FR2576106A1 - Appareil d'etude de la formation d'agregats et/ou de precipites en milieu physiologique et des phases prealables, notamment destine a l'etude des fonctions agregatives plaquettaires et du changement de forme de plaquettes - Google Patents

Abstract

LES MOYENS D'EMISSION LUMINEUSE SONT CONSTITUES PAR UN EMETTEUR LASER 8. ON A PREVU DES MOYENS DIVISEURS 10 DU FAISCEAU LUMINEUX ISSU DES MOYENS DE FOCALISATION 9, TANDIS QUE LES MOYENS DE MESURE DU FLUX LUMINEUX ISSU DE LA CUVE DE MESURE 12 SONT CONSTITUES PAR UN PHOTODETECTEUR 16 MESURANT LE FLUX LUMINEUX DE DIFFUSION A LA SORTIE DU TUBE DE MESURE, ET PAR UN PHOTODETECTEUR 17 MESURANT LE FLUX LUMINEUX DE TRANSMISSION A LA SORTIE DU TUBE DE MESURE, UN PHOTODETECTEUR 11 ETANT EGALEMENT PREVU POUR MESURER LE FLUX DE REFERENCE ISSU DES MOYENS DIVISEURS 10.

Description

La présente invention a pour objet un appareil pour l'étude de la formation d'agrégats et/ou de précipités et des phases préalables en milieu physiologique. Elle vise plus précisément un appareil de ce type destiné à l'étude de fonctions agrégatives plaquettaires et de changements de forme de plaquetes avant agrégation.

En physiologie, on a observé que, lors d'une brèche de la paroi d'un vaisseau sanguin, l'interaction plaquettes-surface lésée constituait le mécanisme de première urgence assurant l'obstruction de la brèche par formation d'un thrombus, essentiellement plaquettaire.

On sait également que la plaquette sanguine est l'un des facteurs actifs de la thrombogénèse artérielle, mais aussi veineuse pouvant aboutir le plus fréquemment à un état de stase sanguine et à l'extrême, dans les petits vaisseaux sanguins à une oblitération totale. L'étape initiale de ces phénomènes thrombotiques est habituellement constituée par une lésion de l'endothélium vasculaire permettant aux plaquettes sanguines d'adhérer à des constituants connus de la paroi, puis de s'agréger entre elles pour former un thrombus.

Jusqu a présent,- on pouvait uniquement réaliser une exploration globale des fonctions agrégatives plaquettaires in vitro en routine par la méthode de Born décrite en 1963. Mais elle n' avait pas été possible d'étudier les changements de forme des plaquettes avec un appareil de ce type.

I1 était toutefois intéressant que l'étude desdites fonctions néphélémétriques puisse être réalisée afin d'étudier les propriétés physiologiques normales et le diagnostic desdits fonctionnements plaquettaires ainsi que l'évaluation de l'efficacité des thérapeutiques antiagrégantes utilisées au cours des étapes préthrombotiques.

Un objet de l'invention est de réaliser un appareil qui permette de réaliser de façon simple les études, diagnostics et évaluations susmentionnés.

Un autre objet de l'invention est de réaliser un appareil susceptible de pouvoir mettre en évidence la phase de modification morphologique des plaquettes et la phase d'agrégation cellulaire, en permettant de quantifier le changement de forme desdites plaquettes.

Encore un autre objet de l'invention est de réaliser un appareil qui soit facile de mise en oeuvre, tout en comportant des mécanismes d'auto-régulation et de commandes électroniques appropriés et qui puissent être reliés à un système informatique d'acquisition et de traitement numérique des données dont le rôle sera de prendre en compte le résultat de toute une série d'analyses, d'effectuer de façon rapide et fiable le calcul des paramètres caractéristiques constituant le bilan hématologique du patient et d'éditer une feuille de résultat.

La présente invention a donc pour objet un appareil tel que spécifié ci-dessus et comportant des moyens d'émissions lumineuses associés, d'une part, à des moyens de focalisation, et d'autre part, à des moyens de mesure des flux lumineux issus d'une éprouvette de mesure renfermant le milieu physiologique, des moyens de traitement analogiques étant en outre prévus pour le traitement des données captées par lesdits moyens de mesure, cet appareil étant en outre caractérisé en ce que les moyens d'émissions lumineuses sont constitués par un émetteur laser, que sont prévus des moyens diviseurs du faisceau lumineux issu des moyens de focalisation et que les moyens de mesure des divers flux lumineux sont constitués par un premier photodétecteur destiné à mesurer le flux de diffusion issu de l'éprouvette, un second photodétecteur pour la mesure du flux lumineux transmis et un troisième photodétecteur pour la mesure du flux de lumière de référence issu desdits moyens diviseurs.

La présente invention est en outre remarquable par les points suivants:
- l'émetteur laser est un tube laser héliumnéon, émettant dans le rouge et polarisé rectilignement.

- les moyens diviseurs sont constitués par une lame à face parallèle orientée à 450 par rapport au prolongement de l'axe optique des moyens de focalisation.

- l'éprouvette renfermant le milieu physiologique est centrée dans une cuve de mesure remplie d'eau et maintenue à température constante, par exemple la température normale du milieu physiologique à étudier, grâce à un dispositif de cartouche chauffante-capteur de température associé à des moyens d'agitation thermique, le niveau d'eau de ladite cuve étant maintenu constant au moyen d'un dispositif de contrôle B.F., ces différents dispositifs étant régulés par des circuits électroniques.

- dans l'éprouvette renfermant le milieu physiologique à étudier, sont prévus des moyens d'agitation thermique, avantageusement constitués par un barreau en matière magnétique entraîné en rotation par un dispositif à aimant ou électroaimant.

- un photodétecteur mesurant le flux lumineux des transmissions est monté dans le prolongement de l'axe optique des moyens de focalisation, tandis qu'un second photodétecteur mesurant le flux lumineux de diffusion est monté à l'extrémité d'un collimateur optique disposé à 300 par rapport audit axe optique.

- les photodétecteurs des flux lumineux de transmission et de diffusion sont respectivement associés à des moyens électroniques de conversion courant-tension et de filtrage, les signaux obtenus passant alors dans un convertisseur numérique-analogique.

- des moyens sont prévus pour adapter les signaux analogiques aux formats nécessaires à leur éventuel acheminement simultané vers le système d'acquisition et de traitement.

- les moyens de focalisation sont constitués d'un système agrandisseur comportant deux lentilles entre lesquelles est monté un diaphragme nettoyeur et d'un système focalisant proprement dit, comportant une lentille coopérant en aval avec un diaphragme nettoyeur, entre ces deux systèmes étant également monté un diaphragme nettoyeur.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention ressortiront de la description suivante d'une forme de réalisation d'appareil plus particulièrement destiné à l'étude des fonctions agrégatives plaquettaires, et qui sera désigné dans ce qui suit par l'expression "thromborhéomètre-laser", en référence aux dessins annexés dans lesquels: :
- Fig. 1 est un schéma synoptique d'un agrégomètre classique de la technique antérieure, opérant par mesure de transmission de lumière;
- Fig. 2 est un schéma synoptique du thromborhéomètre-laser de l'invention;
- Fig. 3 est une vue schématique des moyens de focalisation du faisceau laser dans l'éprouvette de mesure;
- Fig. 4A représente une vue de dessus de l'étage optique de renormalisation de l'intensité incidente du faisceau laser;
- Fig. 4B est une vue de côté de l'étage optique de la Fig. 4A;
- Fig. 5 est une coupe transversale de la cuve de mesure dans laquelle est centrée l'éprouvette de mesure;
Fig.- 6A est une vue de dessus de la cuve de mesure;
- Fig. 6B est une vue de dessous du couvercle de la cuve de mesure de la Fig. 6A;;
- Fig. 7A est une vue de dessus du banc de mesure électro-optique du thromborhéomètre-laser de l'invention;
- Fig. 7B est une vue de côté du banc de mesure de la Fig. 7A;
- Fig. 8 est un schéma synoptique des circuits électroniques de mesure des intensités de lumière et interfaces avec le système d'acquisition et de traitement de données;
- Fig. 9 est un schéma électronique des cellules photosensibles ou photodétecteurs;
- Fig. 10 est un schéma du circuit de filtrage monté sur les voies de mesure de lumière transmise et diffusée;
- Fig. 11 est un schéma synoptique de la régulation de température de la cuve de mesure;
- Fig. 12 est un schéma de l'unité de réglage de la température de référence;
- Fig. 13 est un diagramme synoptique du contrôleur de régulation;
- Fig. 14 est un schéma du circuit électronique du contrôleur de régulation;;
- Fig. 15 est un schéma électronique du dispositif d'amplification de puissance appliqué à l'élément chauffant;
- Fig. 16 est un schéma du circuit électronique du thermomètre et de l'affichage numérique de la température;
- Fig. 17 représente la courbe de chauffage du bain thermostaté, lié à la réponse de l'asservissement;
- Fig. 18 représente un schéma électronique du circuit de régulation de vitesse pour le moteur d'agitation magnétique;
- Fig. 19 représente un schéma électronique du circuit de contrôle du niveau d'eau dans la cuve de mesure;
- Fig. 20 représente une vue schématique du matériel informatique associé à l'appareil selon la présente invention, pour l'acquisition, le traitement et l'édition des résultats obtenus avec ledit appareil;
- Fig. 21 est un schéma synoptique de l'enchaînement séquentiel des modules logiciels;;
- Fig. 22 est un schéma de l'organisation informatique structurelle des fichiers associés au patient;
- Fig. 23 est un schéma de la densité optique mesurée en transmission de lumière, lors d'une agrégation de plasma riche en plaquettes au collagène;
- Fig. 24 est une représentation schématique des différentes phases de l'activation plaquettaire;
- Fig. 25 représente les courbes permettant la mesure d'une agrégation plaquettaire au thromborhéomètre-laser en lumière transmise et diffusée; et
- Fig. 26 est un schéma synoptique de la formation d'un immuno-précipité au cours d'une réaction antigène-anticorps.

Jusqu'à présent la mesure de l'agrégation des plaquettes est effectuée dans un agrégomètre enregistrant les variations d'intensité de lumière transmise par les plaquettes sanguines. En effet, lors du regroupement des plaquettes sanguines en agrégat, après l'adjonction de divers agents inducteurs, le milieu réactionnel s'éclaircit et voit son absorbance propre diminuer. Comme agrégomètre, on utilisait avantageusement le photomètre de
Born tel que schématisé sur la Fig. 1, et qui comportait en aval d'une source lumineuse monochromatique 1, un dispositif de focalisation 2, une enceinte thermostatée 3 à l'intérieur de laquelle effitait centrée une éprouvette de mesure 4, cette enceinte 3 comportant un dispositif d'agitation 3a.La lumière transmise après avoir -traversé l'éprouvette 4 était mesurée par un photodétecteur 5, et les données étaient transmises à une électronique d'amplification et de filtrage 6 et qui acheminait le signal traité vers un enregistreur analogique 7.

Cet appareil permettait de mesurer l'intensité d'agrégation et la vélocité d'agrégation.

Comme représenté sur la Fig. 2, le thromborhéomètre-laser selon l'invention est constitué d'un banc de mesure électronique qui se compose d'une source d'excitation lumineuse constituée de trois éléments, à savoir: un tube à laser à hélium-néon 8, émettant des radiations lumineuses de 632,8 nM de longueur d'onde polarisée rectilignement d'une puissance de 2 mW.

Ce b tube est fixé sur son support avec un certain débattement, de façon à rendre possible l'ajustement correct du plan de polarisation du faisceau par rapport à la cuvette de mesure; un dispositif optique 9 de focalisation est disposé entre le tube laser 8 et un étage optique de renormalisation 10, comportant une lame à face parallèle 13d destinée à envoyer -une partie de l'énergie lumineuse incidente à une cellule de référence 11. En amont de cet étage optique de renormalisation ou diviseur de faisceau 10, est disposée une cuve de mesure 12 remplie d'eau, à l'intérieur de laquelle est centré un tube 14 renfermant le plasma sanguin à étudier. Une partie de la lumière issue du diviseur de faisceau -10 est transmise hors de la cuve 12 et mesurée à l'aide d'un photodétecteur 17 tandis que la lumière diffusée est transmise par l'intermédiaire d'un collimateur 15 à un photodétecteur 16.Les signaux lumineux captés par les photodétecteurs 11, 16, 17 sont transmis à un dispositif électronique de traitement 18 puis transmis à un enregistreur analogique double-voie 20, ces signaux analogiques étant adaptés au format approprié par un circuit simple, non représenté aux dessins, de façon à être acheminés simultanément vers le système numérique de traitement 19. La cuve 12 est pourvue d'un dispositif de contrôle de niveau d'eau 24, d'un dispositif d'agitation régulé 23 et d'un dispositif de régulation de température 21 associé à un thermomètre 22. L'appareil est en outre pourvu d'un dispositif d'alimentation en énergie aliment et d'un dispositif de refroidissement par ventilateur V.

Comme représenté plus en détail sur la Fig.

3, le dispositif de focalisation est constitué de trois lentilles L1, L2 et L3 associées à trois diaphragmes nettoyeurs T1, T2 et T3. Ce dispositif est monté sur un microbanc qui permet de confectionner un faisceau de lumière particulièrement fin au milieu de l'éprouvette de mesure 14, et ce du fait que, 1 'éprouvette présentant un faible rayon de courbure, il est nécessaire de pouvoir effectuer des mesures aux angles faibles et d'éliminer toute tache lumineuse par un système d'émission secondaire inhérente au tube laser polarisé 8. Les lentilles L1 et
L2 forment un système agrandisseur conjointement avec le diaphragme nettoyeur T1, tandis que la lentille L3, conjointement avec le diaphragme nettoyeur T3 constituent le système focaliseur.

Comme représenté sur les Fig. 4A et 4B, l'étage optique de renormalisation ou diviseur de faisceau 10 est constitué d'un tube cylindrique en aluminium 13, noirci à l'intérieur, et présentant trois fenêtres d'entrée, de mesure et de sortie, respectivement référencée 13a, 13c, 13b. Une lame à face parallèle 13d est orientée à 450 par rapport à l'axe optique et est destinée à envoyer 15% de l'énergie lumineuse vers une cellule de mesure lI montée dans la fenêtre 13c.

Comme représenté très en détail sur la Fig.

5, la cuve 12 dans laquelle est centré le tube ou éprouvette 14, est pourvue d'un moteur d'agitation thermique 23a, monté sur la cuve par l'intermédiaire d'un support de moteur 23c, et qui, par l'intermédiaire de son arbre 23b, entrante un agitateur cruciforme 23d. La cuve 12 présente une fenêtre -d'entrée 25 du faisceau lumineux laser, et deux fenêtres de sortie: d'une part, la fenêtre de sortie du signal transmis 28 et d'autre part, la fenêtre de sortie du signal diffusé 29. A l'intérieur de la cuve 12 sont également disposées une pièce 35 forçant le passage de l'eau à travers ladite cuve et une cartouche chauffante 30. Le tube 14 est centré à l'intérieur de la cuve par l'intermédiaire d'un centreur tubulaire 14b, des joints toriques 14a étant prévus entre ce centreur tubulaire 14b et l'éprouvette 14.Un collimateur 15 disposé à 300 par rapport à l'axe optique du système dirige la lumière diffusée vers la fenêtre de sortie 29. A l'intérieur du tube 14 est disposé un petit barreau en métal magnétique 26 entraîné en rotation par un aimant tournant 27. Un certain nombre de passages d'échappement des bulles d'air 15a sont prévus dans le collimateur 15.

Sur les Fig. 6A et 6B qui représentent respectivement une vue de dessus et de dessous de la cuve de mesure, sont également représentés, des éléments spécifiés ci-dessus tel que le capteur de température 21a, ainsi que le robinet de vidange 31 de la cuve 12, et deux électrodes en inox 36 qui sont fixées sur le couvercle et plongent dans le bain thermostatant, constituant ainsi le capteur du dispositif électronique de mesure du niveau d'eau 24.

Sur les Fig. 7A et 7B, sont représentés montés sur une embase 32 les divers éléments constitutifs, spécifiés ci-dessus du thromborhéomètre-laser de l'invention.

En se référant plus précisément au schéma synoptique de la Fig. 8, on voit que les photodétecteurs 16, 11, 17 sont respectivement constitués par des photodiodes 36, 37, 38, associés respectivement à des préamplificateurs 39, 40, 41. Les photodiodes 36 et 38 sont en outre associés à deux étages de filtrage 42, 43 du type filtre passe-bas, respectivement. On a également prévu trois convertisseurs courant-tension 44, 45, 46, agencés pour que la réponse des amplificateurs qui y sont incorporés reste linéaire quelque soit le niveau d'éclairement. Les signaux issus des convertisseurs passent alors dans un convertisseur numérique-analogique 47, associé à un bus camac 49 connecté au système numérique 50, lui-meme relié à une table traçante X-Y 51.

On a également prévu une unité de traitement analogique 48 coopérant avec un traceur double-voie 20.

Sur la Fig. 9 est représenté plus en détail, un étage de pré-amplification associé par exemple à la photodiode 36. Cette photodiode 36 est associée à un certain nombre de capacités C- de résistances et/ou de potentiomètres R, de valeur appropriée pour former conjointement avec deux étages d'amplification Al et A2, un pré-amplificateur approprié, de façon à faire fonctionner une photodiode correspondante en montage "photoampérique", les trois pré-amplificateurs étiiit par ailleurs identiques au gain pret.

Comme déjà spécifié ci-dessus, les photodiodes 36 et 38 sont associés respectivement à des unités de pré-filtrage 42, 43 respectivement constituées comme représenté sur la Fig. 10 par un certain nombre de résistances R et de capacités C associées à un étage d'amplification A3. Le circuit de pré-filtrage tel que représenté sur la Fig. 10 est du type "Butterworth" du second ordre, autorisant une fréquence de coupure de 0,25 Hz, et est monté sur les voies de mesure de lumière transmise et diffusée. Ces unités de pré-filtrage servent à lisser les signaux de sortie des cellules photosensibles correspondantes, qui sont fortement perturbées par l'hétérogénité du substrat biologique.

Sur la Fig. 11, est représenté schématiquement le système de régulation de température de l'appareil, constitué par l'unité de référence pour l'ajustement de la température 52, et l'unité de contrôle de régulation 53, en relation d'une part, avec un amplificateur de puissance, comportant l'élément chauffant, 54 et la fonction de transfert de la cuve, et d'autre part, la fonction de transfert du capteur 56, l'ensemble étant relié à un ensemble de commutation 58, relié à un thermomètre numérique 57 comportant un organe d'affichage 59, et pouvant commuter d'une position correspondante à la température de consigne TO à une position correspondante à la température réelle T.

Sur la Fig. 12, est représentée 1'unité de réglage de la référence de température 52. Cette unité est constituée par un circuit comportant un potentiomètre de précision P associé à un amplificateur de gain A4 et coopérant avec un circuit de sommation A5 de gain unité et d'un circuit suiveur A6, ces différents circuits comportant des résistances R et des capacités C appropriées. Ainsi, ce circuit permet de définir la température de consigne réglable 36 à 400C, au moyen du potentiomètre de précision P. Afin d'obtenir une tension de consigne directement comparable à celle issue du capteur de température, il convient de disposer d'une tension stable pouvant varier entre 3,05 et 3,10 volts, correspondant à la fourchette de réglage de température.

La tension variable de 3,10 à 3,05 volts est réalisée en ajoutant dans le circuit de sommation A5, une tension fixe de 3,10 volts et une tension variable de 0. à -0,05 volts. La tension de 3,10 volts est issue du circuit A6
La tension variable est confectionnée à partir d'une tension pouvant varier de 0 à 1 volt et amplifiée d'un facteur 0,05.

Sur la Fig. 13, est représenté un diagramme synoptique du contrôleur de régulation 53 qui est constitué d'un étage de gain variable K1 permettant d'ajuster la réponse de l'asservissement. L'unité de réglage en gain propre K2 du capteur permet de compenser un éventuel petit décalage pouvant exister entre la température de consigne et celle réellement atteinte après la stabilisation de l'asservissement.

Sur la Fig. 14 est plus particulièrement représenté le circuit électronique du contrôleur de régulation avec ses trois étages d'amplification A7, A8 et
A9, les signaux de référence U et de contrôle V étant comparés directement dans un étage composé des deux amplificateurs opérationnels A8 et A9. La fonction de transfert globale donnant la tension d'erreur est: Vf = K1 (U - K2V)
Sur la Fig. 15 est représenté le schéma électronique de l'amplification de puissance destiné à réguler l'élément chauffant 30, qui est constitué d'une -cartouche chauffante de forte puissance, délivrant 350 watts sous une tension de 220 volts. Le rôle de ce circuit d'amplification de puissance est de délivrer une tension alternative de commande de la cartouche chauffante proportionnelle à la tension d'erreur Vt issue du contrôleur de régulation. Ceci est réalisé par l'intermédiaire d'un circuit intégré CI fournissant une commande de phase à un trac 70 qui est destinée à piloter la cartouche chauffante 30 à partir d'une tension de 220 volts issue d'un transformateur d'isolation 71. Ce circuit d'amplification de puissance comporte également un certain nombre de résistances R, de diodes D, de capacités
C et un étage d'amplification AlO destiné à l'adaptation aux caractéristiques d'entrée du circuit C.I., un contact relais 72 étant en outre prévu.

Sur la Fig. 16 est représenté le thermomètre numérique 22 qui est essentiellement composé de deux circuits intégrés spécialisés, à savoir une unité de convertisseur analogique-numérique intégré 73 et une unité de conduite d'afficheur 74 à trois digits D1, D2 et D3, multiplexé. Ce thermomètre numérique est alimenté sous 5 volts continus, ce qui nécessite la présence d'un régulateur d'alimentation 75. Un suiveur à amplificateur opérationnel 76, qui constitue l'étage d'entrée à très haute impédance. Sur ce schéma est également représenté le capteur de température qui utilise comme élément sensible une diode Zéner 77. Ce circuit comporte de façon classique des résistances R, capacité C et transistors S, présentant les valeurs appropriées au bon fonctionnement du système.

La courbe de la Fig. 17 illustre l'évolution de la température dans la cuve de mesure. en fonction du temps, lors de la mise en route de l'appareil. On notera que malgré la forte inertie thermique de l'ensemble (cuve + caloporteur, par exemple de l'eau), la température de consigne, qui est de 370C, est atteinte en moins de 5 minutes à partir de la température ambiante- du laboratoire, à savoir 200C.

I1 est à noter également que tout dépassement, dont on remarquera que le maximum transitoire n'excède pas 5%, est rapidement amorti par la présence d'un ventilateur de refroidissement 25, continuellement alimenté. Après ce temps d'établissement, la température de consigne est respectée à plus ou moins 0,1 C.

Sur la Fig. 18, est représenté le circuit électronique destiné à réguler la vitesse. du moteur d'agitation magnétique, sur l'axe duquel est fixé un aimant permanent 27 d'entraînement du barreau magnétique 26 d'agitation du réactif. A cet effet, ce circuit comporte un circuit intégré, spécialisé, 79 qui alimente un petit moteur 80 sous 3 volts (ajustable) à courant constant. Sur ce schéma, on notera la présence d'une cellule RC 81 qui a pour rôle de lancer le moteur à la mise sous tension. On notera également la présence d'une photodiode de contrôle 82 et de résistances R de valeurs appropriées.

Sur la Fig. 19 est représenté le circuit de contrôle du niveau d'eau dans la cuve de mesure, destiné à détecter la baisse du niveau d'eau dans la cuve de mesure, et mettant en oeuvre un principe de mesure de la résistance du fluide au passage d'un signal de fréquence élevée. Dans ce circuit électronique, sont montés un oscillateur haute-fréquence 83 construit autour d'un multivibrateur intégré qui délivre un signal carré d'une amplitude de 15 volts, d'une fréquence voisine de 1 KHz; une paire d'électrodes en inox 36 servant de sonde, et plongeant dans le bain de thermostatisation jusqu'à un niveau prédéterminé, correspondant à la hauteur d'eau minimale acceptable pour un bon fonctionnement de la régulation de température; un étage d'amplification ou de signal dont la présence rendue nécessaire par l'atténuation subie par le signal HF lors de son passage dans le bain de thermostatisation. Cet étage s'articule autour d'un amplificateur opérationnel .84, monté en amplificateur non inverseur de gain; une cellule de redressement et d'intégration 85 est constituée par une diode et une cellule RC fournissant la valeur moyenne du signal HF, qui est de -ltordre de 3 volts lorsque l'eau atteint un niveau suffisant pour permettre la transmission du signal entre les deux électrodes, et quasi nulle dans le cas contraire; un comparateur hystérèse 86, destiné à comparer la valeur moyenne obtenue à une tension de référence ajustable par un potentiomètre 87 qui permet de fixer le point de déclenchement de l'alarme.Ce comparateur à hystérèse est construit autour d'un amplificateur opérationnel monté en boucle ouverte.

L'hystérèse amenée par la présence d'une résistance relativement élevée 100 kOhms permet un déclenchement franc de l'alarme 88. Ce circuit comporte également une unité d'oscillateur TBF 89, un ampli de puissance 90 associé à l'élément chauffant 30, ainsi que différents composants, tels que des diodes D, des résistances R, des transistors S, des capacités C.

Sur la Fig. 20 -est représenté le système d'acquisition et de traitement numérique, ainsi que le système d'édition des résultats. On sait .que l'examen d'une agrégation et/ou d'une précipitation exige l'étude d'un certain nombre de réactions, par exemple un examen plaquettaire normal demande l'étude d'environ 10. réactions différentes. Comme le thromborhéomètre-laser délivre deux signaux simultanés (lumière transmise et lumière diffusée), c'est donc 20 tracés analogiques que l'opérateur doit analyser. Les possibilités inédites de quantification du phénomène de changement de forme des plaquettes sanguines, comme cela sera exposé plus loin, que permet le thromborhéomètre-laser, conduisent à l'analyse nouvelle de grandeur caractéristique.C'est pourquoi les inventeurs ont décidé de relier l'appareil de la présente invention à un système informatique d'acquisition et de traitement numérique des données dont le rôle sera de prendre en compte le résultat de toute une série d'analyses, d'effectuer de façon rapide et fiable le calcul des paramètres caractéristiques constituant le bilan hémathologique du patient et d'éditer une feuille de résultat. De plus, le. système informatique permet un contrôle du bon fonctionnement de l'appareil, réalise le traitement annexe, tel que le lissage de courbes, le traitement des dérivés des signaux, etc, et pilote une table traçante X-Y pour la sortie analogique des signaux traités.

Si l'on se réfère plus précisément à la Fig.

20, le système informatique proprement dit est composé d'un chassis Camac 39 qui contient un contrôleur autonome du chassis 91, dont l'unité centrale s'articule autour d'un microprocesseur, et qui assure la liaison -de connection pour la console 92 et l'imprimante 93; un contrôleur de disquette 94 est connecté à-une double unité de disquette 95; et de trois tiroirs d'application, à savoir: un convertisseur analogique numérique 96 à quatre voies multiplexé, et qui prend en compte les trois signaux de lumière transmise diffusée et de référence, respectivement, délivrés par le thromborhéomètre de l'invention; une horloge programmable 97 destinée au séquencement de l'acquisition; et un convertisseur numérique-analogique 98 relié à une table traçante 99.

Les diverses fonctions du logiciel ont été décomposées en 6 parties (AGRO à AGR5) appelées "modules logiciels". L'organigramme d'enchaînement séquentiel de ces divers modules est représenté à la Fig. 21. Les différentes fonctions sont: - AGRO : vérification du bon fonctionnement de
l'appareil
étalonnage des réactions
entrées des données (identité du patient) - AGR1 : acquisition des signaux pour les 10 réactions
traitement en ligne
marquage de certains points remarquables - AGR2 : traitement off line des signaux, calcul des
grandeurs caractéristiques - AGR3 : calcul de dérivée et lissage de courbes
(module optionnel) - AGR4 : édition des-feuilles de résultats - AGR5 : édition de courbes sur la table traçante X-Y,
6 M.

A chaque patient, il est associé onze fichiers comme le met en évidence le schéma de la Fig. 22:
- 1 fichier d'état civil du patient
- 10 fichiers de réaction, chacun étant affecté à une analyse (on fait 10 analyses par patient).

Chaque fichier de réaction est subdivisé en 4 sous-fichiers englobant:
- les données primaires
- les données traitées
- les données après lissage des courbes
- les données après dérivée des courbes.

1 sous-fichier présente 2 tableaux de résultats, l'un lié au signal de lumière transmise, l'autre au signal de lumière diffusée.

Le thromborhéomètre de l'invention ouvre la néphélométrie à des nouvelles applications telles que agrégation cellulaire, mesure cinétique d'immunoprécipitation, enzymologie en substrat soluble.

Seule l'agrégation plaquettaire a été évaluée à ce jour. Mais les propriétés fonctionnelles d'autres éléments figurés du sang pourraient être exploitées: en particulier, les fonctions agrégatives des leucocytes correlés probablement aux propriétés chimiotactiques in vivo, ainsi que l'exploitation de l'hypersensibilité à médiation cellulaire (allergie médicamenteuse et autres).

Différents agents inducteurs pour l'adhésion et l'agrégation plaquettaires sont utilisés in vitro pour tester l'activité fonctionnelle des plaquettes. Ces inducteurs sont comparables aux effecteurs que peut rencontrer la plaquette in vivo lors d'une lésion de la paroi.

Les résultats sont obtenus en présence de collagène, inducteur nécessitant une phase de contact prolongé avec les plaquettes.

Sur la Fig. 23, est illustré le tracé analogique de la variation d'absorbance liée à une agrégation plaquettaire au collagène obtenu par la méthode photométrique de Born.

Ce tracé met en évidence 3 phases distinctes: - phase 1 : ou phase de contact des plaquettes avec le
collagène. Après injection du collagène on
observe une augmentation du s-ignal transmis
due à un effet de dilution du plasma riche en
plaquettes par l'agent agrégant suivi d'un
temps de latence (pas de modification de la
densité optique D.O.) - phase 2 : elle correspond aux modifications
morphologiques des plaquettes lors de leur
étalement le long des fibres de collagène.

Le changement de forme des plaquettes
correspond à une diminution modérée et brève
du signal enregistré, témoin du passage de la
forme discorde vers une forme disco
échinocytaire et sphéro-échinocytaire.

Ce phénomène est mesurable en temps, puisqu'à
sa fin correspond un minima de transmission.

Néanmoins, sa faible amplitude (à peine
quelques % ae l'amplitude totale du signal)
rend impropre une mesure photométrique
quantitative.

- phase 3 : elle correspond à l'adhésion des plaquettes
entre elles ou agrégation qui va se traduire
par une augmentation rapide du signal de
transmission. En pratique, 2 paramètres sont
habituellement estimés:
- la vitesse de formation des agrégats
appréciée par la pente du signal (vélocité)
- la mesure de l'intensité de cette
augmentation appréciée par l'intensité
transmise maximale (I.max.) voir la Fig. 23.

Les différentes phases d'activation sont représentées sur la Fig. 24.

Les conditions de mesure de l'agrégation plaquettaire sur le thromborhéomètre sont comparables à celles utilisées précédemment pour la méthode de Born: induction du même collagène avec la meme concentration finale dans la cuve de mesure. Les tracés obtenus pour le thromborhéomètre-laser de l'invention sont présentés sur la Fig. 25.

a) Tracé obtenu par mesure du flux lumineux transmis
Le tracé obtenu est comparable à celui mesuré par la méthode de Born: pour cet inducteur on retrouve les 3 phases d'activation: temps de latence (non réactivité plaquettaire), suivi du changement morpholog-ique de la forme des plaquettes, (incurvation de la courbe correspondant à une diminution du signal transmis), puis adhésion et agrégation (augmentation de l'intensité transmise).

b) Tracé obtenu par mesure du flux lumineux diffusé
Ce. tracé se distingue de celui mesuré en transmission. I1 existe comme précédemment, un temps de non réactivité du signal correspondant à l'intéraction plaquettes-fibre de collagène (phase 1). Au cours du changement de forme, on observe une diminution rapide et sensible de l'intensité de lumière diffusée (phase 2), suivi par une variation décroissante au cours de la phase agrégative (phase 3).

Le tracé obtenu en néphélémétrie se distingue donc du tracé de transmission par un signal d'amplitude suffisante pour- quantifier le phénomène de changement de forme i En effet, si les 2 méthodes (photométrique et néphélométrique) sont sensibles à la variation de taille des plaquettes, seule la mesure de l'intensité diffusée rend compte des modifications morphologiques des plaquettes.

C'est la mesure simultanée des 2 signaux qui permet de définir l'Amplitude du changement de Forme; en effet, le signal Transmis est indispensable au repérage du minima de D.O., témoin de la fin du phénomène objectivé, et l'abscisse en temps correspondante permet, par report sur le signal diffusé, de séparer en amplitude les 2 phases de la réaction plaquettaire.

Ainsi sur la Fig. 25 représentant les signaux transmis et diffusés lors d'une agrégation au collagène, on notera: que la portion A de l'amplitude diffusée est imputable au changement de forme; que la portion B de l'amplitude diffusée est imputable à l'agrégation; qu'il est possible de définir non plus une, mais 2 vélocités significatives, à savoir la vélocité 1 de changement de forme et la vélocité 2 d'agrégation.

Parmi les autres applications biologiques de l'appareil de l'invention, on peut citer les diverses déterminations et mesures en:
1. Cinétique d' immuno-précipitation
Cette méthode estime l'intensité de la formation d'un immuno-précipité au cours d'une réaction avec un anti-sérum (Fig 26).

Les applications décrites pour des appareils commercialisés (HYLAND-BEHRING) peuvent être aisément adaptées sur notre appareil soit une vingtaine de protéines plasmatiques (immunoglobulines - protéines inflammatoires - protéines de la coagulation).

La première protéine actuellement testée est le facteur antigénique VIII.

2. Enzymologie en substrat insoluble
I1 est possible de suivre par le thromborhéomètre la disparition de particules (ou bien leur changement de taille ou de forme). Les mesures les mieux connues par les biochimistes sont l'amylase (le substrat étant une émulsion d'amidon); la lipase (le substrat de la réaction est la trioleine). La mesure cinétique du lysosyme plasmatique et urinaire a pu être adaptée. Une sensibilité nettement supérieure est obtenue sur ce thromborhéomètre par rapport aux mesures spectrophotométriques utilisées habituellement en biologie.

Le thromborhéomètre-laser a permis de résoudre les problèmes inhérents aux agrégations et/ou précipitations en milieu physiologique, notamment en ce qui concerne l'étude des fonctions agrégatives plaquettaires, et dans ce cas autorise l'exploitation de la phase initiale d'activation des plaquettes sanguines.

La mesure simultanée, corrélative de l'intensité de lumière diffusée et transmise permet de distinguer la phase de modification morphologique des plaquettes et la phase d'agrégation cellulaire.

Pratiqué dans ces conditions, ce test permet de quantifier le changement de forme. D'autre part, les différents critères de qualité de la méthode ont été évalués en particulier la précision (par répétabilité et reproductibilité), la détectabilité et sensibilité. Les résultats satisfaits qui ont été obtenus permettent l'utilisation du thromborhéomètre en routine.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Appareil pour l'étude de la formation d'agrégats etZou de précipités en milieu physiologique et des phases préalables, notamment destiné à l'étude des fonctions agrégatives plaquettaires et du changement de forme de plaquettes, comportant des moyens d'émission lumineuse associés, d'une part, à des moyens de focalisation et, d'autre part, à des moyens de mesure des flux lumineux issus d'un tube de mesure renfermant le milieu physiologique à étudier, des moyens de traitement analogiques étant en outre prévus pour le traitement des données captées par lesdits moyens de mesure, cet appareil étant caractérisé en ce que les moyens d'émission lumineuse sont constitués par un émetteur laser (8), que sont prévus des moyens diviseurs (10) du faisceau lumineux issu des moyens de focalisation (9j, et que les moyens de mesure du flux lumineux issu de la cuve de mesure (12) sont constitués par un photodétecteur (16) destiné à mesurer le flux lumineux de diffusion à la sortie du tube de mesure, et par un photodétecteur (17) destiné à mesurer le flux lumineux de transmission à la sortie du tube de mesure, un photodétecteur (X1) étant également prévu pour mesurer le flux de référence issu des moyens diviseurs (10).

2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'émetteur laser est un tube laser (8) à hélium-néon, émettant dans le rouge et polarisé rectilignement.

3. Appareil selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les moyens diviseurs sont constitués par une lame à face parallèle (13d) et disposés dans un tube cylindrique (13) et orientés à 450 par rapport au prolongement de l'axe optique du système.

4. Appareil selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la cuve de mesure (12), dans laquelle est centré le tube (14) renfermant le milieu physiologique à étudier, est remplie d'un liquide calo-porteur, par exemple de l'eau, maintenu à une température constante, par exemple la température normale du milieu physiologique à étudier, au moyen d'un dispositif de cartouches chauffantes (30) - capteur de température (21a), associé à des moyens d'agitation thermiques (23), le niveau d'eau étant maintenu constant au moyen d'un dispositif de contrôle HF, ces différents dispositifs étant régulés par des circuits électroniques.

5. Appareil selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que, dans le tube (14) renfermant le milieu physiologique à étudier, sont prévus des moyens d'agitation thermique (26,.27).

6. Appareil selon la revendication 5, caractérisé en ce que les moyens d'agitation thermique sont constitués par un barreau en métal magnétique (26) entraîné en rotation par un dispositif à aimant ou à électro-aimant rotatif (27).

7. Appareil selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le photodétecteur (17) mesurant le flux de transmission est monté dans l'axe optique du système, tandis que le photodétecteur (16) mesurant le flux lumineux de diffusion est monte à l'extrémité d'un collimateur optique (15) disposé à 30C par rapport audit axe optique.

8. Appareil selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les photodétecteurs (16, 17) sont associés à des moyens d'électronique de conversion courant-tension et de filtrage, les signaux obtenus passant alors dans un convertisseur numérique-analogique.

9. Appareil selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que des moyens sont prévus pour adapter les signaux analogiques au format nécessaire à leur éventuel acheminement simultané vers le système d'acquisition et de traitement.

10. Appareil selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les moyens de focalisation (9) sont constitués d'un système agrandisseur comportant deux lentilles L1 et L2 entre lesquelles est monté un diaphragme T1 et un système focaliseur proprement dit comportant une lentille L3 coopérant avec un diaphragme nettoyeur T3, entre les deux systèmes étant également monté un diaphragme nettoyeur T2.