FR2551551A1 - Reagent simultaneously determining thrombocyte and leucocyte concns. - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention est relative à un réactif pour la détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes, et à un procédé pour sa préparation. The present invention relates to a reagent for determining the number of thrombocytes and leukocytes, and to a process for its preparation.
La présente invention a pour objet un réactif contenant de 1'acétone et du formaldéhyde ou du glutaraldehyde, des sels minéraux et des colorants, qui convient à la détermination simultanée du nombre des thrombocytes et des leucocytes dans le sang entier, par des methodes normales d'observation au microscope optique. The present invention relates to a reagent containing acetone and formaldehyde or glutaraldehyde, mineral salts and dyes, which is suitable for the simultaneous determination of the number of thrombocytes and leukocytes in whole blood, by normal methods. observation under an optical microscope.
I1 est connu que la détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes fait partie du domaine des méthodes fondamentales des laboratoires cliniques. La numération des thrombocytes peut s'effectuer selon différentes méthodes 1) Numération électronique des éléments au moyen d'appareils
automatiques mis au point pour la numération des thrombo
cytes. Bien que cette méthode soit rapide et simple, il
faut se procurer des instruments très coûteux. Cette mé
thode n'est pas toujours propre à remplacer la détermina
tion au microscope. La reproductibilité de cette méthode
est en outre moins bonne que celle des compteurs micro
scopiques.It is known that the determination of the number of thrombocytes and leukocytes is part of the field of fundamental methods of clinical laboratories. The thrombocyte count can be done using different methods 1) Electronic counting of the elements by means of devices
machines developed for thrombo counting
cytes. Although this method is quick and simple, it
very expensive instruments must be obtained. This met
thode is not always suitable for replacing the determina
tion under the microscope. The reproducibility of this method
is also not as good as that of micro meters
scopic.
2) Numération des thrombocytes à l'aide d'un microscope à
contraste de phase avec utilisation d'une solution conte
nant de la cocaïne ou de la novocaine ou d'une autre so
lution de numération des thrombocytes. Pour la mise en
oeuvre de cette méthode, le microscope à contraste de
phase est indispensable. Un autre inconvénient notable
réside dans le fait que pour le personnel qui réalise les
essais cette méthode est fatigante, pénible et nuisible
pour la vue, en particulier dans le cas d'un grand nom
bre d'expériences.2) Thrombocyte count using a microscope
phase contrast with the use of a tale solution
of cocaine or novocaine or another so
reading of thrombocyte count. For the implementation
work of this method, the contrast microscope of
phase is essential. Another notable drawback
lies in the fact that for the personnel who carry out the
testing this method is tiring, painful and harmful
for sight, especially in the case of a big name
bre of experiences.
3) Détermination du nombre des thrombocytes par une méthode
de coloration. Cette méthode est la plus simple et peut
etre mise en oeuvre à l'aide d'un microscope. Selon les
méthodes actuellement utilisées, on met en oeuvre comme
colorant le violet cristallin (violet de gentiane ; non
chimique : chlorhydrate d'hexaméthyl-p-rosaniline). On fait
à ces méthodes le reproche justifié de causer une distor
sion comparativement à la détermination par contraste de
phase, parce que les thrombocytes ne se colorent pas tous
d'une façon bien visible.3) Determination of the number of thrombocytes by a method
of coloring. This method is the simplest and can
be implemented using a microscope. According to
currently used methods, we implement as
dye crystalline violet (gentian violet; no
chemical: hexamethyl-p-rosaniline hydrochloride). We do
to these methods the justified reproach of causing distortion
compared to the contrast determination of
phase, because not all thrombocytes stain
in a very visible way.
Dans le diagnostic hématologique, la numération des leucocytes constitue la méthode la plus largement utilisée. La solution de Türk décrite dans la Pharmacopée hongroise (Ph. Hg. VI.) convient généralement à cet effet et a donné de bons résultats, mais elle ne convient cependant pas à la détermination du nombre des thrombocytes. C'est là un inconvénient important parce que l'execution conjointe des deux essais de laboratoire les plus répandus serait très souvent nécessaire.Pour déterminer le nombre des thrombocytes et des leucocytes dans le sang entier à l'aide d'un microscope optique normal, il est nécessaire de disposer d'une solution de colorant qui a) provoque l'hémolyse complète des érythrocytes sans dimi
nution du nombre des thrombocytes et des leucocytes, b) fixe aussi bien les thrombocytes que les leucocytes, et c) contienne un colorant qui est fixé avec une grande affi
nité aux éléments figurés susdits et les fixe de cette
façon, en lumière normale.In hematological diagnosis, leukocyte count is the most widely used method. The Türk solution described in the Hungarian Pharmacopoeia (Ph. Hg. VI.) Is generally suitable for this purpose and has given good results, but it is however not suitable for determining the number of thrombocytes. This is a significant disadvantage because the joint execution of the two most common laboratory tests would very often be necessary. To determine the number of thrombocytes and leukocytes in whole blood using a normal light microscope, it is necessary to have a dye solution which a) causes complete hemolysis of erythrocytes without dimi
decrease in the number of thrombocytes and leukocytes, b) fixes both thrombocytes and leukocytes, and c) contains a dye which is fixed with great affi
nity with the aforementioned figurative elements and fixes them of this
way, in normal light.
I1 est vrai que l'on connaît une solution qui répond aux deux premières conditions ci-dessus (Scand. J. Clin. Inzest. 33, 121 (1974)), mais on ne peut effectuer la numération des thrombocytes qu'en utilisant un microscope à contraste de phase. It is true that a solution is known which meets the first two conditions above (Scand. J. Clin. Inzest. 33, 121 (1974)), but the thrombocyte count can only be carried out using a phase contrast microscope.
La présente invention a pour but de préparer une solution de colorant avec laquelle on puisse effectuer la détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes dans le sang entier en utilisant un microscope optique normal et en supprimant les inconvénients susdits des réactifs connus. The object of the present invention is to prepare a dye solution with which the determination of the number of thrombocytes and leukocytes in whole blood can be carried out using a normal light microscope and by eliminating the above drawbacks of the known reagents.
L'invention repose sur la caractéristique surprenante selon laquelle l'association de la solution d'hémolyse et de fixation avec un colorant basique de grande affinité, permet d'obtenir une solution de réactif convenant à la détermination conjointe du nombre des thrombocytes et des leucocytes à l'aide d'un microscope optique normal. Les deux conditions ci-dessus peuvent être remplies si la solution d'hémolyse et de fixation n'est pas incompatible avec le colorant, c'est-à-dire ne forme pas de précipité. The invention is based on the surprising characteristic that the combination of the solution of hemolysis and fixation with a basic dye of high affinity, allows to obtain a reagent solution suitable for the joint determination of the number of thrombocytes and leukocytes using a normal light microscope. The two above conditions can be fulfilled if the hemolysis and fixing solution is not incompatible with the dye, that is to say does not form a precipitate.
I1 faut éviter la formation de précipités microscopiques ; en effet, de tels précipités peuvent présenter un caractère de thrombocytes et ainsi déformer le résultat de la détermination. The formation of microscopic precipitates must be avoided; in fact, such precipitates can have a thrombocyte character and thus distort the result of the determination.
Les solutions de colorant du type du violet crésyle utilisées jusqu'à présent ne répondent que partiellement aux conditions ci-dessus ; en effet, les constituants colorants du type violet cresyle de la solution de numération présentent un caractère faiblement basique ; c'est pourquoi les thrombocytes ne prennent qu'une couleur pàle et les leucocytes ne sont pas nettement mis en évidence. The cresyl violet type dye solutions used up to now only partially meet the above conditions; in fact, the coloring constituents of the cresyle violet type of the counting solution have a weakly basic character; this is why the thrombocytes only take on a pale color and the leukocytes are not clearly highlighted.
On a trouvé, conformément à la présente invention, que les colorants dits à la thiazine conviennent très bien à cet usage. Les colorants du type thiazine sont caractérisés par la présence de deux groupes chromophores. Des composés du type thiazine ont déjà été utilisés dans la pratique médicale dans différents domaines (par exemple la coloration des bactéries, en histochimie), mais la littérature spécialisée et les brevets ne contiennent aucune allusion à la caractéristique qui fait l'objet de la présente invention. Les représentants les plus importants de ce groupe de composés sont le bleu de toluidine (formule I), la thionine (formule II) et le bleu de méthylène (formule III).
La présente invention a pour objet un réactif pour la détermination simultanée du nombre des thrombocytes et des leucocytes par une méthode normale d'observation au microscope optique, caractérisé par le fait qu'il contient 0,1 à 5 parties en poids d'acétone, 0,05 à 2,0 parties en poids de formaldéhyde et/ou de glutaraldéhyde, 0,001 à 0,1 partie en poids d'un colorant de thiazine - avantageusement le bleu de toluidine - 0,1 à 2,0 parties en poids d'un sel minéral, de préférence le chlorure de sodium, et de l'eau en quantité suffisante pour atteindre 100 parties en poids
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le réactif est constitué par 0,1 à 5,0 parties en poids d'acétone, 0,05 à 2,0 parties en poids de formaldéhyde, 0,001 à 0,1 partie en poids de bleu de toluidine et 0,1 à 2 parties en poids de chlorure de sodium.The subject of the present invention is a reagent for the simultaneous determination of the number of thrombocytes and leukocytes by a normal method of observation under an optical microscope, characterized in that it contains 0.1 to 5 parts by weight of acetone, 0.05 to 2.0 parts by weight of formaldehyde and / or glutaraldehyde, 0.001 to 0.1 parts by weight of a thiazine dye - advantageously toluidine blue - 0.1 to 2.0 parts by weight d '' a mineral salt, preferably sodium chloride, and water in sufficient quantity to reach 100 parts by weight
According to an advantageous embodiment of the invention, the reagent consists of 0.1 to 5.0 parts by weight of acetone, 0.05 to 2.0 parts by weight of formaldehyde, 0.001 to 0.1 parts in weight of toluidine blue and 0.1 to 2 parts by weight of sodium chloride.
L'avantage particulier des colorants utilisés conformément à la présente invention réside dans le fait que ceux-ci présentent aussi une très grande affinité pour les macromolécules acides des thrombocytes et des leucocytes et présentent par conséquent une visibilité très intense et très marquée. The particular advantage of the dyes used in accordance with the present invention resides in the fact that they also have a very great affinity for the acid macromolecules of thrombocytes and leukocytes and consequently exhibit very intense and very marked visibility.
L'avantage le plus important des réactifs conformes à la présente invention réside dans le fait que ceux-ci surpassent notablement la sensibilité des réactifs connus. Ce fait peut être démontré par les essais suivants
Les résultats obtenus à partir d'échantillons comportant un nombre inconnu de thrombocytes et de leucocytes sont obtenus au cours de vingt déterminations successives du nombre des thrombocytes et des leucocytes.La précision de la méthode de numération des cellules est satisfaisante lorsque l'écart-type est inférieur à 10 t. Pour un nombre de thrombocytes de 218,8 G/1, l'écart-type ET est de
ET = + 5,0 et en appliquant ces valeurs, le coefficient de variation (exprimé en tant qu'écart-type, en %) est de 2,28 (figure 1). I1 faut encore signaler que la valeur G/1 signifie le nombre de thrombocytes et de leucocytes, indiqué dans le Système International (G/l : giga-(nombre de cellules) = nombre de cellules x 109) (figure 1)-.The most important advantage of the reagents according to the present invention lies in the fact that they significantly exceed the sensitivity of known reagents. This fact can be demonstrated by the following tests
The results obtained from samples containing an unknown number of thrombocytes and leukocytes are obtained during twenty successive determinations of the number of thrombocytes and leukocytes. The precision of the cell counting method is satisfactory when the standard deviation is less than 10 t. For a thrombocyte number of 218.8 G / 1, the standard deviation ET is
ET = + 5.0 and by applying these values, the coefficient of variation (expressed as standard deviation, in%) is 2.28 (Figure 1). It should also be noted that the value G / 1 means the number of thrombocytes and leukocytes, indicated in the International System (G / l: giga- (number of cells) = number of cells x 109) (Figure 1) -.
L'erreur optimale de la numération des leucocytes, pour une moyenne de 5,08 G/1 est ET = + 0,042 , ce qui correspond à un coefficient de variation de 0,8 % (figure 3). The optimal error of the leukocyte count, for an average of 5.08 G / 1 is ET = + 0.042, which corresponds to a coefficient of variation of 0.8% (Figure 3).
Aux fins de comparaison, on compare la solution de réactif conforme à la présente invention, dans le domaine de la numération des thrombocytes, avec la composition de numération des thrombocytes mise sur le marche sous la marque déposée "THROMBOFIX" par la Société Godecke et dans le domaine de la numération des leucocytes, avec une solution de Türk. For comparison purposes, the reagent solution in accordance with the present invention is compared, in the field of thrombocyte counting, with the thrombocyte counting composition marketed under the registered trademark "THROMBOFIX" by the company Godecke and in the field of leukocyte counting, with a Türk solution.
On effectue les essais comparatifs avec le sang de 41 patients, en déterminant parallèlement le nombre des thrombocytes et des leucocytes.The comparative tests are carried out with the blood of 41 patients, by determining in parallel the number of thrombocytes and leukocytes.
Les résultats sont indiqués dans le système de coordonnées cartésiennes (figures 2 et 4). La corrélation entre les deux méthodes et les paramètres normalisés (a, b) de la fonction y = ax + b qui définit les corrélations se déterminent à l'aide d'une calculatrice Hewlett-Packard HP90. The results are shown in the Cartesian coordinate system (Figures 2 and 4). The correlation between the two methods and the normalized parameters (a, b) of the function y = ax + b which defines the correlations are determined using a Hewlett-Packard HP90 calculator.
Lors de la numération des thrombocytes, la corrélation est (r) = 0,927 ; la corrélation fonctionnelle linéaire entre les deux méthodes peut être définie par l'équation y = 1,05 x - 0,94 ; y = le résultat obtenu avec la solution de numération des thrombocytes conforme à la présente invention ; x = le résultat obtenu avec le"THROMBOFIX"(figure 2). When counting thrombocytes, the correlation is (r) = 0.927; the linear functional correlation between the two methods can be defined by the equation y = 1.05 x - 0.94; y = the result obtained with the thrombocyte counting solution in accordance with the present invention; x = the result obtained with the "THROMBOFIX" (figure 2).
On peut constater que le nombre de thrombocytes obtenu en utilisant la solution de réactif conforme à la présente invention est supérieur d'environ 5 % au nombre obtenu à partir du même échantillon, en utilisant le "THROMBOFIX". It can be seen that the number of thrombocytes obtained using the reagent solution according to the present invention is approximately 5% higher than the number obtained from the same sample, using "THROMBOFIX".
Compte tenu du caractère de la détermination, une mesure en exces n'est pas à envisager. La différence obtenue peut être attribuée au fait que le composant colorant de la solution de réactif conforme à l'invention présente une af finité notablement plus grande pour les groupes acides des macromolécules des thrombocytes, c'est pourquoi l'image présente de plus grands contrastes et peut être mieux observée. Given the character of the determination, an excess measure is not to be considered. The difference obtained can be attributed to the fact that the coloring component of the reagent solution according to the invention has a significantly greater affinity for the acid groups of the macromolecules of the thrombocytes, which is why the image has greater contrasts. and can be better observed.
Ainsi, en utilisant la solution de réactif conforme à l'invention, on peut éliminer la mesure-par défaut systématique obtenue avec les solutions de colorant connues.Thus, by using the reagent solution according to the invention, it is possible to eliminate the systematic default measurement obtained with known dye solutions.
Il faut encore signaler que le "THROMBOFIX" présentait une mesure par défaut similaire même lorsqu'on utilisait un microscope à contraste de phase. It should also be noted that the "THROMBOFIX" presented a similar default measurement even when using a phase contrast microscope.
Lors de la numération des leucocytes, la méthode conforme à la présente invention présente avec la solution de Türk une corrélation r - 0,959 ; la corrélation peut être exprimée par la fonction linéaire y = 0,97 x + 0,23. Cela porte à croire qu'il n'y a pas de différence significative entre les deux méthodes. When counting leukocytes, the method according to the present invention has a correlation r - 0.959 with Türk's solution; the correlation can be expressed by the linear function y = 0.97 x + 0.23. This suggests that there is no significant difference between the two methods.
D'autres particularités de la préparation et de l'application de la solution de réactif conforme à la pré sente invention ressortiront des exemples qui vont suivre. Other particular features of the preparation and application of the reagent solution according to the present invention will emerge from the examples which follow.
Il doit être bien entendu1 toutefois que ces exem ples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'il 1z--:tration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples of implementation are given solely by way of illustration, the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
EXEM2LE 1
Solution de numération
On mélange 200 ml d'une solution à 0,9 % de chlorure de sodium dans de l'eau distillée avec 5 ml de format déhyde a 35 % et 770 ml d'eau distillée ayant subi un échange d'ions. Après avoir agité énergiquement, on dissout dans la solution 100 mg de colorant bleu de toluidine. On filtre la solution sur un filtre en verre G-4. Apres addition de 25 ml d'acétone, la solution doit être limpide et exempte de particules.EXAMPLE 1
Numeration solution
200 ml of a 0.9% solution of sodium chloride in distilled water are mixed with 5 ml of 35% dehyde format and 770 ml of distilled water which has undergone ion exchange. After vigorous stirring, 100 mg of toluidine blue dye are dissolved in the solution. The solution is filtered through a G-4 glass filter. After adding 25 ml of acetone, the solution should be clear and free of particles.
EXEMPLE 2
Détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes dans du sanq veineux traité par un anticoagulant.EXAMPLE 2
Determination of the number of thrombocytes and leukocytes in venous blood treated with an anticoagulant.
On traite avantageusement le sang par l'acide éthy
lènediaminetétracétique comme anticoagulant car en présence d'acide éthylènediaminetétracétique il ne se produit pas un dépôt minimal des thrombocytes. Après prélèvement du sang sur de l'acide éthylènediaminetétracétique, on ajuste la concentration de l'acide éthylènediaminetétracétique à 2 mg/ml par Evaporation préalable d'une solution-mere d'éthylènediaminetétracétique disodique dans un petit tube en matière plastique. On peut aussi empêcher la coagulation du sang en utilisant une solution à 3,3 % de citrate trisodique dans l'eau distillée ; lors du prélèvement du sang dans une canule en matière plastique, le rapport est de 9 parties de sang pour 1 partie de citrate.The blood is advantageously treated with ethyl acid
lenediaminetetracetic as an anticoagulant because in the presence of ethylenediaminetetracetic acid there is no minimal deposit of thrombocytes. After sampling the blood on ethylenediaminetetracetic acid, the concentration of ethylenediaminetetracetic acid is adjusted to 2 mg / ml by prior evaporation of a stock solution of disodium ethylenediaminetetracetic acid in a small plastic tube. Blood clotting can also be prevented by using a 3.3% solution of trisodium citrate in distilled water; when drawing blood from a plastic cannula, the ratio is 9 parts of blood to 1 part of citrate.
Mise en oeuvre de la méthode
A 25 pl de sang veineux rendu incoagulable, on ajoute, dans un petit tube à essai en matière plastique,475 P1 de la solution de numération et on laisse rePoser le mélanae à la température ambiante pendant 15 minutes sans aqitation. Implementation of the method
To 25 μl of venous blood made incoagulable, 475 μl of the counting solution are added to a small plastic test tube and the melana is left to stand at room temperature for 15 minutes without agitation.
La numération des thrombocytes et des leucocytes doit s'effectuer en l'espace de 6 heures. Avant la numération, on agite à nouveau la solution, on l'introduit ooutte-à-goutte dans une chambre de Bürker et on la laisse déposer pendant 10 minutes dans la chambre humide.The thrombocyte and leukocyte count should be done within 6 hours. Before counting, the solution is again stirred, introduced dropwise into a Bürker chamber and allowed to settle for 10 minutes in the humid chamber.
a) Numération des thrombocytes.a) Thrombocyte count.
On multiplie le nombre total de thrombocytes compté dans les 10 rectangles de la chambre de Bürker par 2 (coagulation évitée par l'acide éthylênediaminetétracétique) ou par 2,2 (coagulation évitée par le citrate). On obtient le nombre de thrombocytes en G/l. The total number of thrombocytes counted in the 10 rectangles of the Bürker chamber is multiplied by 2 (coagulation avoided by ethylenediaminetetracetic acid) or by 2.2 (coagulation avoided by citrate). The number of thrombocytes in G / l is obtained.
b) Numération des leucocytes.b) Leukocyte count.
On divise par 18 (ou on multiplie par 0,055) le nombre des leucocytes trouvé dans quatre carrés délimités par trois lignes, dans le cas de l'inhibition de la coagulation par le citrate, ou bien on le divise par 20 (ou on le multiplie par 0,05) si l'inhibition de la coagulation a été effectuée au moyen d'acide éthylènediaminetétracétique. On obtient le nombre de leucocytes en G/1. Divide by 18 (or multiply by 0.055) the number of leukocytes found in four squares delimited by three lines, in the case of inhibition of coagulation by citrate, or divide by 20 (or multiply with 0.05) if the coagulation inhibition was carried out using ethylenediaminetetraacetic acid. The number of leukocytes is obtained in G / 1.
EXEMPLE 3
Détermination du nombre des thrombocytes et des leucocytes dans le sang capillaire.EXAMPLE 3
Determination of the number of thrombocytes and leukocytes in capillary blood.
On pique après désinfection le bout d'un doigt ou un talon, on essuie la première goutte de sang et on aspire 25 p1 de sang dans une pipette au moyen d'une seringue en matière plastique (type : par exemple pipette Finn, Gilson ou Eppendorf etc..). On introduit cette quantité de sang dans un petit tube en matière plastique qui contient 25 p1 d'une solution d'acide éthylènediaminetétracétique à 2 mg/ml et on la mélange bien à l'anticoagulant. Après addition de 450 Pl de la solution de numération-et agitation énergique, on laisse reposer la solution à la température au moins 15 minutes, après l'avoir agitée à nouveau on l'introduit goutte-à-goutte dans une chambre de Bürker et on la laisse déposer pendant 10 minutes dans la chambre humide. After disinfecting the tip of a finger or a heel, the first drop of blood is wiped off and 25 μl of blood are drawn up in a pipette using a plastic syringe (type: for example Finn, Gilson or Eppendorf etc.). This quantity of blood is introduced into a small plastic tube which contains 25 μl of a solution of ethylenediaminetetraacetic acid at 2 mg / ml and it is mixed well with the anticoagulant. After adding 450 μl of the counting solution and vigorous stirring, the solution is left to stand at temperature for at least 15 minutes, after having been stirred again it is introduced dropwise into a Bürker chamber and it is left to deposit for 10 minutes in the humid chamber.
On détermine le nombre des thrombocytes et celui des leucocytes de façon analogue à ce que l'on fait pour un sang traité par un anticoagulant ; dans le cas de la numération des thrombocytes, le facteur de multiplication est 2 dans le cas de la numération des leucocytes, il faut diviser par 20. The number of thrombocytes and that of leukocytes are determined in a similar manner to that for blood treated with an anticoagulant; in the case of the thrombocyte count, the multiplication factor is 2 in the case of the leukocyte count, divide by 20.
EXEMPLE 4
On opère comme dans l'Exemple 1, avec cette différence qu'au lieu de formaldéhyde, on utilise 80 g d'un glutaraldéhyde à 25 %.EXAMPLE 4
The procedure is as in Example 1, with the difference that instead of formaldehyde, 80 g of a 25% glutaraldehyde are used.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée,de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its embodiments of implementation and application which have just been described explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which can come to the mind of the technician in the matter, without departing from the framework or the scope of the present invention.
Claims (3)
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