FI92719C - Xanthomonas-bakteerin valmistama polysakkaridipolymeeri - Google Patents
Xanthomonas-bakteerin valmistama polysakkaridipolymeeri Download PDFInfo
- Publication number
- FI92719C FI92719C FI863213A FI863213A FI92719C FI 92719 C FI92719 C FI 92719C FI 863213 A FI863213 A FI 863213A FI 863213 A FI863213 A FI 863213A FI 92719 C FI92719 C FI 92719C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- polysaccharide polymer
- glucose
- xanthomonas
- mannose
- microorganism
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K8/00—Compositions for drilling of boreholes or wells; Compositions for treating boreholes or wells, e.g. for completion or for remedial operations
- C09K8/02—Well-drilling compositions
- C09K8/04—Aqueous well-drilling compositions
- C09K8/06—Clay-free compositions
- C09K8/08—Clay-free compositions containing natural organic compounds, e.g. polysaccharides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
- C12P19/06—Xanthan, i.e. Xanthomonas-type heteropolysaccharides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S507/00—Earth boring, well treating, and oil field chemistry
- Y10S507/935—Enhanced oil recovery
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S507/00—Earth boring, well treating, and oil field chemistry
- Y10S507/935—Enhanced oil recovery
- Y10S507/936—Flooding the formation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
9271 9
Xanthomonas-bakteerin valmistama polysakkaridipolymeeri
Ksantaanikumia tuottavat Xanthomonas-sukuun kuuluvat bakteerit, kuten lajit campestris, albilineans, fragaria, 5 vesicatoria ja muut senkaltaiset. Ksantaanikumia kaytetaan laajalti sen epatavallisten ominaisuuksien vuoksi: silla on erittain korkea ominaisviskositeetti ja pseudoplastisuus. Sitå kaytetaan yleisesti elintarvikkeissa paksunnosaineina ja sekundaarisessa oljytuotannossa liikkuvuuden saatoon ja 10 profiilimodifiointiaineena kivioljyn porausnesteissa.
Kemiallisesti ksantaanikumi on anioninen heteropo-lysakkaridi. Polymeerin toistuva yksikko on pentameeri, joka koostuu viidesta sokeriosasta: kahdesta glukoosi-, yhdesta glukuronihappo- ja kahdesta mannoosiosasta. Ne ovat 15 jarjestyneet siten, etta glukoosiosat muodostavat polymee-riket jun rungon ja mannoosi-glukuronihappo-mannoosisivuket-jut lahtevat tavallisesti joka toisesta glukoosiosasta. Usein tama rakenne on spesifisesti asetyloitu tai pyruvy-loitu (Janson, P.E. Kenne, L. ja Lindberg, B, Carbohydrate 20 Research, 45, 275-282 (1975); Melton, L.D., Mindt, L. ,
Rees, D.A. ja Sanderson, G.R., Carbohydrate Research, 46, 245-257 (1976)). Nama ja muut selityksesså erityisesti mai-nitut julkaisut liitetaan tahan viitteina. Rakennetta kuvaa seuraava kaava: £y· 2 92719
Vaikka luonnossa esiintyvan ksantaanikumin kåytto-kelpoisuus on laaja-alaista, on kuitenkin olemassa tilan-teita, joissa sen fysikaaliset ominaisuudet ovat rajoituk-sena. Varsinkin sekundaarisessa oljyn talteenotossa ei ole 5 epatavallista, etta lampotila oljya sisaltavassa altaassa ja suolakonsentraatio altaan suolaliuoksessa ovat korkeam-pia kuin ksantaaniliuoksen kannalta on optimaalista. Naissa olosuhteissa ksantaani voi saostua, flokkuloitua ja/tai menettaa viskositeettia. Siten tarvitaan uusia viskositeet-10 tia kohottavia tuotteita, jotka toimivat hyvin korkeassa lampdtilassa ja korkeassa suolapitoisuudessa.
Keksinnon kohteena on polysakkaridipolymeeri, joka paremmin korottaa veden viskositeetin kuin luonnossa esiin-tyva ksantaanikumi.
15 Keksinnon kohteena on edelleen polysakkaridipolymee- ri, jonka realogiset ominaisuudet korotetussa lampotilassa ja/tai suolan lasnåollessa ovat paremmat kuin luonnossa esiintyvalla ksantaanikumilla.
Edelleen keksinnon kohteena on mikro-organismi, joka 20 pystyy tuottamaan polysakkaridikumia.
Edelleen keksinnon kohteena on menetelma polysakka-ridipolymeerin valmistamiseksi aerobisesti fermentoimalla mikro-organismia, joka pystyy tuottamaan polysakkaridipoly-meeria.
25 Keksinnolle on tunnusomaista se, mita patenttivaati- muksissa esitetaan.
Keksinnon mukaisesti esitetaan polysakkaridipolymeeri, joka ei sisalla lainkaan glukuronihapporyhmia, jonka D-glukoosi: D-mannoosisuhde on noin 2:1, jossa D-glukoosi-30 ryhmat ovat liittyneet toisiinsa beeta-[1,4]-konfiguraa- tiossa muodostaen polymeerirangon ja D-mannoosiryhmat liit-tyvat alfa-[ 1,3 ]-konf iguraatiossa yleensa joka toiseen glu-koosiryhmaan. Keksinto koskee myos menetelmia polysakkari-dipolymeerin valmistamiseksi, mikro-organismeja, jotka val-35 mistavat polysakkaridipolymeeria japolysakkaridipolymeerin , kayttoa.
9271 9 3
Keksinnon mukainen polysakkaridipolymeeri voidaan valmistaa estamalla yksi ksantaanikumin biosynteesin vai-heista. Siten sen si jaan, etta beeta-[ 1,4 ] -D-glukoosin ran-gasta lahtisi kolmen sokerin sivuketju kuten ksantaaniku-5 missa, keksinnon mukaisessa polysakkaridipolymeerissa on yksi ainoa sokeriryhma tavallisesti liittyneenå rangon joka toiseen glukoosiryhmSan. Keksinnon mukaista polysakkaridi-polymeeria nimitetaan tåssa "polytrimeeriksi", koska se sisaltåa toistuvia trimeeriyksikoita, so glukoosi-glukoo-10 si-mannoosiyksikoita. Sen rakenne nahdåan seuraavassa, jos-sa n tarkoittaa polymeerin toistuvia yksikbitå: / M « åtO / 20 w
Kuten kaavasta nahdaan, polytrimeeri kasittaa alfa-[l,3]-25 sidoksella tavallisesti joka toiseen beeta- [1,4] -sidoksella toisiinsa liittyneisiin D-glukoosiryhmiin liittyneita D-ma-nnoosiryhmia. Kuten ksantaanikumissa mannoosin 6-0asema voi olla (ei kuitenkaan aina ole) esteroity etikkahapolla, kuten kirjallisuusviitteessa Sutherland, I.W., Carbohydrate 30 Polymers, 1, 107-115 (1981) on kuvattu. Vaikka polysakkari-dipolymeerin rakenteen ajatellaan olevan edella esitetty, niin on mahdollista, etta joissakin synteesiolosuhteissa mannoosiryhxna ei aina liity joka toiseen glukoosiryhmaån.
Kuvio 1 kuvaa ksantaanikumin biosynteesin oletettua 35 reaktiotieta. Se perustuu useiden laboratorien tietoihin.
9271 9 4
Katso: Ielpi, L., Couso, R.O. ja Dankert, M.A., Biochem. Biophy. Res. Comm., 102, 1400-1408 (1981), FEBS Letters, 130, 253-256 (1981), Biochem. Intern., 6, 323-333 (1983); Osborn, M.J. ja Weiner. I.M., J. Biol. Chem., 243, 26312639 5 (1967); Troy, F.A., Annual Reviews of Microbiology, 33, 519-560 (1979). Kåytetyt lyhenteet ovat: glu=glukoosi, glu-A=glukuronihappo, man=mannoosi, glu-glu=sellobioosi, P=fos-faatti, PP=pyrofosfaatti, C55=isoprenoidi-lipidikantaja, PEP=fosfoenolipyruvaatti, AcCoA=asetyyli-koentsyymi A, 10 I-V=glykosyylitransferaaseja,UDP=uridiini-5'-difosfaatti, GDP=guanosiini-5'-difosfaatti.
Kuviossa 2 on esitetty polytrimeeri- ja ksantaani-kumiliuosten viskositeetit kumpikin 1000 ppm konsentraati-oisina 10-paino-%:sessa NaCl-liuoksessa leikkausnopeuden 15 funktiona.
Kuviossa 3 on esitetty 1000 ppm konsentraatioisten polytrimeeri- ja ksantaanikumiliuosten viskositeettien suh-de suolaliuoksen suolapitoisuuden funktiona.
Kuviossa 4 on esitetty 10-paino-%: seen NaCl-liuok-20 seen valmistettujen polytrimeeri- ja ksantaanikumiliuosten viskositeettien suhde polymeerikonsentraation funktiona.
Kuviossa 5 on esitetty 1000 ppm konsentraatioisten polymeeri- ja ksantaanikumiliuosten viskositeettien suhde lampotilan funktiona eri suolapitoisuuden omaavissa NaCl-25 liuoksissa.
Keksinnon mukainen polysakkaridipolymeeri voidaan valmistaa soluvapaassa entsyymisysteemissa tai kasvattamal-la sopivan mutanttikannan soluja. Seuraavassa on kuvattu myos muita keinoja polysakkaridipolymeerin valmistamiseksi.
3 0 Perusmenetelman ksantaanikumin valmistamiseksi kayt- taen soluvapaata systeemia ovat kuvanneet Ielpi, L., Couso, R.O. ja Dankert, M.A. (FEBS Letters, 130, 253-256 (1981)), ja sita voidaan kayttaa myos keksinnon mukaisen polymeerin valmistamiseen. Esimerkiksi tyypiltaån villin Xanthomonas 3 5 campestris mikro-organismin solut voidaan lyysata jaadytys- 5 92719 sulatusmenetelmållå ja lysaattiin voidaan lisata polytri-meerisynteesiin kSytettavåt substraatit, UDP-glukoosi ja GDP-mannoosi ja mahdollinen asetyyli-CoA. Vaihtoehtoisessa menetelmasså voidaan kayttaa lyysausta, johon sisåltyy ult-5 raåånikåsittely, kasittely pinta-aktiivisella aineella, entsyymikasittely (joihin ei kuitenkaan rajoituta) ja nåi-den yhdistelmåt. Lysaattia voidaan kayttaa epåpuhtaassa muodossa tai entsyymit voidaan puhdistaa. Ksantaanikumin biosynteesin reaktiotien entsyymit liittavat kovalenttises-10 ti glukoosi- ja mannoosiosat siten kuin normaalissa reak-tiotiesså. Koska entsyymireaktiossa ei ole UDP-glukuroni-happoa liitettåvaksi vastamuodostuneisiin ketjuihin, reak-tiotie katkeaa reaktion IV kohdalla (katso reaktiotie, ku-vio 1) ja vålituoteisoprenoidi lipidi-pyrofosfaatti-glukoo-15 si-glukoosi-mannoosi akkumuloituu. Yllattåen ksantaanipoly- meraasi, joka tavallisesti vaikuttaa lipidisidottuun penta-meeriin (glukoosi-glukoosi-mannoosi-glukuronihappomannoosi) pystyy polymeroimaan lipidisidotun trimeerin (glukoosi-glu-koosi-mannoosi). Keksinnon mukainen polytrimeeri voidaan 20 siten syntetisoida in vitro.
Edella kuvattu polytrimeerin soluvapaa synteesi osoittaa, etta Xanthomonas campestris-soluissa on kaikki polytrimeerin synteesiin tarvittavat entsyymit. Kuitenkin polytrimeerin syntetisointiin in vivo kayttaen kokonaisia 25 soluja tarvitaan keino ksantaanikumisynteesin katkaisemi- seen reaktion IV (katso kuvio 1) kohdalla. Reaktion IV es-tamiseen voidaan kayttaa sopivia mutantteja.
Transposoneja, kuten TnlO ja Tn903, joihin ei kuitenkaan rajoituta, voidaan kayttaa Xanthomonas mikro-orga-30 nismin mutagenointiin. Nama transposonit ovat resistenttejå • vastaavasti tetrasykliinille ja kanamysiinille. Transposo nit pystyvat sijoittumaan geeneihin ja nain tehdessaan ne aiheuttavat mutaatioita katkaistessaan koodaussekvenssin (Klecker, N. Annual Reviews of Genetics, 15, 341 (1981)).
35 Transposonit voidaan vieda Xanthomonasiin ns itsemurhavek- 9271 9 6 torilla, kuten pRK2013. Tama vektori kykenee siirtymåan ei-enterobakteeriin, kuten Xanthomonasiin, muttei pysty yllapitamaan (replikoitumaan) itseaan tassa isannasså (Dit-ta, G., Corbin, D., Helinski, D.R., Proc. Natl. Acad. Sci.
5 USA, 77, 7347-7351 (1980)). Niinpå, kun itsemurhavektori on viety Xanthomonas-solupopulaatioon ja populaatiota sen jal-keen kasitellaan joko tetrasyklllnllla tal kanamysiinilla, niin henkiinjaaneet yksilot ovat niita Xanthomonasyksiloi-ta, joiden genomiin yksi transposoneista on siirtynyt. Tål-10 laisen kasittelyn jalkeen henkiin jaaneet voidaan seuloa eroon, ja nain on saatu mutantteja, jotka ovat menettaneet kykynså valmistaa ksantaanikumia. Tallaiset mutantit ovat heikommin limaa muodostavia kuin villi Xanthomonas-tyyppi.
Voidaan kayttaa myos muita mutageenisia keinoja sel-15 laisten mutanttien saamiseksi, jotka ovat menettaneet ky-kynsa valmistaa ksantaanikumia. Tallaiset keinot ovat alan ammattimiehelle ilmeisia, ja niita ovat mm sateilyttåminen, rekombinantti-DNA-tekniikka ja kasittely kemiallisella mu-tageenilla (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics 20 (1972); Davis, R.W., Botstein, D. ja Roth, J.R., Advanced
Bacterial Genetics (1980); Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular Clonig (1982), Cold Spring Harbor).
Vaikka aluksi voidaan valita mutantteja, jotka ovat vahemman limaa muodostavia kuin villi tyyppi, niin jaljelle 25 halutaan jåttaa sellaisia, jotka valmistavat jonkin verran polysakkaridia. Kustakin ksantaanikumia valmistamattomasta mutantista voidaan valmistaa soluvapaa uute, joka testataan lisaamalla siihen erilaisia substraattiyhdistelmiå ja ana-lysoimalla tuotteet. Esimerkiksi kun substraateiksi lisa-30 taan UDP-glukoosia, GDP-mannoosia ja UDP-glukuronihappoa, tuotteen tulisi olla identtinen tuotteen kanssa, joka saa-daan lisattaessa UDP-glukoosia ja GDP-mannoosia. Vaihtoeh-toisesti sopivat mutantit voidaan loytaa kokeilemalla kun-kin mutantin viljelyliemesta polytrimeerin lasnaolo. Siten 35 voidaan loytaa ksantaanikumia muodostamattomia mutantteja, 9271 9 7 joiden ksantaanikumin reaktiotie nayttåå katkeavan reaktion IV kohdalla. Mutantti, johon tåma kuvaus påtee, on talle-tettu laitokseen the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, merkilla ATCC nro 53195. Tal]aisia 5 mutantteja voidaan kayttaa polytrimeerin syntetisoimiseen in vivo.
Vaikka keksinnon mukaisen polytrimeerin valmistuk-seen esimerkeissa on kaytetty glykosyylitransferaasi IV mutantteja, niin keksinnon muissa toteutusmuodoissa on mah-10 dollista kayttaa mutantteja UDP-glukuronihappometabolismis-
sa. Tållainen mutantti on eristetty ja tallennettu laitokseen the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland merkilla ATCC nro 53196. Tama mutantti saatiin trans-posonimutagenoimalla Xanthomonas campestris NRRL-B-1459 15 S4-L
Villia tyyppia olevan glukotransferaasi IV:n tai UDP- glukuronihappobisosynteesia ehkåisevan entsyymi-inhi-biittorin kåytto saman tuotteen saamiseksi ei ole keksinnon suojapiirin ulkopuolella. Myos muita vaihtoehtoja polytri-20 meerin tuottamiseksi voidaan ajatella, kuten luonnon ksantaanikumin entsymaattista tai kemiallista hajottamista esi-merkiksi poistamalla ksantaanikumin sivuket juista paatease-missa olevat mannoosi- ja glukuronihappo-osat.
Kayttaen samankaltaisia ohjelmia Xanthomonas-kanto-25 jen mutagenointiin on mahdollista saada mutantteja, jotka tuottavat muita uusia polysakkaridipolymeereja. Esimerkiksi asetylaasigeenin mutaatiolla saadaan taysin ei-asetyloitua ksantaanikumia. Kun asetylaasimutaatio ja glykosyylitrans-feraasi-IV-mutaatio suoritetaan samassa kannassa (kaksin-• 30 kertainen mutantti), saadaan ei-asetyloitua polytrimeeria.
1 Muut ksantaanireaktiotiehen vaikuttavat mutaatiot ja mutaa- tioyhdistelmat ovat mahdollisia ja tuottavat uusia tuottei-ta.
Mutantteja voidaan kasvattaa sellaisissa tunnetuis-35 sa olosuhteissa, joissa villia Xanthomonas-tyyppia kasva- 8 92719 tetaan. Niitå voidaan kasvattaa esimerkiksi sopivilla assi-miloituvilla hiililåhteilla, joista esimerkkeja ovat glu-koosi, sakkaroosi, maltoosi, tårkkelys, inverttisokeri, kompleksiset hiilihydraatit, kuten melassi tai maissisii-5 rappi, erilaiset orgaaniset hapot ym. Voidaan myos kåyttåa hiililåhteiden seoksia. Hiililåhteen konsentraatio on usein noin 10 - 60 g/1. Kasvun kannalta vålttamattomiå ovat myos orgaanisen tai epaorgaanisen typen låhteet, joiden maåra on tava] lisesti noin 0,1 - 1,0 g/1, ja mineraalit, joiden va-10 linta on alalla tunnettu. Esimerkkeja sopivista typen lah-teistå ovat ammoniumsuolat, nitraatti, urea, hiivauute, peptoni tai muut hydrolysoidut proteiiniainekset tai nåiden seokset. Esimerkkeja sopivista mineraaleista ovat fosfori, rikki, kalium, natrium, rauta, magnesium; nama lisataan 15 usein yhdessa kelatointiaineen, kuten EDTA:n tai sitruuna-hapon kanssa.
Xanthomonasin kasvun kannalta optimaalinen låmpotila on noin 18 - 35 °C edullisesti noin 28 - 32 °C. Xantho-monassoluja kasvatetaan aerobisesti lisaamalla ilmaa tai 20 happea sellainen maara, ettå liuokseen liuenneen hapen taso pysyy sopivana, esimerkiksi yli noin 10 % kyllastystasosta. Edullisesti taso pidetaan yli noin 20 % kyllastystasosta. pHarvo pidetaan noin 6,0 - 8,0:ssa, edullisesti noin 6,5 -7,5: ssa.
25 Keksinnon mukainen polysakkaridipolymeeri voidaan ottaa talteen fermentointiliemesta sopivin keinoin. Saos-tamalla isopropanolilla, etanolilla tai muulla sopivalla alkoholilla saadaan polytrimeerikumi helposti talteen. Al-koholia lisataan yleenså konsentraatioon noin 50 - 75 tila-30 vuus-%, edullisesti kaliumkloridin, natriumkloridin tai muun suolan låsnåollessa. Vaihtoehtoisesti polymeeri voidaan saada talteen liemesta ultrasuodattamalla.
Suoritettaessa polytrimeerikumin kemiallisia analyy-sejå glukoosi:mannoosisuhteen maarittamiseksi havaitaan 35 poikkeamia teoreettisesta arvosta 2:1. Samantyyppinen poik-
II
9271 9 9 keama havaitaan analysoitaessa ksantaanikumia. Glukoosi:-mannoosisuhteen mitattu arvo on yleenså noin 1,4:1 - noin 2,4:1 edullisesti suhde on 1,7:1 - 2,1:1.
Polysakkaridipolymeerin mannoosiryhmien asetyloin-5 titaso vaihtelee. Keksinnon suojapiirin ulkopuolelle ei-mybskåån joudu sellaisen mikro-organismin kaytto, joka ei-pysty asetyloimaan mannoosiryhmåå, kuten asetylaasivaja-vaiset mutantit. Tållaisessa tapauksessa polysakkaridipo-lymeerissa ei ole asetyloituja mannoosiryhmiå.
10 Polytrimeerin konsentraatio fermentointiliemesså ontyypillisesti noin 0,1 % (paino/paino). Fermentointiolo-suhteiden tavanomaista kokeilua ja klassisia ja rekombi-nantti-DNA-tekniikkoja kannan parantamiseksi, jotka kaikki ovat alalia tunnettuja, voidaan kåyttåå saannon parantami-15 seksi.
Vesivåliaineen viskositeetin kohottajana polytri-meeri samoina painoprosentteina on ksantaanikumia parempi. Polytrimeeriliuosten viskositeetti sSilyy korkean låmpoti-lan ja/tai korkean suolapitoisuuden olosuhteissa. Tållaisia 20 liuoksia voidaan valmistaa mielivaltaisen våkevyisinå, edullisesti noin 0,01 - noin 15-%:sina, liuottamalla poly-sakkaridipolymeeri vesivåliaineeseen. Keksinn6n mukainen tuote soveltuu ihanteellisesti toisen asteen 51jyntuotan-. toon. Samat alalia hyvin tunnetut menetelmSt, joissa ksan- 25 taanikumia kåytetåan toisen asteen oljyntuotannossa, sopi-vat polysakkaridipolymeeria kSytettaesså. Katso esim. Lind-blom, G.P. et al., US-patenttijulkaisu 3 198 268. Liikku- ' vuutta såatåviå liuoksia kåytettåviksi tehostetussa 61jyntuotannossa voidaan valmistaa polysakkaridipolymeerista.
.. 30 Tållaisten liikkuvuutta sååtåvien liuostenpolysakkaridipo- lymeerikonsentraatio on sopivasti noin 100 - noin 3000 ppm. Oljyn saannon parantamiseksi voidaan nåisså liuoksissa tai niiden yhteydesså kayttåå my6s muita tunnettuja lisåainei-ta. Tållaisia lisåaineita ovat esimerkiksipinta-aktiiviset 35 ja alkaliset aineet.
10 92719
Polysakkaridipolymeeria voidaan samoin kuin ksantaa-nikumia kåyttaa myos paksunnosaineena elintarvikkeissa, kosmeettisissa ja lååkekoostumuksissa, paperin tårkkinå, porausnesteisså, painomusteissa ym. Lisaksi sitå voidaan 5 kåyttaa kitkan våhentåmiseen nestevirtausputkissa.
Seuraavat esimerkit on tarkoitettu keksinnon valai-semiseksi, eivåtka ne rajoita keksintoå.
Esimerkki 1 Tåmå esimerkki osoittaa, miten keksinnon mukainen-10 tuote voidaan valmistaa in vitro, ja etta tuote on ksan— taanireaktiotien katkaisulla saatu tuote.
Lysaattien valmistus
Xanthomonas campestris B-1459 S4-L saatiin laitok-sesta Northern Regional Research Laboratories of the U.S. 15 Department of Agriculture. Bakteereja kasvatettiin hiiva-mallaselatusaineessa, johon oli lisåtty 2 % (paino/tila-vuus) glukoosia, jonka Jeanes, A. et al. (U.S. Department of Agriculture, ARS-NC-51, s. 14 (1976)) ovat kuvanneet. Viljelmia kasvatettiin myohåiseen log-vaiheeseen asti 30°C: 20 ssa kierrosluvulla 300 r/min. Solujen tiitteri mååritettiin hiiva-mallas-glukoosi (2 %)-elatusaineella 30 °C:ssa. Solut otettiin talteen linkoamalla ja pestiin kylmållå tris-HClrllå (70 mM, pH 8,2). Pestyt solut suspendoitiin uudel-leen tris-HCl:åån (70 mM, pH 8,2), joka sisålsi 10 mM EDTA, 25 ja suspensiota kåsiteltiin Garcian, R.C. et al. (European Journal of Biochemistry 43, 93-105 (1974)) esittåmållå ta-valla jåådyttåmållå ja sulattamalla kolme kertaa. Tåmå kå-sittely aiheutti solujen repeåmisen, kuten suspension vis-kositeetin kasvu ja elåvien solujen tåydellinen puuttuminen 30 (yksi elåvå solu 106 solua kohti) tåmån kåsittelyn jålkeen osoitti. Jåådytys-sulatus-kåsitellyt lysaatit jaettiin måå-råosiin ja jåådytettiin -80 °C:ssa. Proteiinikonsentraatio mååritettiin BIO RAD-kokeella (BIO RAD-Laboratories, Richmond, California) ja sen todettiin olevan 5 - 7 mg solupro-35 teiinia lysaatin ml:aa kohti.
li 9271 9 11
Biosvnteettinert maaritvsmenetelma
Kuten Ielpi, L., Couso, R.O. ja Dankert, M.A. (FEBS-Letters, 130, 253-256 (981)) kuvasivat, mååraosa jåadytet-tya-sulatettua lysaattia (vastaten 300-400 μg proteiinia), 5 DNAasia I (10 μq/ml) ja MgCl2 (8 mM) esi-inkuboitiin 20 °C:ssa 20 minuuttia. Yhta suuri tilavuusmååra 70 mM tris-HClraå, pH 8,2, ja haluttuja radiomerkittyjå sokerinukle-otideja (UDP-glukoosi ja GDP-mannoosi) UDP-glukuronihapon kanssa tai ilman lisattiin ja inkuboitiin 20°C:ssa. Reakti-10 ot keskeytettiin eri ajankohtina lisaamålla 4 mM EDTArta. Nåytteet lingottiin ja pelletit pestiin 2 kertaa puskuril-la. Paallå olevat nesteet yhdistettiin, lisattiin kantaja-ksantaania (100 μq) ja ksantaani sekå syntetisoitu polymee-ri saostettiin etanoli (60 %)-KCl (0,8 %) seoksella. Saos-15 tunut polymeeri suspendoitiin uudelleen veteen ja saostettiin viela 2 kertaa liittymattoman merkkiaineen poistami-seksi. Kumifraktioon sisaltyva radioaktiivisuus måaritet-tiin nestetuikelaskimella ja tuloksia kasiteltiin merkitty-jen sokerien liittymisen saamiseksi pmooleina.
20 Taulukko 1
Merkittyjen sokerien liittaminen jåadytys-sulatus-menetelmalla X. campestris B-1459 S4-L-kannasta valmiste-tulla solulysaatilla 25 Inkubaatioseos Kumifraktio (pmol) [3H]man [14C]glc glc/man +UDPG, GDPM 98 201 2,1 +UDPG, GDPM, UDP-GA 1540 1562 1,0 dpm/pmol -¾ = 442 30 ,4C = 37,5 92719 12 UDPG = UDP-glukoosi glc = glukoosi GDPM = GDP-mannoosi man = mannoosi UDP-GA = UDP-glukuronihappo dpm = hajoaminen/minuutti 5 pmol = pikomooli B-1459 S4-L:n solulysaattia inkuboitiin 20 °C:ssa 30 mi-nuuttia ja kåsiteltiin sitten tekstisså kuvatulla tavalla. Glukoosi:mannoosimoolisuhde on liittyneen hiili-14:n suhde 10 tritium-merkittyihin sokereihin kumifraktioissa. Kaikkien kolmen sokerirakenneosan låsnåollessa glukoosi: mannoosi suhde oli ksantaanikumille odotettu 1,0:1. Kun UDP-glukuroni-happoa ei ollut låsnå, suhde oli 2,1:1 (katso taulukko 1). Tåmå suhde on sen olettamuksen mukainen, ettå polysakkari-15 dipolymeeri muodostuu trimeeriyksikoistå, jotka ovat ksan- taanikumin biosynteesitien vålituotteita.
Pulssi-jahtikoe in vitro osoitti, ettå lipidiin liittynyt sellobioosi (glukoosidimeeri) muuttui prosessissa lipidiin liittyneeksi trimeeriksi (glukoosi-glukoosi-man-20 noosi) ja sitten polytrimeerikumiksi. Kannan B1459 S4-L jåådytyssulatuslysaatti valmistettiin edellå kuvatulla tavalla. Lysaattiin lisåttiin UDP-[I4C]glukoosia, joka sisålsi "pulssin" ja radiomerkitty sellobioosi kertyi lipidikanta-jalle 13 minuutin inkubaation aikana. "Jahti" kåsitti mer-25 kitsemåttomån UDP-glukoosin sekå GDP-[3H]mannoosin 100-ker-taisen ylimåårån lisååmisen. Lysaatin ja sokerinukleotidien inkubaatioseoksen mååråosia otettiin eri ajankohtina ja kåsiteltiin orgaanisen uutteen (lipidikantajaan sidottu fraktio) ja vesipitoisen fraktion (sisåltåå kumin) tuotta-30 miseksi. Orgaanisen uutteen oligosakkaridit erotettiin li-pidikantajasta happohydrolyysillå, defosforyloitiin, erotettiin ohutkerroskroroatografialla, poistettiin kromato-grammeista, ja niiden radiomerkkiaine mååritettiin. Tulok-set nåhdåån taulukossa 2.
Il : 9271 9 13
Taulukko 2 UDP-[14C]glukoosin "kohtalo" B1459 S4-L:n soluly-saatilla suoritetussa pulssi-jahtikokeessa in vitro 5 Pulssi (12 min) 9 pmol Lipidi-sidottu sellobioosi Jahti (4 min) 1 pmol Lipidi-sidottu sellobioosi 10 pmol Lipidi-sidottu trimeeri Jahti (16 min) 0,5 pmol Lipidi-sidottu sellobioosi 6 pmol Lipidi-sidottu trimeeri 10 3 pmol Liukoinen polytrimeeri
Jahti (48 min) 0,2 pmol Lipidi-sidottu sellobioosi 0,4 pmol Lipidi-sidottu trimeeri 10 pmol Liukoinen polytrimeeri
Koeolosuhteet ja orgaanisen fraktion ja liukoisen 15 kumifraktion kasittely on kuvattu esimerkin 1 tekstissa.
Merkitty glukoosi UDP-[l4C]glukoosista liittyi, kuten taulukosta 2 voidaan nahda, vålittomasti "pulssissa" lipi-disidottuun sellobioosiin. Lisattaessa GDP-mannoosia ja ylimaarin UDP-glukoosia (jahti) merkitty sellobioosi muut-20 tui nopeasti merkityksi lipidiin sidotuksi trimeeriksi, joka myohemmin havaittiin polytrimeerikumina vesifraktiossa noin 16 minuuttia jahdin alkamisesta. Tama osoittaa UDP-glukoosin, lipidisidotun sellobioosin, lipidisidotun tri-meerin ja polytrimeerikumin prekursorituotesuhteen ja nii-25 den suhteen ksantaanireaktiotiehen.
Esimerkki 2
Tama esimerkki osoittaa glukoosin ja mannoosin moo-lisuhteen polytrimeerikumissa, jonka syntetisointiin in vitro kaytettiin glykosyyli-transferaasi IV:aa sisaltama-. · 3 0 tonta mutanttia.
Lysaatin valmistus on kuvattu edellå esimerkissa 1. Lysaatin valmistuksessa kåytetty kanta oli ATCC nro 53195. Lysaattiin lisattiin joko l, 2 tai 3 nukleotidikuormitettua sokeria, so UDP-[ 14C]-glukoosia yksinaan, UDP-[l4C]glukoosia 35 ja GDP-[3H]mannoosia tai UDP- [14C]glukoosia, GDP- [3H]mannoo- 14 92719 sia ja ilxnan merkintaainetta olevaa UDP-glukuronihappoa. 30 minuuttia sokerisubstraattien lisåaxnisesta vesipitoista-fraktiota kasiteltiin ja se analysoitiin siten kuin esimer-kissa 1 kuvattiin. Tulokset nahdåan taulukossa 3. Kun inku-5 baatioseoksessa oli kaksi sokerisubstraattia, UDP-glukoosi ja GDP-mannoosi, kumin glukoosi:mannoosimoolisuhteeksi saa- tiin 2,4:1. Kun kaikkia kolmea sokerisubstraattia inkuboi- tiin yhdesså lysaatin kanssa, tuloksena olevassa kumissa glukoosi:mannoosimoolisuhde oli 2,3:1.
10 Taulukko 3
Merkittyjen sokerien liittaminen polytrimeerikumiin jaådytys-sulatus-menetelmallM ATCC nro 53195-kannas-ta valmistetulla solulysaatilla 15 Reaktioseos Kumifraktio (pmol) [3H]man [l4C]glc glc/man +2 UDPG, GDPM 71 174 2,4 +3 UDPG, GDPM, UDP-GA 65 152 2,3 dpm/pmol 3H = 340 20 14C = 40
Lyhenteet on selitetty taulukon 1 selityksessa.
ATCC nro 53195:n solulysaatteja inkuboitiin ilmoi-tetuissa reaktioseoksissa 20 °C:ssa 30 minuuttia ja seoksia 25 kasiteltiin sitten kumifraktioiden saamiseksi siten kuin esimerkissa 1 kuvattiin. Ilmoitettu glukoosi:mannoosi-moo-lisuhde on liittyneen hiili-14:n suhde tritiummerkittyyn sokeriin pmooleina kasitellyissa fraktioissa.
UDP-glukuronihapon låsnaolo ei vaikuta lainkaan po-30 lysakkaridipolymeeriin sisåltyvån glukoosin ja mannoosin suhteeseen, kun kaytetty soluvapaa lysaatti on saatu glyko-transferaasi IV:åa sisaltamåttomasta mutantista. Mutantti-lysaatin biokemiallinen fenotyyppi sita inkuboitaessakaik- il 92719 15 kien kolmen sokerin kanssa on analoginen villityyppisen lysaatin biokemiallisen fenotyypin kanssa, kun sita inku-boidaan vain kahden sokerisubstraatin kanssa, siina suh-teessa, ettå in vitro tuotetuissa kumeissa on kummassakin 5 tapauksessa glukoosi- ja mannoosiosien inoolisuhde noin 2:1.
Esimerkki 3 Tåmå esimerkki osoittaa, etta trimeerivålituotteel-la, joka polymeroidaan polytrimeeriksi, on sama anomeerinen konfiguraatio kuin sokereilla ksantaanikuroissa. Lisaksi se 10 osoittaa, ettå trimeerin mannoosi on liittynyt sellobioosin ei-pelkiståvåån glukoosiin lipidisidotussa vålituotteessa. Esimerkisså 1 kuvatulla tavalla in vitro syntetisoituja ja kaksoismerkittyjå trimeerisiå oligosakkarideja kåsiteltiin yksittåin tai sarjassa alfa-mannosidaasilla (EC 3.2.1.24) 15 ja beeta-glukosidaasilla (EC 3.2.1.21). Alfamannosidaasi hydrolysoi alfa-l-sidoksella liittyneen terminaalisen, sub-stituoimattoman mannoosiryhraån. Beeta-glukosidaasi hydrolysoi beeta-l-sidoksella liittyneen terminaalisen, substi-tuoimattoman D-glukosyyliryhroån.
20 Trimeeri poistettiin lipidista ja defosforyloitiin.
Sitten se deasetyloitiin kåsittelemållå emåksellå esim. pH-arvossa 12 2 - 3 tuntia, koska alfa-mannosidaasi ei pysty tunnistamaan asetyloituja mannoosiryhmia.
. Tulokset olivat seuraavat: Kasittely beeta-glukosi- t 1 25 daasilla jatti trimeerisen oligosakkaridin muuttumattomak-si. Kun trimeerista oligosakkaridia kåsiteltiin alfa-mannosidaasilla, muodostui sellobioosia ja mannoosia. Kun tri- . meeristå oligosakkaridia kåsiteltiin ensin alfa-mannosidaasilla ja sitten beeta-glukosidaasilla, muodostui glukoosia •*30 ja mannoosia. Tulokset vahvistavat, ettå mannoosi on liit-* tynyt ei-pelkiståvåån glukoosiin alfa-sidoksella trimeeri- sesså vålituotteessa ja ettå glukoosiosat ovat liittyneet beeta-sidoksella. Tåmå vahvistaa sen, ettå trimeeri on nor-maalin ksantaanientsyymireaktiotien vålituote.
• 9271 9 16
Esimerkki 4
Tama esimerkki esittaa mutageneesi- ja seulonta-menetelmia, joita kaytettiin sellaisten mutanttikantojen synnyttåmiseen, joilta puuttuu ksantaanikumin valmistuskyky 5 johtuen glykosyylitransferaasi IV:a tuottavan geenin vial-lisuudesta.
Xanthomonas campestris-organismia, joka on geneet-tisesti kromosomiresistentti streptomysiinille, kaytettiin vastaanottajana konjugaatiossa plasmidin pRK2013: TnlO si-10 saltavan E.coli LE392:n kanssa. Plasmidi pRK2013 sisaltaa Tn903:n, joka koodaa kanamysiiniresistenssia (Figurski, D.H. ja Helinski, D.R., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 76, 1648-1652 (1979)), ja plasmidi ei voi replikoida Xantho- monasissa (Ditta, G. et al., supra). Transposoni TnlO koo-15 daa resistenssia tetrasykliinille. Valittiin transkonju-gaatteja, jotka olivat resistentteja streptomysiinille ja kanamysiinille tai streptomysiinille ja tetrasykliinille. Edellisten esiintymistiheys oli noin 4 x 10"6 /vastaanottaja ja ne johtuivat oletettavasti Tn903:n transpositiosta. Vii-20 meksimainittujen esiintymistiheys oli noin 3 x lO^/vas- taanottaja ja ne johtuivat oletettavasti Tnl0:n transpositiosta Xanthomonas campestrisin genomiin.
Naiden transkonjuganttien joukosta loytyi noin 2 % auksotrofeja; niiden tarpeet olivat laajalti jakautuneina 25 eri ravinnevaatimusten joukossa. Tama osoittaa, etta trans-posoneilla ei ole mitaan erityista etusijalle asetettavaa insertiokohtaa Xanthomonasissa. Valittiin auksotrofien pro-totrofisia revertantteja, joista useimmat todettiin laake-herkiksi; tama nayttaa osoittavan, ettå auksotrofit aiheu-30 tuivat transposoni-insertiosta.
" Ksantaanikumia tuottamattomien mutanttien seulomi- seksi kaksinkertaisesti resistenttien transkonjuganttien joukosta kiinteisiin elatusaineisiin lisattiin kongopunais-ta, joka variaine korostaa ksantaanikumia tuottavien ja 35 ei-tuottavien pesåkkeiden morfologista eroa. Pesåkkeiden 17 92719 morfologiaa tutkittiin 7-12 vrk inkuboinnin jalkeen 30 -°C:ssa. Ksantaanikumia tuottamattomien mutanttien esiinty-mistiheys oli noin 10^.
Glykotransferaasi IV-mutanttien identifioimiseksi 5 ksantaanikumia tuottaroattomien mutanttien joukosta valmis-tettiin kustakin jåådytys-sulatus-lysaatti. Lisåttiin ra-diomerkittyå UDP-glukoosia ja GDP-mannoosia sekå osaan naytteita UDP-glukuronihappoa. Halutut mutantit valmistivat kumia, jonka glukoosi:mannoosisuhde oli noin 2:1, riippu-10 matta UDP-glukuronihapon låsnåolosta. Tata kuvausta vastaa-via mutantteja loytyi useita. Niissa on TnlO:sta johtuvia vaurioita. Myos Tn903:n indusoimat mutantit todettiin ole-van tata fenotyyppiå. Lisåksi on eristetty nitrosogu-anidiinilla indusoituja mutantteja, joiden fenotyyppi on 15 sama.
Esimerkki 5
Tamå esimerkki kuvaa glykotransferaasi IV-vajaan mu-tantin kayttoa polytrimeerikumin tuottamiseen in vivo.
In vivo syntetisoitujen kumien valmistamiseksi vil-20 lityyppista NRRL B-1459 S4-L mikro-organismia ja esimerkin 4 glykotransferaasi IV-vajaata mutanttia (ATCC nro 53195) viljeltiin kumpaakin aerobisesti 5 litran fermenttorissa 28 - 32 °C:ssa pH-arvossa, joka pidettiin 6,0 - 8,0:na. Kay-tettiin minimielatusainetta, joka sisålsi 10 g/1 kaliumfos-25 faattia, 1,43 g/1 ammoniumsulfaattia, 2 g/1 sitruunahappoa, 30 g/1 glukoosia ja hivenalkuaineita. 145 tunnin kuluttua kumit otettiin talteen ja puhdistettiin. Solut poistettiin -linkoamalla ja kumit saostettiin liemestå lisååmållå iso-propanolia (55 vol/vol-%) ja natriumkloridia (0,5 p/vol-%).
30 Saostuneet aineet koottiin suodattamalla ja liuotettiin veteen. Kumit saostettiin uudelleen isopropanolilla (55 vol/vol-%) ilman suolaa ja liuotettiin jålleen veteen. Val-misteet dialysoitiin vettå vastaan 3 vuorokauden ajan kåyt-tåen membraanidialyylisputkea, jonka rajakohta oli molekyy-35 lipaino 12 000.
18 92719
Glukoosi:mannoosisuhteet maaritettiin hydrolysoimal-la hapon avulla polysakkaridipolymeerit tåydellisesti ja analysoimalla sitten suurisuorituskykyisellå nestekromato-grafialla (HPLC), ja suhteiden todettiin vastaavan in vitro 5 syntetisoitujen polymeerien vastaavia suhteita. Glykosyyli-transferaasi IV-vajaa mutantti ATCC nro 53195 valxnisti ku-mia, jossa glukoosi:mannoosisuhde oli noin 2,15:1, kun sen-sijaan villintyyppinen organismi valmisti kuxnia, jossa tåma suhde oli noin 0,96:1.
10 Muista in vivo tuotetuista polytrimeerikuminSytteis- ta tehtiin happohydrolyysin jålkeen sokerianalyysit HPLC: 11a tai entsymaattisesti. 24 suoritetussa analyysisså glu-koosi :mannoosiinoo li suhde vaihteli valilla 1,43:1 - 2,44:1. Glykosyylitransferaasi IV-va jaalla mutanttikanna 11a valmis-15 tetuissa polytrimeereissa keskimaaråinen suhde oli 1,90 ± 0,15:1.
In vivo tuotetuissa polytrimeereissa osoitettiin myos HPLC-analyyseilla havaittavissa olevissa rajoissa: 1-glukuronihapon puuttuminen; 2 - pyruvaatin puuttuminen; 3-20 asetaatin lasnaolo; 4 - muiden sokerien kuin glukoosin ja mannoosin puuttuminen.
Esimerkki 6
Tama osoittaa, etta polytrimeerilla saadaan vesili-uoksia, joiden reologiset ominaisuudet ovat paremmat kuin 25 ksantaanikumin ominaisuudet laajalla lampotila- ja epSor-gaanisen suolan konsentraatioalueella.
Valmistettiin polytrimeerikumin (syntetisoitu esi-merkin 5 mukaisesti) ja ksantaanikumin (puhdistettu Pfizer Flocon 4800) 1000 ppm sisaltavia liuoksia veteen, joka si-30 salsi 10 paino-% natriumkloridia. Polytrimeerikumilla on olennaisesti suurempi viskositeetti kuin ksantaanikumilla laajalla leikkausnopeuden alueella (kuvio 2).
Polytrimeerikumin ja ksantaanikumin viskositeettien suhde huoneen lampotilassa vaihtelee veden suolapitoisuu-35 desta riippuen ja on 2 - 2,5 NaCl-paino-%-alueella 0-20 : % (kuvio 3). Polytrimeerin viskositeetin ja ksantaanikumin 19 9271 9 viskositeetin suhde vaihtelee myos polymeerikonsentraatios-ta riippuen (kuvio 4). Lopuksi, polytrimeerin viskositeetin paremmuus ksantaanikuinin viskositeettiin nåhden kasvaa låmpotilan kohotessa 25 °C:sta 75 °C:seen ja veden NaCl-5 paino-%:n kasvaessa 0:sta 20 %:iin (kuvio 5).
Claims (14)
1. Vesiliukoinen polysakkaridipolymeeri, t u n -n e t t u siitå, ettå se ei sisallå lainkaan glukuronihap-5 poryhmiå, se koostuu D-glukoosista ja D-mannoosista suh-teessa noin 2:1, jolloin D-glukoosiryhmåt ovat liittyneet toisiinsa beeta-[1,4]-konfiguraatiossa ja D-mannoosiryhmåt alfa-[l,3]-konfiguraatiossa yleenså joka toiseen glukoosi-ryhmåån.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polysakkaridipo- lymeeri, tunnettu siitå, ettå polysakkaridipoly-meerin mannoosiryhmien 6-0-asemat ovat asetyloituja.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polysakkaridipolymeeri, tunnettu siitå, ettå polysakkaridipoly- 15 meerin mannoosiryhmien 6-0-asemat eivåt ole asetyloituja.
4. Menetelmå patenttivaatimuksen 1 mukaisen polysak-karidipolymeerin valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå siirrostetaan sopivaan kasvualustaan sukuun Xantho-monas kuuluvaa mikro-organismia, kuten X. campestris ATCC 20 53195 tai 53196, joka ei pysty sisållyttåmåån glukuronihap- poa polysakkaridipolymeeri in, ja siirrostettua kasvualustaa inkuboidaan sopivassa låmpotilassa ja sopivassa liuenneen hapen pitoisuudessa polysakkaridipolymeerin muodostamisek-si.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmå, tun nettu siitå, ettå polysakkaridipolymeeri otetaan tal-teen kasvualustasta saostamalla tai ultrasuodattamalla.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå mikro-organismi kuuluu lajiin
30 Xanthomonas campestris.
‘ 7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmå, tun nettu siitå, ettå mikro-organismi on glykosyylitrans-feraasi IV-vajaa Xanthomonas-mutantti.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmå, t u n- 35. e t t u siitå, ettå mikro-organismi on UDP-glukoronihap-povajaa Xanthomonas-mutantti. 9271 9
9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmå, tunnet t u siitå, ettå raikro-organismi on ATCC nro 53195 Xanthomonas campestris NRRL B-1459 S4-L:n transferaasi IV-mutantti.
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå mikro-organismi on ATCC nro 5-3196, Xanthomonas campestris NRRL B-1459 S4-L:n UDP-gluku-ronihappomutantti.
11. Mikrobiologisesti puhdas Xanthomonas-viljelmå, 10 tunnettu siita, etta se on X. campestris, jolla on ATCC:n talletus nro 53195 tai sen jålkelåinen.
12. Mikrobiologisesti puhdas Xanthomonas-viljelmå, tunnettu siitå, ettå se on X. campestris, jolla on ATCC:n talletus nro 53196 tai sen jålkelainen.
13. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen polysakkaridipo- lymeerin kåytto vesipitoisen våliaineen viskositeetin ko-hottamiseksi, edullisesti konsentraationa yli noin 0,001 paino-% ja erityisesti konsentraationa yli noin 1 pai-no-%.
14. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen polysakkaridipo- lymeerin kåytto ol jyn talteenottamiseksi oljyå sisåltåvåstå maanalaisesta muodostumasta, edullisesti konsentraationa yli noin 0,001 paino-% ja erityisesti konsentraationa yli noin 1 paino-%. 92719
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76287885 | 1985-08-06 | ||
| US06/762,878 US4713449A (en) | 1985-08-06 | 1985-08-06 | Polysaccharide polymer made by xanthomonas |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI863213A0 FI863213A0 (fi) | 1986-08-06 |
| FI863213A FI863213A (fi) | 1987-02-07 |
| FI92719B FI92719B (fi) | 1994-09-15 |
| FI92719C true FI92719C (fi) | 1994-12-27 |
Family
ID=25066264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI863213A FI92719C (fi) | 1985-08-06 | 1986-08-06 | Xanthomonas-bakteerin valmistama polysakkaridipolymeeri |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4713449A (fi) |
| EP (1) | EP0211288B1 (fi) |
| JP (2) | JP2520881B2 (fi) |
| AT (1) | ATE81672T1 (fi) |
| CA (1) | CA1247033A (fi) |
| DE (1) | DE3686986T2 (fi) |
| DK (1) | DK174575B1 (fi) |
| FI (1) | FI92719C (fi) |
| NO (1) | NO170858C (fi) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4868293A (en) * | 1985-08-06 | 1989-09-19 | Getty Scientific Development Company | Polysaccharide polymer made by xanthomonas |
| US5102561A (en) * | 1985-08-06 | 1992-04-07 | Getty Scientific Development Company | Processes of thickening and of oil recovery using polysaccharide polymer made by xanthomonas |
| US5514791A (en) | 1986-03-26 | 1996-05-07 | Getty Scientific Development Company | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan based polysaccharide polymers |
| EP0380470B1 (en) * | 1986-03-24 | 1995-02-15 | Texaco Development Corporation | Process for the synthesis of sugar nucleotides using recombinant-dna methods |
| SG164261A1 (en) * | 1986-03-24 | 2010-09-29 | Texaco Development Corp | Family of xanthan-based polysaccharide polymers including non- acethylated and/or non-pyruvylated gum |
| US5559015A (en) * | 1986-03-26 | 1996-09-24 | Getty Scientific Development Company | Recombinant-DNA mediated production of xanthan gum |
| US4948733A (en) * | 1986-07-28 | 1990-08-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Zoogloea transformation using exopoly saccharide non-capsule producing strains |
| US5091376A (en) * | 1986-07-28 | 1992-02-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Non-capsule exopolysaccharide from Zoogloea ramigera |
| US5194386A (en) * | 1987-04-14 | 1993-03-16 | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | Xanthomonas campestris strain expressing xanthan gum |
| US5334520A (en) * | 1990-05-25 | 1994-08-02 | Center For Innovative Technology | Production of poly-beta-hydroxybutyrate in transformed escherichia coli |
| US5518907A (en) * | 1989-06-07 | 1996-05-21 | Center For Innovative Technology | Cloning and expression in Escherichia coli of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-beta-hydroxybutyrate biosynthetic pathway |
| US5015577A (en) * | 1989-08-29 | 1991-05-14 | Board Of Regents, The University Of Texas System | DNA encoding hyaluronate synthase |
| IT1245385B (it) * | 1991-03-28 | 1994-09-20 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione di polipeptidi maturi |
| CA2108895C (en) * | 1991-05-07 | 2002-07-09 | Daniel H. Doherty | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan based polysaccharide polymers |
| US5247995A (en) * | 1992-02-26 | 1993-09-28 | Bj Services Company | Method of dissolving organic filter cake obtained from polysaccharide based fluids used in production operations and completions of oil and gas wells |
| US5224544A (en) * | 1992-02-26 | 1993-07-06 | Bj Services Company | Enzyme complex used for breaking crosslinked cellulose based blocking gels at low to moderate temperatures |
| GB9301894D0 (en) * | 1993-01-30 | 1993-03-17 | Cerestar Holding Bv | Fermentation feedstock |
| US5591699A (en) * | 1993-02-24 | 1997-01-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Particle transport fluids thickened with acetylate free xanthan heteropolysaccharide biopolymer plus guar gum |
| ES2160792T3 (es) * | 1995-04-20 | 2001-11-16 | Clariant Finance Bvi Ltd | Suspensiones liquidas estables de colorantes al azufre y metodo para analizar las mismas. |
| US5881813A (en) * | 1996-11-06 | 1999-03-16 | Bj Services Company | Method for improved stimulation treatment |
| US6110875A (en) * | 1997-03-07 | 2000-08-29 | Bj Services Company | Methods and materials for degrading xanthan |
| US6138760A (en) * | 1998-12-07 | 2000-10-31 | Bj Services Company | Pre-treatment methods for polymer-containing fluids |
| US6818594B1 (en) | 1999-11-12 | 2004-11-16 | M-I L.L.C. | Method for the triggered release of polymer-degrading agents for oil field use |
| US6572755B2 (en) * | 2001-04-11 | 2003-06-03 | Speedfam-Ipec Corporation | Method and apparatus for electrochemically depositing a material onto a workpiece surface |
| JP2008019532A (ja) * | 2006-07-13 | 2008-01-31 | Ranka:Kk | 照明装置付き手袋 |
| KR101075557B1 (ko) * | 2008-12-03 | 2011-10-20 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물 |
| KR101255050B1 (ko) | 2009-07-14 | 2013-04-16 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 락토바실러스 플란타룸 및 이를 포함하는 조성물 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3054689A (en) * | 1959-12-30 | 1962-09-18 | Allene R Jeanes | Atypically salt-responsive alkali-deacetylated polysaccharide produced by xanthomonas campestris |
| US3020206A (en) * | 1960-05-23 | 1962-02-06 | Jersey Prod Res Co | Process for synthesizing polysaccharides |
| US3711462A (en) * | 1970-04-01 | 1973-01-16 | Mobil Oil | Method of clarifying polysaccharide solutions |
| US4517101A (en) * | 1983-08-22 | 1985-05-14 | David Williams | Reduced biodegradability in a polymer flood process |
-
1985
- 1985-08-06 US US06/762,878 patent/US4713449A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-15 CA CA000513834A patent/CA1247033A/en not_active Expired
- 1986-07-16 EP EP86109782A patent/EP0211288B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-16 AT AT86109782T patent/ATE81672T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-07-16 DE DE8686109782T patent/DE3686986T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-31 JP JP61178978A patent/JP2520881B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-04 NO NO863135A patent/NO170858C/no unknown
- 1986-08-05 DK DK198603721A patent/DK174575B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-06 FI FI863213A patent/FI92719C/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-12-27 JP JP7341723A patent/JP2746560B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0211288B1 (en) | 1992-10-21 |
| FI92719B (fi) | 1994-09-15 |
| NO863135D0 (no) | 1986-08-04 |
| JPH08239403A (ja) | 1996-09-17 |
| FI863213A (fi) | 1987-02-07 |
| ATE81672T1 (de) | 1992-11-15 |
| DE3686986D1 (de) | 1992-11-26 |
| JP2520881B2 (ja) | 1996-07-31 |
| JPS6284102A (ja) | 1987-04-17 |
| NO863135L (no) | 1987-02-09 |
| CA1247033A (en) | 1988-12-20 |
| DK372186A (da) | 1987-02-07 |
| DK174575B1 (da) | 2003-06-23 |
| EP0211288A2 (en) | 1987-02-25 |
| NO170858B (no) | 1992-09-07 |
| DE3686986T2 (de) | 1993-03-04 |
| DK372186D0 (da) | 1986-08-05 |
| EP0211288A3 (en) | 1987-09-30 |
| US4713449A (en) | 1987-12-15 |
| FI863213A0 (fi) | 1986-08-06 |
| JP2746560B2 (ja) | 1998-05-06 |
| NO170858C (no) | 1992-12-16 |
| CA1264537C (fi) | 1990-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI92719C (fi) | Xanthomonas-bakteerin valmistama polysakkaridipolymeeri | |
| EP0127698B1 (en) | Acidic heteropolysaccharide am-2, a process for the production thereof, uses thereof and acetobacter mh-1597 (ferm bp-280) | |
| US5175278A (en) | Heteropolysaccharide S-657 | |
| EP0079038B1 (en) | Highly viscous polysaccharides and process for the preparation of said polysaccharides | |
| US6316614B1 (en) | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan based polysaccharide polymers | |
| US4996153A (en) | Heat-stable, salt-tolerant microbial xanthanase | |
| EP0323952B1 (en) | Family of xanthan-based polysaccharide polymers including non-acetylated and/or non-pyruvylated gum and acetylated or non-acetylated polytetramer gum | |
| CA1318621C (en) | Heteropolysaccharide s-657 | |
| US4868293A (en) | Polysaccharide polymer made by xanthomonas | |
| US4886746A (en) | Heat-stable, salt-tolerant microbial xanthanase | |
| EP0584206B1 (en) | Genetic control of acetylation of xanthan based polysaccharide polymers | |
| EP0066961B1 (en) | Production of xanthan having a low pyruvate content | |
| US5102561A (en) | Processes of thickening and of oil recovery using polysaccharide polymer made by xanthomonas | |
| US4647657A (en) | Heteropolysaccharide - NW-01 | |
| JP3560968B2 (ja) | キサンタンガムのアセチル化及びピルビル化の遺伝子調節 | |
| CA1279180C (en) | Process utilizing a polysaccharide polymer | |
| CA1264537A (en) | Process utilizing a polysaccharide polymer | |
| US4016085A (en) | Production of heteropolysaccharide by fermentation of methanol | |
| US3932218A (en) | Production of heteropolysaccharide by fermentation of methanol | |
| BACI'ERIAL DEGRADATION | MC CADMUS and ME SLODKI Northern Reglonal Research Center, Agrlcultural Research Servlce, US Department of Agriculture, 1815 N. University St., Peoria, IL 61604 (USA) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: MONSANTO COMPANY |
|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MONSANTO COMPANY |