FR2550216A1 - Nouvelle lignee cellulaire, son obtention et son application a la production d'un facteur a activite erythropoietique - Google Patents

Abstract

LA GREFFE D'UNE LEUCEMIE MURINE (IW32 OU NN10) INDUITE IN VIVO PAR UN VIRUS LEUCEMOGENE DEPOURVU D'ACTIVITE SFFV S'EST ACCOMPAGNEE D'UNE POLYGLOBULIE CHEZ LES ANIMAUX RECEVEURS. LE SURNAGEANT DE LA CULTURE DES CELLULES MONTRE QU'ELLES PRODUISENT UNE ACTIVITE ERYTHROPOIETIQUE STABLE A LA CHALEUR. APPLICATION A LA PRODUCTION D'ERYTHROPOIETINE.

Description

''invention, qui appartient au domaine biologique, concerne la production d'un facteur capable de moduler la multiplication et la différenciation des précurseurs érythroblastiques. Elle a plus particulièrement pour objet une nouvelle lignée cellulaire dont
la culture permet l'obtention d'un facteur à activité érythropoSétique.

Le pLus connu et le mieux défini de tels facteurs est l'érythropoiétine qui est responsable de l'essentiel de la régulation de la différenciation érythroblastique normale.

L'érythropoiétine (Ep) est une glycoprotéine acide, sialique, présente dans le plasma à très faible concentration (- 0,0003 IU/ml) dans les conditions normales Elle est produite en grande partie dans le rein de l'animal ou de l'homme adulte. Il existe aussi très certainement des sites extrarénaux de production de l'Ep.

L'article de MIYAKE T, KUNG C.K.H.,
GOLDWASSER E., Journal of Biological Chemistry, 252 5558, 1977,décrit la purification jusqu'à apparente homogénéité de l'érythropoiétine extraite d'urines de patients aplasiques. Le processus de purification a permis d'obtenir une préparation contenant 70 400 U/mg de protéine. Le poids moléculaire de la molécule sans acide sialique est de 34 000, celui de la molécule native est de 39 000. On sait que l'acide sialique est nécessaire à l'activité in vivo de l'Ep. Une molécule sans acide sialique n'est active qu 'in vitro.

L'Ep est stable à la chaleur. Elle supporte des pH compris entre 5 et 9. Elle est inactivée par des enzymes protéolytiques (trypsine par exemple).

Elle n'a pas de spécificité d'espèce. Elle est active in vivo et in vitro, voir CASADEVALL, N., BERNARD, J.,
LEVY, J.P. , VARET, B. (1976), Hématologie, Editions
Flammarion, p. 71-96.

Le dosage le plus ancien de l'Ep est un dosage biologique qui mesure le pourcentage d'incorpora- tion du fer radio-actif chez des animaux dcnt on a bloqué l'érythropoièse spontanée Cpolyglobulie induite par exemple). Il reste le dosage de référence.

L'érythropoétine qui est c tuellement la plus commercialisée est de l'Ep fabriquée à partir de plasma de mouton rendu anémique par des injections de phénylhydrazine conjuguées à une irradiation corporelle totale. Le plasma est dialysé et absorbé sur un mélange de DEAE cellulose et de phosphate de cellulose, élué, précipité par du sulfate d'ammonium, redissous, dialysé, lyophilisé. Ce procédé aboutit à un type d'Ep dénommé "Ep Step I" qui a normalement une activité de 0,2 à 0,9 U/mg. Il existe un autre type de produit, dénommé "Ep Step III" qui est obtenu à partir du produit Step I par précipitation fractionnée suivie d'une chromatographie sur Sephadex G 100 - dialyse et lyophilisation.

Normalement l'activité est de 2,8 U/mg.

On fabrique aussi actuellement de I 'érythro- piétine extraite d plasma de porcs anémiques.

On commercialise également une Ep extraite d'urine humaine.

Il est souhaitable de disposer d'autres sources d'érythropoiétine ou de facteurs à activité érythropoSétique, permettant notamment à moindres frais d'obtenir des produits ayant une activité élevée.

L'invention répond à un tel besoin et a pour objet principal une lignée permanente de cellules de souris dont le surnageant possède une activité érythropoiétique.

L'invention concerne ainsi une lignée érythroleucémique murine induite par le composant leucémogène, dépourvu de SFFV (virus formant des foyers dans la rate), du virus de Friend, lignée cellulaire dont le surnageant possède une activité érythropoSe- tique.

Selon un premier mode de réalisation, l'in- vent ion concerne une lignée cellulaire murine, du type général décrit ci-dessus, dénommée IW32, déposée le 28 juillet 1983 sous le n" I-234 dans la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Inst;- tut Pasteur à Paris.

Selon un second mode de réalisation, I' in- vention concerne une autre lignée cellulaire murine du type général décrit ci-dessus, dénommée NN10, déposée le 28 juillet 1983 sous le n I-235 dans la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur à Paris.

La lignée cellulaire IW32 a été obtenue ainsi qu'il sera indiqué ci-apres à partir du virus I-5, qui est décrit par MATHIEU-MAHUL D., HEARD J.M.,
FICHELSON S., GISSELBRECHT S., SOLA B. et LARSEN C.J.,
Virology 119 : 59-67 (1982).

La Lignée cellulaire NN10 a été obtenue ainsi qu'il sera indiqué ci-après à partir du clone 201 qui est décrit par A. OLIFF et al, Journal of
Virology, 33 : 475-486 (1980). Le clone I-5 est décrit dans D. MATHIEU-MAHUL et al., Virology 119 55-67 (1982).

L'invention a également pour objet un procédé pour l'obtention d'une lignée cellulaire capable de développer dans son surnageant une activité éry thropolétique, ledit procédé consistant à
(a) inoculer le virus 1-5 à des souris ICFW
nouveau-nées,
(b) réaliser des transfusions pour remédier à l'érythroblastose précoce du nouveau-né induite après L'étape (a),
(c) sacrifier les souris après plusieurs mois,
(d) prélever les rates des souris et préparer un broyat cellulaire desdites rates,
(e) injecter ce broyat à d'autres souris ICFW adultes en vue d'un traitement de tumorisation in vivo, lequel provoque une ascite,
(f) effectuer plusieurs passages in vivo de cette ascite jusqu'à constatation de la présence de muqueuses très colorées en rouge chez les souris et jusqu'à obtention in vitro de la lignée, la souris obtenue au stade final n'étant plus polyglobulique et répondant aux caractéristiques c;-après
- son plasma ne contient pas de virus SFFV,
- son plasma n'a aucune activité érythropoiétique in vivo.

La technique selon L'invention est illustrée d'une manière résumée par l'exemple suivant
Des souris ICFW nouveau-nées ont reçu une injection de virus I-5. Les souris ont développé une érythroblastose précoce du nouveau-ne guérie par plusieurs transfusions. Trois mois après sont apparus un gros foie, une grosse rate, des ganglions mésentériques. L'examen cytologique montrait un aspect d'érythroleucémie. Les broyats cellulaires de natte ont été injectés à d'autres souris ICFW adultes (tumorisation in vivo); celles-ci ont développé une ascite.

Après 7 passages in vivo de cette ascite (9 mois après la première injection), on constate que les souris malades ont des muqueuses très colorées rouges" (hématocrite: 51% - 55% - 50%, pour un hématocrite normal d'une souris à35X). La 8è série de souris tumorisées est toujours polyglobulique. C'est à partir d'une souris de la 9è tumorisation qu'a été obtenue la lignée in vitro. Cette souris avait un hématocrite à 56%, son plasma ne contenait pas de virus SFFV et n'avait aucune activité érythropoiétique in vivo.

Le surnageant de la lignée IW 32manifeste une activité érythropoSétique. Ainsi, il induit in vitro en culture clonale, des colonies érythroblastiques à partir d'une moelle normale de souris ainsi qu 'à partir de la moelle humaine normale.

Testé in vivo chez des souris rendues polyglobuliques, le surnageant a une activité érythropoSé- tique mesurée par l'incorporation du Fe.

Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé pour L'obtention d'une lignée cellulaire capable de développer dans son surnageant une activité érythropoiétique, ledit procédé consistant à:
(a) inoculer le virus cloné 210 à des souris
ICFW,
(b) réaliser des transfusions pour remédier à l'érythroblastose induite après L'étape (a),
(c) transplanter in vivo les leucémies ultérieurement apparues,
(d) effectuer plusieurs passages in vivo jus qu'à obtention d'une souris non polyglobulique.

Cette technique peut notamment être réalisée de la manière suivante : La lignée NN10 est obtenue chez des souris ICFW inoculées avec le virus cloné 210. Les animaux inoculés ont développé une maladie érythroproliférative traitée par des transfusions répétées; les leucémies sont apparues ultérieurement. Plusieurs de ces leucémies ont été transplantées in vivo chez d'autres animaux ICFW. Deux lignées érythroleucémiques ont été mises en culture à partir de ces leucémies transplantées. L'une de ces deux lignées (NN10) mise en culture in vitro après sept passages in vivo, produisait en culture un facteur érythropoiétique d'activité tout à fait identique à celle de la lignée IW32.

On observera que L'invention procure des résultats inattendus dans L'obtention de lignées cellulaires murines dont le surnageant possède une activité érithropoiétique. En effet, des essais ont été réalisés dans Le cadre de t'invention sur plusieurs lignées érythroleucémiques, sans pour autant conduire à une Lignée permanente donnant lieu à cette activité.

Ainsi, on a entrepris des essais sur cinq lignées érythroleucémiques, à savoir trois induites par Le virus I-5 et deux par le virus Clone 201. Seule la ignée induite par le virus I-5 et la lignée induite par le virus Clone 201, dont des cellules représentatives se trouvent déposées dans la Collection de l'institut Pasteur sous les numéros respectifs I-234 et I-235, se sont révélées capables de fournir une activité érythropoiétique dans leur surnageant.

On notera également que les deux lignées cellulaires selon l'invention permettent d'obtenir un facteur érythropoiétique ayant, dans chaque cas, la même activité in vivo et in vitro, et qu'en conséquence, les études les plus approfondies ont été effectuées avec la lignée IW 32.

D'autres caractéristiques de la présente invention apparaitront dans la description détaillée ci-après qui illustre L'obtention de La nouvelle lignée cellulaire murine IW 32 érythroleucémique et son application à la production d'un facteur à activité érythropoiétique.

Dans cette description, les abréviations suivantes sont utilisées:
SFFV Virus formant des foyers dans la rate.

FMuLV Virus leucémique murin de Friend.

FVp Souche des virus de Friend polycythémiques.

MCF Foyers cytopathogènes.

CFUE Unité de basedes petites colonies érythroides.

BFU E Unité de base des grandes colonies érythroides.

CSF Facteur de stimulation de la colonie.

GM-CFU Unité de formation de la colonie granulo mac rophagi que.

BPA Activité stimulant les BFUE.

On sait que des lignées de cellules leucémiques produisent des facteurs de croissance ou de différenciation pour des cellules hématopoiétiques de différentes descendances [ASCENSAO J.L. , VESSELA R.L. et
ZANJANI E.D., Experimental Hematology Today, p.49-52 (1982)1. La production de facteurs spécifiques aux lignées érythroides apparaît toutefois très rare.

Deux lignées de cellules humaines ont synthétisé des facteurs capables de potentialiser la différenciation des descendants en érythroblastes, voir:
GOLDE, D.W. - BERSCH, N. - QUANS, G. et
LUSIS, A.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
593-596 (1980), ainsi que
ASCENSAO, J.L. - Kay, N.E. - EARENFIGHT
ENGLER, T. - KOREN, H.S. et ZANJANI, E.D.

Blood 57,170-173 (1981).

Ces facteurs étaient actifs seulement en la présence d'érythropoiétine et étaient incapables d'in dui re par eux-mêmes le dernier stade de la différent ciation érythroide.

Une activité érythropoiétique, définie par l'induction de la synthèse de l'hémoglobine, in vivo et in vitro, a été trouvée dans le surnageant de macrophages murins cultivés in vitro, voir:
RICH, I.N. - HEIT, W. et KUBANEK, B.
Blood, 60, 1007-1018 (1982).

Toutefois, la production d'une activité érythropoiétique par une culture permanente de cellules n'a, à la connaissance du demandeur, jamais été décrite.

Selon la présente invention, on a -maintenant trouvé qu'une cellule murine érythroleucémique induite in vivo par un vi-rus leucémogène et étabtie in vitro comme une lignée permanente de cellules, produit de grandes quantités d'une protéine ayant une activité érythropoiétique.

Virus leucémique et Lignée de cellules
La souche du virus I-5 a déjà été décrite, voir:
MATHIEU-MAHUL, D. - HEARD, J.M. - FICHELSON, S.

GISSELBRECHT, S. - SOLA, B. et LARSEN, C.J.

Virology 119, 59-67 (1982).

Ce virus écotropique (FMuLV) a été isolé du complexe leucémogène polycythémique (FV ) et ne p possède aucune activité SFFV, xénotropique ou MCF.

Il a été montré que ce virus produit des leucémies érythroides, myéloSdes ou lymphoSdes, chez les souris résistantes ou échappant aux troubles aigus induits par ce FMuLV comme d'autres virus similaires, voir:
OLIFF, A.I. - RUSCETTI, S.R. - DOUGLAS, E.C.

et SCOLNICK, E.M. - Blood 58, 244-254 (1981)
ainsi que
SHIBUYA, T. et MAK, T.W. - Cell 31, 483-493
(1982).

Pour déterminer la présence de SFFV, 0,1 ml de plasma ou de surnageant de culture ont été injectés à des souris ICWF ou Balb/C âgées de 4 à 6 semaines.

Dix jours plus tard, la rate était examinée pour La formation de foyer conformément à La technique décrite par:
AXELRAD, A.A. et STEEVES, R.A.
Virology, 24, 513-518 (1964).

Obtention de la lignée de cellules IW32
La leucémie IW 32 a été induite chez les souriceaux ICFW nouveau-nés et infectée par la souche du virus I-5. L'évolution initiale in vivo de cette leucémie n'a pas différé des autres leucémies induites par le même virus.

Un mois après l'infection, certaines souris développent une anémie et une hépatosplénomégalie, comme décrit précédemment chez les souris infectées de
FMuLV. Cette phase disparut complètement après des transfusions répétées. Deux mois plus tard, une hépatosplénomégalie réapparut, alors que les transfusions étaient maintenues. Les souris furent alors sacrifiées.

Chez la souris leucémique ayant reçu les cellules IW 32, des études cytologiques de La rate ont montré une infiltration de cellules leucémiques indif
férenciées. Ces cellules furent transplantées en série chez des souris ICFW.

L'évolution in vivo de la leucémie IW 32 transplantable diffère des autres leucémies par l'ap- parition d'une polyglobulie chez les animaux receveurs après 7 transplantations in vivo.

Les souris receveuses apparurent rougeâtres et leur hématocrite atteignait 60% un mois après l'inoculation des cellules leucémiques.

Des cellules de la rate du 13ème passage in vivo furent utilisées pour établir la lignée cellulaire in vitro.

Des fragments de la rate avec ses tumeurs furent soigneusement placés dans un milieu de culture alpha, (Flow, Scotland) pour obtenir une suspension de ceLlules uniques.

106 à 5.106 cellules ont été placées directement dans des flacons de culture de 25 cm2 (Corning) avec 10 ml de milieu alDha additionné de 10% de FCS et 20 mM de glutamine. Les passages successifs des cellules non adhérentes ont conduit à l'obtention d'une Lignée pure de cellules en suspension.

Les cellules leucémiques ont été changées de milieu trois fois par semaine. Le surnageant de culture fut collecté après 48 heures puis filtré à travers un filtre "Millipore" ayant une ouverture de pores de 0,2 pm. Il fut conservé à -200C jusqu'aux essais.

Essais in vivo de l activité èrythropoiétique
Des souris femelles adultes DBA2 furent rendues polyglobuliques (Hématocrite > 60%) par injections intrapéritonéales de globules rouges (1 ml le jour - 4 et 0,5 ml le jour - 1).

L'érythropoSétine de référence (Laboratoires
Connaught, Toronto - Canada), le surnageant de culture et une solution saline furent injectés de manière sous-cutanée le jour 0 (5 animaux dans chaque groupe expérimental).

59
Du citrate de Fe CAmersham) (1 UC dilué dans 0,2 ml de MEM) fut injecté par intraveineuse le 3ème jour.

59
L'incorporation du Fe dans les cellules des globules rouges fut mesurée le 6ème jour.

Essais in vitro pour les descendants hématopoitetiques normaux
Les essais du CFUE furent effectués dans des cultures de caillots de plasma selon la technique de MC LEOD D.L., SHREEVE M.M. et AXELRAD A.A., Blood 44, 517-534 (1974) modifiée conformément à LACOMBE C,
CASADEVALL N. et VARET B., Br. J. Haemat. 44, 189-199 (1980). Les cultures furent réalisées soit avec des cellules de moelles de souris normales (5.105/ml), soit avec des cellules humaines normales de moelle (5.105/ml).

Des cultures furent placées dans des boîtes de Pétri de 35 x 10 mm (Falcon 3001) contenant 0,4 ml de sérum (voir ci-après), 0,2 ml de sérumaîbumine bovine détoxifiée 0,2-ml de L-Asparagine (0,2 mg/ml) (Calbiochem) diluée dans du milieu alpha plus du CaCl2 (28 mg/lOO ml), 0,2 ml de suspension de cellules, 0,2 ml d'érythropoiétine Step III (Labortoires Connaught,
Toronto - Canada), 0,6 ml de milieu alpha.

Dans certaines cultures, l'érythropoiétine fut remplacée par du milieu alpha, soit par O,05 à 0,9 ml de surnageant de culture de la lignée 1W 32.

Toutes les cultures ont été faites en double, mises en caillot par l'addition de 0,2 ml de plasma bovin citraté (Flobio) et ensuite mises à incuber à 37 C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2.

Après incubation, les caillots furent fixés avec du glutaraldéhyde et colorés avec de La benzidine hématoxyline; on a dénombré les colonies érythroides.

Pour les cultures murines, un sérum de veau foetal a été utilisé et L'incubation a duré 60 heures. Pour les cultures humaines, le sérum AB normal a été utilisé et l'incubation a duré 7 jours.

Les essais pour les GM-CFU murins furent effectués dans des cultures agar monocouches comme décrit par METCALF D., Hemopoïetic colonies : in vitro cloning of normal and leukemic cells - Springer Verlan,
Berlin/New-York, p. 57-98 (1977). 7 x 104 cellules de moelle de souris furent cultivées dans 1 ml d'agar à 0,3% dans un milieu alpha contenant 10% de sérum de veau foetal. Du sérum provenant de souris ayant reçu de l'endotoxine fut utilisé comme source de CSF.

Le 7ème jour, les cultures furent ajoutées aux colonies granulo-monocytiques sous microscope inverse.

Induction de la différenciation
Divers produits à savoir le HMBA (Serva), le butyrate de sodium (Sigma), le diméthylsulfoxyde (DMSO) (Sigma), et l'hémine (Sigma) furent essayés pour leur capacité à induire la synthèse de l'hémoglobine dans les cellules IW 32 aux concentrations indiquées sur le Tableau 1. La synthèse de l'hémoglobine était mise en évidence par la réaction des cellules à la benzidine.

Etudes biochimiques
Des digestions de trypsine furent effectuées de la façon suivante: 1 ml d'échantillon fut mis à incuber avec 0,4 mg de trypsine TPCK 227 p/mg (Worthington) diluée dans 1 ml de tampon salé tris (TBS) à pH 7,4. Le mélange fut mis à incuber à 370C pendant 1 h et 6 h. La digestion fut stoppée en additionnant 0,8 mg d'inhibiteur de la trypsine à base de soja. Des contrôles furent effectués à 37"C avec le mélange trypsine TPCK + inhibiteur ou avec l'inhibiteur seul.

Les chromatographies sur colonne de concanavaline A - Sépharose furent faites avec une colonne équilibrée en tris-HCl O,Q2M, à pH 7,4 avec du NaCi 0,5M. Les protéines liées furent éluées dans Le même tampon contenant du méthyl-mannopyranoside 0,2M.

Des précipitations de sulfate d'ammonium furent effectuées en ajoutant aux échantillons du sulfate d'ammonium pour atteindre 50, 65 et 100X en saturation.

Les produits protéiques successivement précipités furent redissous dans du TBS à pH 7,4 et dialysés dans le même tampon.

RESULTATS
Les cellules IW 32 en suspension ont un aspect de cellules blastoides libres avec un cytoplasme basophile contenant de nombreuses vacuoles.

Les réactions à la myélopéroxydase et à l'estérase restent négatives comme pour la benzidine.

Après incubation avec le butyrate de sodium et l'hémine, de nombreuses cellules positives à la benzidine fuient trouvées. Le DMSO et le HMBP restent sans effet (Tableau 1). Une étude préliminaire cystogénétique a mis en évidence un caryotype anormal avec 70 chromosomes.

Toutes les souris inoculées de façon souscutanée ouintrapéritonéale avec les cellules IW 32 développent une tumeur locale et/ou une splénomégalie, de deux à quatre semaines après l'inoculation.

En même temps, elLes développèrent une polyglobulie montrée par l'augmentation de l'hématocrite.

Pour déterminer si cette polyglobulie différait d'une polyglobulie induite par le virus FVp, on a cherché les CFUE, de moelle de souris porteuses d'une tumeur IW 32 et polyglobuliques. Les cellules mononucléées de la moelle furent cultivées avec et sans adjonction d'érythropoiétine.

Des colonies dérivées des CRUE furent observées seulement en la présence d'érythropoSétine alors que chez les animaux porteurs d'une polyglobulie induite par le virus de Friend, il entre dans la moelle de nombreuses CFUE capables de se différencier in vitro en érythroblastes sans adjonction d'érythropoiétine.

Le surnageant des cultures de cellules IW 32 et le plasma des tumeurs affectant les souris étaient dépourvus d'activité SFFV comme l'a montré l'inocula- tion des souris adultes ICFW et Balb/C et la vérification des foyers de la rate 10 jours plus tard. Ceci a été confirmé par l'absence de splénomégalie et de polyglobulie 28 jours après l'inoculation du surnageant de 1W 32.

Activité érythropoiétique du surnageant 1W32
In vivo, l'inoculation de 0,4 ml de surnageant IW 32 chez des souris polyglobuliques hypertransfusées induit une incorporation importante du 59 Fe dans les cellules des globules rouges de La circulation
(Tableau 2).

TABLEAU 1
Effet du HMBA, du butyrate de sodium, du DMSO et de l'hémine sur l'induction de cellules positives à la benzidine dans la lignée cellulaire IW 32.

<SEP> % <SEP> de <SEP> cellules <SEP> positives <SEP> à <SEP> la <SEP> benzidine
<tb> Traitement <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 72 <SEP> h <SEP> 96 <SEP> h
<tb> Aucun <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 6 <SEP> mM <SEP> à <SEP> 15 <SEP> mM <SEP> de <SEP> HMBA <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 0,5 <SEP> mM <SEP> de <SEP> butyrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> #70%
<tb> 0,1% <SEP> à <SEP> 1% <SEP> de <SEP> DMSO <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 50 <SEP> M <SEP> d'hémine <SEP> 0 <SEP> #95% <SEP> #95%
<tb> TABLEAU 2
Activité érythropoïétique in vivo du surnageant de la lignée IW 32 injecté chez la sour is polyglobulique.

Transfusion <SEP> de <SEP> Injection <SEP> Injection <SEP> 59 <SEP> Fe <SEP> Incorporation
<tb> Gr <SEP> à <SEP> J-5 <SEP> et <SEP> J-1 <SEP> à <SEP> J <SEP> O <SEP> à <SEP> J <SEP> 3 <SEP> érythrocytaire <SEP> 59 <SEP> Fea)
<tb> <SEP> + <SEP> Erythropoïétine <SEP> 1 <SEP> Ci <SEP> 20,5%
<tb> <SEP> 1 <SEP> UI <SEP> (0,4 <SEP> ml)
<tb> <SEP> + <SEP> Surnageant <SEP> IW <SEP> 32
<tb> <SEP> x <SEP> 20 <SEP> (0,4 <SEP> ml)b) <SEP> 1 <SEP> Ci <SEP> 17,1%
<tb> <SEP> + <SEP> Sérum <SEP> physiologique
<tb> <SEP> (0,4 <SEP> ml) <SEP> 1 <SEP> Ci <SEP> 0,07%
<tb> a) Chaque série comportait 5 animaux. Chaque résultat représente la moyenne de 5 mesures.

b) Le surnageant de la lignée IW 32 a été concentré en présence de polyéthylèneglycol
(PEG 4000) et dialysé contre du PBS.

TABLEAU 3
Activité in vitro du surnageant de la lignée IW 32 sur la différenciation
des CFUE en érythroblastes
(Technique du caillot plasmatique)

Facteur <SEP> érythropoïétique <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> colonies
<tb> <SEP> utilisé <SEP> érythroblastiques <SEP> après <SEP> 48 <SEP> h
<tb> <SEP> de <SEP> culture <SEP> (1)
<tb> Erythropoïétine <SEP> Step <SEP> III
<tb> 0,5 <SEP> UI <SEP> 1275 <SEP> # <SEP> 35
<tb> Surnageant <SEP> IW <SEP> 32
<tb> 0,5 <SEP> ml <SEP> 1342 <SEP> # <SEP> 36
<tb> <SEP> - <SEP> 0
<tb> (1) Chaque résultat représente la moyenne et l'écart type de 5 expériences successives
faites chaque fois en double.

n v;tro, le surnageant IW 32 a été ajouté à la culture de cellules murines de moelle normale à la place d'érythropoiétine. On a ainsi induit des colonies érythroïdes caractéristiques positives à la benzidine, dans les cultures de caillots de plasma après 60 h (CFUE) et 7 jours (BFUE). 10 U1 de surnageant par culture ont été suffisants pour induire de telles colonies. Les courbes de réponse des CFUE normales de la moelle au surnageant IW 32 et à l'éry- thropoïétine Step III étaient très similaires avec d'abord une augmentation linéaire du nombre de colonies érythroides dérivées des CFUE, puis un plateau.

La figure est un diagramme indiquant les courbes des doses-réponses de CFUE de moelle de souris d'une part à l'érythropoiétine Step III (à gauche) et d'autre part au surnageant IW 32. Les colonies érythroides ont été dénombrées après 60 heures de culture. Le nombre de colonies érythroides au plateau est nettement plus important après l'addition de surnageant IW 32 qu'après
L'addition de l'érythropoïétine Step III. Le surnageant d'IW 32 n'a pas provoqué de différenciation des
GM-CSF avant l'addition à des cellules de moelle de souris en culture agar. L'activité érythropoïétique in vitro du IW 32 n'est pas spécifique d'espèce, car le surnageant IW 32 a induit des colonies érythroides typiques dérivant des CFUE 7 jours après l'addition à des cellules humaines mononucléaires de moelle dans des cultures de caillots de plasma (0,5 ml de surnageant IW 32 utilisé à la place de l'érythropoiétine a induit 510 t 30 colonies érythroides/5.105 cellules de molle humaine normaLe).

Etudes biochimiques
Les caractéristiques biochimiques du surnageant IW 32 et de l'érythropoiétine StepIII ont été comparées en testant la capacité d'induire des colonies érythroides de la moelle de souris normale dérivées-des CFUE, apres des traitements biochimiques similaires. Les activités biologiques de l'érythro- poiétine Step III et du surnageant IW 32 n'ont pas été affectées après un chauffage à 56 C pendant 30 mn, une ébullition à 100 C pendant 3 mn, une lyophilisa- tion, une congélation, un traitement avec 10D vg/ml de trypsine pendant 1 h à 37 C.Elles ont été détruites avec 200 g/ml de trypsine pendant 6 heures à 37 C.

Le facteur érythropoiétique du surnageant IW 32 et l'érythropoiétine Step III ont été précipités ar le sulfate d'ammonium. Après une chromatographie sur
Concanavaline A-Sépharose, les activités des deux facteurs ont été éluées immédiatement après le wolume vide.

Les indications détaillées qui précedent illustrent que l'invention permet la production d'une activité érythropoiétique très voisine de l'érythropoïétine Step III du plasma des moutons anémiques par une lignée de cellules murines leucé- moques.

La capacité à la différenciation èrythroide d'une lignée de cellules leucémiques a été prouvée par la synthèse de l'hémoglobine (montrée par La coloration par la benzidine) après incubation e présence de composants biochimiques (butyrate de sodium et hémine) connus pour induire la dif-feren- cjation in vitro d'autres lignées de cellules urines érythroleucémiques. La Lignée de cellules leucémiques IW 32 est dérivée d'une leucémie induite chez des souris infectées d'un F-MuLV écotropique cloné biologiquement à partir du virus de Friend.La souche du virus utilisé ne possède aucune activité SFFV détectable
La présence dans la lignée de cellules d'un virus à action polycythémiante peut être exclue pour & s raisons suivantes:
(1) Aucune activité SFFV n'a pu être détectée dans les surnageants IW 32 du plasma des souris porteuses de tumeurs polycythémiantes.

(2) Les souris polyglobuliques infectées avec une tumeur 1W 32 n'ont pas de CFUE capables de former des colonies érythroides in vitro, en l'absence d'érythropoiétine, tandis que de telles colonies ont été toujours trouvées dans la moelle des souris rendues polycythémiantes par Le FVp.

(3) L'activité érythropoïétique des surnageants IW 32 était stable à 1000C, une température connue pour détruire l'infectivité de n importe quel virus de type C.

La polycythémie observée chez les animaux inoculés est donc bien due à la sécrétion d'un facteur érythropoiétique par tes cellules IW 32 infectieuses.

Cela fut en outre prouvé en étudiant les propriétés du surnageant de la lignée cellulaire IW 32 obtenue in vitro de façon permanente. Ce surnageant possède deux propriétés majeures de l'érythropoîétine :
a) Il induit une vague de différenciation érythroSde in vivo comme cela a été vu par I' incorpo- ration de 59 Fe dans les réticulocytes de souris rendues polycythémiques par transfusions.

b) IL permet la différenciation in vitro des
CFUE murines en colonies érythroblastiques mâtures.

De plus, son activité n'est pas spécifique d'espèce, étant donné que des colonies érythroides dérivées de CFUE ont été aussi obtenues à partir de cellules humaines de moelle normale comme cela a été décrit pour l'érythropoétine naturelle.

La seule différence trouvée entre l'érythropoiétine Step III et le facteur IW 32 a été le nombre maximal de CFUE détectée à partir des cellules murines normales de moelle de souris. Des impuretés présentes dans l'érythropoïétine Step III et absentes dans le surnageant IW 32 peuvent aussi avoir été responsables de cette différence quantitative.

On a également constaté que l'activité érythropoiétique produite par la lignée IW 32 différait des facteurs érythropoiétiques précédemment décrits comme distincts de l'érythropoiétine. L'activité BPA a été définie comme une substance nécessaire à la différenciation des précurseurs érythroblastiques les plus inducteurs (BFU ) ou CFUE: voir ISCOVE N.N. et
GUILBERT N J. "In vitro aspects of erythropoietin",
Eds Murphy N.J. et al., Springer Verlag New-York, p.3-7 (1978). Ce facteur est incapable d'induire la différenciation de CFUE en érythroblastes.

Au contraire, l'érythropoiétine et le facteur 1W 32 induisirent in vitro des colonies érythroblastiques matures en deux jours à partir decellules de moelle de souris normale.

Le facteur décrit par JOHNSON G.R. et
METCALF D. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3879-3882 (1977) est nécessairement différent étant donné qu'il n'est actif que sur les précurseurs érythroides hépatiques de souris foetales et qu'il est inefficace sur les cellules humaines. De plus, on a montré que ce facteur différait de l'érythropoétine en étant retenu dans la colonne de chromatographie
Con-A-Sépharose.

Les colonnes Con-A-Sépharose n'ont pas permis la distinction entre l'érythropoSétine et l'activité érythropolétique du facteur IW 32, ce qui démontre que le facteur érythropoiétique IW 32 est différent du facteur décrit par JohnsonwG.R. et
Metcalf,D.

A la connaissance du Demandeur, la présente invention constitue le premier exemple d'une limnée cellulaire infectieuse produisant in vitro de grandes quantités d'un facteur soluble à activité érythropoïétique. Les cellules IW 32 représentent une source d'activité érythropoiétique, et peuvent remplacer au moins, in vitro, l'érythropoïétine actuellement rare et coOteuse.

La quantité d'activité d'érythropoïétine contenue dans 1 ml de surnageant de culture peut être estimée par le dosage in vivo chez la souris, l'Ep.

de référence étant L'érythroiétine Step III,
- à 0,2 U par son action in vitro sur la moelle humaine,
- entre 0,5 U et 1 U/ml par son action in vitro sur la moelle de souris.

L'activité présente dans le surnageant est stable à la-température (30 mn à 56 C, 3 mn à 100 C), aux congélations et décongélations, à la lyophilisation. Par contre, une dialyse classique en TBS pendant 2 jours ne restitue qu' environ 20% de L'activité de départ. L'activité est abolie par la trypsine mais avec une dose de 200 Ug/2 mg de protéines et une incubation de 6 h à 37 C.

l'érythropoiétine traitée de manière parallèle a des propriétés comparables.

La précipitation du (des) facteur(s) par (NH4)2SO4 donne une activité optimale dans la fraction protéique précipitant entre 50 et 65% de saturation.

On a encore effectué d'autres traitements biochimiques pour comparer L'activité érythropoiétique produite selon l'invention et l'érythiopoiétine Step
III. On a utilisé Les divers réactifs suivants:
urée 8M, chlorhydrate de guanidine 6M,
2 Mercaptoéthanol 0,1M, SDS 1%,
chlorhydrate de guanidine 6M + Mercaptoéthanol 0,1M,
SDS 1% + Mercaptoéthanol 0,1M,
acide acétique M, métapériodate 5 mM,
hydroxyde de sodium 10 mM.

Aucune différence de comportement entre l'érythropoïétine de mouton Step III et L'activité érythropolïétique produite par la lignée IW 32 n'est apparue. Ces résultats montrent que te facteur érythropoiétique produit par la lignée IW 32 est biochimiquement une érythropoiétine.

De plus, l'érythropoïétine Step III de mouton et le facteur érythropoiétique de ta Lignée IW 32 ont le même comportement en Get filtration et en chromatographie (échangeuse d'ions) DEAE Affi
Gel Blue. Le poids molécuLaire des deux moLécules est sensiblement identique (environ 40 000 à 50 000).

Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Lignée érythroleucémique murine induite par le composant leucémogène, dépourvu de SFFV (virus formant des foyers dans la rate), du virus de Friend, lignée cellulaire dont le surnageant possède une activité érythropoiétique.

2. Lignée cellulaire murine selon la revendication 1, dénommée IW32 et déposée sous Le n" I-234 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur à Paris.

3. Lignée cellulaire murine selon la revendication 1, dénommée NN10 et déposée sous le n" I-235 à La Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur à Paris.

4. Cellules de la lignée IW32, caractérisées en ce que:

- elles ont en suspension un aspect de cellules blastoSdes libres avec un cytoplasme basophile contenant de nombreuses vacuoles,

- les réactions à la myéloperoxydase, à l'estérase ainsi qu a la benzidine sont négatives,

- après incubation avec le butyrate de sodium et l'hémine, de nombreuses cellules positives à la benzidine apparaissent,

- le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le HMBA restent sans effet.

5. Application de la lignée cellulaire

IW32 ou NN10 à la production d'un facteur érythropoïétique se trouvant dans le surnageant des cultures desdites cellules.

6. Surnageant de cultures de cellules IW32 et NN10.

7. Surnageant selon la revendication 6, caractérisé en ce que:

- il induit in vitro en culture clonale-, des colonies érythroblastiques à partir d'une moelle nor male de souris ou de la moelle humaine normale,

- il possède une activité érythropoiétique mesurée par L'incorporation du 59F lors d'essais in

e vivo chez des souris rendues polyglobuliques.

8. Facteur a activité érythropolétique contenu dans le surnageant selon L'une des revendications 6 ou 7.

9. Facteur à activité érythropoSétique selon la revendication 8, caractérisé en ce que:

- son activité est stable à la température, aux congélations et décongélations ainsi qu'à la lyophilisation.

10. Facteur à activité érythropoiétique consistant en la fraction protéique obtenue par précipitation après traitement au sulfate d'ammonium du surnageant selon L'une des revendications 6 ou 7 et précipitant entre 50 et 65% de saturation.

11. Erythropoiétine obtenue dans l'appli- cation selon la revendication 5.

12. Procédé pour l'obtention d'une lignée cellulaire capable de développer dans son surnageant une activité érythroporétique, ledit procédé consistant à:

(a) inoculer le virus I-5 à des souris ICFW nouveau-nées,

(b) réaliser des transfusions pour remédier à l'érythroblastose précoce du nouveau-né induite après

L'étape (a),

(c) sacrifier Les souris après plusieurs mois,

(d) prélever les rates des souris et préparer un broyat cellulaire desdites rates,

(e) injecter ce broyat à d'autres souris ICFW adultes en vue d'un traitement de tumorisation in vivo, lequel provoque une ascite,

f) effectuer plusieurs passages in vivo de cette ascite jusqu'à constatation de la présence de muqueuses très colorées en rouge chez les souris et jusqu'à obtention in vitro de la lignée, la souris obtenue au stade final n'étant plus polyglobulique et répondant aux caractéristiques ci--après:

- son plasma ne contient pas de virus SFFV,

- son plasma n'a aucune activité érythropoétique in vivo.

13. Procédé pour l'obtention d'une li-gnée cellulaire capable de développer dans son surnageant une activité érythropoiétique, ledit procédé consistant à:

(a) inoculer le virus cloné 210 à des souris I C FW,

(b) réaliser des transfusions pour remédier à l'érythroblastose induite après L'étape ta),

(c) transplanter in vivo les leucémies ulté rieurement apparues,

(d) effectuer plusieurs passages in vivo jus qu'à obtention d'une souris non polyglobulique.