEMPLE 1 - PROCEDE DE CULTURE EN DEUX ETAPES ET EN MILIEU
BIPHASIQUE DE CERTAINS ACTINOMYCETES A CROISSANCE
LENTE APPARTENANT AU GROUPE DES FRANKIA
La culture se fait en trois étapes :
"Etape a" - On cultive Frankia en boîte de
Petri (10 cm) dans un milieu gélosé pendant 2 à 3
semaines. Pour ce faire, on ensemence, dans la
masse, 10 ml de milieu nutritif gélosé à 1,5 t
fondu à 400C avec 1 ml d'une suspension de Frankia
obtenue par homogénéisation d'une culture de
Frankia. Après 2 - 3 semaines
d'incubation à 300C, les colonies de Frankia se
sont développées dans la gélose (500 à 2 000
colonies par boîte).Chacune de ces plaques de
gélose envahies de colonies de Frankia est
détachée de sa boîte de Petri et introduite stérilement dans une fiole contenant 50 ml d'eau et un barreau magnétique.
"Etape~bt - Les plaques sont ainsi fragmentées finement en microgranules de gélose qui renferment des colonies ou fragments de colonies de Frankia.
"Etape~c" - La suspension de fragments obtenue comme indiqué ci-dessus est utilisée pour ensemncer un milieu nutritif liquide à raison de 10 ml de suspension de fragments Frankia par 50 ml de milieu nutritif liquide. L'incubation à 300C dure 2 à 3 semaines. La composition du milieu nutritif (gélosé ou liquide) varie suivant les souches de Frankia utilisées. Il peut s'agir soit du milieu Qmod, soit du milieu BAP. Cette étape c" constitue la culture biphaslque.
Détermination de la biomasse de Frankia obtenue
Etant donné que Frankia est un organisme filamenteux, il n'est pas possible d'estimer la biomasse en nombre de cellules comme c'est le cas pour les bactéries. On 1 exprime soit en poids de protéines (ce qui est la solution adoptée ici), soit en poids de la matière sèche.
Etant donné que Frankia est un organisme filamenteux, il n'est pas possible d'estimer la biomasse en nombre de cellules comme c'est le cas pour les bactéries. On 1 exprime soit en poids de protéines (ce qui est la solution adoptée ici), soit en poids de la matière sèche.
Après élimination du milieu nutritif par centrifugation, on introduit le culot de centrifugation dans un tube à essai contenant environ 30 ml d'eau distillée et on met au bain marie en ébullition pendant 2 min pour faire fondre la gélose des microgranules. On verse ensuite tout le contenu du tube dans environ 200 ml d'eau distillée bouillante pour diluer la gélose fondue afin de pouvoir l'éliminer, soit par filtration sur filtre
Millipore, soit par centrifugation. On rince la culture plusieurs fois à l'eau distillée puis on la récolte pour effectuer le dosage de protéines selon la méthode de Lowry et al. (1951).
Millipore, soit par centrifugation. On rince la culture plusieurs fois à l'eau distillée puis on la récolte pour effectuer le dosage de protéines selon la méthode de Lowry et al. (1951).
Comparaison de la méthode usuelle en milieu liquide et de la méthode selon l'invention en milieu biphasique
Afin de comparer ces deux méthodes, on a été amené b conduire la culture en milieu liquide en adoptant la même succession de manipulations que celle préconisée dans le cadre de la présente invention.
Afin de comparer ces deux méthodes, on a été amené b conduire la culture en milieu liquide en adoptant la même succession de manipulations que celle préconisée dans le cadre de la présente invention.
Le tableau 1 résume la succession des opérations dans les deux cas.
TABLEAU 1
COMPARAISON DE LA METHODE DE CULTURE USUELLE EN MILIEU LIQUIDE
ET DE LA METHODE DE CULTURE BIPHASIQUE SELON L'INVENTION AVEC DES FRAGEMENTS DE GELOSE
COMPARAISON DE LA METHODE DE CULTURE USUELLE EN MILIEU LIQUIDE
ET DE LA METHODE DE CULTURE BIPHASIQUE SELON L'INVENTION AVEC DES FRAGEMENTS DE GELOSE
Méthode <SEP> de <SEP> culture <SEP> usuelle <SEP> en <SEP> milieu <SEP> liquide <SEP> Méthode <SEP> de <SEP> culture <SEP> biphasique <SEP> avec <SEP> des
<tb> <SEP> fragments <SEP> de <SEP> gélose
<tb> 1ml <SEP> de <SEP> la <SEP> suspension <SEP> decellules <SEP> de <SEP> Frankia <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> de <SEP> la <SEP> suspension <SEP> de <SEP> cellules <SEP> de <SEP> Frankia
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Culture <SEP> sur <SEP> milieu <SEP> liquide <SEP> pendant <SEP> Culture <SEP> sur <SEP> milieu <SEP> gélosé <SEP> pendant
<tb> 2 <SEP> à <SEP> 3 <SEP> semaines <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 3 <SEP> semaines
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Homogénéisation <SEP> de <SEP> la <SEP> culture <SEP> Homogénéisation <SEP> de <SEP> la <SEP> culture <SEP> et <SEP> obtention
<tb> <SEP> de <SEP> fragments <SEP> de <SEP> gélose <SEP> renfermant <SEP> les
<tb> <SEP> colonies <SEP> de <SEP> Frankia
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Continuation <SEP> de <SEP> la <SEP> culture <SEP> en <SEP> milieu <SEP> Transfert <SEP> des <SEP> fragments <SEP> en <SEP> milieu
<tb> liquide <SEP> pendant <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 3 <SEP> semaines <SEP> liquide <SEP> et <SEP> culture <SEP> pendant <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 3 <SEP> semaines
<tb> <SEP> (culture <SEP> biphasique)
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Centrifugation, <SEP> lavage <SEP> Centrifugation, <SEP> lavage
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Produit <SEP> final <SEP> Produit <SEP> final
<tb> Culture de la souche de Frankia de
Casuarina eguisetifolla ORS 021001
Les résultats qui figurent au tableau 2 montrent clairement que le procédé selon l'invention permet l'obtention d'une biomasse beaucoup plus importante ( x 20) tout en partant-d'un inoculum identique et ce pour la même dure d'incubation.
<tb> <SEP> fragments <SEP> de <SEP> gélose
<tb> 1ml <SEP> de <SEP> la <SEP> suspension <SEP> decellules <SEP> de <SEP> Frankia <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> de <SEP> la <SEP> suspension <SEP> de <SEP> cellules <SEP> de <SEP> Frankia
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Culture <SEP> sur <SEP> milieu <SEP> liquide <SEP> pendant <SEP> Culture <SEP> sur <SEP> milieu <SEP> gélosé <SEP> pendant
<tb> 2 <SEP> à <SEP> 3 <SEP> semaines <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 3 <SEP> semaines
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Homogénéisation <SEP> de <SEP> la <SEP> culture <SEP> Homogénéisation <SEP> de <SEP> la <SEP> culture <SEP> et <SEP> obtention
<tb> <SEP> de <SEP> fragments <SEP> de <SEP> gélose <SEP> renfermant <SEP> les
<tb> <SEP> colonies <SEP> de <SEP> Frankia
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Continuation <SEP> de <SEP> la <SEP> culture <SEP> en <SEP> milieu <SEP> Transfert <SEP> des <SEP> fragments <SEP> en <SEP> milieu
<tb> liquide <SEP> pendant <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 3 <SEP> semaines <SEP> liquide <SEP> et <SEP> culture <SEP> pendant <SEP> 2 <SEP> à <SEP> 3 <SEP> semaines
<tb> <SEP> (culture <SEP> biphasique)
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Centrifugation, <SEP> lavage <SEP> Centrifugation, <SEP> lavage
<tb> <SEP> # <SEP> #
<tb> Produit <SEP> final <SEP> Produit <SEP> final
<tb> Culture de la souche de Frankia de
Casuarina eguisetifolla ORS 021001
Les résultats qui figurent au tableau 2 montrent clairement que le procédé selon l'invention permet l'obtention d'une biomasse beaucoup plus importante ( x 20) tout en partant-d'un inoculum identique et ce pour la même dure d'incubation.
Culture de trois autres souches de
Frankia
Pour vérifier la fiabilité du procédé selon l'invention, on a refait cette expérience à un autre moment de l'année avec trois autres souches de Frankia qui sont les suivantes
ORS 022602 : Frankia d'Allocasuarina stricta
ORS 060501 : Frankia de Colletia spinosa
ORS 140102 : Frankia d'HippoShaë rhamnoides.
Frankia
Pour vérifier la fiabilité du procédé selon l'invention, on a refait cette expérience à un autre moment de l'année avec trois autres souches de Frankia qui sont les suivantes
ORS 022602 : Frankia d'Allocasuarina stricta
ORS 060501 : Frankia de Colletia spinosa
ORS 140102 : Frankia d'HippoShaë rhamnoides.
Les résultats qui figurent au tableau 3 confirment l'amélioration de la production de la biomasse de Frankia par le procédé de culture selon l'invention par rapport à la méthode de culture usuelle. Cette amélioration est plus faible dans cet essai que dans l'essai précédent.
Ceci serait dû à plusieurs causes temps d'incubation réduit à 4 semaines
au lieu de 6 semaines, état physiologique et présence variable
de diverses structures de Frankia (hyphes
végétatifs, sporanges) dans l'inoculum
initial.
au lieu de 6 semaines, état physiologique et présence variable
de diverses structures de Frankia (hyphes
végétatifs, sporanges) dans l'inoculum
initial.
TABLEAU 2
COMPARAISON DE LA CROISSANCE DE FRANKIA ORS 021001 CULTIVEE
SELON LA METHODE USUELLE EN MILIEU LIQUIDE ET SELON LA
NOUVELLE METHODE DE CULTURE BIPHASIQUE AVEC MICROGRANULES
DE GELOSE
BIOMASSE DE FRANKIA (g protéines/fiole)
METHODE APRES 6 SEMAINES
A L'ENSEMENCEMENT D'INCUBATION (1)
Méthode usuelle 2 55
Méthode de culture 2 1 205 biphas ique (1) dont 3 semaines sur milieu gélosé et
3 semaines en milieu biphasique
Milieu nutritif utilisé :Qmod
TABLEAU 3
COMPARAISON DE LA CROISSANCE DE TROIS SOUCHES DE FRANKIA
CULTIVEES SELON LA METHODE USUELLE EN MILIEU LIQUIDE ET
SELON LA NOUVELLE METHODE DE CULTURE BIPHASIQUE AVEC
FRAGMENTS DE GELOSE
BIOMASSE DE FRANKIA (g protéines/fiole)
METHODE ET SOUCHE A L'ENSEMENCEMENT APRES 4 SEMAINES
D'INCUBATION (1)
Souche ORS 022602 Méthode usuelle 2 26 . Méthode biphasique 2 145
Souche ORS 060501 . Méthode usuelle 3 58 . Méthode biphasique 3 315
Souche ORS 140102 . Méthode usuelle 6 41 .Méthode biphasique 6 360 (1) dont 2 semaines sur milieu gélosé et 2 semaines en milieu biphasique
Milieux nutritifs utilisés : même milieu que dans le tableau 2, sauf pour ORS 022602 qui a été cultivé sur milieu BAP
EXEMPLE 2 - EFFET DE L'ADJONCTION DE CHARBON ACTIVE AU
MILIEU DE CULTURE Qmod SUR LE NOMBRE DE
COLONIES DE FRANKIA SOUCHE ORS 021001
On cultive la souche ORS 021001 dans des tubes b essai de 18 x 180 mm contenant 10 ml de milieu Qmod.
COMPARAISON DE LA CROISSANCE DE FRANKIA ORS 021001 CULTIVEE
SELON LA METHODE USUELLE EN MILIEU LIQUIDE ET SELON LA
NOUVELLE METHODE DE CULTURE BIPHASIQUE AVEC MICROGRANULES
DE GELOSE
BIOMASSE DE FRANKIA (g protéines/fiole)
METHODE APRES 6 SEMAINES
A L'ENSEMENCEMENT D'INCUBATION (1)
Méthode usuelle 2 55
Méthode de culture 2 1 205 biphas ique (1) dont 3 semaines sur milieu gélosé et
3 semaines en milieu biphasique
Milieu nutritif utilisé :Qmod
TABLEAU 3
COMPARAISON DE LA CROISSANCE DE TROIS SOUCHES DE FRANKIA
CULTIVEES SELON LA METHODE USUELLE EN MILIEU LIQUIDE ET
SELON LA NOUVELLE METHODE DE CULTURE BIPHASIQUE AVEC
FRAGMENTS DE GELOSE
BIOMASSE DE FRANKIA (g protéines/fiole)
METHODE ET SOUCHE A L'ENSEMENCEMENT APRES 4 SEMAINES
D'INCUBATION (1)
Souche ORS 022602 Méthode usuelle 2 26 . Méthode biphasique 2 145
Souche ORS 060501 . Méthode usuelle 3 58 . Méthode biphasique 3 315
Souche ORS 140102 . Méthode usuelle 6 41 .Méthode biphasique 6 360 (1) dont 2 semaines sur milieu gélosé et 2 semaines en milieu biphasique
Milieux nutritifs utilisés : même milieu que dans le tableau 2, sauf pour ORS 022602 qui a été cultivé sur milieu BAP
EXEMPLE 2 - EFFET DE L'ADJONCTION DE CHARBON ACTIVE AU
MILIEU DE CULTURE Qmod SUR LE NOMBRE DE
COLONIES DE FRANKIA SOUCHE ORS 021001
On cultive la souche ORS 021001 dans des tubes b essai de 18 x 180 mm contenant 10 ml de milieu Qmod.
L'incubation a lieu b 300C et les durées d'incubation sont respectivement de 3 semaines, 1 mois et 2 mois. A la fin de ces périodes d'incubation, chacun des tubes renferme de 50 à 70 g de protéines de Frankia.
On décante chaque culture, pn ajoute 20 ml de milieu Qmod frais et on homogénéise stérilement à l'aide d'un barreau magnétique pendant 1 heure. On fait deux dilutions (10-1 et 10-2) des suspensions obtenues et on inocule deux séries de boîtes de Petri en incorporant 0,5 ml de chaque suspension-dilution à 20 m1 de milieu Qmod gélosé et additionné ou non de charbon activé (Merck Art. 2186) à la dose de 150 mg par litre. On incube les boites de Petri ainsi ensemencées à 300C pendant 3 semaines. On compte le nombre de colonies formées sous une loupe binoculaire, les résultats étant exprimés sur la base de 1 ml d'inoculum.
Le tableau 4 montre clairement que l'adjonction de charbon au milieu accroit le nombre de colonies de Frankia observées, cet accroissement étant considérable dans le cas des cultures de 2 mois.
Ce premier résultat indique que le charbon activé favorise la germination des structures de type spore accumulées dans les cultures de 2 mois (figure 1). D'un autre côté, l'observation à la loupe montre que les hyphes nouvellement formés sont plus ramifiés sur milieu Qmod avec charbon activé que sur milieu Qmod seul, ce deuxième résultat prouvant que le charbon activé favorise la croissance des hyphes.
TABLEAU 4
EFFET DE L'ADJONCTION DE CHARBON ACTIVE AU
MILIEU NUTRITIF (Qmod) SUR LE NOMBRE DE
COLONIES FORMEES A PARTIR DE 1 ml DE
SUSPENSION DE FRANKIA ORS 021001
NOMBRE DE COLONIES FORMEES
CULTURE DE FRANKIA MILIEU Qmod MILIEU Qmod + charbon
Culture.de 3 semaines 1 000 3 400
Culture de 1 mois 8 200 266 000
Culture de 2 mois 4 200 940 000
EXEMPLE 3 - CROISSANCE DE FRANKIA DANS LES BILLES D'ALGINATE
On ensemence 100 ml de milieu Qmod avec 10 ml d'une suspension de cellules de Frankia ORS 021001. Après 4 semaines d'incubation, on obtient une culture renfermant une biomasse de Frankia qui, évaluée en protéines (Lowry et al., 1951), atteint 240 g.On décante la culture, on la transfère dans la même quantité (100 ml) de milieu Qmod liquide frais, on homogénéise avec un barreau magnétique pendant 1 heure. On procède alors à l'inclusion de Frankia dans l'alginate. Pour ce faire, on ajoute 100 ml de milieu
Qmod liquide stérile contenant l'alginate à 4 % S170 (Satialgine S170, Société Bretonne de Produits Chimiques et Pharmaceutiques, 6 impasse Latécoère, Velizy 78140).On obtient ainsi au total 200 ml de suspension de fragments de zo'.sr.ieF de Frankc dans le milieu Qmod contenant 2 % d'alginate
On laisse tomber goutte à goutte aseptiquement cette suspension dans un récipient contenant une solution aqueuse stérile de CaCl2 (1 %) et muni d'un barreau magnétique en agitation continue.
EFFET DE L'ADJONCTION DE CHARBON ACTIVE AU
MILIEU NUTRITIF (Qmod) SUR LE NOMBRE DE
COLONIES FORMEES A PARTIR DE 1 ml DE
SUSPENSION DE FRANKIA ORS 021001
NOMBRE DE COLONIES FORMEES
CULTURE DE FRANKIA MILIEU Qmod MILIEU Qmod + charbon
Culture.de 3 semaines 1 000 3 400
Culture de 1 mois 8 200 266 000
Culture de 2 mois 4 200 940 000
EXEMPLE 3 - CROISSANCE DE FRANKIA DANS LES BILLES D'ALGINATE
On ensemence 100 ml de milieu Qmod avec 10 ml d'une suspension de cellules de Frankia ORS 021001. Après 4 semaines d'incubation, on obtient une culture renfermant une biomasse de Frankia qui, évaluée en protéines (Lowry et al., 1951), atteint 240 g.On décante la culture, on la transfère dans la même quantité (100 ml) de milieu Qmod liquide frais, on homogénéise avec un barreau magnétique pendant 1 heure. On procède alors à l'inclusion de Frankia dans l'alginate. Pour ce faire, on ajoute 100 ml de milieu
Qmod liquide stérile contenant l'alginate à 4 % S170 (Satialgine S170, Société Bretonne de Produits Chimiques et Pharmaceutiques, 6 impasse Latécoère, Velizy 78140).On obtient ainsi au total 200 ml de suspension de fragments de zo'.sr.ieF de Frankc dans le milieu Qmod contenant 2 % d'alginate
On laisse tomber goutte à goutte aseptiquement cette suspension dans un récipient contenant une solution aqueuse stérile de CaCl2 (1 %) et muni d'un barreau magnétique en agitation continue.
Dans ces conditions, les billes se forment au bout de 20 à 30 min dans la solution de CaCl2. Les billes sont immédiatement rincées 10 fois avec de l'eau distillée stérile.
On transfère les billes dans les fioles contenant 50 ml de milieu Qmod liquide (environ 20 ml de billes par fiole) et on incube à 30 C pendant 4 semaines. Après ce délai, l'observation à la loupe montre que de nombreuses colonies de Frankia (20-40 colonies/bille) se sont développées à l'intérieur de chaque bille parfaitement dépourvue de toute contamination microbienne exogène. Ces colonies ont des tailles différentes mais sont parfaitement identiques en ce qui concerne la morphologie et le mode de croissance radiale typique de Frankia. Beaucoup de colonies produisent des sporanges également typiques (figure 2).
EXEMPLE 4 - CROISSANCE DE RHIZOBIUM DANS LES BILLES D'ALGINATE
On fait une culture de Rhizobium souche A16 isolée d'Albizia lebbeck sur un milieu YEM usuel. Après 4 jours d'incubation, on prélève 1 ml que l'on introduit dans 100 ml de milieu YEM modifié, ce milieu est pauvre en phosphate et contient de l'alginate S170 (Satialgine S170, Société
Bretonne de Produits Chimiques et Pharmaceutiques, 6 impasse Latécoère, Velizy 78140). On obtient des billes en effectuant les opérations de l'exemple 3.On fait deux lots de ces billes contenant les cellules de Rhizobium inclus . le premier lot est immergé dans une fiole renfermant du
milieu nutritif liquide YEM modifié mais dépourvu d'alginate . le deuxième lot est incubé dans les mêmes conditions mais en
l'absence de milieu nutritif.
On fait une culture de Rhizobium souche A16 isolée d'Albizia lebbeck sur un milieu YEM usuel. Après 4 jours d'incubation, on prélève 1 ml que l'on introduit dans 100 ml de milieu YEM modifié, ce milieu est pauvre en phosphate et contient de l'alginate S170 (Satialgine S170, Société
Bretonne de Produits Chimiques et Pharmaceutiques, 6 impasse Latécoère, Velizy 78140). On obtient des billes en effectuant les opérations de l'exemple 3.On fait deux lots de ces billes contenant les cellules de Rhizobium inclus . le premier lot est immergé dans une fiole renfermant du
milieu nutritif liquide YEM modifié mais dépourvu d'alginate . le deuxième lot est incubé dans les mêmes conditions mais en
l'absence de milieu nutritif.
Au bout de 48 heures, on constate que le nombre de
Rhizobium dénombré sur milieu Yem normal gélosé passe de 175.103 par bille à 280.105 par bille dans le premier lot, lors que dans le deuxième lot le nombre de Rhizobium reste stationnaire. Ce résultat montre que la croissance de Rhizobium à l'intérieur des billes d'alginate requiert, comme dans le cas de Frankia, l'incubation de ces billes dans un milieu nutritif liquide approprié.
Rhizobium dénombré sur milieu Yem normal gélosé passe de 175.103 par bille à 280.105 par bille dans le premier lot, lors que dans le deuxième lot le nombre de Rhizobium reste stationnaire. Ce résultat montre que la croissance de Rhizobium à l'intérieur des billes d'alginate requiert, comme dans le cas de Frankia, l'incubation de ces billes dans un milieu nutritif liquide approprié.
EXEMPLE 5 - REHYDRATATION DES BILLES D'ALGINATE DESHYDRATEES
Les billes d'alginate renfermant les microorganismes symbiotiques préalablement déshydratées sont immergée s dans une solution de tampon phosphate (pH 6,8) ayant la composition suivante KH2PO4 : 4,29 g ; K2HP04 : 4,34 g ; eau q.s.p. 1 litre.
Les billes d'alginate renfermant les microorganismes symbiotiques préalablement déshydratées sont immergée s dans une solution de tampon phosphate (pH 6,8) ayant la composition suivante KH2PO4 : 4,29 g ; K2HP04 : 4,34 g ; eau q.s.p. 1 litre.
Au bout de 4 à 6 heures, les billes déshydratées reprennent la forme et la consistance initiales des billes fraîches. Par écrasement, il est très facile d'obtenir l'ino culer sous forme d'un gel. Ce traitement au tampon phosphate est indispensable car il permet la libération et la dissémination des microorganismes précédemment inclus ou développés après l'inclusion.
EXEMPLE 6 - INOCULATION DES PLANTES
Pour contrôler la qualité de l'inoculum obtenu par le procédé selon l'invention, on a testé l'infectivité d'un inoculum de Frankia sur Casuarina equisetifolia (Frankia souche ORS 021001) et d'un inoculum de champignon endomycorhizien vésiculo-arbusculaire (Glomus mosseae).
Pour contrôler la qualité de l'inoculum obtenu par le procédé selon l'invention, on a testé l'infectivité d'un inoculum de Frankia sur Casuarina equisetifolia (Frankia souche ORS 021001) et d'un inoculum de champignon endomycorhizien vésiculo-arbusculaire (Glomus mosseae).
Frankia souche ORS 021001
On a d'abord obtenu des plantules de Casuarina
equisetifolia en faisant germer des graines
superficiellement stérilisées (trempage dans
H2S04 concentré pendant 1 min, puis rinçage
abondant avec de l'eau distillée stérile). Les
plantules âgées de 4 semaines ont été repiquées
à raison de 1 plantule par pot en plastique
(diamètre 7 cm, hauteur 7 cm) contenant du sol
stérile humidifié quotidiennement à l'eau stérile.
On a d'abord obtenu des plantules de Casuarina
equisetifolia en faisant germer des graines
superficiellement stérilisées (trempage dans
H2S04 concentré pendant 1 min, puis rinçage
abondant avec de l'eau distillée stérile). Les
plantules âgées de 4 semaines ont été repiquées
à raison de 1 plantule par pot en plastique
(diamètre 7 cm, hauteur 7 cm) contenant du sol
stérile humidifié quotidiennement à l'eau stérile.
Pour inoculer les plantules au moment du repiquage,
on prépare l'inoculum comme suit
. on fait regonfler 120 mg de billes déshydratées
dans le tampon phosphate indiqué ci-dessus ;
. après écrasement on mélange le gel obtenu
avec du sable stérile et l'on répartit en 12 pots,
ce qui revient à apporter à chaque pot inoculé
10 mg de billes déshcratées.
on prépare l'inoculum comme suit
. on fait regonfler 120 mg de billes déshydratées
dans le tampon phosphate indiqué ci-dessus ;
. après écrasement on mélange le gel obtenu
avec du sable stérile et l'on répartit en 12 pots,
ce qui revient à apporter à chaque pot inoculé
10 mg de billes déshcratées.
On a utilisé deux lots d'inoculun : un premier lot
stocké pendant 2 semaines seulement (inoculum nO 1),
un deuxième lot stocké à la température du
laboratoire pendant 1 an (inoculum nO 2). Bien
entendu, parallèlement aux pots inoculés, on a mis
en place une série de pots témoins non inoculés.
stocké pendant 2 semaines seulement (inoculum nO 1),
un deuxième lot stocké à la température du
laboratoire pendant 1 an (inoculum nO 2). Bien
entendu, parallèlement aux pots inoculés, on a mis
en place une série de pots témoins non inoculés.
Après 2 mois de culture, on détermine le poids sec
des parties aériennes des plantes (séchage jusqu'à
poids constant) , le nombre de plantes nodulées et
le nombre de nodules par plante (tableau 5).
des parties aériennes des plantes (séchage jusqu'à
poids constant) , le nombre de plantes nodulées et
le nombre de nodules par plante (tableau 5).
TABLEAU 5
INOCULATION DES PLANTULES DE CASUARINA EQUISETIFOLIA AVEC
ORS 021001 INCLUS DANS LES BILLES D'ALGINATE DESHYDRATEES
PUIS REGONFLEESAU MOMENT DE L'EMPLOI DANS LE TAMPON PHOSPHATE
POIDS SEC PLANTES NODULEES NOMBRE DES
TRAITEMENT DES PLANTES SUR NOMBERE TOTAL NODULES/PLANTE
(mg/plante)
Témoin 80 o / 12 0
Inoculum n01 220 12 / 12 3 - 8
Inoculum n02 170 12 / 12 3 - 5
Inoculum n 1 Billes conservées sous forme déshydratée
pendant 2 semaines à la température du
laboratoire
Inoculum n 2 Billes conservées sous forme déshydratée
pendant 1 an à la température du laboratoire.
INOCULATION DES PLANTULES DE CASUARINA EQUISETIFOLIA AVEC
ORS 021001 INCLUS DANS LES BILLES D'ALGINATE DESHYDRATEES
PUIS REGONFLEESAU MOMENT DE L'EMPLOI DANS LE TAMPON PHOSPHATE
POIDS SEC PLANTES NODULEES NOMBRE DES
TRAITEMENT DES PLANTES SUR NOMBERE TOTAL NODULES/PLANTE
(mg/plante)
Témoin 80 o / 12 0
Inoculum n01 220 12 / 12 3 - 8
Inoculum n02 170 12 / 12 3 - 5
Inoculum n 1 Billes conservées sous forme déshydratée
pendant 2 semaines à la température du
laboratoire
Inoculum n 2 Billes conservées sous forme déshydratée
pendant 1 an à la température du laboratoire.
Glomus mosseae
On a inclus dans les billes d'alginate les structures de Glomus mosseae (hyphes libres ou dans les racines, spores) suivant la méthode décrite par
Diem et al. (1981) et Ganry et al. (1982). On a repiqué des plantules de Vigna unguiculata âgées de 7 jours dans des pots en terre cuite (diamètre 15 cm, hauteur 20 cm) contenant du sol stérile.
On a inclus dans les billes d'alginate les structures de Glomus mosseae (hyphes libres ou dans les racines, spores) suivant la méthode décrite par
Diem et al. (1981) et Ganry et al. (1982). On a repiqué des plantules de Vigna unguiculata âgées de 7 jours dans des pots en terre cuite (diamètre 15 cm, hauteur 20 cm) contenant du sol stérile.
Un premier lot de 5 plantes a été inoculé avec un inoculum qui est un mélange de sable et de gelée préparé de la même façon que précédemment décrit mais à partir de billes déshydratées contenant les structures de Glomus mosseae. Ces billes avaient été stockées pendant 1 an à 1a tem?érature du laboratoire. On a apporté à chaque pot inoculé l'équivalent de 30 mg de billes déshydratées.
Un deuxième lot de 5 plantes a été constitué par les plantes non inoculées.
Le tableau 6 montre que l'inoculum de Glomus mosseae est parfaitement infectif à la dose utilisée et après conservation pendant 1 an.
TABLEAU 6
INOCULATION DES PLANTULES DE VIGNA UNGUICULATA AVEC GLOMUS
MOSSEAE INCLUS DANS LES BILLES D'ALGINATE DESHYDRATEES PUIS
REGONFLEESAU MOMENT DE L'EMPLOI DANS LE TAMPON PHOSPHATE
TRAITEMENT PLANTES INFECTEES FREQUENCE D'INFECTION
SUR NOMBRE TOTAL
Témoin O / 5 o
Inoculum n" 1 5 / 5 86
Inoculum nO 1 : Billes conservées sous forme déshydratée
pendant 1 an
Fréquence d'infection : nombre de morceaux de racine (3 mm)
infectés sur nombre total observé REFE RENCE S
DIEM H.G. et Y.R. DOMMERGUES (1985) In vitro production of
specialized reproductive torulose hyphae by Frankia
strain ORS 021001 isolated from Casuarina
junghuhniana root nodules. Plant and Soil 87:17-29.
INOCULATION DES PLANTULES DE VIGNA UNGUICULATA AVEC GLOMUS
MOSSEAE INCLUS DANS LES BILLES D'ALGINATE DESHYDRATEES PUIS
REGONFLEESAU MOMENT DE L'EMPLOI DANS LE TAMPON PHOSPHATE
TRAITEMENT PLANTES INFECTEES FREQUENCE D'INFECTION
SUR NOMBRE TOTAL
Témoin O / 5 o
Inoculum n" 1 5 / 5 86
Inoculum nO 1 : Billes conservées sous forme déshydratée
pendant 1 an
Fréquence d'infection : nombre de morceaux de racine (3 mm)
infectés sur nombre total observé REFE RENCE S
DIEM H.G. et Y.R. DOMMERGUES (1985) In vitro production of
specialized reproductive torulose hyphae by Frankia
strain ORS 021001 isolated from Casuarina
junghuhniana root nodules. Plant and Soil 87:17-29.
LALONDE M. et H.E. CALVERT (1979) Production of Frankia hyphae
and spores as an infective inoculant for Alnus
species. In : Symbiotic Nitrogen Fixation in the
Management of Temperate Forests. (J.C. Gordon,
C.T. Wheeler et D.A. Perry, eds) pp. 95-110.
and spores as an infective inoculant for Alnus
species. In : Symbiotic Nitrogen Fixation in the
Management of Temperate Forests. (J.C. Gordon,
C.T. Wheeler et D.A. Perry, eds) pp. 95-110.
(Corvallis, Forest Research Laboratory).
LOWRY O.H., N.J. ROSEBROUGH, A.L. FARR et R.J. RANDALL (1951)
Protein measurements with the folin phenol reagent.
Protein measurements with the folin phenol reagent.
J. Biol. Chem., 193: 265-275.
MURRY M.A., N.S. FONTAINE et J.G. TORREY (1984) Growth
kinetics and nitrogenase induction in Frankia sp.
kinetics and nitrogenase induction in Frankia sp.
HF?ArI3 grow in batch culture. Plant and Soil,
78: 61-78.
78: 61-78.
Claims (13)
1. Procédé de préparation d'un inoculum microbien, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes : a) on inclut les microorganismes dans une matrice de
polymère, b) les matrices de polymère incluant les microorganismes
obtenues à l'issue de 1,l'étape a" sont incubées dans
un milieu permettant la croissance desdits microorga
nismes jusqu'à la formation de colonies à l'intérieur
desdites matrices, c) les matrices de polymère incluant les colonies de micro
organismes obtenues au cours de "l'étape b" sont deshy
dratées.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère est sous forme de fragments.
3. Procédé de préparation d'un inoculum microbien selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le polymère utilisé est de l'alginate de calcium.
4. Procédé de préparation d'un inoculum microbien selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les microorganismes sont des microorganismes symbiotiques des plantes.
5. Procédé de préparation d'un inoculum microbien selon la revendication 4, caractérisé en ce que les microorganismes appartiennent au groupe des Frankia ou des
Rhizobium.
6. Procédé de préparation d'un inoculum microbien selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que les matrices de polymère obtenues se présentent sous la forme de billes ou de granules.
7. Procédé de préparation d'un inoculum microbien selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les microorganismes à partir desquels on fabrique ledit inoculum sont obtenus par un procédé de culture biphasique.
8. Procédé de préparation d'un inoculum microbien selon la revendication 7 avec un procédé de culture biphasique dans lequel a) on cultive les microorganismes sur un milieu nutritif
solide ("8tape a"), b) après culture, on fragmente ce milieu solide colonisé
par les microorganismes ("étape b"), c) on ensemence avec les fragments obtenus à 1' "étape b"
un milieu nutritif liquide ("étape c"), après croissance des microorganismes, on récupère ceux-ci.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le microorganisme cultivé est un Actinomycète croissance lente , en particulier appartenant au groupe des Frankia.
10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le milieu nutritif solide utilisé dans l'étape a) contient de la gélose.
11. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on ajoute au milieu nutritif du charbon activé.
12. Inoculum microbien caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 7
13. Application de l'inoculum microbien selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'avant utilisation les matrices de polymère sont réhydratées avec un tampon jusqu'à l'obtention d'un gel.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR868609528A FR2601032B1 (fr) | 1985-12-04 | 1986-07-01 | Procedes de preparation d'un inoculum microbien et de culture de microorganismes inclus, inoculum obtenu et son application |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR858517933A FR2590904B1 (fr) | 1985-12-04 | 1985-12-04 | Procede de culture de microorganismes, et de preparation d'inoculums comportant ces microorganismes, inoculum obtenu et son application |
| FR868609528A FR2601032B1 (fr) | 1985-12-04 | 1986-07-01 | Procedes de preparation d'un inoculum microbien et de culture de microorganismes inclus, inoculum obtenu et son application |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2601032A1 true FR2601032A1 (fr) | 1988-01-08 |
| FR2601032B1 FR2601032B1 (fr) | 1988-10-21 |
Family
ID=26224858
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR868609528A Expired FR2601032B1 (fr) | 1985-12-04 | 1986-07-01 | Procedes de preparation d'un inoculum microbien et de culture de microorganismes inclus, inoculum obtenu et son application |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2601032B1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2535583A1 (es) * | 2013-11-11 | 2015-05-12 | Marhlidy MONADA AMAYA | Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de patógenos |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1981001714A1 (fr) * | 1979-12-06 | 1981-06-25 | Purdue Research Foundation | Micro-organismes myceliens sous forme de comprimes |
| US4518693A (en) * | 1982-11-01 | 1985-05-21 | Research Corporation | Immobilized biocatalysts |
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1986
- 1986-07-01 FR FR868609528A patent/FR2601032B1/fr not_active Expired
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1981001714A1 (fr) * | 1979-12-06 | 1981-06-25 | Purdue Research Foundation | Micro-organismes myceliens sous forme de comprimes |
| US4518693A (en) * | 1982-11-01 | 1985-05-21 | Research Corporation | Immobilized biocatalysts |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 2, 1985, pages 107-117, Elsevier Science Publishers B.V.; H. NAKAJIMA et al.: "Entrapment of Lavandula vera cells and production of pigments by entrapped cells" * |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2535583A1 (es) * | 2013-11-11 | 2015-05-12 | Marhlidy MONADA AMAYA | Control microbiológico para recuento de microorganismos y aislamiento de patógenos |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2601032B1 (fr) | 1988-10-21 |
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