FI96090C - Menetelmä heraproteiinien fraktioimiseksi - Google Patents

Description

96090

Menetelmä heraproteiinien fraktioimiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä heraproteiinien fraktioimiseksi. Tarkemmin esitettynä keksinnön kohteena 5 on menetelmä heran tai heraproteiiniliuoksen jakamiseksi kromatografisesti selektiivisesti alfa-laktalbumiini- ja beeta-laktoglobuliinikomponenteiksi. Saatu alfa-laktalbu-miinikomponentti sopii sellaisenaan käytettäväksi äidinmaidonkorvikkeissa ja saatu beeta-laktoglobuliinikompo-10 nentti puolestaan sopii sellaisenaan käytettäväksi pro-teiinikomponenttina kliinisissä ravintovalmisteissa ja monenlaisissa elintarviketeollisuuden tuotteissa.

Maidon heraproteiineja käytetään mm. äidinmaidonkorvikkeissa hyvän sulavuutensa ja erinomaisen ravintoar-15 vonsa vuoksi. Yleisesti äidinmaidonkorvikkeiden proteiini koostetaan maidon kaseiinista ja heraproteiinista käyttäen suhteena 40:60 (kaseiini:heraproteiini), joka vastaa kaseiinin ja heraproteiinin suhdetta äidinmaidossa. Kuitenkaan äidinmaidonkorvikkeiden proteiinikoostumus ei sittenkään 20 täysin vastaa äidinmaitoa, sillä lehmänmaidon heraproteiini poikkeaa koostumukseltaan äidinmaidon heraproteiinista; äidinmaito ei sisällä lainkaan beeta-laktoglobuliinia (B-LG), joka taas on lehmänmaidon heraproteiinin pääkompo-nentti. Sen sijaan lehmänmaidon heraproteiinin alfa-lakt-25 albumiini (α-LA) on lähes identtinen äidinmaidon a-LA:n kanssa. Koska äidinmaidon proteiini koostuu pääosin a-LA:sta (n. 40 p-%), lehmänmaidosta eristetyn, mahdollisimman puhtaan alfa-laktalbumiinifraktion käyttö pääasiallisena proteiinikomponenttina äidinmaidonkorvikkeissa 30 olisi ravitsemuksellisesti edullista.

Koska β-LG on joiltakin funktionaalisilta ominai-• * suuksiltaan (mm. liukoisuus laajalla pH-alueella, hyvä geeliytyrniskyky) selvästi heraproteiinikonsentraattia (WPC) parempi, on β-LG:n todettu soveltuvan hyvin elin-35 tarviketeollisuuden tarpeisiin. Tällä hetkellä elintarvi- • 2 96090 keteollisuus käyttää WPC:tä, mutta odottaa hinnaltaan kilpailukykyisen beeta-laktoglobuliinin tuloa markkinoille [D.M. Mulvihill, Food Research Quarterly 51 (1991) 65 -73]. WPC:tä käytetään mm. kliinisissä ravintovalmisteissa.

5 Jogurteissa; tuorejuustoissa ja rahkassa WPC:tä käytetään kaseiinin sijaan. Rahkassa jopa 20 paino-% kaseiinista voidaan korvata heraproteiinilla. Juomateollisuus käyttää rasvatonta WPC:tä erilaisten urheilu- ja virvoitusjuomien proteiinipitoisuuden nostamiseen. Maustettuihin maltojuo-10 miin (esim. kaakao) WPC:tä lisätään kasvattamaan viskositeettiä ja kolloidista stabiilisuutta. Makkaroiden valmistuksessa jopa 20 paino-% lihaproteiinista voidaan korvata heraproteiinilla. WPC:tä on käytetty myös jäätelön, mehu-jään, marenkien (vain rasvaton WPC) ja suklaakuorrutusten 15 valmistukseen [D.M. Mulvihill, Food Research Quarterly 51 (1991) 65 - 73].

P.J. Skudder on julkaisussa J. Dairy Res., 52 (1985) 167-181 esittänyt menetelmän, jossa vahvalla anio-ninvaihtohartsilla (Spherosil QMA, Sepracor, Ranska) voi-20 daan erottaa juusto- tai kaseiiniherasta a-LA- ja 8-LG-pitoiset fraktiot. Spherosil QMA -hartsi koostuu piidiok-sidihiukkasista (halkaisija 100 - 300 pm), jotka on päällystetty styreenivinyylitrietoksisilaanikopolymeerillä, johon on sidottu kvaternäärisiä ammoniumryhmiä. Mainitun . 25 hartsin keskimääräinen huokoskoko on 1250 A, huokostila- « vuus 1 cm3/g ja ominaispinta-ala 25 m2/g. Tämä tunnettu menetelmä perustuu siihen, että B-LG:lla on suurempi affiniteetti mainittuun hartsiin kuin muilla heraproteiineilla. Täten johtamalla heraa kloridimuotoon regeneroidun 30 hartsipylvään läpi saadaan pylväästä ensin jae, joka sisältää B-LG:a vain vähäisiä määriä. Pylvään kapasiteetin täyttyessä myös B-LG:a alkaa tulla ulos pylvään läpi. Täten katkaisemalla pylvään läpi tullut eluaatti sopivasta kohdasta, saadaan runsaasti a-LA:a sisältävä jae (alfa-35 jae). Pylvääseen tarttunut heraproteiini (beeta-jae, si- • 3 96090 sältää pääosin B-LG:a) voidaan vapauttaa hartsista laimealla suolahappoliuoksella (yleisimmin 0,1 N HC1). Menetelmässä käytetyn Spherosil QMA -hartsin haittoina ovat kuitenkin hartsin hienojakoisuus teollisuussovelluksia 5 ajatellen ja erityisen kallis hinta.

Thibault on US-patenttijulkaisussa 5 077 067 tosin esittänyt menetelmän, jossa heraproteiinien fraktiointi on aikaansaatavissa mm. huokealla Duolite A101 -anioninvaih-tohartsilla kierrättämällä sopiva määrä heraa ioninvaihto-10 pylvään läpi, jolloin B-LG sitoutuu hartsiin ja saatu liuos on käytännöllisesti katsoen vapaa B-LG:sta. Näin tämän tunnetun menetelmän pitäisi teoriassa toimia. Duolite A101 -hartsin ei ole lukuisista kokeista huolimatta kuitenkaan todettu toimivan väitetyllä tavalla; mainittu 15 hartsi ei sido B-LG:a lainkaan kuten on esitetty. Tämä käy ilmi jäljempänä esitetystä esimerkistä 8. Lisäksi Thibaul-tin esit-tämässä menetelmässä voidaan natiivia heraa (tuhkapitoisuus alle 1 paino-%) käsitellä vain pH-alueella 4 - 6. Runsassuolaista heraa (tuhkapitoisuus 1-3 paino-%) 20 voidaan käsitellä pH-alueella 6-8.

Tämän keksinnön tarkoituksena onkin aikaansaada teolliseen käyttöön soveltuva menetelmä, jolla voidaan välttää edellä mainitut epäkohdat ja jolla hera tai hera-proteiiniliuos voidaan jakaa selektiivisesti alfa-laktal-. 25 burniini- ja beeta-laktoglobuliinikomponenteiksi.

Keksinnön kohteena on menetelmä heran tai herapro-teiiniliuoksen jakamiseksi kromatografisesti selektiivisesti alfa-laktalbumiini- ja beeta-laktoglobuliinikompo-nenteiksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että 30 a) annos heraa tai heraproteiiniliuosta kirkaste taan ja tarvittaessa siitä poistetaan glykomakropeptidit; b) vaiheessa a) käsiteltyä heraa tai proteiinin suhteen vastaava määrä heraproteiiniliuosta johdetaan pH:ssa 6,0 - 7,0 virtausnopeudella 3-5 pylvästilavuut-35 ta/h kormatografiapylvään läpi, joka on täytetty vahvalla 4 96090 plystyreenipohjäisellä anioninvaihtohartsilla, siten että 1 cm3:a kohti hartsia pylvään läpi johdetaan 6-7 cm3 heraa tai proteiinin suhteen vastaava määrä heraproteiini-liuosta, joka hartsi on suuren huokoskoon omaava hartsi, 5 jonka huokoskoko on 1000 - 2000 A ja huokostilavuus on vähintään 0,9 cm3/g ja jossa styreenidivinyylibentseenipoly-meerimatriisiin on kiinnitetty kvaternäärisiä alkyyliamii-ni- tai alkyylialkanoamiiniryhmiä, edullisimmin alkyylial-kanoamiiniryhmiä ja jonka hiukkasten halkaisija on 300 -10 600 pm, ja pylvään läpi tullut jae otetaan talteen; c) vaiheessa b) käsitelty anioninvaihtohartsipylväs pestään deionisoidulla vedellä, pesuvesi yhdistetään vaiheessa b) talteenotettuun jakeeseen ja näin saatu liuos otetaan talteen alfa-laktalbumiinikomponenttina; ja sen 15 jälkeen d) pesty anioninvaihtohartsipylväs eluoidaan laimealla NaCl-vesiliuoksella ja eluaatti otetaan talteen bee-ta-laktoglobuliinikomponenttina.

Keksinnön mukainen menetelmä sopii proteiinien 20 fraktiointiin erityyppisistä heroista ja heraproteiini- liuoksista, kuten juusto- ja kaseiiniherasta, deminerali-soidusta herasta sekä heraproteiinikonsentraatista. Erityisen hyvin se soveltuu kaseiiniheran fraktioimiseen al-fa-lakt-albumiini- ja beeta-laktoglobuliinikomponenteiksi.

. 25 Nyt on yllättäen havaittu, että heran tai herapro- teiiniliuoksen aikaisempaa parempi fraktioituminen voidaan saada aikaan Spherosil QMA -hartseja paljon huokeammilla vahvoilla anioninvaihtohartseilla Diaion HPA 25 ja HPA 75 (Resindion, Mitsubishi Kasei Corp., Japani). Näiden 30 HPA-hartsien styreeni-divinyyli-bentseenipolymeerimatrii-siin on kiinnitetty kvaternäärisiä alkyyliamiini- (HPA 25) ' * tai alkyylialkanoliamiini- (HPA 75) ryhmiä. Suuren huokos kokonsa (1000 - 2000 A), huokostilavuutensa (0,9 cm3/g) ja ominaispinta-alansa (23 - 25 m2/g) puolesta nämä HPA-hart-35 sit soveltuvat suurikokoisten molekyylien eristämiseen.

. · 5 96090 HPA-hartsien hinta on vain n. 1/100 Spherosil QMA -hartsien hinnasta. HPA-hartsit soveltuvat hyvin teolliseen käyttöön sopivan karkeusasteensa (halkaisija 300 - 600 pm) sekä mekaanisen lujuutensa vuoksi. HPA-hartsien etuna on 5 myös se, että niihin sitoutunut proteiini voidaan eluoida 2-5 p-% NaCl-liuoksella, kun taas P.J. Skudderin julkaisussa J. Dairy Res., 52 (1985) 167-181 esittämässä menetelmässä Spherosil QMA -hartsiin sitoutunut proteiini on eluoitava hartsista työturvallisuuden kannalta vaaralli-10 semmalla suolahapolla. NaCl-käsittely on myös proteiinin natiivisuuden säilyttämisen kannalta parempi vaihtoehto kuin HC1.

Lisäksi keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan suurin osa B-LG:stä erottaa natiivista herasta (tuhkapi-15 toisuus alle 1 paino-%) muista heran proteiineista hyvin puhtaaksi fraktioksi pH-alueella 6-7 ilman pH-säätöä, kun taas US-patenttijulkaisussa 5 077 067 esitetyssä menetelmässä natiivia heraa voidaan käsitellä vain pH-alueella 4-6.

20 Oheisissa piirustuksissa esitetään nestekromato- grafin (Fast Protein Liquid Chromatography; FPLC) antamat kromatogrammit heran alfa-laktalbumiini- ja beeta-lakto-globuliinijakeille.

Kuvio 1 esittää kaseiiniheran keksinnön mukaisesti , 25 ΗΡΑ 75 -hartsilla saatujen alfa-laktalbumiini- ja beeta- laktoglobuliinijakeiden FPLC-kromatogrammeja.

Kuvio 2 puolestaan esittää kaseiiniheran Spherosil QMA LS -hartsilla saatujen alfa-laktalbumiini- ja beeta-laktoglobuliinij akeiden FPLC-kromatogrammeja.

30 Menetelmän vaiheessa a) hera tai heraproteiiniliuos kirkastetaan seostamalla jäännöskaseiini, fosfolipoprote-* iinit ja kalsiumfosfaatti pH:n nostolla, CaCl2*2H20-lisäyk- sellä ja lievällä lämpökäsittelyllä ja poistamalla sakka dekantoimalla, sentrifugoimalla tai mikrosuodattamalla. 35 Kirkastusmenetelmillä ei ole merkittävää vaikutusta herojen proteiinikoostumukseen.

6 96090

Menetelmän valheessa b) valheessa a) käsitelty hera tai heraproteiiniliuos johdetaan kromatografiapylvään läpi, joka on täytetty vahvalla polystyreenlpohjäisellä anioninvaihtohartsilla, joka on suuren huokoskoon omaava 5 hartsi, jonka huokoskoko on 1000 - 2000 A ja huokostila-vuus on vähintään 0,9 cm3/g ja jossa styreenidivinyylibent-seenipolymeerimatriisiin on kiinnitetty kvaternäärisiä alkyyliamiini- tai alkyylialkanoamiiniryhmiä, edullisimmin alkyylialkanoamiiniryhmiä ja jonka hiukkasten halkaisija 10 on 300 - 600 pm, ja pylvään läpi tullut jae otetaan talteen. Tällöin menetelmän vaiheessa b) johdetaan vaiheessa a) käsiteltyä heraa tai proteiinin suhteen vastaava määrä heraproteiiniliuosta pH:ssa 6,0 - 7,0 virtausnopeudella 3-5 pylvästilavuutta/h kromatografiapylvään läpi, joka 15 on täytetty vahvalla polystyreenipohjaisella anioninvaih-tohartsilla, siten että 1 cm3:a kohti hartsia pylvään läpi johdetaan 6-7 cm3 heraa tai proteiinin suhteen vastaava määrä heraproteiiniliuosta.

Kun kirkastettu hera tai heraproteiiniliuos on me-20 netelmän vaiheessa b) johdettu vahvalla anioninvaihtokro-matografiahartsilla Diaion HPA 25 tai Diaion HPA 75 täyte-tyn pylvään läpi, on pylvään läpi tulleen heraliuoksen β-LG-pitoisuus huomattavasti alentunut ja sen pääproteiini-komponentti on a-LA.

25 Menetelmän vaiheessa c) vaiheessa b) käsitelty an ioninvaihtohart s ipylväs pestään deionisoidulla vedellä, pesuvesi yhdistetään vaiheessa b) talteenotettuun jakee-seen ja näin saatu liuos otetaan talteen alfa-laktalbumii-nikomponenttina.

30 Talteenotettua alfa-laktalbumiinikomponenttia voi daan käyttää α-LA-komponenttina erityisesti äidinmaidonkorvikkeissa sellaisenaan tai se voidaan konsentroida ja haluttaessa se voidaan vielä kuivata sinänsä tunnetulla tavalla ennen käyttöä a-LA-komponenttina.

35 Menetelmän vaiheessa d) hartsipylvääseen sitoutunut β-LG voidaan vapauttaa pestystä anioninvaihtohartsipyl-

ii ' · Mt'* »*lt litl'M

7 96090 väästä eluoimalla laimealla NaCl-vesiliuoksella, joka edullisesti on NaCl:n 2 - 5-painoprosenttinen vesiliuos, ja eluaatti otetaan talteen beeta-laktoglobuliinikompo-nenttina. Vesihuuhtelun jälkeen hartsi on valmis uudellen 5 käytettäväksi.

Talteenotettua beeta-laktoglobuliinikomponenttia voidaan käyttää sellaisenaan β-LG-komponenttina esimerkiksi kliinisissä ravintovalmisteissa tai erilaisissa elintarviketeollisuuden tuotteissa, kuten erilaisissa juomis-10 sa, makkaroissa ja jäätelöissä. Se voidaan myös konsentroida ja haluttaessa se voidaan vielä kuivata sinänsä tunnetulla tavalla ennen käyttöä β-LG-komponenttina.

Juustohera sisältää yleensä glykomakropeptidiä (GMP), joka syntyy maidon kaseiinista juustonvalmistuksen 15 yhteydessä juoksete-entsyymin toiminnan tuloksena ja juus-tomassan erotuksessa se joutuu heraan. GMP:n on todettu heikentävän proteiinien fraktioi tumista anioninvaihtohart-seilla [P.J. Skudder, J. Dairy Res., 52 (1985) 167 - 181] ja jopa aiheuttavan Spherosil QMA -hartsin tukkeutumista. 20 J. Burton ja P.J. Skudder ovat GB-patenttihakemuksessa 2 188 526 esittäneet menetelmän, jossa käytetään GMP:n poistoon Spherosil QMA:ta.

Nyt on yllättäen todettu, että GMP voidaan poistaa herasta tai heraproteiiniliuoksesta kvalitatiivisesti, 25 koska se saadaan tarttumaan vahvaan anioninvaihtohartsiin Diaion HPA 25 tai HPA 75 pH 5,0:ssa.

Täten keksinnön mukaisen menetelmän vaiheessa a) herassa tai heraproteiiniliuoksessa mahdollisesti läsnäolevat glykomakropeptidit poistetaan johtamalla kirkastet-30 tua heraa tai heraproteiiniliuosta pH:ssa 5,0 virtausnopeudella 3-7 pylvästilavuutta/h kromatografiapylvään läpi, joka on täytetty vahvalla polystyreenipohjäisellä anioninvaihtohartsilla, joka on suuren huokoskoon omaava hartsi, jonka huokoskoko on 1000 - 2000 k ja huokostila-35 vuus on vähintään 0,9 cm3/g ja jossa styreenidivinyylibent-seenipolymeerimatriisiin on kiinnitetty kvaternäärisiä 8 96090 alkyylismiini- tai alkyylialkanoamiiniryhmiä, edullisimmin alkyylialkanoamiiniryhmiä ja jonka hiukkasten halkaisija on 300 - 600 pm, siten että 1 cm3:a kohti hartsia pylvään läpi johdetaan 7-10 cm3 heraa tai proteiinin suhteen vas-5 taava määrä heraproteiiniliuosta, ja pylvään läpi tullut jae johdetaan vaiheeseen b). Tällä tavalla saadaan GMP:stä puhdasta heraa tai heraproteiiniliuosta.

Heraproteiinien fraktioituminen on tällaisesta GMP:stä puhdistetusta juustoherasta tai juustoheraproteii-10 niliuoksesta huomattavasti tehokkaampaa kuin puhdistamat-tomasta juustoherasta tai juustoheraproteiiniliuoksesta eikä pylvään tukkeutumisongelmia ole.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä GMP:n poisto voidaan suorittaa huomattavasti taloudellisemmin kuin edellä 15 mainitussa tunnetussa menetelmässä, koska kalliin Sphero-sil QMA -hartsin sijaan nyt voidaan käyttää sitä merkittävästi huokeampaa Diaion HPA 25 tai HPA 75 -hartsia ja lisäksi Diaion HPA 25 tai HPA 75 -hartsien eluoinnissa voidaan käyttää NaCl-liuosta HCl:n sijaan.

20 Esimerkki 1

Kaseiiniheran (2000 cm3) pH säädettiin alueelle 7,5 - 8,5 ja heraa lämmitettiin 30 min 50 °C:ssa, minkä jälkeen heraa seisotettiin 16 h 5 °C:ssa. Kirkas hera erotettiin saostuneesta kalsiumfosfaatista, rasvasta ja lipo-25 proteiineista dekantoimalla. Kirkastettu hera suodatettiin vielä Whatman GF/A -suodatinpaperin läpi ja säilytettiin 5 °C:ssa.

30 cm3 regeneroitua, vahvaa anioninvaihtohartsia Diaion HPA 25 pakattiin kromatografiakolonniin. Hartsipyl-30 vään läpi ajettiin 200 cm3 edellä kuvatulla tavalla kirkastettua kaseiiniheraa 100 cm3/h pH 6,5:ssa. Pylväs pestiin 60 cm3:11a deionisoitua vettä (100 cm3/h), kunnes liuoksen absorbanssi aallonpituudella 280 nm oli 0 (liuos ei sisältänyt enää proteiinia). Pylväästä läpitullut hera ja pesu-35 vesi yhdistettiin (alfa-jae). Pylvääseen tarttunut proteiini eluoitiin 2-5 p-% NaCl-liuoksella (50 cm3, 9 96090 100 cm3/h), kunnes liuoksen absorbanssi aallonpituudella 280 nm oli 0 (beeta-jae). Pylvästä huuhdottiin deionisoi-dulla vedellä, kunnes pesuvesi ei enää sisältänyt suolaa. Tämän jälkeen pylväs oli valmis käytettäväksi uudelleen.

5 Jakeiden koostumukset on esitetty taulukossa 1.

Esimerkki 2

Kuten esimerkki 1, mutta heran kirkastuksessa saostunut materiaali erotettiin herasta sentrifugoimalla (4200 g, 20 min), ja hartsi oli Diaion HPA 75. a- ja 8-10 jakeiden koostumustiedot on esitetty taulukossa 1. Neste-kromatografin antamat a- ja B-jakeiden FPLC-kromatogrammit (kolonni: Superdex 75, Pharmacia) on esitetty kuviossa 1. Kuviossa esitetyt numeroarvot ilmaisevat retentioajan, A = immunoglobuliinit, B - naudan seerumialbumiini (BSA), C = 15 B-LG, D = a-LA, E = orottihappo.

Esimerkki 3 30 cm3 regeneroitua, vahvaa anioninvaihtohartsia Spherosil QMA LS pakattiin kromatografiakolonniin. Hartsi-pylvään läpi ajettiin 200 cm3 esimerkin 2 mukaisesti kir-20 kastettua kaseiiniheraa 100 cm3/h pH 6,5:ssa. Pylväs pestiin 60 cm3 deionisoidulla vedellä (100 cm3/h), kunnes liuoksen absorbanssi aallonpituudella 280 nm oli 0. Pylväästä läpitullut hera ja pesuvesi yhdistettiin (alfa-jae). Hart-sipylvääseen tarttunut proteiini eluoitiin 0,1 N HCl-liu-25 oksella (50 cm3, 100 cm3/h), ja huuhdottiin deionisoidulla vedellä kunnes eluentin proteiinipitoisuus oli 0 (beeta-jae). Pylvästä huuhdeltiin edelleen, kunnes pylväästä ulostulevan veden pH oli yli 4,0, minkä jälkeen pylväs oli valmis käytettäväksi uudelleen. Jakeiden koostumukset on 30 esitetty taulukossa 1. Nestekromatografin antamat a- ja B- jakeiden FPLC-kromatogrammit (kolonni: Superdex 75, Pharmacia) on esitetty kuviossa 2. Kuviossa esitetyt numeroarvot ilmaisevat retentioajan, A * immunoglobuliinit, B » naudan seerumialbumiini (BSA), C *= B-LG, D = a-LA, E -35 orottihappo.

10 96090

Taulukko 1

Esimerkkien 1-3 mukaan tuotettujen proteiinifraktioiden koostumukset 5 QMA LS HPA 25 HPA 75

a-LA β-LG a-LA β-LG a-LA β-LG

(mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg)

Kaseiinihera 98 419 101 432 122 462 (syöttö) 10 Alfa-jae 32 20 92 116 95 44

Beeta- jae 66 500 7 340 28 403

Saanto (%)* 100 124 98 106 101 97 *) « ((Proteiini alfa-j akeessa+beeta-j akeessa)/Proteiini 15 syötössä)♦100%

Tuloksista voidaan nähdä, että Spherosil QMA LS sitoi parhaiten proteiineja, vain 5 % 8-LG:sta ja 33 % a-LA:sta eluoitui aifa-jakeessa, jonka a-LA:β-LG - 1:0,63. 20 Beeta-jakeessa a-LA:β-LG - 1:7,6. Diaion HPA -hartsit si toivat proteiineja paljon selektiivisemmin: HPA 25 päästi 91 % ja HPA 75 78 % α-LA: s ta suoraan alfa-jakeeseen, kun taas β-LG:a sitoutui HPA 25:11a 79 % ja HPA 75:11a 87 % (HPA 25: alfa-jae: a-LA:8-LG * 1:1,3; HPA 75: alfa-jae: 25 a-LA:β-LG - 1:0,5). Diaion HPA 75:11a saatiin näin ollen parempilaatuinen alfa-jae paremmalla saannolla kuin Spherosil QMA LS:lla.

Esimerkki 4

Juustoheraan (2000 cm3) lisättiin 8,8 g CaCl2*2H20, 30 ja heran pH säädettiin 7,3:een 1 N NaOH:lla. Lämmitettiin 50 °C:ssa 8 min. Seisotettiin 5 °C:ssa 16 h, minkä jälkeen kirkas hera erotettiin saostuneesta fosfolipidisakasta de-kantoimalla. Kirkastettu hera suodatettiin Whatman GF/A -suodatinpaperin läpi.

11 96090

Edellä kuvatulla tavalla kirkastettua heraa (300 cm3) ajettiin Diaion HPA 75 -hartsipylvään (30 cm3) * läpi 100 cm3/h pHtssa 5,0. Läpitullut hera sisälsi alle 20 % alkuperäisestä GMP:stä. α-LA-pitoisuus säilyi käsit-5 telyssä muuttumattomana, B-LG:a jäi hartsiin alle 9 % syötön sisältämästä beeta-laktoglobuliinista. Hartsiin kiinnittynyt GMP eluoitiin 4 p-% NaCl-liuoksella, ja hartsi pestiin deionisoidulla vedellä puhtaaksi suoloista. Hartsi oli valmis käytettäväksi uudelleen.

10 Esimerkki 5

Juustoheraa kirkastettiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, paitsi että fosfolipoproteiinisakka erotettiin herasta sentrifugoimalla. Näin kirkastettua heraa (300 cm3) ajettiin Spherosil QMA LS -hartsipylvään (30 cm3) läpi 15 100 cm3/h pH:ssa 5,0. Läpitullut hera sisälsi alle 20 % alkuperäisestä GMP:stä. a-LA:a ja B-LG:a sitoutui hartsiin yhteensä 17 %. Hartsiin kiinnittynyt GMP eluoitiin 0,1 N HCl-liuoksella, ja hartsi pestiin deionisoidulla vedellä, kunnes ulostulevan pesuveden pH oli yli 4,0. Hartsi oli 20 valmis käytettäväksi uudelleen.

Taulukko 2

Esimerkkien 4 ja 5 proteiinitaseet QMA LS HPA 75

25 a-LA B-LG a-LA 6-LG

(mg) (mg) (mg) (mg)

Syöttö 188 422 228 819 hera-jae1’ 177 374 235 742 GMP-jae em2) em 8 21 30 Proteiinitappio (%)3) 6 11 0 9

11 hera, josta on poistettu GMP

2) em tarkoittaa "ei määritetty" 35 3> Alfa-laktabumiinin ja beeta-laktoglobuliinin määrä GMP- jakeessa 96090 12

Tulosten perusteella GMP voidaan erottaa kummallakin hartsilla melko selektiivisesti, proteiinitapplot olivat melko pieniä.

Esimerkki 6 5 200 cm3 juustoheraa, josta GMP oli poistettu kuten esimerkissä 4, ajettiin Diaion HPA 75 -hartsin (30 cm3) läpi 100 cm3/h pH 6,5:ssa, minkä jälkeen hartsi huuhdeltiin deionisoidulla vedellä, kunnes liuoksen absorbanssi aallonpituudella 280 nm oli 0. Läpi tullut hera ja pesuvesi 10 yhdistettiin (alfa-laktalbumiinijae). Hartsiin kiinnittynyt proteiini eluoitiin 5 p-% NaCl-liuoksella (50 cm3) (beeta-laktoglobuliinijae). Jakeiden koostumukset on esitetty taulukossa 3.

Esimerkki 7 15 295 cm3 juustoheraa, josta GMP oli poistettu kuten esimerkissä 5, ajettiin Spherosil QMA LS -hartsin (30 cm3) läpi 100 cm3/h pH 6,5:ssa, minkä jälkeen hartsi huuhdeltiin deionisoidulla vedellä, kunnes ulostulevan liuoksen kuiva-aine oli 0. Läpitullut hera ja pesuvesi yhdistettiin (al-20 fa-laktalbumiinijae). Hartsiin kiinnittynyt proteiini eluoitiin 0,1 N HCl-liuoksella (50 cm3) (beeta-laktoglobuliinijae). Jakeiden koostumukset on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3

Esimerkkien 6 ja 7 mukaan tuotettujen proteiini-25 fraktioiden koostumukset QMA LS_ HPA 75

a-LA B-LG a-LA B-LG

(mg) (mg) (mg) (mg) 30 Syöttö 177 374 132 366

Alfa-jae 117 46 97 51

Beeta-jae 46 314 66 396

Saanto (%) 92 96 123 122 35 GMP:n poisto paransi merkittävästi proteiinien fraktioitumista kummankin hartsin kohdalla.

;· Hi Iti l.iitf < · t 13 96090

Esimerkki 8

Juustoherasta poistettiin fosfolipoproteiinit mik-rosuodattamalla 1,4 pm kalvon läpi. 60 cm3 näin kirkastettua heraa johdettiin 30 cm3 Cl*-muotoon regeneroidun vah-5 van anioninvalhtohärtsin Duolite A 101 (Rohm & Haas, Rans ka) läpi 150 cm3/h pHtissa 5, 6, 7 ja 8. Heraa kierrätettiin kussakin pH:ssa 30 min hartsin läpi. Kokeet tehtiin huoneenlämmössä. Kierrätyksen jälkeen pylvään läpi ajettiin 100 cm3 ionivaihdettua vettä ja pesuvesi yhdistettiin 10 herajakeeseen (alfa-jae). Pylvääseen tarttunut proteiini eluoitiin 0,1 N HCl:lla (beeta-jae).

Taulukko 4

Esimerkin 8 mukaan valmistettujen proteilnijakeiden koostumukset___________ 15 pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0

ö—LA 6—LG a—LA 6—LG a—LA 6—LG e—LA 8—LG

(mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg)

Syöttö 47 149 46 152 52 155 45 149

Alfa-jae 50 147 46 151 46 148 44 149 20 Beeta-jae 02016 810

Tulosten perusteella Duolite A101 ei sitonut käytännöllisesti katsoen lainkaan proteiinia, eikä näin ollen sovellu proteiinien fraktiointiin.

Claims (7)

14 96090

1. Menetelmä heran tai heraproteiiniliuoksen jakamiseksi kromatografisesti selektiivisesti alfa-laktalbu- 5 miini- ja beeta-laktoglobuliinikomponenteiksi, tun nettu siitä, että a) annos heraa tai heraproteiiniliuosta kirkastetaan ja tarvittaessa siitä poistetaan glykomakropeptidit; b) vaiheessa a) käsiteltyä heraa tai proteiinin 10 suhteen vastaava määrä heraproteiiniliuosta johdetaan pH :ssa 6,0 - 7,0 virtausnopeudella 3-5 pyvästilavuutta/h kromatografiapylvään läpi, joka on täytetty vahvalla poly-styreenipohjäisellä anioninvaihtohartsilla, siten että 1 cm3:a kohti hartsia pylvään läpi johdetaan 6-7 cm3 he-15 raa tai proteiinin suhteen vastaava määrä heraproteiiniliuosta, joka hartsi on suuren huokoskoon omaava hartsi, jonka huokoskoko on 1000 - 2000 A ja huokostilavuus on vähintään 0,9 cm3/g ja jossa styreenidivinyylibentseenipoly-meerimatriisiin on kiinnitetty kvaternäärisiä alkyyliamii-20 ni- tai alkyylialkanoamiinlryhmiä, edullisimmin alkyylial-kanoamiiniryhmiä ja jonka hiukkasten halkaisija on 300 -600 pm, ja pylvään läpi tullut jae otetaan talteen; c) vaiheessa b) käsitelty anioninvaihtohartsipylväs pestään deionisoidulla vedellä, pesuvesi yhdistetään vai- 25 heessa b) talteenotettuun jakeeseen ja näin saatu liuos otetaan talteen alfa-laktalbumiinikomponenttina; ja sen j älkeen d) pesty anioninvaihtohartsipylväs eluoidaan laimealla NaCl-vesiliuoksella ja eluaatti otetaan talteen 30 beeta-laktoglobuliinikomponenttina.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että herassa tai heraproteiini-liuoksessa mahdollisesti läsnäolevat glykomakropeptidit poistetaan vaiheessa a) johtamalla kirkastettua heraa tai 35 heraproteiiniliuosta pH:ssa 5,0 virtausnopeudella 3-7 pylvästilavuutta/h kromatografiapylvään läpi, joka on täy- 15 96090 tetty vahvalla polystyreenipohjäisellä anioninvaihtohart-silla, joka on suuren huokoskoon omaava hartsi, jonka huokoskoko on 1000 - 2000 λ ja huokostilavuus on vähintään 0,9 cm3/g ja jossa styreenidivinyylibentseenipolymeerimat-5 riisiin on kiinnitetty kvaternäärisiä alkyyliamiini- tai alkyylialkanoamiiniryhmiä, edullisimmin alkyylialkanoamii-niryhmiä ja jonka hiukkasten halkaisija on 300 - 600 pm, siten että 1 cm3:a kohti hartsia pylvään läpi johdetaan 7 -10 cm3 heraa tai proteiinin suhteen vastaava määrä herapro- 10 teiiniliuosta, ja pylvään läpi tullut jae johdetaan vaiheeseen b).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsitellään heraa tai hera-proteiiniliuosta, joka on juustohera, kaseiinihera, demi- 15 neralisoitu hera tai heraproteiinikonsentraatti.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hera tai heraprote-iiniliuos kirkastetaan seostamalla siinä mahdollisesti läsnäoleva jäännöskaseiini, fosfolipoproteiinit ja kalsi- 20 umfosfaatti säätämällä pH arvoon, joka on ainakin 7,3, lisäämällä 4,4 g CaCl2*2H20/l hera ja lämmittämällä lievästi ja poistamalla näin syntynyt sakka dekantoimalla, sent-rifugoimalla tai mikrosuodatuksella.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me- 25 netelmä, tunnettu siitä, että anioninvaihtohartsi eluoidaan vaiheessa d) NaCl:n 2 - 5-painoprosenttisella vesiliuoksella.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa c) tal- 30 teen otettu alfa-laktalbumiinikomponentti konsentroidaan ja mahdollisesti kuivataan.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa d) talteen otettu beeta-laktoglobuliinikomponentti konsentroi- 35 daan ja mahdollisesti kuivataan. 16 96090