FR2496123A1

FR2496123A1 - PROCESS FOR THE EXTRACTION OF NON-FILTERED FERMENTATION BROTHS

Info

Publication number: FR2496123A1
Application number: FR8123261A
Authority: FR
Inventors: Karoly Zalai; Arpad Trompler; Emilia Limdmayer; Laszlo Terdy; Agnes Kelemen; Gyula Beszedics
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1980-12-15
Filing date: 1981-12-14
Publication date: 1982-06-18
Also published as: IT8125583A0; CS250211B2; CH650531A5; HU183266B; IT1142098B; FR2496123B1; JPH0141314B2; BE891421A; JPS57150398A

Abstract

An unfiltered fermentation broth which has been produced by Claviceps purpurea strains is extracted with organic solvents which have no more than limited miscibility with water. In order to simplify the extraction, the fermentation broth, whose pH at the end of the fermentation is between 4.0 and 5.5, is mixed with the organic solvent while maintaining this pH and is extracted for the time necessary for the extraction of the fungal cells. An alkaloid mixture containing ergotoxin alkaloids is obtained from the extract. It is then possible to obtain from the extracted fermentation broth, after adjustment of the pH to 7 to 9, an alkaloid mixture mainly containing water-soluble ergot alkaloids.

Description

La présente invention est relative à un nouveau procédé pour réaliser ltextraction de bouillons de fermentation non filtrés, principalement l'extraction de bouillons de fermentation non filtrés obtenus lors de l'application des souches Claviceps purpurea dans des conditions saprophytes.Les souches Claviceps purpurea cultivées dans des conditions saprophytes, produisent surtout des alcaloïdes peptidiques par ailleurs connus sous le nom d'alcaloï type ergotoxine, principalement l'ergocornine et son épimère, ltergocorninine, ainsi que l'a- et la B-ergocryptine et leurs épimères, les aet B-ergocryptinine, et de plus éventuellement, des alcaloïdes du type non-peptidique, tel que l'ergomAtrine et son épimère, l'ergométrinine. Parmi les alcaloïdes ainsi produits, l'ergométrine et son épimère sont solubles dans l'eau. The present invention relates to a new process for carrying out the extraction of unfiltered fermentation broths, mainly the extraction of unfiltered fermentation broths obtained during the application of the Claviceps purpurea strains under saprophytic conditions. The Claviceps purpurea strains cultivated in saprophytic conditions, especially produce peptide alkaloids otherwise known as alkaloid ergotoxin type, mainly ergocornine and its epimer, ltergocorninine, as well as a- and B-ergocryptine and their epimers, a and B- ergocryptinine, and more possibly, non-peptide type alkaloids, such as ergomAtrine and its epimer, ergometrine. Among the alkaloids thus produced, ergometrine and its epimer are soluble in water.

Le Brevet hongrois nO 164 658 décrit la production d'alcaloides solubles dans l'eau, qui sont obtenus par extraction d'un bouillon de fermentation filtré, à un pH basique. Ce procédé ne résout pas le problème du traitement du mycélium filtré. Hungarian Patent No. 164,658 describes the production of water-soluble alkaloids, which are obtained by extracting a filtered fermentation broth, at basic pH. This process does not solve the problem of treating filtered mycelium.

Le Brevet britannique nO 1 158 380 est relatif à la préparation d'alcaloldes appartenant principalement au type ergotoxine. Ici, le bouillon de fermentation est filtré et le filtrat ainsi que le mycélium sont séparément extraits. British Patent No. 1,158,380 relates to the preparation of alkaloids mainly belonging to the ergotoxin type. Here, the fermentation broth is filtered and the filtrate and the mycelium are separately extracted.

Les alcaloïdes du type ergotoxine sont extraits du mycélium avec un mélange d'une solution aqueuse d'acide tartrique a 2 % et d'acétone, l'extrait est épaissi, puis les alcaloldes du type ergotoxine sont dissous dans du chloroforme à un pH basique, et ensuite ils sont purifiés par chromatographie.The alkaloids of the ergotoxin type are extracted from the mycelium with a mixture of a 2% aqueous solution of tartaric acid and acetone, the extract is thickened, then the alkaloid of the ergotoxin type are dissolved in chloroform at a basic pH. , and then they are purified by chromatography.

On obtient d'autres alcaloïdes du type ergotoxine, en traitant le bouillon de fermentation filtré avec du chloroforme.Other ergotoxin-type alkaloids are obtained by treating the filtered fermentation broth with chloroform.

Le Brevet hongrois nO 171 659 se réfere, de meme, au traitement de bouillons de fermentation filtrés. Ici, les alcaloïdes du type ergotoxine sont dissous à un pH basique dans le mycélium séparé par filtration, avec de l'acétate d'éthyle ammoniacal. Hungarian Patent No. 171,659 also refers to the treatment of filtered fermentation broths. Here, the ergotoxin-type alkaloids are dissolved at a basic pH in the mycelium separated by filtration, with ammoniacal ethyl acetate.

Comme la filtration d'importants volumes de bouillons de fermentation nécessite une capacité de filtration plutôt élevée et que la filtrabilité du bouillon de fermentation influence fortement la possibilité que l'on a d'obtenir les alcaloldes distincts, on essaie d'éliminer la filtration en élaborant les procédés plus récents. As the filtration of large volumes of fermentation broths requires a rather high filtration capacity and that the filterability of the fermentation broth strongly influences the possibility that one has of obtaining the separate alkaloids, one tries to eliminate filtration by developing more recent processes.

Dans les procédés n'impliquant pas de filtration, cependant, les alcaloïdes solubles dans l'eau et les alca bides du type ergotoxine, apparaissent ensemble dans 1'ex- trait et une certaine quantité de ces deux types d'alca bides reste aussi dans le mycélium ; il est donc nécessaire de procéder à des échanges de phase supplémentaires pour séparer les deux types dwalceloldes. In processes not involving filtration, however, the water-soluble alkaloids and the ergotoxin-type alka bides appear together in the extract and some of these two types of alka bides also remain in the extract. the mycelium; it is therefore necessary to carry out additional phase exchanges to separate the two types of dwalceloldes.

Le procédé décrit dans le Brevet hongrois nO 164 116 repose sur une telle méthode traitant des bouillons de fermentation non filtrés. Conformément à ce procédé, on ajuste le pH du bouillon de fermentation non filtré à 7, puis on sature celui-ci de sulfate d'ammonium et on l'extrait avec de l'acétone. Le pH de l'extrait est ajusté a 3,5 , 11 extrait est partiellement évaporé, puis les alcaloïdes du type ergotoxine sont séparés du résidu par une extraction avec du chloroforme et purifiés par chromatographie. The process described in Hungarian Patent No. 164,116 is based on such a method treating unfiltered fermentation broths. In accordance with this process, the pH of the unfiltered fermentation broth is adjusted to 7, then the latter is saturated with ammonium sulfate and extracted with acetone. The pH of the extract is adjusted to 3.5, the extract is partially evaporated, then the alkaloids of the ergotoxin type are separated from the residue by extraction with chloroform and purified by chromatography.

Le Brevet hongrois -publié nO RI-631 décrit partiellement une méthode qui repose également sur le traitement de bouillons de fermentation non filtrés. Le pH de ceux-ci est ajusté à 9-10, les alcaloldes peptidiques sont extraits avec de la méthylisobutylcétone, puis dissous dans de l'eau acide et encore à nouveau dans du chloroforme. The Hungarian Patent - published nO RI-631 partially describes a method which is also based on the treatment of unfiltered fermentation broths. The pH of these is adjusted to 9-10, the peptide alkaloids are extracted with methyl isobutyl ketone, then dissolved in acidic water and again in chloroform.

On a maintenant constaté que les trois étapes utilisées pour obtenir les alcaloldes peptidiques, peuvent etre réduites à une seule étape d'extraction, si le bouillon de fermentation non filtré est extrait dans la gamme des pH acides, à un pH compris entre 4,0 et 5,5. It has now been found that the three stages used to obtain the peptide alkaloids can be reduced to a single extraction stage, if the unfiltered fermentation broth is extracted in the range of acidic pH, at a pH of between 4.0 and 5.5.

Dans cette gamme de pH caractéristique, l1extrac- tion des alcaloïdes peptidiques se révèle encore sélective de façon satisfaisante. A savoir, bien que le pH soit plus élevé, par rapport à ce que l'on pratiquait dans le procédé antérieur (pH = 3,5, milieu acide tartrique), les alcaloïdes solubles dans l'eau restent dans la phase aqueuse. En même temps,il est surprenant de constater que dans cette gamme de pH choisie (4,0 à 5,5), l'efficacité de l'extraction des alca loi des peptidiques est plus favorable que dans les cas où les extractions sont réalisées a des valeurs basiques de pH. Within this characteristic pH range, the extraction of peptide alkaloids is still found to be satisfactorily selective. Namely, although the pH is higher, compared to what was practiced in the previous process (pH = 3.5, tartaric acid medium), the water-soluble alkaloids remain in the aqueous phase. At the same time, it is surprising to note that in this chosen pH range (4.0 to 5.5), the extraction efficiency of the alca law of peptides is more favorable than in the cases where the extractions are carried out. has basic pH values.

Pour expliquer ce fait, au cours de ses expériences détaillées, la Demanderesse a constaté qu'en rendant alcalin le bouillon de fermentation soit avant, soit pendant l'extraction, des substances organiques de haut poids moléculaire précipitent et sont capables d'adsorber une partie importante des alcaloides. Si l'extraction est réalisée dans la gamme de pH basique et que les alcaloïdes sont précipités par relarguage, la formation de ces précipités devient plus intense et à la fois la séparabilité et les rendements se détériorent. To explain this fact, during its detailed experiments, the Applicant has found that by making the fermentation broth alkaline either before or during the extraction, organic substances of high molecular weight precipitate and are capable of adsorbing part important alkaloids. If the extraction is carried out in the basic pH range and the alkaloids are precipitated by salting out, the formation of these precipitates becomes more intense and both the separability and the yields deteriorate.

Comme il est essentiel que le pH puisse ne pas être élevé avant l'extraction, c'est la fermentation qui doit être terminée dans la gamme de pH recherchée de 4,0 à 5,5. As it is essential that the pH should not be raised before extraction, it is the fermentation which must be completed in the desired pH range of 4.0 to 5.5.

I1 est aussi important d'observer que, pendant la procédure d'extraction des bouillons de fermentation contenant du mycélium, deux procédés de transport ont lieu. It is also important to observe that, during the procedure for extracting fermentation broths containing mycelium, two transport processes take place.

L'un concerne le transfert des alcaloïdes des cellules mycéliales au milieu aqueux, l'autre celui des alcaloïdes du milieu aqueux vers le milieu solvant. I1 en résulte que la durée de séjour découlant de la distribution des alca lourdes et du caractère de l'équipement d'extraction n'est pas suffisante, mais qu'il faut du temps supplémentaire pour achever également l'extraction des cellules mycéliales.One concerns the transfer of the alkaloids from the mycelial cells to the aqueous medium, the other that of the alkaloids from the aqueous medium to the solvent medium. As a result, the length of stay resulting from the distribution of the heavy alca and the character of the extraction equipment is not sufficient, but it takes additional time to also complete the extraction of the mycelial cells.

Ainsi, c'est un fait surprenant et caractéristique que l'on n'avait pas réalisé jusqu'à maintenant, que le temps nécessaire à l'extraction est déterminé par l'efficacité de l'extraction cellulaire. En conséquence, pendant l'extraction, il faut assurer le temps nécessaire à cette extraction cellulaire. Thus, it is a surprising and characteristic fact that we had not realized until now, that the time necessary for the extraction is determined by the efficiency of the cell extraction. Consequently, during the extraction, it is necessary to ensure the time necessary for this cell extraction.

L'extraction peut être réalisée sous une quelconque forme opérationnelle. En appliquant un extracteur à fonctionnement intermittant, on répète le mélange avec un solvant 2 à 3 fois. De plus, le bouillon de fermentation non filtré peut être extrait, par exemple, dans un extracteur
RDC ou dans un extracteur tournant à contre-courant (par exemple Podbielniak).The extraction can be carried out in any operational form. By applying an intermittent extractor, the mixture is repeated with a solvent 2 to 3 times. In addition, the unfiltered fermentation broth can be extracted, for example, in an extractor
Ground floor or in an extractor rotating against the current (for example Podbielniak).

Le fait de s'en tenir à un pH compris entre 4,0 et 5,5, se traduit par un avantage opérationnel en ce que la séparation des phases devient une tAche beaucoup plus simple, puisque la formation de précipité peut être évitée. Sticking to a pH between 4.0 and 5.5 translates into an operational advantage in that phase separation becomes a much simpler task, since the formation of precipitate can be avoided.

Ainsi, l'invention concerne un procédé d'extraction de bouillons de fermentation non filtrés de Claviceps purpurea, à l'aide d'un solvant non miscible à l'eau ou ayant une miscibilité limitée avec l'eau, comprenant les étapes suivantes : on extrait ce bouillon ayant un pH final compris entre 4,0 et 5,5 avec un solvant peu ou pas miscible à l'eau, au pH du bouillon de fermentation fini en assurant le temps nécessaire à l'extraction des cellules mycéliales, puis on récupère le mélange alcaloïde contenant des alcaloïdes appartenant principalement au type ergotoxine et, éventuellement, après avoir ajusté le pH à une valeur comprise entre 7 et 9, on recueille les alcaloïdes de type ergot, qui sont principalement des produits solubles dans l'eau. Thus, the invention relates to a process for extracting unfiltered fermentation broths of Claviceps purpurea, using a solvent immiscible with water or having limited miscibility with water, comprising the following steps: this broth having a final pH of between 4.0 and 5.5 is extracted with a solvent little or not miscible with water, at the pH of the finished fermentation broth, ensuring the time necessary for the extraction of the mycelial cells, then the alkaloid mixture containing alkaloids mainly belonging to the ergotoxin type is recovered and, optionally, after having adjusted the pH to a value between 7 and 9, the ergot type alkaloids, which are mainly products soluble in water, are collected.

Conformément au procédé de la présente invention, des bouillons de fermentation non filtrés produits par les souches de champignons Claviceps purpurea,servent de matières de départ. Comme souches de champignons, on peut utiliser des souches de Claviceps purpurea produisant principalement des alcaloïdes du type ergotoxine, surtout l'ergocornine et son épimère, l'a- et B-ergocryptine,ainsi que leurs épimères, et aussi éventuellement, des alcaloïdes de l'ergot solubles dans l'eau. On emploie de préférence les souches MNG 00022, MNG 00088 et MNG 00186 déposées à l'institut National de la Santé a BUDAPEST. In accordance with the process of the present invention, unfiltered fermentation broths produced by the Claviceps purpurea fungal strains are used as starting materials. As strains of fungi, it is possible to use strains of Claviceps purpurea producing mainly alkaloids of the ergotoxin type, especially ergocornine and its epimer, a- and B-ergocryptine, as well as their epimers, and also optionally, alkaloids of water soluble ergot. Preferably, the strains MNG 00022, MNG 00088 and MNG 00186 deposited at the National Institute of Health at BUDAPEST are used.

La fermentation elle-mtme peut être réalisée selon une méthode connue en elle-même, par exemple, de la façon décrite dans le Brevet Hongrois n0 164 016 ; il faut cependant veiller à ce qu'à la fin de la fermentation, le pH du bouillon soit compris entre 4,0 et 5,5 et de préférence entre 4,7 et 5,2. Eventuellement, un additiL augmentant la pression osmotique du milieu de culture est fourni au bouillon de fermentation conformément à la méthode décrite dans le Brevet Hongrois 153 739.Des additifs accroissant la pression osmotique utilisables sont d'abord des sels minéraux ou organiques, tels que le chlorure, le sulfate, le carbonate, le phosphate, l'acé- tate, le succinate ou l'asparaginate de sodium, de potassium, de calcium et de magnésium ou bien des mono- ou disaccharides, par exemple : mannite, sorbite, glucose ou saccharose. The fermentation itself can be carried out according to a method known per se, for example, as described in Hungarian Patent No. 164,016; however, care must be taken that at the end of fermentation, the broth pH is between 4.0 and 5.5 and preferably between 4.7 and 5.2. Optionally, an additive increasing the osmotic pressure of the culture medium is supplied to the fermentation broth in accordance with the method described in Hungarian Patent 153,739. Additives increasing the osmotic pressure that can be used are first of all mineral or organic salts, such as sodium, potassium, calcium and magnesium chloride, sulfate, carbonate, phosphate, acetate, succinate or asparaginate or mono- or disaccharides, for example: mannite, sorbite, glucose or sucrose.

Après la fermentation, le bouillon de fermentation non filtré est extrait dans un extracteur fonctionnant en continu ou en discontinu, avec une solution peu ou pas miscible à l'eau, sans qu'un changement préalable du pH du bouillon de fermentation soit effectué. Comme agent d'extraction, on peut utiliser surtout des cétones ali phasiques inférieures peu ou pas miscibles h l'eau, de préférence la méthylisobutylcétone ou des carboxylates aliphatiques inférieurs, de préférence l'acétate d'éthyle, ou des hydrocarbures chlorés, de préférence le chloroforme ou le dichloroéthane. After fermentation, the unfiltered fermentation broth is extracted in an extractor operating continuously or batchwise, with a solution little or not miscible with water, without a prior change in the pH of the fermentation broth. As extraction agent, use may be made, above all, of lower aliphatic ketones with little or no water miscibility, preferably methylisobutylketone or lower aliphatic carboxylates, preferably ethyl acetate, or chlorinated hydrocarbons, preferably chloroform or dichloroethane.

En effectuant l'extraction, il faut veiller à assurer un contact convenable du bouillon de fermentation non filtré avec l'agent d'extraction pendant une période suffisante pour obtenir une extraction appropriée des cellules de champignon. L'extraction est réalisée de préférence sous agitation et avec utilisation d'un récipient de préagitation inséré avant l'extracteur, de telle sorte que l'agent d'extraction et le bouillon de fermentation non filtré restent ensemble pendant une période de temps appropriée. When carrying out the extraction, care must be taken to ensure adequate contact of the unfiltered fermentation broth with the extraction agent for a period sufficient to obtain an appropriate extraction of the fungus cells. The extraction is preferably carried out with stirring and with the use of a pre-stirring container inserted before the extractor, so that the extraction agent and the unfiltered fermentation broth remain together for an appropriate period of time.

Avec une agitation convenable, on peut atteindre en 3 minutes une extraction correspondant à 95 % de la valeur maximale d'extraction des cellules de champignons. En général, les durées optimales d'extraction sont comprises entre 3 et 15 minutes, de préférence entre 3 et 8 minutes en fonction des conditions d'agitation.With suitable stirring, an extraction corresponding to 95% of the maximum extraction value of the fungal cells can be achieved in 3 minutes. In general, the optimal extraction times are between 3 and 15 minutes, preferably between 3 and 8 minutes depending on the stirring conditions.

Les alcaloïdes du type ergotoxine peuvent être obtenus à partir de l'extrait par évaporation etfou précipita- tion avec de l'éther de pétrole. The alkaloids of the ergotoxin type can be obtained from the extract by evaporation and / or precipitation with petroleum ether.

Le pH du bouillon de fermentation extrait est alors ajusté à une valeur comprise entre 7 et 9, puis les alcaloldes solubles dans l'eau sont récupérés d'une façon connue en elle-même, de préférence sous forme de sels d'acide maléique. The pH of the extracted fermentation broth is then adjusted to a value of between 7 and 9, then the water-soluble alkaloids are recovered in a manner known per se, preferably in the form of maleic acid salts.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. In addition to the foregoing provisions, the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du compl6- ment de description qui va suivre qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. The invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of implementation of the process which is the subject of the present invention.

I1 doit titre bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should of course, however, be understood that these examples of implementation are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.

EXEMPLE 1
250 litres d'une culture noyée, obtenue par culture de la souche MNG 00088 de Claviceps purpurea selon la méthode décrite dans le Brevet Hongrois 164 816, sont extraits, à la différence près qu'un additif augmentant la pression osmotique du milieu de culture et ddcrit dans le
Brevet Hongrois 153 739, est utilisé. La culture renferme 0,812 mg/ml d'alcaloïdes du type ergotoxine et 0,350 mg/ml d'ergométrine. L'extraction est effectuée au propre pH (4,8) du bouillon de fermentation original, avec 125 litres de méthylisobutylcétone, tandis qu'une agitation est assurée pendant 10 minutes.EXAMPLE 1
250 liters of a drowned culture, obtained by culture of the strain MNG 00088 of Claviceps purpurea according to the method described in Hungarian Patent 164 816, are extracted, with the difference that an additive increasing the osmotic pressure of the culture medium and described in the
Hungarian patent 153 739, is used. The culture contains 0.812 mg / ml of alkaloids of the ergotoxin type and 0.350 mg / ml of ergometrine. The extraction is carried out at the own pH (4.8) of the original fermentation broth, with 125 liters of methyl isobutyl ketone, while stirring is ensured for 10 minutes.

Ensuite, le bouillon de fermentation extrait et le mycélium, ainsi que le mélange contenant l'extrait, sont filtrés dans un filtre-centrifuge, puis les phases sont séparées. On ajoute encore 125 litres de méthylisobutylcétone à la phase aqueuse, puis on réajoute le mycélium et on agite à nouveau le mélange pendant 10 minutes. Then, the extracted fermentation broth and the mycelium, as well as the mixture containing the extract, are filtered in a centrifugal filter, then the phases are separated. Another 125 liters of methyl isobutyl ketone are added to the aqueous phase, then the mycelium is added again and the mixture is again stirred for 10 minutes.

Après filtration, les phases sont séparées.After filtration, the phases are separated.

La phase solvant est évaporée sous vide à un volume de 2 litres à une température ne dépassant pas 400C, puis le résidu d'évaporation est versé dans 20 litres d'éther de pétrole sous agitation intense. On laisse reposer le précipité séparé pendant 10 minutes, puis on le filtre, on le lave deux fois avec 0,1 1 d'éther de pétrole à chaque fois, puis on sèche sous vide à une température ne dépassant pas 400C. On recueille 279,5 g de produit. The solvent phase is evaporated under vacuum to a volume of 2 liters at a temperature not exceeding 400C, then the evaporation residue is poured into 20 liters of petroleum ether with intense stirring. The separated precipitate is left to stand for 10 minutes, then it is filtered, it is washed twice with 0.1 l of petroleum ether each time, then it is dried under vacuum at a temperature not exceeding 400C. 279.5 g of product are collected.

Le produit renferme 730 mg/g d'alcaloïdes de type ergotoxine et 20 mg/g d'ergométrine. The product contains 730 mg / g of ergotoxin-type alkaloids and 20 mg / g of ergometrine.

Le pH du mélange de la phase aqueuse et du mycélium est alors ajusté à 8 avec une solution aqueuse concentrée d'hydroxyde d'ammonium, puis sous agitation, le mélange est extrait à deux reprises avec 125 1 de méthylisobutylcétone. A partir du mélange de réaction, on obtient les extraits contenant les alcaloïdes solubles dans l'eau à l'aide d'une filtration et d'une séparation des phases liquides. La phase organique combinée est évaporée sous vide à une température maximale de 400C, jusqu'à un volume de 5 1, puis sous agitation vigoureuse, une solution d'acide maléique dans la méthylisobutylcétone est ajoutée au résidu d'évaporation jusqu'à obtention d'un pH de 4. Le maléate d'ergométrine précipité est filtré, lavé avec 2 x 300 ml de méthylisobutylcétone, puis séché sous vide à une température maximale de 400C.Le produit obtenu pèse 116,4 g et renferme 683 mg/g d'ergométrine sous forme de maléate d'ergométrine. The pH of the mixture of the aqueous phase and the mycelium is then adjusted to 8 with a concentrated aqueous solution of ammonium hydroxide, then with stirring, the mixture is extracted twice with 125 l of methyl isobutyl ketone. From the reaction mixture, the extracts containing the water-soluble alkaloids are obtained using filtration and separation of the liquid phases. The combined organic phase is evaporated under vacuum at a maximum temperature of 400C, to a volume of 5 1, then with vigorous stirring, a solution of maleic acid in methyl isobutyl ketone is added to the evaporation residue until d pH 4. The precipitated ergometrine maleate is filtered, washed with 2 x 300 ml of methyl isobutyl ketone, then dried under vacuum at a maximum temperature of 400 C. The product obtained weighs 116.4 g and contains 683 mg / g d ergometrine in the form of ergometrine maleate.

EXEMPLE 2
Après arrêt de la fermentation, 100 1 du bouillon de fermentation préparés avec la souche différente de
Claviceps purpurea déposée sous le nO MNG 00186, conformément au procédé de fermentation qui est décrit dans le
Brevet hongrois nO 164 816, sont introduits dans un extracteur-mélangeur, au propre pH du bouillon de fermentation, à raison de 40 1/h et en même temps, l'acétate d'éthyle est ajouté à raison de 30 l/h. Dans les 100 1 de bouillon de fermentation, l'ergocornine et son épimère sont présents à la concentration de 0,351 mg/ml, l'a-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,137 mg/ml, et la 6-ergo- cryptine et son épimère à la concentration de 0,152 mg/ml.EXAMPLE 2
After stopping the fermentation, 100 1 of the fermentation broth prepared with the strain different from
Claviceps purpurea registered under the number MNG 00186, in accordance with the fermentation process which is described in the
Hungarian Patent No. 164,816, are introduced into an extractor-mixer, at the proper pH of the fermentation broth, at a rate of 40 l / h and at the same time, ethyl acetate is added at a rate of 30 l / h. In the 100 l of fermentation broth, ergocornine and its epimer are present at the concentration of 0.351 mg / ml, a-ergocryptine and its epimer at the concentration of 0.137 mg / ml, and 6-ergocryptin and its epimer at the concentration of 0.152 mg / ml.

Ensuite, le mélange agité est séparé avec un séparateur à chambre à vidange automatique, en une phase acétate d'éthyle et une phase aqueuse de mycélium. Cette opération est conduite de telle sorte que la durée de séjour du bouillon de fermentation dans l'extracteur est comprise entre 6 et 8 minutes. Après la séparation, dans l'extrait d'acétate d'éthyle, l'ergocornine et son épimère sont présents a la concentration de 0,427 mg/ml, l'u-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,172 mg/ml et la ss-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,187 mg/ml.Then, the stirred mixture is separated with a separator with an automatic draining chamber, into an ethyl acetate phase and an aqueous mycelium phase. This operation is carried out so that the residence time of the fermentation broth in the extractor is between 6 and 8 minutes. After separation, in the ethyl acetate extract, ergocornine and its epimer are present at the concentration of 0.427 mg / ml, u-ergocryptine and its epimer at the concentration of 0.172 mg / ml and the ss-ergocryptine and its epimer at a concentration of 0.187 mg / ml.

EXEMPLE 3
10 m du bouillon de fermentation obtenus à partir d'une souche de Claviceps purpurea déposée sous le nO MNG 00022 , conformément au procédé décrit dans le Brevet hongrois nO 164 816, sont extraits à deux reprises, au propre
3 pH (4,5) du bouillon de fermentation non filtré. Les 10 m du bouillon de fermentation contiennent l'ergocornine et son épimère à une concentration de 0,423 mg/ml, l'a-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,381 mg/ml et la S-ergocryptine et son épimère à la concentration de 0,093 mg/ml.L'extraction est réalisée avec de l'acétate d'éthyle dans un extracteur du type Podbielniak D 36 tra vaillant à raison de 1500 tpm. On utilise 2 x 400 1 d'acétate
3 d'éthyle pour 1 m de bouillon de fermentation. Afin d'assurer une durée de séjour moyenne de 6 minutes, on utilise un récipient de prémélange, dans lequel on mélange le bouillon de fermentation non filtré avec 40 % en volume d'acétate d'éthyle et respectivement après démarrage de l'extraction, avec 40 % en volume d'extrait d'acétate d'éthyle. On fait fonctionner l'extracteur de telle façon que l'acétate d'éthyle forme la phase continue dans l'extracteur et que le bouillon de fermentation soit dispersé dans celle-ci.Il en résulte que, dans la partie active située à l'intérieur de l'extracteur, on utilise environ 1 litre d'acétate d'éthyle pour 0,1 à 0,15 litre de bouillon de fermentation. Les extraits d'acétate d'éthyle sont rassemblés et mis de coté pour un traitement ultérieur (ensuite : extrait obtenu à un pH acide). Le pH du bouillon de fermentation restant est alors ajusté a 8,5 avec une so- lution laqueuse concentree d'hydroxyde d'ammonium, puis celui-ci est extrait deux fois avec de l'acétate d'éthyle.EXAMPLE 3
10 m of the fermentation broth obtained from a strain of Claviceps purpurea deposited under the No. MNG 00022, in accordance with the process described in the Hungarian patent No. 164 164, are extracted twice, in the clean
3 pH (4.5) of the unfiltered fermentation broth. The 10 m of the fermentation broth contains ergocornine and its epimer at a concentration of 0.423 mg / ml, a-ergocryptine and its epimer at a concentration of 0.381 mg / ml and S-ergocryptine and its epimer at a concentration 0.093 mg / ml. The extraction is carried out with ethyl acetate in an extractor of the Podbielniak D 36 type working at 1500 rpm. 2 x 400 1 acetate is used
3 ethyl per 1 m of fermentation broth. In order to ensure an average residence time of 6 minutes, a premix container is used, in which the unfiltered fermentation broth is mixed with 40% by volume of ethyl acetate and respectively after starting the extraction, with 40% by volume of ethyl acetate extract. The extractor is operated in such a way that ethyl acetate forms the continuous phase in the extractor and that the fermentation broth is dispersed therein. As a result, in the active part located at the inside the extractor, about 1 liter of ethyl acetate is used for 0.1 to 0.15 liter of fermentation broth. The ethyl acetate extracts are collected and set aside for further processing (then: extract obtained at an acidic pH). The pH of the remaining fermentation broth is then adjusted to 8.5 with a concentrated lacquer solution of ammonium hydroxide, then this is extracted twice with ethyl acetate.

Les extraits sont rassembles.The extracts are collected.

L'extrait d'acétate d'éthyle obtenu a un pli acide est évaporé à un volume de 50 litres sous vide, à une température ne dépassant pas 400C, puis sous agitation vigoureuse, le résidu d'évaporation est versé dans 500 litres d'éther de pétrole. Le mélange alcaloïde précipité est filtré dans un filtre-centrifuge, lavé deux fois avec 15 litres d'éther de pétrole, puis séché sous vide à une température maximale de 40ex. Le produit obtenu pèse 12,19 kg et présente la composition suivante 302 mg/g d'ergocornine et son épimère, 270 mg/g d'a-ergocryptine et son épimère, et
68 mg/g de S-ergocryptine et son épimère.The ethyl acetate extract obtained with an acid fold is evaporated to a volume of 50 liters under vacuum, at a temperature not exceeding 400C, then with vigorous stirring, the evaporation residue is poured into 500 liters of petroleum ether. The precipitated alkaloid mixture is filtered in a centrifugal filter, washed twice with 15 liters of petroleum ether, then dried under vacuum at a maximum temperature of 40ex. The product obtained weighs 12.19 kg and has the following composition: 302 mg / g of ergocornine and its epimer, 270 mg / g of α-ergocryptine and its epimer, and
68 mg / g of S-ergocryptine and its epimer.

EXEMPLE 4
250 litres du bouillon de fermentation obtenu à partir de la souche Claviceps purpurea déposée sous le nO MNG 00088, conformément au procédé décrit dans le Brevet hongrois n0 164 816, sont extraits au propre pH du bouillon de fermentation non filtré (4,7), dans un extracteur du système RDC (colonne à plateau tournant) avec de l'acétate d'éthyle. Les 250 litres du bouillon de fermentation renferment 822 mg/ml d'alcaloïdes du type ergotoxine et 0,150 mg/ml d'ergométrine.EXAMPLE 4
250 liters of the fermentation broth obtained from the Claviceps purpurea strain deposited under the No. MNG 00088, in accordance with the process described in Hungarian Patent No. 164 816, are extracted at the pH of the unfiltered fermentation broth (4.7), in an extractor of the RDC system (column with rotating plate) with ethyl acetate. The 250 liters of fermentation broth contain 822 mg / ml of alkaloids of the ergotoxin type and 0.150 mg / ml of ergometrine.

Le diamètre intérieur de l'extracteur est de 150 mm, le nombre de tours du mélangeur est de 150 par minute, le nombre de cellules actives se monte à 50. Avant l'extracteur, un récipient de prémélange est placé, assurant une durée de séjour moyenne de 5 minutes et dans le- quel le bouillon de fermentation non filtré est mélangé a 40 % % en volume d'acétate d'éthyle et, après le début de l'extraction, avec 40 e en volume de l'extrait d'acétate d'éthyle.Au cours de l'extraction, le bouillon de fermentation prémélangé est introduit dans la première cellule supérieure (n 1) de l'extracteur continu a contre-courant
RDC à la vitesse de 60 i/h, tandis qu'à la cellule infE- rieure n 50, de l'acétate éthyle est envoyé 8 raison de 48 l/h. Pour 100 litres de bouillon de fermentation, on utilise 80 litres d'acétate d'éthyle. Dans l'extracteur, l'acétate d'éthyle constitue la phase continue,et dans la partie active (mélangée) de lgestracteur, 0,1 a 0,25 litre de bouillon de fermentation est dispersé dans 1 litre d'acétate d'éthyle.Après une période d'indu:tion d'environ 90 minutes, la concentration en alcaloïdes de l'extrait sortant (la phase acétate d'éthyle quittant le système par la cellule supérieure) et celle du raffinat (le bouillon de fermentation extrait sortant par la cellule inférieure), deviennent constantes et l'on considère alors que le fonctionnement de l'extracteur est équilibré. Le récipient récepteur est alors échangé,et en faisant fonctionner l'extracteur pratiquement pendant la durée optimale, on peut recueillir des extraits et respectivement des raffinats ayant la composition à l'équilibre dans les récipients collecteurs. En rassemblant les extraits et les raffinats obtenus en introduisant exactement 100 litres de bouillon de fermentation, on recueille 63 litres d'extrait et 110,5 litres de raffinat.The internal diameter of the extractor is 150 mm, the number of revolutions of the mixer is 150 per minute, the number of active cells rises to 50. Before the extractor, a premix container is placed, ensuring a duration of average stay of 5 minutes and in which the unfiltered fermentation broth is mixed with 40% by volume of ethyl acetate and, after the start of extraction, with 40% by volume of the extract d acetate. During extraction, the premixed fermentation broth is introduced into the first upper cell (n 1) of the countercurrent continuous extractor
DRC at the speed of 60 i / h, while at the lower cell No. 50, ethyl acetate is sent 8 at the rate of 48 l / h. For 100 liters of fermentation broth, 80 liters of ethyl acetate are used. In the extractor, ethyl acetate constitutes the continuous phase, and in the active (mixed) part of the extractor, 0.1 to 0.25 liters of fermentation broth is dispersed in 1 liter of ethyl acetate .After an induction period of approximately 90 minutes, the alkaloid concentration of the outgoing extract (the ethyl acetate phase leaving the system through the upper cell) and that of the raffinate (the outgoing extract fermentation broth by the lower cell), become constant and it is then considered that the operation of the extractor is balanced. The receiving container is then exchanged, and by operating the extractor practically for the optimal duration, it is possible to collect extracts and respectively raffinates having the composition at equilibrium in the collecting containers. By gathering the extracts and the raffinates obtained by introducing exactly 100 liters of fermentation broth, 63 liters of extract and 110.5 liters of raffinate are collected.

L'extrait comprenant principalement des alcaloldes du type ergotoxine, renferme 1,217 mg/ml d'alcalol- des du type ergotoxine et 0,011 mg/ml d'ergométrine. Le raffinat comprenant principalement l'ergométrine, renferme 0,0529 mg/ml d'alcaloïdes du type ergotoxine et 0,133 mg/. The extract comprising mainly alkaloids of the ergotoxin type contains 1.217 mg / ml of alkalols of the ergotoxin type and 0.011 mg / ml of ergometrine. The raffinate comprising mainly ergometrine, contains 0.0529 mg / ml of alkaloids of the ergotoxin type and 0.133 mg /.

d'ergométrine.ergometrine.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits -de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of implementation, embodiment and application which have just been described - more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which may come to the mind of the technician in the matter, without departing from the scope, or the scope, of the present invention.

Claims

10- Process for the extraction of unfiltered fermentation broths of Claviceps purpurea with a solvent little or not miscible with water, characterized in that the broth having a final pH of between 4.0 and 5.5 is extracted with a solvent little or not miscible with water, at the pH of the finished fermentation broth, ensuring the contact time necessary for the extraction of the mycelial cells, then the alkaloid mixture containing alkaloids mainly of the ergotoxin type is recovered, and possibly, after adjusting the pi to a value between 7 and 9, the ergotic alkaloids are recovered mainly of the water-soluble type.

20- process according to claim 1, characterized in that one uses as an extraction agent, a lower aliphatic ketone little or not miscible with water, or a carboxylic ester or a chlorinated hydrocarbon.

3 - Process according to Claim 1, characterized in that the extraction is carried out at a pH between 4.7 and 5.2.