FR2487197A2

FR2487197A2 - Extraction of glyco:proteins and muco:polysaccharide(s) - by macerating animal tissue in a slightly alkaline buffer

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Publication number: FR2487197A2
Application number: FR7912040A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1979-05-11
Filing date: 1979-05-11
Publication date: 1982-01-29

Abstract

Glycoproteins and/or mucopolysaccharides and substances which accompany these in natural products (heat-resistant proteins, nucleic acids, lipids, glucide and their derivs.) are extracted from animal tissue by macerating the tissue in a buffered extn. medium at pH 7.5-9.5, heated to 60-110 deg.C, and the fibrous debris and thermosensitive protein are removed by filtration or centrifuging. The products have dermatological and cosmetological properties. They lubricate, hydrate, and tone the skin, restore the proteo-glucide- lipidic protecting film, aid normal collagen development and increase permeability.

Description

La présenteaddition est relative à un procédé d'extraction de glycoprotéines et/ou mucopolysaccharides et substances qui les accompagnent à partir de matières naturelles, ainsi qu'aux extraits stables obtenus par ce procédé. The present addition relates to a process for extracting glycoproteins and / or mucopolysaccharides and substances which accompany them from natural materials, as well as to the stable extracts obtained by this process.

Au brevet principal et dans ses trois additions, on a décrit un procédé d'extraction de protéines thermostables et des corps qui les accompagnent (glycoprotéines, mucopolysaccharides, sucres aminés divers, peptides thermostables, etc...) à partir d'organes, tissus ou cellules d'animaux ou humains, de végétaux ou de microorganismes ou de liquides d'origine biologique. In the main patent and in its three additions, a process has been described for extracting thermostable proteins and the bodies which accompany them (glycoproteins, mucopolysaccharides, various amino sugars, thermostable peptides, etc.) from organs, tissues or cells of animals or humans, plants or microorganisms or liquids of biological origin.

Ce procédé comprend un broyage des matières premières d'origine naturelle énumérées ci-dessus, l'extrac- tion en une ou plusieurs étapes par utilisation d'un tampon alcalin ayant un pH compris entre 7,5 et 9,5, un chauffage ultérieur du produit d'extraction à une température comprise entre 60 et 110 OC et éventuellement une restérilisation. Ce procédé s'appliquait particulièrement au traitement de cordons ombilicaux, de placentas humains ou animaux, de salive, de lait et de moelle osseuse rouge. This process includes grinding the raw materials of natural origin listed above, extraction in one or more stages using an alkaline buffer having a pH between 7.5 and 9.5, subsequent heating of the extraction product at a temperature between 60 and 110 OC and possibly a re-sterilization. This process was particularly applicable to the treatment of umbilical cords, human or animal placentas, saliva, milk and red bone marrow.

La poursuite de recherches portant sur l'extraction et le traitement des glycoprotéines, des mucopolysaccharides et des substances qui les accompagnent, notamment des complexes protéo-glucido-lipidiques 9u nucléiques, dans leurs associations naturelles, à partir de certains organes animaux, en particulier cerveau, placenta, etc..., a permis de simplifier et de perfectionner certains stades des procédés et de techniques antérieurement décrits au brevet principal et ses trois additions. The pursuit of research on the extraction and processing of glycoproteins, mucopolysaccharides and substances which accompany them, in particular nucleo proteo-glucido-lipid complexes, in their natural associations, from certain animal organs, in particular the brain , placenta, etc ..., has made it possible to simplify and improve certain stages of the processes and techniques previously described in the main patent and its three additions.

I1 s'agit, par chauffage en milieu basique, d'éliminer les protéines thermosensibles et de conserver les substances thermostables associées; de façon naturelle à l'état de complexes. It processus dans ses aspects généraux et les buts à atteindre sont les mêmes que ceux définis au brevet principal et ses additions; les simplifications et perfectionnements techniques portent sur le traitement des organes et la préparation de leurs extraits, soit à l'état liquide, soit à l'état sec. I1 is, by heating in basic medium, to eliminate the heat-sensitive proteins and to preserve the associated thermostable substances; naturally in the state of complexes. The process in its general aspects and the aims to be achieved are the same as those defined in the main patent and its additions; technical simplifications and improvements relate to the treatment of organs and the preparation of their extracts, either in a liquid state or in a dry state.

La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'extraction et de traitement de glycoprotéines et/ou mucopolysaccharides (protéoglycane, glycosaminoglyeane) et des substances qui les accompagnent de manière naturelle (protides thermorésistants, acides nucléiques, lipides, glucides et leurs dérivés), à partir de matières biologiques, notamment de tissus d'organistes animaux, par broyage de ces matières > puis extraction en milieu tamponné basique à un pH de 7,5 à 9,5 > suivi d'un chauffage à une température de 60 à ll00C et d'une récupération de l'extrait, caractérisé en ce que le broyage des matières premières d'origine biologique est réalisé directement dans le milieu d'extraction ayant un pH compris entre 7,5 et 9,5, puis l'extrait est séparé par centrifugation ou filtration des déchets fibreux et des protéines thermosensibles qui ont précipité lors du chauffage. The present invention thus relates to a process for the extraction and treatment of glycoproteins and / or mucopolysaccharides (proteoglycan, glycosaminoglyeane) and substances which accompany them naturally (heat-resistant proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates and their derivatives), from biological materials, in particular animal organism tissues, by grinding these materials> then extraction in a basic buffered medium at a pH of 7.5 to 9.5> followed by heating at a temperature of 60 to 1100C and recovery of the extract, characterized in that the grinding of the raw materials of biological origin is carried out directly in the extraction medium having a pH of between 7.5 and 9.5, then the extract is separated by centrifugation or filtration of the fibrous waste and the heat-sensitive proteins which precipitated during heating.

Ainsi, selon le procédé de la présente invention, on peut réunir en une seule étape le broyage dans un milieu d'extraction approprié qui est tamponné au pH désiré par des agents qui seront définis ci-après. Thus, according to the process of the present invention, the grinding can be combined in a single step in an appropriate extraction medium which is buffered to the desired pH by agents which will be defined below.

Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, des matières organiques telles que des tissus d'animaux, sont lavées de leurs souillures, par exemple le sang et débarasséesde leurs enveloppes; elles sont broyées par un broyeur à grande vitesse dans un mélange tampon qui constitue le liquide d'extraction. La proportion est, par exemple, de 33 % en poids d'organes dans le tampon. Le liquide d'extraction peut être le tampon glycine 7,5 g dans l'eau distillée, quantité suffisante pour 1000 ml, auquel est ajoutée de la soude normale jusqu'à pH 8,50; ou le même tampon auquel est ajouté du phosphate disodique (0,01 M); ou encore selon les conditions : laurate de potassium à 2,5 g pour 1000 ml dans l'eau distillée, pH 8s15, ou laurate de triéthanolamine à 5 g pour 1000 ml dans l'eau distillée, pH 7,60. For the implementation of the process of the invention, organic materials such as animal tissues are washed with their defilements, for example blood and rid of their envelopes; they are ground by a high-speed mill in a buffer mixture which constitutes the extraction liquid. The proportion is, for example, 33% by weight of organs in the buffer. The extraction liquid can be the glycine buffer 7.5 g in distilled water, an amount sufficient for 1000 ml, to which is added normal soda until pH 8.50; or the same buffer to which disodium phosphate (0.01 M) is added; or according to the conditions: potassium laurate at 2.5 g per 1000 ml in distilled water, pH 8:15, or triethanolamine laurate at 5 g per 1000 ml in distilled water, pH 7.60.

Le broyat ainsi obtenu est chauffé au bain-marie à au moins 600C, pendant au moins une heure, en enceinte close, avec agitation continue. Après refroidissement, ce mélange est centrifugé en continu, ou filtré, de telle sorte que soient éliminés sous forme de culot, les déchets fibreux et les matières thermosensibles qui ont été précipitées par le chauffage préalable au bain-marie. The ground product thus obtained is heated in a water bath to at least 600C, for at least one hour, in a closed enclosure, with continuous stirring. After cooling, this mixture is continuously centrifuged, or filtered, so that the fibrous waste and the heat-sensitive materials which have been precipitated by heating beforehand in a water bath are removed in the form of a pellet.

Ce broyat centrifugé est traité alors de façon à obtenir, soit un extrait liquide stérile, soit un extrait sec, comme cela est décrit ci-dessous. This centrifuged ground material is then treated so as to obtain either a sterile liquid extract or a dry extract, as described below.

Dans le cas d'extrait liquide, il est préférable d' ajouter au broyat, des corps ayant un effet antioxydant, soit hydrosolubles, soit liposolubles, mais dans ce dernier cas qui puissent s'y incorporer. In the case of liquid extract, it is preferable to add to the ground material, bodies having an antioxidant effect, either water-soluble or liposoluble, but in the latter case which can be incorporated therein.

Parmi les nombreux corps antioxydants possibles, l'a-tocophérol est favorable. Il peut être ajouté sous forme d'huile de germes, par exemple de mais qui en est riche, et qui s'incorpore dans les extraits lipido-protéiques à la dose de 5 ml par litre, par exemple. Du propylène glycol (propanediol-1,2) peut être ajouté aussi, à la dose de 20 à 50 g par litre, par exemple. L'extrait liquide ainsi préparé est alors stérilisé à l'autoclave à 1050 pendant 30 minutes, par exemple. On obtient un liquide épais, blanc crème, homogène, onctueux, stérile, de bonne conservation. Among the many possible antioxidant bodies, a-tocopherol is favorable. It can be added in the form of seed oil, for example corn but which is rich in it, and which is incorporated in the lipid-protein extracts at a dose of 5 ml per liter, for example. Propylene glycol (propanediol-1,2) can also be added, at a dose of 20 to 50 g per liter, for example. The liquid extract thus prepared is then sterilized in an autoclave at 1050 for 30 minutes, for example. A thick, creamy white, homogeneous, unctuous, sterile liquid is obtained, of good conservation.

Lorsqu'il s'agit de la préparation de extrait sec, le broyat peut recevoir un antioxydant comme l'acétate du DLa-tocophérol, à la dose de 0,5 g par litre. Le broyat est alors soit désséché à 500C sous vide, par exemple, puis réduit en poudre, ou directement réduit en poudre par atomisation (nébulisation), ou encore par lyophilisation. When it comes to the preparation of dry extract, the ground material can receive an antioxidant such as DLa-tocopherol acetate, at a dose of 0.5 g per liter. The ground material is then either dried at 500 ° C. under vacuum, for example, then reduced to powder, or directly reduced to powder by atomization (nebulization), or even by lyophilization.

Les poudres obtenues se conservent bien, elles ne sont pas hygroscopiques. Mais, plongées dans l'eau, elles gonflent et s'émulsionnent lentement; cette émulsion est obtenue rapidement et au mieux par dispersion par un broyeur à grande vitesse : on obtient alors des solutions-suspensions stables, qui, par exemple, à la concentration de 10 %, sont crémeuses, de pH 7,3. De plus, de telles préparations supportent sans dommage la stérilisation à l'autoclave, par exemple à 1050,pendant 30 minutes. The powders obtained keep well, they are not hygroscopic. But, immersed in water, they swell and emulsify slowly; this emulsion is obtained quickly and at best by dispersion by a high-speed grinder: stable solutions-suspensions are obtained, which, for example, at a concentration of 10%, are creamy, of pH 7.3. In addition, such preparations withstand damage without autoclave sterilization, for example at 1050, for 30 minutes.

Les préparations soit liquides, soit sèches et remises à 11 état liquide, ont les mêmes propriétés que celles décrites au brevet principal. Elles ont notamment les meil leurs effets dermatologiques et cosmétologiques : elles lubrifient, hydratent et tonifient la peau, restaurent le film protéo-glucido-lipidioue protecteur, favorisent le développement normal du collagène, augmentent le pouvoir perméant. The preparations, either liquid or dry and returned to the liquid state, have the same properties as those described in the main patent. They have in particular the best their dermatological and cosmetic effects: they lubricate, hydrate and tone the skin, restore the protective proteo-glucido-lipidioue film, promote the normal development of collagen, increase the permeating power.

L'augmentation de la pénétration percutanée est rendue objective et se trouve directement démontrée par rapport à des témoins, d'une part par le test du marquage des extraits considérés, d'autre part par l'analyse biochimique. The increase in percutaneous penetration is made objective and is directly demonstrated in relation to controls, on the one hand by the test of the marking of the extracts considered, on the other hand by biochemical analysis.

Les extraits à la concentration de 30 % par exemple, cerveau-placenta, sont couplés à la peroxydase (en présence de glutaraldéhyde à 1 % en tampon phosphate, dialysés, centrifugés, séparés par chromatographie, le premier pic qui contient la fraction couplée étant concentré à froid). The extracts at a concentration of 30% for example, brain-placenta, are coupled to peroxidase (in the presence of 1% glutaraldehyde in phosphate buffer, dialyzed, centrifuged, separated by chromatography, the first peak which contains the coupled fraction being concentrated Cold).

Les extraits ainsi marqués sont appliqués par onction douce sur la peau rasée sans irritation de l'animal testé, par exemple pendant 3 jours consécutifs, matin et soit. Un jour après la fin de ces 6 onctions, la peau ointe est prélevée et comparée à la peau témoin. L'analyse histologique montre que I1 extrait couplé à la peroxydase est précipité dans les tissus, au'il y ait ou non révélation de la peroxydase par diaminobenzidine, sous forme de fins granules noirs, depuis le seuil de la visibilité jusqu'à de petites enclaves vacuolaires noires. Or, on constate que 11 extrait a traversé l'épiderme et a pénétré très profondément dans le derme, non seulement autour des gaines pileuses, mais aussi loin d'elles, en plein tissu dermique dépourvu de gaines. Ces grains sont soit isolés, soit amassés en groupes ou plages parfois très importants. La pénétration de extrait est diune part directe, et d'autre part suit le trajet des gaines pileuses : il les traverse et se répand dans le derme. The extracts thus marked are applied by gentle anointing to the shaved skin without irritation of the animal tested, for example for 3 consecutive days, morning and either. One day after the end of these 6 anointings, the anointed skin is removed and compared to the control skin. Histological analysis shows that the extract coupled to the peroxidase is precipitated in the tissues, whether or not there is revelation of the peroxidase by diaminobenzidine, in the form of fine black granules, from the threshold of visibility to small black vacuolar enclaves. However, it can be seen that the extract crossed the epidermis and penetrated very deeply into the dermis, not only around the hair sheaths, but also far from them, in full dermal tissue devoid of sheaths. These grains are either isolated or gathered in groups or sometimes very large ranges. The penetration of extract is on the one hand direct, and on the other hand follows the path of the hair sheaths: it crosses them and spreads in the dermis.

Corrélativement, par exemple chez le lapin, les analyses histologiques et par microscopie électronique, ainsi que biochimiques conjointes, montrent, après de telles onctions, avec les extraits à 30 r cerveau-placenta, par exemple 12 onctions en 6 jours, que l'épiderme est riche en mitoses et dépourvu de pycnoses, son épaisseur staecrott de 64 %, ses organelles cytoplasmiques et nucléaires étant parfaitement normales; dans le derme le réseau des fibres élastiques est riche, le collagène très développé, la largeur de ses fibres, dont la striation est normale, est augmentée de 31 , démontrant leur hydratation; corrélativement, l'augmentation du collagène acétosoluble est de 34 % et du taux d'hydroxyproline de 31 . Enfin, les augmentations relatives des taux des composants fondamentaux sont : acide désoxyribonucléique 40 %, acide ribonucléique 33 %, protéines solubles 45 %, protéines solubles thermorésistantes après chauffage à 1100C 86 %, hexoses totaux, jusqu'à 209 %. Correlatively, for example in rabbits, histological and electron microscopy analyzes, as well as joint biochemicals, show, after such anointments, with the extracts at 30 r brain-placenta, for example 12 anointings in 6 days, that the epidermis is rich in mitoses and devoid of pycnosis, its staecrott thickness of 64%, its cytoplasmic and nuclear organelles being perfectly normal; in the dermis the network of elastic fibers is rich, the collagen very developed, the width of its fibers, whose striation is normal, is increased by 31, demonstrating their hydration; correlatively, the increase in acetonoluble collagen is 34% and the hydroxyproline level is 31. Finally, the relative increases in the levels of the fundamental components are: deoxyribonucleic acid 40%, ribonucleic acid 33%, soluble proteins 45%, soluble heat-resistant proteins after heating at 1100C 86%, total hexoses, up to 209%.

Les exemples de préparation ci-après sont donnés à titre indicatif; ils ne sont nullement limitatifs, ni en ce qui concerne les matériaux d'extraction, biologiques et chimiques, ni les modalités, ni les quantités. Ils peuvent subir, à volonté, pourvu que les buts indiqués et ci-dessus définis, soient atteints, des adaptations diverses. The following preparation examples are given for information only; they are in no way limiting, neither with regard to extraction materials, biological and chemical, nor the methods, nor the quantities. They can undergo, at will, provided that the goals indicated and above defined, are achieved, various adaptations.

ExemPle 1 - Extraction à t > artir du cerveau
Des cerveaux de bovins stockés à l'état congelé à -25 C, sont lavés à l'eau courante, débarassés des caillots et des méninges, puis grossièrement fragmentés. Ils sont plongés dans un liquide tampon composé de glycine 7,5 g pour 1000 ml d'eau distillée, portée à pH 8,50 par de la soude normale, à raison de 1 kg de cerveau pour 2 litres de tampon.EXAMPLE 1 - Extraction from the brain
Bovine brains stored frozen at -25 ° C are washed with running water, rid of clots and meninges, then grossly fragmented. They are immersed in a buffer liquid composed of glycine 7.5 g per 1000 ml of distilled water, brought to pH 8.50 by normal soda, at the rate of 1 kg of brain for 2 liters of buffer.

Ils sont réduits en pulpe fine par un broyeur à grande vitesse.They are reduced to fine pulp by a high speed grinder.

Cette pulpe est chauffée à 60 OC, pendant une heure, en bain-marie clos, avec agitation continue. Après refroidissement, le produit est centrifugé en continu, de façon à éliminer sous forme de culot, les déchets fibreux et les matières thermosensibles qui ont été précipitées par le chauffage. This pulp is heated to 60 ° C. for one hour in a closed water bath with continuous stirring. After cooling, the product is centrifuged continuously, so as to remove in the form of a pellet, the fibrous waste and the heat-sensitive materials which have been precipitated by heating.

Lorsque le produit est préparé pour rester à l'état liquide, on lui ajoute un antioxydant sous forme d'huile de germe de mais, à la dose de 0,5 ml par litre; on ajoute encore 25 ml de propylène glycol par litre. Le produit est ensuite stérilisé à l'autoclave à 1050C pendant 30 minutes. When the product is prepared to remain in the liquid state, an antioxidant is added to it in the form of corn germ oil, at a dose of 0.5 ml per liter; another 25 ml of propylene glycol per liter are added. The product is then sterilized in an autoclave at 1050C for 30 minutes.

Lorsque le produit est préparé pour être porté à ltétat sec, on lui ajoute 0,5 g par litre d'acétate de D La-tocophérol, puis on le soumet à la dessication par atomisation (nébulisation). La poudre obtenue peut être utilisée à l'état de solution-suspension à 10 % dans l'eau distillée, le pH final étant 7,3. When the product is prepared to be brought to the dry state, 0.5 g per liter of D-la-tocopherol acetate is added thereto, then it is subjected to drying by atomization (nebulization). The powder obtained can be used in the form of a 10% solution-suspension in distilled water, the final pH being 7.3.

Exemple 2
Le processus est le même que celui indiqué à l'exemple 1, mais le liquide d'extraction est formé de laurate de potassium à 2,5 g pour 1000 ml d'eau distillée à pH = 8,15. Example 2
The process is the same as that indicated in Example 1, but the extraction liquid is formed of potassium laurate at 2.5 g per 1000 ml of distilled water at pH = 8.15.

Exemple 3
Le processus d'extraction est réalisé comme aux exemples 1 t 2, à partir de cerveau, mais le liquide d'extraction est formé de laurate de triéthanolamine à 5 g pour 1000 ml d'eau distillée, à pH 7,60. Example 3
The extraction process is carried out as in Examples 1 t 2, from the brain, but the extraction liquid is formed from triethanolamine laurate at 5 g per 1000 ml of distilled water, pH 7.60.

Claims

1. Process for the extraction and treatment of glycoproteins and / or mucopolysaccharides (proteoglycan glycosaminoglycans) and substances which accompany them naturally (heat-resistant proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates and their derivatives), from biological materials , in particular from tissues of animal organisms, by grinding these materials, then extraction in a basic buffered medium at a pH of 7.5 to g, 5, followed by heating at a temperature of 60 to 1100C and recovery extract, characterized in that the grinding of the raw materials of biological origin is carried out directly in the extraction medium having a pH of between 7.5 and 9.5, then the extract is separated by centrifugation or filtration of the waste fibrous and heat-sensitive proteins that precipitated upon heating.

2. Method according to claim 1, characterized in that the extraction medium consists of an aqueous solution of potassium laurate at 2.5 g per 1000 ml of water, at a pH of 8.15.

3. Method according to claim 1, characterized in that the extraction medium consists of an aqueous solution of triethanolamine laurate at 5 g per 1000 ml of water, pH 7.60.

4. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that an antioxidant is added to the extracts.

5. Method according to claim 4, characterized in that the antixoydant is a product rich in a-tocopherol such as corn germ oil, added in an amount of 0.5 ml per liter of extract, or Dba-tocophero acetate; added at a rate of 0.5 g per liter of extract.

6. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that a stabilizing body, such as propylene glycol, is added to the liquid extract obtained, at a rate of 25 ml per liter of extract, then the product is sterilized in an autoclave. mixture obtained,

7. A method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the liquid extract obtained is brought to dryness by simple desiccation or by atomization or lurophilization, to obtain a powder.

8. Dry or liquid extract of glycoproteins and / or mucopolysaccharides and the substances which accompany them, characterized in that they are obtained by a process according to any one of the preceding claims.

9. Composition for pharmaceutical or cosmetic use, characterized in that it comprises a liquid extract or a dry extract in which water has been incorporated to obtain stable emulsion solutions.