FR2583061A1 - Procede de production de la l-lysine par fermentation - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE PRODUCTION DE LA L-LYSINE PAR FERMENTATION; ON CULTIVE DANS UN MILIEU DE CULTURE UNE SOUCHE MUTANTE DU GENRE BREVIBACTERIUM OU CORYNEBACTERIUM 1 CAPABLE DE PRODUIRE LA L-LYSINE ET 2 AYANT UNE ACTIVITE ACCRUE DE SUPEROXYDE-DISMUTASE.

Description

La présente invention concerne la production de la
L-lysine par fermentation. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de fermentation pour la production de la L-lysine par emploi d'un micro-organisme appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium.

On a proposé un grand nombre de procédés pour produire la L-lysine par fermentation. Ils comprennent : le procédé utilisant des souches résistant à la S-(2-aminoéthyl)-1-cystéine (désignée ci-apres par l'abréviation AEC) décrit dans le brevet japonais publié nO 55213 (1967) ; le procédé utilisant des souches mutantes résistant à l'AEC et qui sont L-leucine-négatives,
L-homosérine-négatives, L-proline-négatives, L-arginine-négatives ou L-alanine-négatives (désignées ci-apres comme Alla ) décrit par les demandes de brevets japonais mises à l'inspection publique n" 36888 (1974), n" 80289 (1974) et n" 21078 (1976) ; le procédé utilisant des souches mutantes résistant à l'AEC et aux analogues de la leucine telles que la ss-hydroxyleucine (désignée ci-après par l'abréviation HL) décrit par le brevet japonais publié n" 1833 (1978) ; le procédé utilisant des souches mutantes résistant à l'a-chlorocaprolactame (désigné ci-après par l'abréviation CCL) décrit par le brevet japonais publié nO 43591 (1978) ; le procédé utilisant la y-méthyllysine (désignée ci-après par labréviation ML) décrit par le brevet japonais publié n" 19235 (1981) ; le procédé utilisant des souches sensibles à l'acide fluoropyruvique (désigné ci-apres par l'abréviation FP) décrit par la demande de brevet japonais mise à l'inspection publique n" 9783 (1980) ; et le procédé utilisant des souches mutantes ayant une activité d'acide pyruvique-kinase réduite décrit par la demande de brevet japonais mise à l'inspection publique n" 170487 (1983).

Tous ces procédés de production par fermentation de la
L-lysine sont coûteux, ce qui rend la L-lysine elle-même coûteuse.

En raison de la demande considérable de L-lysine, on s'efforce donc de trouver un procédé plus économique pour la production de la L-lysine.

La présente invention a pour objet :
- de fournir un nouveau procédé pour la production de la
L-lysine ;
- de fournir un nouveau procédé pour la production par fermentation de la L-lysine ; et
- de fournir un nouveau procédé économique pour la production par fermentation de la Lysine.

La demanderesse a découvert que,de façon étonnante, le procédé de L'invention permet d'atteindre tous les buts ci-dessus ainsi que d'autres qui apparaitront à la lecture de la description de L'invention qui figure ci-après. Le procédé repose sur La découverte de la demanderesse selon laquelle la culture dans un mi lieu de culture liquide d'une souche mutante appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium, capable de produire la
L-lysine et ayant une activité intensifiée de superoxyde-dismutase, permet d'obtenir la L-lysine de façon très économique.

Les modes de réalisation préférés de l'invention vont maintenant être décrits de façon détaillée.

Des études d'amélioration des souches visant à obtenir des rendements de fermentation accrus ont conduit la demanderesse à découvrir que l'accroissement de l'activité de superoxydedismutase d'une souche productrice de L-lysine accroît considérablement sa capacité de production de la L-lysine. L'invention repose sur cette découverte.

L'invention concerne donc un nouveau procédé pour la production par fermentation de la L-lysine. Ce procédé comprend la culture dans un milieu de culture Liquide d'une souche mutante appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium. La souche mutante uitlisée est capable de produire la L-lysine et a une activité accrue de superoxyde-dismutase. La L-lysine formée et accumulée dans le liquide de culture est ensuite recueillie.

Les micro-organismes utilisés dans le procédé de l'invention peuvent être obtenus par mutation d'une souche appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium capable de produire la
L-lysine et ayant une activité intensifiée de superoxyde-dismutase.

A partir des mutants ainsi obtenus, on sélectionne et utilise tes souches qui résistent aux accélérateurs de production de superoxyde, aux inhibiteurs de L'induction de la superoxyde-dismutase, aux accélérateurs de réaction radicalaire des superoxydes et aux agents oxydants qui fournissent de l'oxygène pour La formation de superoxyde. Les souches mutantes ainsi sélectionnées ont une activité intensifiée de superoxyde-dismutase.

Les souches mères dont dérivent les souches productrices de L-lysine-utilisées dans l'invention peuvent être des espèces quelconques appartenant au genre Brevibacterium ou Corynebacterium.

Cependant, les souches connues comme corynéformes productrices d'acide L-glutamique énumérées ci-dessous sont particulièrement appropriées.

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Corynebacterium acetoacidophyrum ATCC 13870
Corynebacterium lilium ATCC 15990
On peut utiliser ces mutants auxquels de nouvelles propriétés avantageuses pour la production de L-Lysine (par exemple la résistance à l'AEC, le CCL et La ML, la sensibilité au FP, à la thréonine et à la méthionine et les caractères homosérinenégatifs et Alla ) ont été conférées.

On peut employer, pour obtenir les souches mutantes de l'invention, une irradiation par les ultraviolets, une irradiation par les rayonx X, un traitement avec un mutagéne et toute autre technique couramment utilisée pour la mutation des micro-organismes à partir d'une souche de Brevibacterium ou de Corynebacterium à laquelle des propriétés avantageuses de production de la Lysine ont été conférées. Le traitement avec 250 pg/ml de N-nitro-N' méthyl-N-nitrosoguanidine à 30"C pendant 20 min constitue un exemple.

Le stade suivant consiste à sélectionner à partir des cellules variantes ainsi produites les souches qui résistent aux accélérateurs de production de superoxyde, aux inhibiteurs de
L'induction de superoxyde-dismutase, aux accélérateurs de réaction radicalaire des superoxydes ou aux agents oxydants qui fournissent de l'oxygène pour la formation de superoxyde. Tous ces agents ont pour activité d'accélérer la formation de peroxylipidespar reaction entre un superoxyde (02) et des acides gras insaturés. En d'autres termes, les souches résistant à ces agents doivent avoir une activité cellulaire importante et être capables de se propager activement, même dans des conditions défavorables à t'activité cellulaire. En fait, la demanderesse a démontré qu'elles conviennent le mieux à la production de la L-lysine.

Les accélérateurs de la production de superoxyde sont des agents qui accélèrent la production de superoxyde dans les organismes vivants. Ils comprennent le méthylviologène, la nitro furantoine, La vitamine K1, la morphine, ta streptonigrine, l'adriamycine, la mitomycine C, la daunomycine, la bléomycine, le ss-rapacon et le cis-platine(II)diamino-dichlorure.

Les inhibiteurs de l'induction de la superoxyde-dismutase sont des agents qui inhibent la formation de superoxyde-dismustase dans les organismes vivants ; cette enzyme transforme un superoxyde en peroxyde d'hydrogène. La puromycine en est un exemple typique.

Les accéLérateurs de la réaction radicalaire des superoxydes sont des agents qui accélèrent La formation de peroxylipides par réaction entre un superoxyde et des acides gras insa turés. La phénythydrazine en est un exemple typique.

Les agents oxydants sont des composés qui apportent
L'oxygène nécessaire à la formation de superoxyde dans les organismes vivants, tels que le peroxyde de benzoyle et le persulfate d'ammonium.

On peut recueillir les souches résistant à ces agents selon une technique connue quelconque couramment utitisée pour recueillir les souches résistant aux médicaments. Par exemple, on étale les cellules variantes, obtenues par mutation, sur un mulieu gélosé contenant l'un quelconque des agents précités en une quantité arrêtant la croissance de la souche mere. On recueille les colonies qui se développent.La concentration appropriee de l'agent dans le milieu gélosé varie selon Le type d'agent ; cependant, environ 1 uglml pour le méthylviologène, environ 0,5 ug/mt pour la puromycine, environ 20 pg/ml pour ma pbénylhydrazine et environ 20 uglml pour le peroxyde de benzoyle sont appropriés.

Pour les autres, les concentrations appropriées doivent être déter-.

minées par des essais préliminaires.

Sinon, les souches mutantes de l'invention,ayant une productivité fortement accrue de la lysine, peuvent également être obtenues d'abord par mutation d'une souche naturelle de Brevibacterium ou de Corynebacterium. A partir des mutants ainsi produits, on sélectionne les souches qui résistent aux accélérateurs de production de superoxyde, aux inhibiteurs d'induction de la superoxyde-dismutase, aux accélérateurs de réaction radicalaire des superoxydes ou aux agents oxydants qui fournissent l'oxygène pour la formation de superoxyde. On confère ensuite aux souches résistantes ainsi sélectionnées des propriétés avantageuses à la production de la lysine, telles que la résistance à l'AEC, au
CCL et à la ML, le caractère homosérine-négatif et la sensibilité au FP.

Des exemples.illustratifs des micro-organismes que l'on peut utiliser dans le procédé de l'invention comprennent entre autres Brevibacterium lactofermentum AJ 12222 (FERM-P8248,
FERM BP-996) résistant au méthyviologène (un accélérateur de production de superoxyde), Corynebacterium acetoglutamicum
AJ 12223 (FERM-P8251, FERM BP-998) résistant à la puromycine (un inhibiteur de l'induction de la superoxyde-dismutase), Brevibacterium flavum AJ12222 (FERM-P8250, FERM BP-997) résistant à la phénylhydrazine (un accélérateur de réaction radicalaire des superoxydes) et Bervibacterium lactofermentum AJ 12221 (FERM-P8249) résistant au peroxyde de benzoyle (un agent oxydant qui fournit de l'oxygène pour la formation de superoxyde).

Les mutants Brevibacterium lactofermentum AJ 12220,
FERM P-8248, FERM BP-996, Brevibacterium flavum AJ 12222,
FERM P-8250, FERM sP-997 et Corynebacterium acetoglutamicum
AJ 12223, FERM P-8251, FERM BP-998 ont été déposés de façon ordinaire le 2 mai 1985 au Fermentation Research Institute, Agency of
Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), 1-3, Migashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun,
Ibaragix-ken, 305, Japon et ont reçu le numéro FERM-P indiqué cidessus. Les mutants déposés ont ensuite été transformés en dépôts selon le traite de Budapest le 13 mars 1986 et on reçu les numéros FERM-BP correspondants.

Ces souches peuvent 'être cultivées pour produire La
L-lysine selon les techniques connue couramment utilisées pour la production par fermentation de L-Lysine.

Les milieux de culture courants contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions minéraux et d'autres substances nutritives peuventêtre utilisés à cet effet. Comme exemples de sources de carbone, on peut mentionner les jus de betterave et de canne, les mélasses résiduelles, l'hydrolysat d'amidon et d'autres matières sucrées ; et des acides organiques tels que l'acide acétique.

On peut employer des sels d'ammonium, l'ammoniaque, l'urée et d'autres sources d'azote couramment utilisées pour la production de la lysine par fermentation. De plus, on peut ajouter au milieu de culture à la demande des ions minéraux (par exemple des ions phosphates et des ions magnésium) et des vitamines (par exemple la thiamine).

Pour une souche nécessitant une substance déterminée pour sa croissance (telle que les mutants auxotrophes) cette substance doit être ajoutée au milieu de culture. Sinon, il faut ajouter au milieu de culture un hydrolysat de protéines, de l'infusion de mals, un extrait de viande ou un extrait de levure contenant cette substance.

Les conditions de culture sont Les mêmes que celles couramment utilisées pour la production par fermentation de la
L-lysine, c'est-à-dire des conditions aérobies à une température dans la gamme de 30 à 400C et à un pH dans la gamme de 6 à 8. La lysine peut être isolée de la tiqueur de fermentation selon des procédés habituels.

L'invention repose sur les nouvelles découvertes que la productivité de la L-lysine des souches productrices de L-lysine peut être accrue par intensification de leur activité de superoxydedismutase. Donc, le procédé de L'invention permet la production de
L-lysine à des coûts réduits selon des techniques simples.

D'autres caractéristiques de L'invention apparaîtront à la lecture d'exemples de modes de réalisation qui sont présentés pour illustrer l'invention et non pour la limiter.

Certains exemples d'obtention des souches mutantes de l'invention sont présentés ci-dessous.

Les espèces indiquées ci-dessous sont utilisées comme souches mères : 1) 2)
Brevibacterium tactofermentun ; AJ 3990, FERM-P3387 (AVEC , ML
Alla )
Brevibacterium flavum ; FAEC 1-30, FERM-P282 (AECr) 3)
Corynebacterium acetoglutamicum, AJ 3792, FERM-P2650 (AEC r HLr )
1) résistant à l'AEC
2) résistant à la ML
3) résistant à la HL.

On cultive chacune de ces souches mères sur gélose nutritive inclinée pendant 24 h puis on traite avec 250 pg/ml de
N-nitro-N'-méthyl-N-nitrosoguanidine à 3O0C pendant 20 min pour obtenir des souches mutantes.

A un milieu de base contenant 1 g/dl d'extrait de Levure, 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl de chlorure de sodium et 2 g/dl de gélose, on ajoute séparément les composés suivants : (1) méthylviologène (1,5 pg/ml), (2) puromycine (0,5 ug/ml), (3) phénylhydrazine (20 pgiml) et (4) peroxyde de benzoyle (10 pg/ml).

On ajuste le pH de chaque milieu à 7,0 puis on stérilise à 120 C pendant 15 min pour obtenir quatre types de milieux gélosés.

On ensemence les souches mutantes obtenues ci-dessus sur ces milieux gélosés et on incube à 31,5"C pendant 48 h. On recueille les colonies formées et à chaque souche résistant à un produit on attribue un numéro AJ comme indiqué dans le tableau 1.

On soumet les souches résistant aux produits ainsi obtenues ainsi que les souches mères à un essai de culture pour différentes concentrations des produits comme décrit ci-dessous.

On ensemence avec chaque souche une gélose nutritive inclinée pendant 24 h puis on étale sur gélose dans une boute de
Petri de 8 cm de diamètre contenant 1 g/dl d'extrait de levure, 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl de chlorure de sodium et 2 g/dl de gélose (pH : 7,0) pour obtenir un nombre de cellules compris dans la gamme de 105 à 106 par boîte. Avec un disque de papier contenant un produit à la concentration indiquée dans le tableau 1, placé sur chaque boîte de gélose, on poursuit la culture pendant 16 à 48 h et on évalue la culture de chaque souche par la présence ou l'absence d'un disque d'inhibition de la culture. Les résultats obtenus figurent également dans le tableau 1 dans lequel (++) représente une culture -importante, (+) une culture modérée, (-) L'absence de culture.

Tableau 1
Produit Souche AJ 3990 AJ 12220
Méthylviologéne 0,1 pg/ml ++ ++
0,5 " + ++
1,5 " - ++
AJ 3792 AJ 12223
Puromycine 0,1 pg/mL ++ ++
0,25 'g + ++
0,5 " - ++
FAEC 1-30 AJ 12222
Phénylhydrazine 10 pg/mL ++ ++
15 " + ++
10 " - ++
AJ 3990 AJ 12221
Peroxyde de benzoyle 5 ugiml ++
10 " + ++
20 " - ++
On mesure comme décrit ci-dessous L'activité de superoxydedismutase des souches résistant aux produits mentionnés ci-dessus et des souches mères correspondantes. Les résultats des mesures figurent dans Le tableau 2.

On centrifuge La Liqueur de culture de chaque souche (20 ml) pendant 10 min à'1O 900 tr/min, on recueille le précipité ainsi séparé, on lave deux fois avec du tampon phosphate 0,1 M (pH : 7) et on met en suspension dans 20 ml du même tampon. On traite la suspension avec des ultrasons pendant 5 min puis on centrifuge pendant 10 min à 10 000 tr/min et on recueille le surnageant comme échantillon de solution.

A 2,4 ml de tampon carbonate de sodium 0,05 M (pH : 10,2) placé dans un tube à essai, on ajoute des portions de 0,1 ml de xanthine 3 mM, d*EDTA 3 mM, de sérum-albumine bovine à 0,15 % et de
Nitroblue tetrazonium 0,75 mM. On ajoute 0,1 ml des échantillons de solution préparés ci-dessus à ces solutions d'agents actifs et on laisse le mélange reposer à 250C pendant 10 min puis on ajoute 0,1 ml de la solution de xanthine-oxydase décrite ci-dessous, puis on mélange rapidement. Après incubation à 25"C pendant 20 min, on ajoute 0,1 ml de CuCl2 6 mM au mélange pour arrêter la réaction et on mesure l'absorbance à 560 nm. On effectue un essai à blanc en utilisant de l'eau distillée au lieu de liéchantillon de solution.

On prend comme unité l'activité de superoxyde-dismutase qui inhibe de moitié la réaction de la xanthine-oxydase dans ces conditions de mesure.

Pour préparer la solution de xanthine-oxydase utilisée dans l'essai ci-dessus, on dilue la xanthine-oxydase avec du (NH4)2S04 2 M pour que l'absorbance du blanc soit d'environ 0,28.

La concentration effective de la xanthine-oxydase est d'environ 2,1 x 10 7 M.

Tableau 2
Souche Activité de la SOD (%)
AJ 3990 100
AJ 12220 147
AJ 12221 156
FAEC 1-30 100
AJ 12222 127
AJ 3792 100
AJ 12223 139
nSOD : superoxyde-dismutase.

Les exemples suivants illustrent L'invention.

Exemple 1
On prépare un milieu de culture contenant 36 mg/ml de glucose, 20 mg/ml de chlorure d'ammonium, 1 mg/ml de KH2P04, 0,4 mg/ml de MgSO4.7H20, 10 pg/ml de FeS04.7H20, 8 pg/ml de MnSO4.7H 20, 1 pg/ml (en N) d'hydrolysat acide de protéines de soja, 0,1 llg/ml de chlorhydrate de thiamine et 0,3 pg/ml de biotine. On répartit des portions de 30 ml de ce milieu dans des flacons à agitation de 500 ml, on stérilise par chauffage à 1150C pendant 10 min et on rajoute 1 g de carbonate de calcium préalablement stérilisé par chauffage à sec.On ensemence le milieu avec chacune des souches indiquées dans le tableau 2 et on poursuit la fermentation à 31,50C pendant 48 h sur un agitateur à va-et-vient. Le tableau 3 indique la quantité de L-lysine accumulée dans chaque liqueur de fermentation. Comme le montre le tableau, toutes les souches résistant aux produits étudiés produisent de la L-lysine avec de bons rendements.

Tableau 3
Souche L-lysine- Rendement par
HCl (g/l) rapport au sucre (%)
AJ 3990 13,7 38,1
AJ 12220 15,4 42,8
AJ 12221 15,1 41,9
FAEC 1-30 5,6 15,6
AJ 12222 7,7 21,4
AJ 3792 10,4 28,9
AJ 12223 11,3 31,4
Exemple 2
On prépare un milieu de culture (pH : 7,0) contenant 80 mg/ml (en sucre) de mélasse résiduelle, 1 pg/ml de KH2PO4, 1 ml/ml de MgS04.7H20, 1 pg/ml (en N) d'hydrolysat acide de protéines de soja et 500 mg/ml de sulfate d'ammonium. On répartit des portions de 20 ml de ce milieu dans des flacons à agitation de 500 ml, on stérilise par la vapeur et on rajoute 1 g de carbonate de calcium préalablement stérilisé par chauffage à sec.

On ensemence le milieu avec chacune des souches indiquées dans le tableau 4 et on poursuit la culture à 31,5"C pendant 72 h sur un agitateur à va-et-vient. Le tableau 4 indique la quantité de lysine accumulée dans chaque liqueur de fermentation. Comme le montre le tableau, toutes les souches résistant aux produits étudiées produisent la L-lysine avec un bon rendement.

Tableau 4
Souche L-lysine- Rendement par rapport
HCl (g/l) au sucre (X)
AJ 3990 27,2- 34,0
AJ 12220 31,1 38,9
AJ 12221 30,3 37,8
FAEC 1-30 14,5 18,1
AJ 12222 17,7 22,1
AJ 3792 24,7 30,9
AJ 12223 27,0 33,8
ExempLe 3
On prépare un milieu de culture contenant 160 mg/ml (en glucose) d'empois d'amidon saccharifié, 55 mg/ml de sulfate d'ammonium, 1 mg/ml de KH2P04, 0,4 mg/ml de MgS04.7H20, 10 g/ml de;
FeS04.7H20, 8 pg/ml de MnS04.4H20, 1 pg/ml (en N) d'hydrolysat acide de 50 g de protéines de haricots, 0,2 pg/ml de chlorhydrate de thiamine, 0,3 pg/ml de biotine et 0,05 mg/ml d'antimousse.On introduit 10 l de ce milieu dans un fermenteur de 30 l et on stérilise par la vapeur à 1150C pendant 10 min. On ajoute à ce milieu un inoculum (0,5' I) d'AJ 12221 ou d'AJ 3990 préalablement préparé dans un milieu nutritif separé et on poursuit la fermentation à 31,5 + 0,5 C avec un taux d'aération de 0,5 i/min avec-agitation à 350 tr/min en maintenant le pH dans la gamme de 6,5 + 0,1 avec de l'ammoniac gazeux. La quantité de L-lysine accumulée dans la
Liqueur de fermentation est de 76,3 g/l lorsqu'on utilise AJ 12221 et de 64,1 g/l lorsqu'on utilise AJ 3990.

Exemple 4
On prépare un milieu de culture contenant 80 mg/ml (en sucre de mélasse résiduelle, 500 mg/ml de sulfate d'ammonium, 1 mg/ml de KH2P04, 1 mg/ml de MgS04.7H20, 2 mg/ml d'hydrolysat acide de protéines de soja et 0,1 mg/ml d'antimousse. On introduit 10 L de ce milieu dans un fermenteur de 30 l et on stérilise par la vapeur à 1200C pendant 15 min. On ajoute à te milieu un inoculum (0,5 l) d'AJ 12228 ou d'AJ 3990, préalablement produit dans un milieu nutritif séparé et on effectue la fermentation à 31,5 + 0,5 C avec un taux d'aération de 10 I/min avec agitation à 400 tr/min en maintenant le Ph dans la gamme de 6,8 + 0,1 avec de l'ammoniac gazeux. Lorsque 16 h se sont écoulées, on ajoute périodiquement de- la mélasse résiduelle et de l'antimousse stériles et on poursuit la fermentation pendant au total 76 h. La quantité de L-lysine accumulée dans-la liqueur de fermentation est de 71 g/L lorsqu'on utilise AJ 12220 et de 56 g/l lorsqu'on utilise AJ 3990.

Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de L'a-rt aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non Limitatifs sans sortir du cadre de L'invention.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour La production de Lysine, caractérisé en ce qu'il consiste à i) cultiver dans un milieu de culture une souche mutante du genre

Brevibacterium ou Corynebacterium (*1) capable de produire la

L-lysine et (2) ayant une activité accrue de superoxyde-dismutase ; et ii) recueillir la L-lysine formée.

2. Procédé pour la production de L-lysine, caractérisé en ce qu'il consiste à : i) cultiver dans un milieu de culture une souche mutante du genre

Brevibacterium ou Corynebacterium (1) capable de produire de La

L-lysine et (2) résistant à un accélérateur de production de superoxyde, à un inhibiteur d'induction de la superoxyde-dismutase, à un accélérateur de la réaction radicalaire des superoxydes ou à un agent oxydant qui fournit de l'oxygène pour la production de superoxyde ; et ii) récolter la L-lysine formée.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'emploi d'un mutant obtenu à partir de Brevibacterium divaricatum (ATCC 14020), Brevibacterium flavum (ATCC 14067),

Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13869), Brevibacterium roseum (ATCC 13825), Corynebacterium acetoacidophyrum (ATCC 13870) ou

Corynebacterium lilium (ATCC 15990).

4. Procédé selon la revendication 1, carac térisé en ce qu'il comprend l'emploi de Brevibacterium lactofermentum AJ 12220 (FERM-P8248 ; FERM BP-996),

Corynebacterium acetoglutamicum AJ 12223 (FERM-P8251 ; FERM BP-998),

Brevibacterium flavum AJ 12222 (FERM-P8250 ; FERM BP-997) ou Brevibacterium lactofermentum AJ 12221(FERM-P8249).

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend l'emploi de Brevibacterium divaricatum (ATCC 14020).

6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend l'emploi de Brevibacterium flavum (ATCC 14067).

7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend l'emploi de Brevibacterium Lactofermentum (ATCC 13869).

8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend l'emploi de Brevibacterium roseum (ATCC 13825).

9. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend L'emploi de Corynebacterium acetoacidophyrum (ATCC 13870).

10. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend L'emploi de Corynebacterium lilium (ATCC 15990).

11. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend l'emploi de Brevibacterium lactofermentum AJ 12220 (FERM-P8248 ; FERM BP-996).

12. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend l'emploi de Corynebacterium acetoglutamicum AJ 12223 (FERM-P8251 ; FERM BP-998).

13. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend l'emploi de Brevibacterium flavum AJ 12222 (FERM-P8250 ; FERM BP-997).

14. Procédé selon La revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend l'emploi de Brevibacterium lactofermentum AJ 12221 (FERM-P8249).