FR2591901A1 - Procede et appareil d'extraction selective de macromolecules a partir d'une solution de plasma - Google Patents

Abstract

Procédé permettant d'extraire de manière plus sélective des macromolécules à partir d'une solution de plasma, caractérisé selon l'invention en ce qu'il consiste : à présenter une solution de plasma contenant les macromolécules à extraire, à porter et/ou à maintenir ce plasma à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure au point d'ébullition de cette solution de plasma, et à filtrer, à l'aide d'un filtre à membrane, cette solution chauffée de plasma tant qu'elle se trouve à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais au-dessous de son point d'ébullition, afin d'extraire de manière plus sélective les macromolécules hors de cette solution de plasma. L'invention concerne également un appareil pour la mise en îoeuvre du procédé. (CF DESSIN DANS BOPI)

Description

259 1 901

La présente invention concerne la filtration de macromolécules à partir de fluides, et plus particulièrement l'extraction de macromolécules indésirables à partir de solutions de plasma, à l'aide du procédé appelé thermofiltration. La séparation des matières dissoutes indésirables à partir du plasma sanguin par filtration du plasma est un procédé connu permettant de traiter des maladies, ces maladies ayant en commun des niveaux élevés indésirables en matières dissoutes dans le plasma telles que des toxines, un excès d'anti-corps et d'autres facteurs métaboliques. Un traitement réussi de ces maladies implique l'élimination des matières indésirables dissoutes dans le plasma, hors de ce plasma sanguin, par filtration sur membrane. On a mis au point divers procédés de filtration du plasmas parmi lesquels la filtration en cascade, la double filtration et la cryofiltration. Toutefois, ces procédés contiennent un certain nombre de

caractéristiques indésirables qui en limitent l'usage.

La demanderesse a noté un certain nombre de paramètres qui sont liés aux performances du procédé, parmi lesquels la conception du module, les propriétés de la membrane, la composition du plasma et la température du plasma et de la filtration. Comme caractéristiques du module qui influent sur la dynamique de l'écoulement et, de là sur les performances, on peut citer l'aire, le fluide et les dimensions du film, ainsi que les propriétés de la membrane séparatrice parmi lesquelles le type de polymère et les caractéristiques microstructurelles telles la taille des pores, leur

sinuosité, leur longueur et leur nombre.

Des variations dans la composition du plasma influent également sur sa filtration. Des plasmas provenant de patients présentant des états différents de maladie ou offrant des teneurs différentes en macromolécules ont des caractéristiques différentes de filtration. Le rendement de la filtration sera influencé par la manipulation du plasma qui est réalisée pour provoquer des variations du pH ou de la composition de l'électrolyte et par l'addition d'anticoagulants tels que l'héparine ou d'autres additifs d'agglomération des macromolécules tels que le polyéthylèneglycol. En général, de telles manipulations sont effectuées dans le but d'accroître la séparation de l'une des matières dissoutes ou d'un groupe de celles-ci, par

rapport au plasma, par précipitation ou agglomération des macromolécules.

En raison du nombre des paramètres qui influent sur le rendement de la filtration, on a démontré que le choix de la température et son contrôle constituent un paramètre clé dans la séparation des fluides. Pour accroître l'extraction sélective dans un domaine macromoléculaire particulier, il est extrêmement important de travailler dans la gamme convenable de température. A cet égard, on a noté des différences notables pour des conditions comparables de filtration (débits de travail, types de module et types de plasma analogues) entre la filtration en cascade et la double filtration, qui fonctionnent à des températures presque ambiantes, et la cryofiltration, qui fonctionne à des températures inférieures à une

O10 température physiologique déterminée.

Le contrôle de température offre de nombreux avantages par rapport aux autres paramètres dans la mesure o ce contrôle de température constitue le paramètre physique que l'on contrôle le plus aisément et o on peut combiner le contrôle de température avec l'utilisation de divers agents complexants afin d'accroître la sensibilité de l'extraction des macromolécules. Un exemple caractéristique peut en être donné dans le cas de la cryofiltration o l'addition d'heparine favorise la formation d'un cryogel en formant des complexes avec de la fibronectine et du fibrinogène

à des températures inférieures a 25 C.

La filtration effectuée à une température sous-physiologique est efficace dans l'extraction des constituants du plasma qui sont d'une taille analogue, mais diffèrent au niveau de la sensibilité a la température. On peut traiter de cette manière un certain nombre de maladies autoimmunes, comme cela était décrit dans la littérature. L'efficacité du traitement est attribuée à la formation et l'extraction d'un cryogel qui est composé de concentrations élevees des macromolécules associées aux états de maladie autoimmune. De la sorte, la séparation qui s'effectue dans la cryofiltration n'est pas basée sur la taille moléculaire à la température

physiologique, mais sur la taille moléculaire à des températures réduites.

Toutefois, un fonctionnement à une température réduite peut en fait réduire la sélectivité de la séparation des molécules lorsque les différences de taille sont grandes étant donné que l'agglomération ou la formation de complexes de petites molécules peuvent également se produire à des températures réduites. Par conséquent, pour une séparation basee sur des différences de taille à des températures physiologiques, il peut être

plus avantageux d'éviter la formation d'un cryogel.

En conséquence, la présente invention a pour but de fournir des moyens appropriés permettant d'extraire hors de fluides, d'une manière

effective et efficace, des macromolécules indésirables.

A cet effet, l'invention a pour objet un procédé permettant d'extraire de manière plus sélective des macromolécules à partir d'une solution de plasma, caractérisé en ce qu'il consiste à présenter une solution de plasma contenant les macromolécules à extraire, à porter et/ou à maintenir ce plasma à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure au point d'ébullition de cette solution de plasma, et à filtrer, à l'aide d'un filtre à membrane, cette solution chauffée de plasma tant qu'elle se trouve à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais au-dessous de o10 son point d'ébullition, afin d'extraire de manière plus sélective les macromolécules hors de cette solution de plasma. En outre, du fait du chauffage de la solution de plasma, diverses macromolecules présentes dans la solution de plasma peuvent devenir inactivées ou dénaturees, ce qui

favorise leur extraction sélective par filtration du plasma.

L'invention a également pour objet un procédé permettant d'extraire de manière sélective des macromolécules hors d'une solution de plasma, caractérisé en ce qu'il consiste à assurer un écoulement de sang à partir d'un échantillon, à séparer cet écoulement de sang en un courant d'éléments cellulaires concentrés et un courant de plasma contenant des macromolécules à extraire, à porter ou maintenir le courant de plasma contenant des macromolécules à extraire à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure à son point d'ébullition, à filtrer, à l'aide d'un filtre à membrane, ce courant chauffé de plasma tant qu'il se trouve à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure à son point d'ebulition, de facon à extraire de manière plus sélective les macromolécules hors de la solution de plasma afin de former un courant de plasma filtre, et à combiner ce courant de plasma filtré et ledit courant d'éléments cellulaires de façon à constituer un courant de plasma traité, et à refroidir et/ou renvoyer à

l'échantillon ce courant de plasma traité.

L'invention a encore pour objet un procéde permettant de contrôler des conditions anormales du plasma dans un organisme vivant en extrayant de manière sélective des macromolécules hors d'une solution de plasma, caractérise en ce qu'il consiste à assurer un écoulement de sang à partir d'un organisme vivant, à séparer cet écoulement de sang en un courant d'éléments cellulaires concentrés et un courant de plasma contenant des macromolécules à extraire, à porter ou maintenir le courant de plasma contenant des macromolécules à extraire à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inferieure à son point

-2591901

d'ébullition, à filtrer, à l'aide d'un filtre à membrane, ce courant chauffé de plasma tant qu'il se- trouve à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure à son point d'ébullition, de façon à extraire de manière plus sélective les macromolécules hors de la solution de plasma afin de former un courant de plasma filtré, et à combiner ce courant de plasma filtré et ledit courant d'éléments cellulaires de façon à constituer un courant de plasma traité, et à refroidir et/ou à renvoyer à l'organisme vivant ce courant de plasma

traité.

L'invention a également pour objet un appareil permettant d'extraire d'une manière plus sélective des macromolécules hors d'une solution de plasma, caractérisé en ce qu'il comprend un moyen permettant de recevoir et de diviser une solution contenant un plasma, qui contient des macromolécules et provient d'un échantillon, en un courant d'éléments cellulaires concentrés et un courant de plasma, un moyen permettant de recevoir le courant de plasma, le porter et/ou le maintenir à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure à son point d'ébullition, un moyen permettant de recevoir et de filtrer ce courant chauffé de plasma afin d'extraire de manière sélective les macromolécules, un moyen permettant de recevoir le courant de plasma filtré à partir des moyens de filtration et permettant de recevoir le courant d'éléments cellulaires concentrés et de combiner les courants afin de constituer un courant traité sensiblement exempt des macromolécules que l'on désire extraire, et des moyens permettant de recevoir et/ou de faire refroidir le courant combiné jusqu'à une température normale du corps afin

de renvoyer ledit fluide à l'échantillon.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront

de la description qui va suivre, à titre d'exemple non limitatif et en

regard des dessins annexés sur lesquels: la figure 1 représente le circuit utilisé dans une filtration in vitro, la figure 2 représente le circuit extracorporel utilisé dans la filtration ex vivo ou clinique, la figure 3 représente la quantité de cholestérol extraite à des températures différentes pour une filtration in vitro, la figure 4 représente les coefficients moyens de tamisage avec divers types de plasma (module Kuraray Eval 4A, in vitro à 37 C), la figure 5 représente la répartition granulométrique de la lipoprotéine pour le plasma HCF et le plasma de chien avec divers niveaux de cholestérol, et la figure 6 représente la récupération post-traitement du

cholestérol LBD-LTBD et LHD.

La demanderesse a constaté que la thermofiltration offre de nombreux avantages par rapport aux procédés classiquement connus de filtration du plasma. La thermofiltration consiste à extraire des macromolécules hors du plasma en portant ce plasma à une température sélective voisine ou supérieure à la température physiologique normale, mais ne dépassant pas son point d'ébullition, et à filtrer le plasma chauffé à l'aide d'un filtre à membrane présentant une porosité qui extraira les macromolécules voulues. Les avantages d'importance critique o10 qui sont offerts par la thermofiltration comprennent la capacité de filtrer un volume beaucoup plus grand de plasma à des températures plus élevées, étant donné que du plasma exposé à la température plus élevée a moins tendance à former des dépôts de matières dissoutes indésirables sur le milieu à membrane, ainsi que l'extraction plus sélective des macromolécules qui est basée sur des différences dans les coefficients de tamisage à des

températures plus élevées.

Une analyse des filtres de filtration de plasma à membranes multiples portant sur la structure, la taille des pores et la matière du filtre indique que le module Kuraray Eval 4A (copolymère d'éthylène et d'alcool vinylique, Kuraray Co., Japon) et d'autres modules de propriétés analogues conviennent particulièrement bien au fractionnement des matières dissoutes du plasma par thermofiltration. Comme autres filtres convenables, on peut citer ceux qui utilisent des milieux de filtration constitués d'une polysulfone, de polypropylène, de nylon, de polyester, d'acétate de

cellulose, de collagène et de milieux analogues.

La demanderesse a démontré que les coefficients de tamisage de certaines macromolécules sont notablement plus élevés à 37 C et 42 C qu'à C pour le module Kuraray Eval 4A (tableau I ci-dessous). Les tamisages très élevés du cholestérol LHD, de l'IgG, du fibrinogène, de la protéine totale et de l'albumine à 37 à 42 C sont particulièrement remarquables. En outre, il résulte de la réduction de la formation de cryogel à ces températures plus élevées que l'on peut filtrer un volume beaucoup plus grand de plasma. Cela est dû au fait qu'à des températures voisines ou supérieures à la température physiologique normale, l'agglomération des matières dissoutes est maintenue à un minimum et que la séparation est due aux différences de taille moléculaire des matières dissoutes et non aux

compositions d'agglomération.

TABLEAU I: Coefficients de tamisage pour diverses macromolécules PT Alb Glb Fib IgG IgA IgM Volume traité(ml)

C 0,61 0,71 0,48 < 0,06 0,36 0,21 0,15 1 000

37 C 0,74 0,82 0,59 0,13 0,55 0,51 0,17 1 000>3 000

42 C 0,74 0,86 0,59 0,26 0,57 0,46 0,18 1 0003 000

Chol T LBD LHD TG Volume traité (ml)

C 0,07 0,03 0,71 0,13 <1 000

37 C 0,06 0,02 0,84 0,11 1 000%3 000

42 C 0,04 0,03 0,97 0,13 1 0003 000

Toutes les macromolécules proviennent de la même source de plasma. Dosage

d'héparine: 1 000 U/L.

PT: protéine totale; Alb: albumine; Glb: globuline; Fib: fibrinogéne; Chol T: cholestérol total; LBD: lipoprotéine basse densité; LHD: lipoproteine

haute densité; TG: triglycérides.

Par ailleurs, la thermofiltration constitue un procédé efficace permettant d'extraire des pyroglobulines hors de solutions de plasma. Les pyroglobulines sont des globulines du sérum qui précipitent ou se gélifient lorsqu'on les chauffe. Normalement, on ne trouve pas de pyroglobulines dans le sérum des individus normaux. Elles sont au contraire couramment associés aux macroglobulinémies et autres désordres lymphoproliférants ou à myélomes multiples. Le chauffage d'un sérum contenant des pyroglobulines à 55-56 C entraine la formation d'un gel que l'on peut extraire d'une manière efficace hors du sérum par filtration du plasma. D'une manière analogue, on peut également extraire de manière sélective par thermofiltration des proteines et d'autres immunoglobulines qui se dénaturent ou coagulent d'une

manière effective lorsqu'on les chauffe.

Il résulte des avantages ci-dessus, que la thermofiltration présente par rapport aux procédés classiquement connus de séparation du plasma, que l'on peut utiliser cette thermofiltration pour extraire de manière sélective des macromolécules pathologiques hors du sang par des traitements du plasma en circuit ou hors circuit, tout en permettant

simultanément le passage ou le retour des proteines avantageuses du plasma.

L'avantage de ce type de traitement peut être clairement vu dans le

contrôle thérapeutique du cholestérol.

On a établi que le cholestérol est un constituant important de la formation de l'infection artérielle dans l'artériosclérose ainsi que dans l'hypercholestérolémie. Le cholestérol circule dans le sang en étant lié à des molécules de proteines de grandes dimensions. On sait qu'une forme de proteines portant du cholestérol, appelee lipoprotéine basse-densité (LBD)

259190 1

favorise l'artériosclérose. Environ les deux tiers ou plus du cholestérol total du sang est transporté dans les LBD. On sait qu'une autre forme, appelée lipoprotéine haute-densité (LHD) protège contre le processus de la maladie. Par conséquent, une extraction sélective des LBD et le maintien des LHD sont importants dans le traitement de l'artériosclérose et le

contrôle thérapeutique de l'hypercholestérolémie.

Récemment, on a utilisé un échange de plasma pour extraire le plasma et le remplacer, sur des malades atteints d'hypercholestérolémie familiale, par des solutions d'électrolyte et/ou des produits de type plasma. Toutefois, ces procédés ne sont pas sélectifs et extraient de manière proportionnelle des lipoprotéines basse-densité (LBD) avec des lipoprotéines haute-densité (LHD) et d'autres protéines du plasma qui sont bénéfiques pour le malade. On a par ailleurs étudié plusieurs procédés permettant l'extraction sélective des LBD, parmi lesquels les colonnes Sépharose anti-LBD-anticorps et des combinaisons d'une précipitation de l'héparine et d'une dialyse du bicarbonate. Toutefois, la filtration sur membrane offre de nombreux avantages par rapport à ces procédés en ce qui concerne la biocompatibilité et l'efficacité rapportée au coot du traitement. On peut démontrer, à la fois sous des conditions in vitro et ex vivo, l'extraction sélective du cholestérol LBD par thermofiltration à partir du plasma. L'expérimentation in vitro se présente dans les conditions d'un équipement de laboratoire, tandis que l'expérimentation ex vivo se présente dans les conditions d'une circulation extracorporelle sur

des organismes vivants.

1. Filtration in vitro On utilise in vitro divers types de plasma dans le but d'analyser l'influence de la température sur l'extraction sélective du cholestérol. On conduit les essais de filtration in vitro avec ces divers types de plasma à des températures variables et conformément au circuit extracorporel

présenté sur la figure 1.

Sur cette figure 1, on ajoute une unité par ml d'héparine (injection héparine-sodium, Invenex Lab., Ohio, USA) à un réservoir de plasma 10 dans lequel ce plasma est maintenu à approximativement 37 C à

l'aide d'un régulateur de température 12 et d'un agitateur magnétique 14.

Le plasma est soutiré de ce réservoir 10 par un conduit 16 et est envoyé à une pompe à plasma 18 dont le débit de plasma est de 15 ml/mn. Le plasma est pompé par cette pompe 18 dans un conduit 20, puis dans un bain d'eau 22 qui est contrôlé par un régulateur de température 24. Dans ce bain d'eau 22, le plasma traverse un échangeur thermique 26 et se dirige, en passant par un manomètre 28, dans un filtre 30 o le cholestérol LBD est retenu, tandis que le cholestérol LHD et l'albumine le traversent de manière notable. A partir de ce filtre 30, le plasma filtré moins le cholestérol LBD s'écoule à travers un conduit 32 jusque dans un bac collecteur de

filtrat 34.

Les exemples particuliers suivants illustrent de manière plus

précise la mise en oeuvre de la présente invention.

EXEMPLE I

On s'est procuré du plasma hypercholestérolémique de type II familial (HCF) par échange centrifuge répété de plasma. On a conduit les essais de filtration in vitro avec ce plasma HCF et avec le filtre à membrane Kuraray Eval 4A, à des températures respectivement de 4, 25, 37, 42 et 47 C, conformément au circuit extracorporel présenté sur la figure 1 et tel que décrit ci-dessus. On a déterminé, aux températures ci-dessus et à l'aide des calculs suivants, les coefficients moyens de tamisage (ct), le

volume de plasma traité et la quantité totale de cholestérol LBD et LHD.

Coefficient de tamisage (ct) - concentration dans le filtrat (mg/dl) concentration dans l'entrée du filtre (mg/dl) o un coefficient de tamisage de 0,9 à i indique peu de séparation ou d'extraction, ou pas du tout, des macromolécules à partir du plasma et un coefficient de tamisage de O à 0,1 indique une extraction pratiquement

totale des macromolécules hors de ce plasma.

Quantité d'extraction (g) = Concentration dans le bassin de plasma (g/dl) x(I-ct) x volume traité (dl)

RESULTATS

Le tableau II fait ressortir le volume traité et les coefficients moyens de tamisage pour le cholestérol total, le cholestérol LHD, le cholestérol LBD et l'albumine à diverses températures. Les résultats ont indiqués que l'on a extrait plus de 85% du cholestérol total et de 90% du cholestérol LBD, tandis que plus de 70% de l'albumine et de 60% du cholestérol LHD ont traversé le filtre. Les coefficients de tamisage du cholestérol LHD et de l'albumine ont augmenté avec la température, tandis

que le cholestérol LBD a été indépendant de la température.

TABLEAU II: coefficients moyens de tamisage et volumes traités de plasma à diverses températures; essai de filtration in vitro de Kuraray Eval 4A (aire superficielle 1,0 M) en utilisant un plasma hypercholestérolémique familial.

259 1901

coefficients moyens de-tamisage Temps ( C) Volume traité Cholestérol Cholestérol cholestérol (ml) total LHD LBD Alb

4 365 0,10 0,58 0,07 0,72

1135 0,11 0,76 0,10 0,84

37 1780 0,12 0,67 0,06 0,81

42 2150 0,16 0,72 0,08 0,91

47 2350 0,14 0,79 0,08 0,94

La figure 3 prouve que l'extraction du cholestérol est différente lorsque la température varie. A 37 à 42 C, la quantité extraite de cholestérol LBD est la plus grande (4,5 g par module), tandis que le cholestérol LHD est inférieur à 0,1 g. La quantité d'extraction par module s'est trouvée limitée

par la Ptm (300 mm Hg) permise.

Conclusion: La thermofiltration s'avère hautement efficace, sous des conditions in vitro, pour extraire de manière sélective des quantités importantes de cholestérol LBD à partir du plasma, tout en retenant des quantités importantes d'albumine et de cholestérol LHD utiles. La filtration in vitro sur membrane d'un plasma HCF à l'aide du filtre EVAL A4 permet un rejet presque complet du cholestérol LBD avec une retenue ou un tamisage élevé du cholestérol LHD et de l'albumine. Les coefficients de tamisage de ce cholestérol LHD et de cette albumine ont augmenté avec la température, tandis que le coefficient de tamisage du cholestérol LBD correspondait à un rejet presque complet à toutes les températures. De la sorte, la filtration sur membrane au voisinage ou au-dessus des températures physiologiques, c'est à dire la thermofiltration, améliore la sélectivité de l'extraction du

cholestérol LBD par rapport à celle du cholestérol LHD et de l'albumine.

En outre, cette thermofiltration permet également de traiter des volumes plus élevées de plasma. Cela résulte de la réduction de la formation de cryogel et d'une extraction moindre des matières dissoutes que l'on ne désire pas extraire, aux températures élevées. De plus, on traite des volumes plus élevé de plasma et on extrait des quantités plus importantes de cholestérol par

module élémentaire.

EXEMPLE II

On a conduit des essais de filtration in vitro sur module avec du plasma humain normal (PHN) et du plasma à cholangite sclérosante (PCS) en utilisant l'Eval 4A (copolymère d'éthylène et d'alcool vinylique; aire superficielle 2,0 m2) à respectivement 4 ,25 ,37 ,42 , 47 et 52 C, conformément au circuit extracorporel représenté sur la figure 1 et tel que décrit ci-dessus. On s'est procuré le PHN par filtration à 37 C d'un plasma traité au citrate et hors de date, en utilisant le séparateur de plasma Toray PS-05 (polyméthacrylate de méthyle; aire superficielle 0,5 m2; Toray

Industries, Japon). On s'est procuré le PCS par échange de plasma sur membrane.

Ce PCS différait du PHN en ce que le PCS présentait des concentrations 1, 5 fois plus élevées en fibrinogène et 4 fois plus élevées en cholestérol LBD, avec des niveaux analogues en albumine et en antithrombine II par comparaison avec le PHN. On a conduit tous les essais de filtration sous un débit de plasma de ml/mn. On a contrôlé les variations de la pression d'entrée en fonction de

la pression transmembrane et elles ont traduit un colmatage de la membrane.

On a analysé des échantillons obtenus avant et après filtration en ce qui concerne diverses matières biochimiques dissoutes parmi lesquelles l'albumine (Alb), le fibrinogène (Fib), le cholestérol total (Chol T), le cholestérol LBD (Chol LBL), le cholestérol LHD (Chol LHD), l'antithrombine III (AT III) et l'héparine. On a mesuré l'Alb avec un analyseur automatique (SMA-II, Technicon Instrument Co., Tarrytown, NY) par le procédé au vert de bromocrésol. On a mesuré le Fib à l'aide du Fibrosystème (BBL, Ockeysville, Maryland, USA). On a mesuré le chol T et les triglycérides à l'aide d'un analyseur automatique (AA-II, Technicon Inst.Co.) en utilisant le procédé enzymatique oxydase-peroxydase du cholestérol. On a calculé le chol LBD par: chol T-chol LHD-1/5 triglycérides. On a mesuré le chol LHD par le procédé de précipitation au sulfate de dextrane-Mg2+. On a mesuré l'antithrombine III et l'héparine à l'aide de l'essai au substrat synthétique héparine et

antithrombine III Protopath (American Dade, Miami, Floride, USA).

RESULTATS

Les figures 4A et 4B représentent les volumes traités et les coefficients de tamisage pour la filtration du PHN et du PCS sur la gamme de températures de 4 à 52 C. Dans l'un et l'autre plasmas, on a traité des

volumes plus élevés lorsque l'on a augmenté la température de 4 à 52 C.

Toutefois, le volume traité n'a pas augmenté pour des températures supérieures à 42 C et il a chuté de manière notable à 52 C. Les tamisages pour l'Alb ont augmenté avec une température croissant de 4 à 420C, puis ensuite également chuté. On peut voir une tendance analogue dans le fibrinogène. On a observé des augmentations notables du chol LHD dans la gamme de températures de 4 à 42 C o on n'a pas noté de variations notables dans le chol LBD. Le tamisage du chol LHD a également chuté à 52 C. L'extraction totale du chol LBD et les rapports d'extraction du chol LHD et de l'Alb par rapport au chol LBD font l'objet d'une liste dans le tableau III. C'est à 42 C que l'on a obtenu des quantités d'extraction maximale du chol LBD et d'extraction minimale du chol LHD et de

l'Alb par rapport à l'extraction du chol LBD.

TABLEAU III: extraction totale et rapports d'extraction cholestérol LHD/cholestérol LBD et albumine/cholestérol LBD, en utilisant du plasma de

malades PHN et PCS à diverses températures.

Plasma Temps C 4 25 37 420 470 52 PHN LBD Chol LBD (mg) 130 347 932 1854 1549 198 chol LHD 0,95 0,76 0,45 0,19 0,23 0,48 chol LBD Alb 31,1 18, 2 10,5 5,6 6,5 14,1 chol LBD PCS chol LBD (mg) 887 1458 2368 3130 2790 1216 chol LHD 0,016 0,021 0,008 0,001 0,007 0,05 chol LBD Alb 6,2 5,6 2,9 2,2 3,2 4,8 chol LBD PHN = plasma humain normal PCS = plasma de cholangite sclérosante Conclusion: ces résultats suggèrent qu'il est prometteur de travailler a une température presque physiologique dans le but de prévenir une agglomération induite par l'héparine et qui survient au-dessous de la température physiologique, ainsi qu'un colmatage du filtre provoqué par ces dép6ts lorsqu'on utilise pour séparer les molécules des membranes à pores de très faible taille. Comme le montrent les figures 4 A et 4 B, une filtration au-dessus de la température physiologique (jusqu'à 47 C) produit des volumes traités plus importants et un passage plus élevé d'albumine et de cholestérole LBD. Ces résultats indiquent i'intérêt prometteur de la filtration du plasma au voisinage ou au-dessus de 37 C, c'est-à-dire de la thermofiltration, pour une utilisation clinique dans la séparation des matières dissoutes du plasma basée sur des différences de taille (à savoir la séparation sélective des LBD par

rapport au tamisage LHD). II. Filtration ex vivo La filtration ex vivo est constituée par le

filtrage continu du plasma, en circuit avec des organismes vivants. On a conduit les essais de filtration

ex vivo à 37 C et conformément au circuit corporel représenté sur la figure 2.

Si l'on se reporte à cette figure 2, du sang est extrait d'une artère d'un organisme vivant vers un conduit 36, puis envoyé vers une pompe 38 à partir de laquelle il est pompé dans un conduit 40, pour passer par un manomètre 42 et jusque dans un séparateur de plasma 44 o sont séparés le plasma et les éléments cellulaires du sang. Les éléments cellulaires concentrés du sang sont envoyés dans un conduit 46, tandis que le plasma est envoyé dans une tuyauterie 48. A partir de cette ligne 48, le plasma s'écoule à travers une pompe 50, en direction d'un conduit 52 par laquelle il pénètre dans un bain d'eau 54 contrôlé par un régulateur de température 56. A l'intérieur de ce bain sd'eau 54, le plasma traverse un échangeur de chaleur 58 pour parvenir, en passant par un manomètre 60, jusque dans un filtre 62 dans lequel le cholestérol LBD se trouve substantiellement retenu, mais que traversent substantiellement le cholestérol LHD, l'albumine et d'autres macromolécules de

poids moléculaire élévé.

A partir du filtre 62, le plasma filtré, qui est essentiellement dépourvu de cholestérol LBD, s'écoule à travers une tuyauterie 64 et fait l'objet d'un mélange mutuel avec les éléments cellulaires du sang du conduit 46. Le mélange fait alors l'objet soit d'un refroidissement jusqu'à la température du corps, dans un échangeur de chaleur 66, soit d'une introduction dans un conduit 68 o il passe par un manomètre 70 et est envoyé dans un conduit 72 pour être renvoyé à une veine de l'organisme vivant, suivant un

processus continu.

Les exemples particuliers suivants illustrent de manière plus détaillés

la mise en oeuvre de la présente invention.

Exemple 3 En raison de la similitude de ses lipoprotéines et de sa taille corporelle qui convient pour une filtration en circuit, un chien à hypercholestérol a constitué le modèle choisi pour une filtration ex vivo. Le modèle canin thyroîdectomisé au régime est un modèle bien déterminé qui a été étudié de manière extensive. En utilisant ce modèle, on a analysé trois gammes différentes de niveaux de cholestérol allant jusqu'à 600 mg/dl (normale

mg/dl).

On a réalisé des fistules artério-veineuses (AV) sur deux chiens males de race mongrel et en bonne santé pesant de 24 à 30 kg. A titre de contrôle, on a maintenu les chiens sous un régime normal (lab Canine Diet 5006; Lab Chow, St. Louis, Missouri, USA). Pour servir de modèle à concentration moyenne en cholestérole, on a maintenu le même chien au même régime après une thyroîdectomie chirurgicale. Pour servir de modèle à concentration élevée en cholestérol, on a maintenu le chien, après thyrotdectomie, sous un régime spécial qui était constitué du repas normal auquel était ajouté 4 % d'huile de coprah hydrogénée et 0,75 % d'acide cholique (TD 75337, Taklad, Madison,

Wisconsin, USA).

On a procédé à des essais de filtration ex vivo sur ces chiens, à des niveaux différents en cholestérol, sous anesthésie générale à l'oxyde nitreux

9 1901

gazeux sous injection de Nembutal (solution de Nembutal de sodium, Abbott Lab, IL). On a utilisé une fistule AV pour l'accès au sang et on a injecté 200 unités/kg d'heparine en tant qu'anticoagulant. On a séparé le plasma dans le système extracorporel en circuit en utilisant un séparateur de plasma à membrane (Mitsubishi 60TW, polyethylène, Mitsubishi Rayon Co., Japon). On a filtré le plasma séparé en utilisant le même procédé que dans la filtration in vitro (à 37 C) et on a alors recombiné ce plasma filtré et on l'a renvoyé vers le chien (fig. 3). Les débits utilisés de sang et de plasma étaient respectivement de 60 et 15 ml/mn. On a filtré l'un des volumes calculés de plasma. On a introduit par perfusion par voie intraveineuse, au cours de la

circulation extracoporelle, 800 à 1000 ml de solution de Ringer au lactate.

On a extrait simultanément des échantillons à partir des tuyauteries d'artère et de plasma de l'entrée et de la sortie du filtre une fois qu'un volume et demi a été traité, ceci avant et après traitement. A une heure et à 1, 3, 7, 14 et 21 jours après traitement, on a prélevé des échantillons de sang après un jeûne de 14 à 16 heures. On a alimenté les chiens suivant le même régime qu'avant la filtration et à volonté. Les mesures biochimique ont porté sur le cholestérol et les triglycérides (analyse automatique AA II, Technicon Instrument Co., NY), le cholestérol LHD (procéde de précipitation au sulfate de dextrane-MgCl2), avec en outre une analyse multiple de routine du serum (système SMA-II, Technicon Instrument Co.) et une analyse hématologique

(compteur automatique de cellules, Coulter Electronics Inc., FL).

On a calculé la concentration du plasma humain en cholestérol LBD en

utilisant l'équation: cholestérol total - cholestérol LHD - 1/5 triglycérides.

On a calculé la concentration en cholestérol LBD-LTBD dans les chiens de la manière suivante: cholestérol total - cholestérol LHD. On a préparé pour l'analyse les fractions de lipoprotéines à l'aide d'une ultracentrifugeuse préparatoire (LBD humain: 1,006<d<1,063, LHD humain: 1, 063<d<1,21, LBD-LTBD canin: d<1,063, LHD canin: 1,087<d<1,21), o d = densité. On a mesuré les tailles des particules de lipoprotéines en utilisant des microphotographies électroniques à contrainte negative. Ces fractions de lipoprotéines canines ne sont pas homogènes, mais sont comparables aux fractions obtenues par des

procédes de précipation.

RESULTAT

Le tableau IV fait ressortir les concentrations du cholestérol au divers stades du modèle canin. Le cholestérol total, et plus particulièrement le cholestérol LBD - LTBD, s'est trouvé accru et le rapport de ce cholestérol LBD - LTBD au cholestérol LHD s'est trouvé accru de plus de 10 fois. L'albumine ne manifestait aucune modification notable. On a réalisé une filtration du plasma en circuit pour chaque niveau du cholesterol. La pression transmenbrane (Ptm) du séparateur de plasma a été stable tout au long du processus. Les coefficients de tamisage de l'albumine et du cholestérol total et des autres macromolécules ont été supérieurs à 95 %. La Ptm du filtre à macromolécules a augmenté. Les valeurs de Ptm pour un volume traité de plasma se trouvaient dans la gamme de 10 à 256 mm Hg. Des différences notables dans les variations de Ptm

ne dépendaient pas des concentrations du cholestérol.

TABLEAU IV.Niveaux de cholestérol et d'albumine sur un modèle canin hypercholestérolémique. NIVEAU DE CHOLESTEROL (mg/dl) NIVEAU D'ALBUMINE TOTAL LHD LBD - LTBD (g/dl) I: 137 + 24 115 + 15 21 + 9 3,00 + 0,06 (n=3) II: 395 + 30 181 + 13 214 + 17 3,25 + 0,07 (n=2) III: 600 + 14 219 + 30 382 + 16 3,25 + 0,21 (n=2) I: chien normal sous régime normal II: chien thyroîdectomisé sous régime normal II: chien thyroidectomisé avec une addition de 4% d'huile de coco hydrogénee et de 0,75% d'acide cholique au régime normal Le tableau V fait ressortir les coefficients moyens de tamisage pour les divers niveaux de cholestérol. Le cholestérol LBD-LTBD se trouvait fortement rejeté par le filtre de plasma, alors que l'albumine et le cholestérol LHD manisfaitaient un tamisage élevé. Le ct du cholestérol LBD-LTBD

diminuait avec l'augmentation du cholestérol.

TABLEAU V. Coefficients moyens de tamisage du filtre à macromolécules; essai de filtration ex vivo en circuit (37 C) Kuraray Eval 4A à différents niveaux de cholestérol

NIVEAU DE CHOLESTEROL NIVEAU D'ALBUMINE

TOTAL LHD LBD - LTBD

I: 0,60 + 0,10 0,63 + 0,09 0,39 + 0,07 0,88 + 0,07 (n=3) II: 0,42 + 0,08 0,61 + 0,11 0,32 + 0,01 0,95 + 0,06 (n=2) III: 0,34 + 0,05 0,59 + 0,09 0, 19 + 0,04 0,93 + 0,04 (n=2) + moyenne - écart type La figure 5 représente la répartition granulométrique des lipoproteines pour le plasma HCF et les plasmas de chien à divers niveaux de cholestérol. La différence de granulométrie entre le LHD et le LBD du plasma HCF était supérieure à celle des plasmas de chien. Les diamètres de particule et l'écart du LBDLTBD dans les plasmas de chien ont également augmenté, mais dans une mesure qui n'est pas aussi importante qu'avec le plasma humain. La granulométrie du LHD n'a pas été d'une différence notable parmi les differents

259 1 901

groupes. La figure 5 démontre le redressement des cholestérols LBD-LTBD et LHD après traitement. Le redressement du cholestérol LBD-LTBD a été prolongé dans les groupes de niveaux plus élevés en cholestérol. Pour les groupes II et III, cela a pris environ deux semaines pour revenir aux valeurs avant traitement. Le redressement du cholestérol LHD a été constant et est revenu dans les sept jours aux valeurs avant traitement, pour tous les groupes. La figure 6 fait apparaître les variations dans les rapports cholestérol LBD-LTBD/cholestérol LHD. Ce rapport a diminué au cours des périodes après filtration et a été maintenu à un niveau très faible pendant quatorze jours. La tendance à un rapport plus fortement réduit pour des périodes plus longues, par comparaison aux valeurs avant et après traitement, s'est avérée supérieure dans le groupe

III qui présentait le cholestérol le plus élevé.

Conclusion: les données indiquent que les coefficients de tamisage et la taille des particules de lipoprotéine dépendent fortement de la concentration du cholestérol. Lorsque cette concentration du cholestérol augmente, la taille des particules de lipoprotéine (en particulier LBDLTBD) augmente, le tamisage

diminue et l'extraction du cholestérol total (cholestérol LBD-LTBD) augmente.

Une comparaison des coefficients de tamisage indique que le tamisage du LBD-LTBD canin est supérieur à celui du LBD humain. Cette corrélation s'explique par l'étude de la taille des particules qui indique des chevauchements et des écarts plus importants entre le LHD et les LBD-LTBD canins, ce qui rend plus difficile la séparation des lipoprotéines sur les plasmas canins que sur les plasmas humains. Ces résultats indiquent qu'une thermofiltration serait tout à fait efficace sur des plasmas humains si l'on

considère l'extraction sélective des lipoprotéines.

Par ailleurs, les données indiquent qu'il existe un redressement plus prolongé du cholestérol LBD-LTBD dans les stades plus hypercholestérolémiques, alors que le redressement du cholestérol LHD demeure relativement normal. La réduction du cholestérol LBD avec préservation du cholestérol LHD par thermofiltration et le redressement prolongé du cholestérol LBD-LTBD avec maintien d'un rapport LBD/LHD plus faible suggèrent fortement qu'il s'agit d'un

procédé efficace pour traiter les situations anormales des lipoprotéines.

EXEMPLE IV

On a mis en oeuvre des procédures cliniques initiales de thermofiltration sur un malade à hypercholestérolémie secondaire. Le malade choisi pour l'essai était un homme agé de 39 ans qui avait une concentration élevée (210-450 mg/dl) de cholestérol et un rapport de cholestérol LBD/LHD très

élevé (8-30) du fait de la cholestase d'une cholangite sclérosante.

On a conduit les essais de thermofiltration conformément au système en circuit représenté sur la figure 2. On a réglé le débit sanguin à 100 ml/mn et le débit de plasma à 30 ml/mn. On a utilisé en tant que séparateur de plasma les modules Toray PS-05 (Toray Industries, Tokyo, Japon) et Asahi Plasmaflo (AP 0511, Asahi Medical Co., Tokyo, Japon), et on a utilisé en tant que filtre à plasma l'Eval 4A 2,0 m2 (Kuraray Co. Osaka, Japon). On a enveloppe le filtre et ne plaque plus chaude à l'aide d'un coussin de chauffage électrique afin de maintenir la température à 37 C dans la cryochambre du Cryomax (Cryomax 360, Parker Biomedical, Irvine, Californie, U.S.A). Pour l'anticoagulation, on a injecte 5000 U d'heparine en tant que fébrifuge avant de déclencher la circulation extracorporelle. On a surveillé de manière continue tout au long du processus le volume de plasma traite et la pression transmembrane. On a procéde à la filtration jusqu'à ce que la pression transmembrane (Ptm) du filtre à plasma atteigne 500 mm Hg. On a extrait simultanément des échantillons a partir des tuyauteries d'entrée et de sortie de plasma du filtre lorsque la Ptm a

atteint 150 et 300 mm Hg, en vue de calculer les coefficients de tamisage (ct).

On a calculé le tamisage des matières dissoutes comme étant la concentration dans le filtrat divisée par la concentration dans l'entrée de plasma du filtre à plasma. Des mesures biochimiques ont porté sur le cholestérol et les triglycérides (analyse automatique AAII, Technicon Instrument Co., Tarrytowm, New York, U.S.A) et sur le cholestérol LHD (procéde de précipitation sulfate de dextrane-MgC12), en plus de l'analyse multiple de routine du sérum (SMA-II, Technicon Instrument Co). On a retiré le filtre du circuit à la suite d'un colmatage, et on a remplacé le procéde de plasmapherèse par un échange de plasma, en utilisant une solution à 5 % d'albumine en tant de fluide de substitution. On a poursuivit l'échange de plasma jusqu'à ce qu'un volume

calculé de plasma ( 2893 ml) ait été traité par échange de plasma seul.

On a procéde à des études de filtration in vitro en utilisant le même filtre, la même température et un plasma provenant du même patient que cela

était décrit dans l'exemple 1.

RESULTATS

Le processus a bien été toléré par le malade et l'on n'a noté aucune réaction défavorable. On n'a utilisé aucun fluide de substitution pendant la phase de thermofiltration. Sous une Ptm de 500 mm Hg. 1355 + 275 ml (1160 et 1540 ml) de plasma ont été filtrés et 1117 + 183 ml (980 et 1253 ml) ont été filtrés sous une Ptm de 300 mm Hg. L'évolution de la Ptm en fonction du volume filtré a été comparable aux examens in vitro effectués avec ce plasma du malade, et il en a été de même du volume filtré (1060 ml traités à 300 mm Hg de

Ptm in vitro).

259 1 901

Il s'est produit un rejet presque complet du cholestérol LBD + LTBD (ct = 0,02) et un passage élevé d'albumine (ct = 0,75) et de cholestérol LHD (ct = 0,78). Le tamisage du fibrinogène a été faible (0,07). Ces résultats se sont avérés comparables aux résultats de filtration in vitro. (Tableau VI ci-dessous).

TABLEAU VI

Concentration et coefficients de tamisage (ct)

(moyenne + écart type).

Protéine totale (g/dl) Albumine (g/dl) Cholesterol total (mg/dl) Cholestérol LHD (mg/dl) Cholestérol LBD (mg/dl) Cholestérol LBD-LTBD (mg/dl) Fibrinogène (mg/dl) Protéine totale (g/dl) Albumine (g/dl) Cholestérol total (mg/dl) Cholestérol LHD (mg/dl) Cholestérol LBD (mg/dl) Cholestérol LBD-LTBD (mg/dl) Fibrinogène (mg/dl) Clinique (ex vivo)* Concentration

6,8 + 1,0

3,2 + 0,2

181 + 47

17 + 7

+ 40

163 + 41

286 + 84

** In vitro Concentration

6,2 + 0,3

3,6 + 0,1

274 + 2

11 + 3

228 + 12

263 + 5

298 + 28

des matières dissoutes ct

0,64 + 0,09

0,75 + 0,06

0,09 + 0,00

0,78 + 0,09

0,01 0,02 + 0,Oi

0,07 + 0,03

ct

0,72 +

0,82 +

0,06 +

0,84 +

0,02 +

0,03 +

0,13 +

0,02 0,03 0,01 0,08 0,02 0,02 0,03 LHD: lipoprotéines haute densité; LBD: lipoprotéines basse densité

LTBD: lipoprotéines très basse densité Ptm pression transmembrane.

* valeur moyenne de quatre échantillons, prélevés à une Ptm de 150 mm Hg et

300 mm Hg à partir de chacun de deux traitements.

** valeur moyenne de trois essais de filtration sous les mêmes conditions.

CONCLUSION

Les coefficients de tamisage du cholestérol LBD (0,02), du cholestérol LHD (0,78) et de l'albumine (0,75) ont démontré la sélectivité de la thermofiltration. Ces résultats sont comparables aux essais de filtration in vitro utilisant le plasma du même malade. L'avantage de ce système par comparaison à l'échange du plasma réside dans le maintien du LHD (lipoprotéine) antiartériogénique) et d'autres matières dissoutes essentielles du plasma se trouveraient rejetées dans un échange de plasma. La thermofiltration est plus sélective que les processus à membrane sans contrôle de température et elle est plus simple à mettre en oeuvre étant donnée qu'elle n'exige pas d'autres étapes de traitement du plasma, ni l'adjonction d'additifs chimiques éventuellement nocifs. Par ailleurs, la thermofiltration peut également permettre l'extraction efficace de concentrations anormales de diverses protéines (telles que des immunoglobulines).

Claims (32)

REVENDICATIONS

1. Procédé permettant d'extraire de manière plus sélective des macromolécules à partir d'une solution de plasma, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à présenter une solution de plasma contenant les macromolécules à extraire, b) à porter et/ou a maintenir ce plasma à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure au point d'ébullition de cette solution de plasma, et c) à filtrer, à l'aide d'un filtre à membrane, cette solution chauffee de plasma tant qu'elle se trouve à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais au-dessous de son point d'ébullition, afin d'extraire de manière plus sélective les macromolécules hors de cette solution

de plasma.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on procède

au chauffage dans une gamme de températures d'environ 35 à environ 60 C.

3. Procéde selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on procède au

chauffage dans une gamme de températures d'environ 37 à environ 52 C.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le filtre a membrane présente une porosité inférieure à celle des macromolecules sélectives

à extraire de la solution de plasma.

5. Procéde selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on sépare les macromolécules de la solution de plasma sur la base des différences existant

dans les coefficients de tamisage aux températures élevées.

6. Procéde selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit les macromolécules à extraire dans le groupe constitué par les lipoproteines base densité (LBD), les pyroglobulines, les protéines de poids molécule élevé

et des mélanges de celles-ci.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le plasma est constitué par un plasma normal, à cholangite sclérosante et à

hypercholestérolémie de type IIa.

8. Procédé permettant d'extraire de manière sélective des macromolécules hors d'une solution de plasma, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à assurer un écoulement de sang à partir d'un échantillon, b) à séparer cet écoulement de sang en un courant d'éléments cellulaires concentrés et un courant de plasma contenant des macromolécules à extraire, c) à porter ou maintenir ce courant de plasma contenant des macromolécules à extraire à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure à son point d'ébullition, d) à filtrer, à l'aide d'un filtre à membrane, ce courant chauffe de plasma tant qu'il se trouve à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure à son point d'ebullition, de façon à extraire de manière plus sélective les macromolécules hors de la solution de plasma afin de former un courant de plasma filtré, et e) à combiner ce courant de plasma filtré et ledit courant d'éléments

cellulaires de façon à constituer un courant de plasma traite.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérise en ce qu'on refroidit le courant de plasma du processus avant qu'il ne soit combiné avec le courant

d'éléments cellulaires.

O10

10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on renvoie

le courant de plasma traité vers l'échantillon.

11. Procéde selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à pomper le sang à partir du malade avant qu'il ne donne lieu à un

courant sépare.

12. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'on effectue la séparation de l'écoulement de sang en un courant d'éléments cellulaires concentres et un courant de plasma, soit à l'aide d'un filtre à

membrane, soit à l'aide d'une centrifugeuse.

13. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on procède

au chauffage du courant de plasma dans la gamme de températures de 35 C à 60 C.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on procède

au chauffage dans une gamme de températures d'environ 37 C à environ 52 C.

15. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le filtre a membrane macromoléculaire présente une porosité inférieure à celle des

macromolécules sélectives à extraire de la solution de plasma.

16. Procéde selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'on sépare les macromolécules sélectives par rapport a la solution de plasma sur la base des différences existant dans les coefficients de tamisage à température élevée.

17. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les macromolécules sélectives à extraire sont des lipoprotéines base densité (LBD), des pyroglobulines, des protéines à poids moléculaire élevé ou des mélanges de celles-ci.

18. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le

processus est continu.

19. Procédé permettant de contrôler des conditions anormales du plasma dans un organisme vivant par extraction de manière sélective des macromolécules hors d'une solution de plasma, caractérisé en ce qu'il consiste: a) à assurer un écoulement de sang à partir d'un organisme vivant b) à séparer cet écoulement de sang en un courant d'éléments cellulaires concentrés et un courant de plasma contenant des macromolécules à extraire, c) à porter le courant de plasma contenant des macromolécules à extraire à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure à son point d'ébullition, d) à filtrer, à l'aide d'un filtre à membrane, ce courant chauffé de plasma tant qu'il se trouve à une température voisine ou supérieure à la température normale du corps, mais inférieure à son point d'ébullition, de façon a extraire de manière plus sélective les macromolécules hors de la solution de plasma afin de former un courant de plasma filtre, et e) à combiner ce courant de plasma filtré et ledit courant d'éléments

cellulaires de façon à constituer un courant de plasma traité.

20. Procéde selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'on refroidit le courant de plasma du processus avant qu'il ne soit combiné avec le

courant d'éléments cellulaires.

21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'on renvoie

le courant de plasma traité vers l'organisme vivant.

22. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il consiste en outre à pomper le sang à partir de l'organisme vivant avant qu'il ne donne

lieu à un courant séparé.

22. Procédé selon la revendication 19, caractérise en ce que l'on effectue la séparation de l'écoulement de sang en un courant d'eléments cellulaires concentrés et un courant de plasma, à l'aide d'un filtre à membrane.

23. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'on procède au chauffage du courant de plasma dans la gamme de températures d'environ 35 C

à environ 60 C.

24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'on procède

au chauffage dans une gamme de températures d'environ 37 C à environ 52 C.

25. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le filtre à membrane macromoléculaire présente une porosité inférieure à celle des

macromolécules sélectives à extraire de la solution de plasma.

26. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'on sépare les macromolècules par rapport à la solution de plasma sur la base des

différences existant dans les coefficients de tamisage à température élevee.

27. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les macromolécules sélectives sont des lipoproteines base densité, des pyroglobulines, des proteines à poids moléculaire élevé ou des mélanges de celles-ci.

28. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que lesdites caractéristiques anormales des lipoprotéines existent dans des conditions de lipidémie.

29. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le processus est continu.

30. Appareil permettant d'extraire des macromolécules sélectives à partir d'une solution de plasma, caractérisé en ce qu'il comprend: a) des moyens permettant de diviser une solution contenant un plasma contenant des macromolécules, en un courant d'éléments cellulaires concentrés et un courant de plasma, b) des moyens permettant de porter ledit courant de plasma à une température supérieure à la température normale du corps, mais inférieure a son point d'ébullition, c) des moyens permettant de filtrer le courant chauffé de plasma afin d'extraire de manière sélective les macromolécules, d) des moyens permettant de recevoir le courant de plasma filtré et le courant d'éléments cellulaires concentrés, en les combinant de façon à former un

courant traité sensiblement exempt de macromolécules sélectives.

31. Appareil selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens permettant de refroidir ledit courant combiné jusqu'à la température normale du corps, en vue de renvoyer ce fluide vers l'échantillon.

32. Appareil selon la revendication 30, caractérisé en ce que les moyens de chauffage sont adaptés de façon à porter le courant de plasma à une

température se trouvant dans la gamme d'environ 35 C à environ 60 C.