DK174575B1 - Polysaccharid, fremgangsmåde til fremstilling deraf og mikroorganisme til brug ved udøvelse af fremgangsmåden samt fremgangsmåder til forøgelse af viskositeten af et vandigt medium og til udvinding af olie fra en olieførende underjordisk formation - Google Patents

Description

DK 174575 B1 5 Opfindelsen angår et hidtil ukendt polysaccharid, en fremgangsmåde til fremstilling deraf og en mikroorganisme til brug ved udøvelse af fremgangsmåden. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til forøgelse af viskositeten af et vandigt medium og en fremgangsmåde til udvinding af olie fra en olieførende underjordisk formation.

10 OPFINDELSENS BAGGRUND

Xanthangummi produceres af bakterier tilhørende slægten Xanthomonas, såsom arterne X. campestris, albilineans, fragaria, vesicatoria og lignende. Xanthangummi er et udbredt anvendt produkt på grund af dens usædvanlige fysiske egenskaber: Yderst høj specifik viskositet og pseudoplasticitet. Den 15 er almindeligt anvendt i fødevarer som fortykningsmiddel og inden for sekundær olieudvinding som mobilitetskontrol- og profilmodificeringsmidler og i jordolieborevaesker.

Kemisk er xanthangummi et anionisk heteropolysaccharid. Den gentagne enhed i polymeren er en pentamer sammensat af fem sukkerdele: to gfuco-20 se-, en glucuronsyre- og to mannose-dele. De er anordnet således, at gluco-sedelene danner rygraden i polymerkæden, og sidekæder af mannose-glucuronsyre-mannose almindeligvis strækker sig ud fra alternerende gluco-sedele. Ofte er denne grundstruktur specifikt acetyleret og/eller pyruvyleret (Janson, P.E., Kenne, L, and Lindberg, B., Carbohydrate Research, 45, 275-25 282 (1975); Melton, L.D. Mindt, L., Rees, D.A., and Sanderson, G.R., Carbo hydrate Research, 46, 245-257 (1976)). Strukturen er afbildet nedenfor: DK 174575 B1 2 f“ “1 KØ *9 .

ψ \ ‘>C&· n,

Til trods for den brede anvendelighed af naturligt forekommende xanthan-gummi, er der nogle situationer, hvor dens fysiske egenskaber bliver be-10 grænsende. Især inden for sekundær olieudvinding er det ikke ualmindeligt, at temperaturen i det olieførende reservoir og saltkoncentrationerne i reservoirsaltvandet er højere, end det er optimalt for xanthanopløsninger. Når disse betingelser indtræffer, kan xanthan fælde ud, flokkulere og/eller tabe viskositet. Derfor er der et behov for nye viskositetsgivende produkter, som op-15 træder godt ved høj temperatur og høje saltkoncentrationer.

SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe et polysaccharid, som er en bedre viskositetsforøger af vand end naturligt forekommende xanthangummi, og som har forbedrede rheologiske egenskaber i forhold til naturligt forekom-20 mende xanthangummi ved forhøjet temperatur og/eller i nærvær af salte.

Endnu et formål for opfindelsen er at tilvejebringe en mikroorganisme med evne til at producere et sådant polysaccharid. Et yderligere formål for opfindelsen er at angive en fremgangsmåde til fremstilling af polysaccharidet ved aerob gæring af en mikroorganisme med evne til at producere dette.

25 I overensstemmelse med opfindelsen tilvejebringes et vandopløseiigt polysaccharid af xanthangummitypen, som er særegent ved, at det i det væsentlige ikke indeholder nogen glucuronsyredele i dets sidekæder og har et D- DK 174575 B1 3 glucose/D-mannose-forhold på omkring 2:1, idet D-glucose-delene er forbundet med hinanden i 3-[1,4]-konfiguration, og D-mannose-delene er forbundet med D-glucosedelene i a-[1,3]-konfiguration, almindeligvis til alternerende glucoseringe.

5 Fremgangsmåde ifølge opfindelsen til fremstilling af polysaccharidet er særegen ved, at et egnet dyrkningsmedium podes med mikroorganismen ATCC nr. 53195 eller ATCC nr. 53196, henholdsvis en glycosyltransferase-IV-deficient og en UDP-glucuronsyre-deficient mutant af Xanthomonas cam-pestris NRRL B-1459 S4-L, eller en fra en af disse to mikroorganismer afledt 10 mutant med i det væsentlige samme egenskaber, og at det podede dyrkningsmedium inkuberes ved en egnet temperatur og ved egnede opløste oxygenniveauer til dannelse af det ønskede produkt.

Mikroorganismen ifølge opfindelsen til brug ved udøvelse af den ovenstående fremgangsmåde er særegen ved, at den er mikroorganismen ATCC nr.

15 54195 eller ATCC nr. 53196.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til forøgelse af viskositeten af et vandigt medium er særegen ved, at et polysaccharid ifølge opfindelsen opløses i mediet i en egnet koncentration, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen til udvinding af olie fra en olieførende underjordisk formation er særegen ved, at 20 en opløsning indeholdende et polysaccharid ifølge opfindelsen injiceres i en brønd til udpresning af indfanget olie fra den porøse klippe, og at den udpressede olie opsamles.

Polysaccharidet ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at blokere et af trinnene i xanthangummi-biosyntesen. Derfor har polysaccharidet ifølge opfindel-25 sen i stedet for en 3-sukker-sidekæde ragende ud fra rygraden af β-[1,4]-D-glucose som i xanthangummi, en enkelt sukkerdel, almindeligvis forbundet med alternerende glucosedele i rygraden. Polysaccharidet ifølge opfindelsen betegnes i denne beskrivelse med krav som "polytrimer", fordi det består af en gentagen trimer-enhed, glucose-glucose-mannose. Dets struktur er vist 30 nedenfor, hvor n er antallet af gentagne enheder i polymeren.

DK 174575 B1 4

Hi. KO.

s V "

Som vist ved den ovenstående formel består polytrimeren af D-mannose forbundet a-[1,3] almindeligvis med alternerende dele af β-[1,4]-forbundet D-glucose. Som i xanthangummi kan 6-0-stillingen i mannose eventuelt være 10 esterificeret med en eddikesyredel som beskrevet i Sutherland, I.W., Carbohydrate Polymers, 1 107-115, (1981).

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE

Figur 1 afbilder den antagne reaktionsvej for xanthangummibiosyntese. Den er baseret på data fra flere laboratorier; se lelpi, L, Couso, R.O., and Dan-15 kert, M.A., Biochem. Biophys. Res. Comm., 102, 1400-1408 (1981), FEBS Letters, 130, 253-256 (1981), Biochem. Intern., 6, 323-333 (1983); Osborn, M.J. and Weiner, I.M., J. Biol. Chem., 243, 2631-2639 (1967); Troy, F.A.,

Annual Reviews of Microbiology, 33, 519-560 (1979). De anvendte forkortelser er: glu= glucose, gluA = glucuronsyre, man = mannose, glu-glu = cello-20 biose, P = phosphat, PP = pyrophosphat, C55 = isoprenoidt-lipid-bærer, PEP = phosphoenolpyruvat, AcCoA = acetylcoenzym A, 1-V = glycosyltransfera-ser, UDP = uridin-5’-diphosphat, GDP = guanosin-5’-diphosphat.

Figur 2 viser viskositeterne ved 25 °C af opløsninger af polytrimer og xanthangummi, hver ved 1000 ppm i 10 vægt-% NaCI-opløsning, som funktion af 25 forskydningshastigheden.

Figur 3 viser forholdet mellem viskositeterne af opløsninger indeholdende 1000 ppm polytrimer og 1000 ppm xanthangummi som funktion af saltholdighed ved 25 °C og en forskydningshastighed på 8,1 s'1.

DK 174575 B1 5

Figur 4 viser forholdet mellem viskositeterne af opløsninger af polytrimer og xanthangummi som funktion af polymerkoncentration i 10 vægt-% NaCI-opiøsning ved 25 °C og en forskydningshastighed på 8,1 s'1.

Figur 5 viser forholdet mellem viskositeterne af opløsninger af 1000 ppm po-5 lytrimer og 1000 ppm xanthangummi som funktion af temperaturen i saltopløsninger med varierende saltkoncentrationer ved en forskydningshastighed på 8,1 s'1.

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Polysaccharidet ifølge opfindelsen kan fremstilles med et cellefrit enzymsy-10 stem eller kan fremstilles ved dyrkning af celler af en passende mutantstamme. Andre midler til fremstilling af polysaccharidet er også beskrevet nedenfor.

Den grundlæggende fremgangsmåde med hensyn til anvendelsen af et cellefrit system til fremstilling af xanthangummi er beskrevet i lelpi, L., Couso, 15 R.O., og Dankert, M.A. (FEBS Letters, 130, 253-256, (1981)) og kan også anvendes til fremstilling af polysaccharidet ifølge opfindelsen. F.eks. kan vildtype Xanthomonas campestris celler lyseres ved en fryse-optønings-proces, og substraterne for polytrimersyntese, UDP-glucose og GDP-mannose, med eller uden acetyl-CoA, kan sættes til lysatet. Alternative midler til lyse kan 20 anvendes, herunder f.eks. ultralydbehandling, detergensbehandling, enzymbehandling og kombinationer deraf. Lysatet kan anvendes i dets rå form, eller der kan anvendes rensning af enzymerne. Enzymerne for xanthangummi-biosyntese-vejen forbinder kovalent glucose- og mannose-delene som i den normale reaktionsvej. Da enzymerne ikke har nogen UDP-glucuronsyre at 25 føje til de opstående kæder, er reaktionsvejen blokeret ved reaktion IV (se reaktionsvejen, figur 1), og mellemproduktet isoprenoidt-lipid-pyrophosphat-glucose-glucose-mannose, akkumuleres. Det har overraskende vist sig, at xanthanpolymerasen, der almindeligvis virker på lipid-forbundet pentamer (glucose-glucose-mannose-glucuronsyre-mannose), er i stand til at polymeri-30 sere lipid-forbundet trimer (glucose-glucose-mannose). Således kan polytri-meren ifølge opfindelsen syntetiseres in vitro.

6 DK 174575 B1

Den ovenfor beskrevne cellefrie syntese af polytrimer viser, at Xanthomonas campestris celler har alle de nødvendige enzymer til at syntetisere polytrimer. Imidlertid kræves for at anvende hele celler til at syntetisere polytrimer in vivo et middel til blokering af xanthangummisyntese ved reaktion IV (se figur 1).

5 Mutagenese kan anvendes til at blokere reaktion IV.

Transposoner. herunder, men ikke udelukkende, Tn10 og Tn903, kan anvendes til at mutagenere Xanthomonas. Disse transposoner overfører resistens over for henholdsvis tetracyclin og kanamycin. Transposoner har evnen til at indsætte sig selv i gener; når de gør dette, frembringer de mutatio-10 ner ved at afbryde kodesekvensen (Kleckner, N., Annual Reviews of Genetics 15, 341 (1981)). Transposonerne kan indføres i Xanthomonas på en såkaldt selvmordsvektor, såsom pRK2013. Denne vektor har den evne at overføre sig selv til ikke-enteriske bakterier, såsom Xanthomonas, men kan ikke opretholde sig selv (replikeres) i den vært (Drtta, G., Corbin, D., Helinski, 15 D.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347-7351 (1980). Hvis således selv mordsvektoren indføres i en population af Xanthomonas-ceWer, og den population derefter udsættes for enten tetracyclin eller kanamycin, er de individer, som overlever, dem hvori et af transposonerne har indsat sig selv i genomet af Xanthomonas. De overlevende fra en sådan udsættelse kan screenes for 20 dem, som har mistet evnen til at fremstille xanthangummi. Sådanne mutanter viser sig mindre mucoide end vild-type Xanthomonas.

I andre udførelsesformer af opfindelsen kan andre midler anvendes til at frembringe mutanter, som har mistet evnen til at fremstille xanthangummi.

Sådanne midler vil være nærliggende for fagfolk og inkluderer, uden be-25 grænsning dertil, bestråling, rekombinant-DNA-teknologi og kemisk mutagenbehandling (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics (1972); Davis, R.W., Botstein, D., and Roth, J.R., Advances Bacterial Genetics (1980);

Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor).

30 Selv om der først kan vælges mutanter, som forekommer mindre mucoide end vild-typen, bevarer de ønskede evnen til at fremstille noget polysaccha-rid. Cellefrie ekstrakter af hver af de xanthangummi-deficiente mutanter kan fremstilles og prøves ved tilsætning af forskellige kombinationer af substrater DK 174575 B1 7 og analyse af produkterne. Hvis f.eks. UDP-glucose, GDP-mannose og UDP glucuronsyre tilsættes som substrater, bør produktet være identisk med det, som produceres, når der tilsættes UDP-glucose og GDP-mannose. Alternativt kan passende mutanter detekteres ved prøvning af dyrkningsvæsken af 5 hver mutant for tilstedeværelsen af polytrimer. Således kan der findes xanthangummi-deficiente mutanter, som synes at være blokerede ved reaktion IV i santhangummi-reaktionsvejen. En mutant af denne beskrivelse er blevet deponeret i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. som ATCC No. 53195. Sådanne mutanter kan anvendes til at 10 syntetisere polytrimer in vivo.

Selv om der i eksemplerne er blevet anvendt glycosyltransferase IV mutanter til fremstilling af polytrimeren ifølge opfindelsen, regnes i andre udførelses-former af opfindelsen med anvendelsen af mutanter i UDP-glucuronsyre-metabolismen. En sådan mutant er blevet isoleret og deponeret i the Ameri-15 can Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A., som ATCC No.

53196.

Det er også muligt at anvende en enzyminhibitor for vild-type glycosyltransferase IV eller for UDP-glucuronsyre-biosyntese for at nå til det samme produkt. Endnu andre alternativer til fremstilling af polytrimer forudses, herunder 20 enzymatisk og kemisk nedbrydning af naturlig xanthangummi, f.eks. ved fjernelse af de terminale mannose- og glucuronsyre-dele fra sidekæderne i xanthangummi.

Mutanterne kan dyrkes under betingelser, som er kendte inden for faget til vækst af vild-type Xanthomonas. F.eks. kan de dyrkes på egnede assimiler-25 bare carbonkilder, såsom glucose, saccharose, maltose, stivelse, invertsuk-ker, sammensatte carbonhydrater, såsom melasse eller majssirup, forskellige organiske syrer og lignende. Blandinger af carbonkilder kan også anvendes. Koncentrationen af tilført carbonkilde er ofte mellem ca. 10 og ca. 60 g/l.

Nødvendig for vækst er også en assimilerbar kilde til organisk eller uorganisk 30 nitrogen, almindeligvis mellem ca. 0,1 og 1,0 g/l, og mineraler, for hvilke valget er inden for fagkundskaben. Eksempler på egnede nitrogenkilder er ammoniumsalt, nitrat, urinstof, gærekstrakt, pepton eller andre hydrolyserede proteinholdige materialer eller blandinger deraf. Eksempler på egnede mine- 8 DK 174575 B1 raler inkluderer phosphor, svovl, kalium, natrium, jern og magnesium; disse tilsættes ofte med et chelateringsmiddel, såsom EDTA eller citronsyre.

Optimale temperaturer for vækst af Xanthomonas er almindeligvis mellem ca.

18 og ca. 35 °C, fortrinsvis mellem ca. 28 og ca. 32 °C. Xanthomonas-ceWer 5 dyrkes aerobt ved tilførsel af luft eller oxygen, således at der opretholdes et tilstrækkeligt niveau af opløst oxygen, f.eks. over ca. 10% af mætning. Fortrinsvis holdes niveauet over ca. 20%. pH-værdien holdes ofte ved fra omkring 6,0 til omkring 8,0, fortrinsvis ved fra omkring 6,5 til omkring 7,5.

Polysaccharidet ifølge opfindelsen kan udvindes fra gæringsvæsker ved eg-10 nede midler. Udfældning med isopropylalkohol, ethanol eller en anden egnet alkohol giver let polytrimergummien. Almindeligvis tilsættes alkoholer til en koncentration på fra omkring 50 til omkring 75 vol.-%, fortrinsvis i nærvær af kaliumchlorid, natriumchlorid eller et andet salt. Alternativt kan polymeren udvindes fra væsken ved ultrafiltrering.

15 Når der gennemføres kemiske analyser på polytrimergummien for at bestemme forholdet glucose/mannose, findes en variation fra den teoretiske værdi på 2:1. Den samme type variation findes, når man analyserer xanthan-gummi. Målte områder af forhold mellem glucose og mannose vil almindeligvis være fra omkring 1,4:1 til omkring 2,4:1. Fortrinsvis vil forholdet være mel-20 lem 1,7:1 og 2,1:1.

Niveauerne af acetylering af mannoseresterne på polysaccharidpolymeren varierer.

Typisk er koncentrationerne af polytrimer i gæringsvæsken omkring 0,1 vægt-%. Rutineprøvning af gæringsbetingelser og klassisk og rekombinant-25 DNA stammeforbednngsteknik, som alle ligger inden for fagkundskaben, kan anvendes til at forbedre udbyttet. På vægtbasis er poiytrimeren bedre end xanthan som viskoseforøger af et vandigt medium. Viskositeten af opløsninger af polytrimer bevares under betingelser med høje temperaturer og/eller høj saltholdighed. Sådanne opløsninger kan fremstilles i alle ønskelige kon-30 centrationer, fortrinsvis mellem ca. 0,01 og ca. 15 %, ved opløsning af polysaccharidet i vandigt medium. Produktet ifølge opfindelsen er ideelt egnet til DK 174575 B1 9 anvendelse ved sekundær olieudvinding. Den samme teknik som anvendes med xanthangummi inden for faget og er velkendt ved sekundær olieudvinding, er passende med polysaccharidet ifølge opfinden; se f.eks. Lindblom, G.P., et al., US patentskrift nr. 3 198 268.

5 Mobilitetskontrolopløsninger til anvendelse ved forhøjet olieudvinding kan fremstilles ud fra polysaccharidet. Koncentrationer på fra omkring 100 til omkring 3000 ppm af polysaccharidet er passende for sådanne mobilitetskontrolopløsninger. Andre kendte additiver kan også anvendes i eller i kombination med disse opløsninger til yderligere at forhøje olieudvinding. Sådanne 10 additiver inkluderer f.eks. overfladeaktive midler og alkaliske midler.

Polysaccharidet ifølge opfindelsen kan også, ligesom xanthangummi, anvendes som fortykningsmiddel i fødevarer, kosmetika, lægemiddelsammensætninger, papirglittemidler, boremuddere, trykkefarver og lignende. Desuden kan det anvendes til at reducere friktionsbremsning af væskestrøm i rør.

15 De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

EKSEMPEL 1

Dette eksempel viser, hvordan produktet ifølge opfindelsen kan fremstilles in vitro, og identificerer det som et afkortet produkt af xanthan-reaktionsvejen.

Fremstilling af lysater 20 Xanthomonas campestris B1459 S4-L blev skaffet fra Northern Regional Research Laboratories of the U.S. Department of Agriculture. Bakterier blev dyrket i YM (gær-malt-medium) suppleret med 2 vægt/vol.-% glucose som beskrevet af Jeanes, A., et al. (U.S. Department of Agriculture, ARS-NC-51, 14 pp (1976)). Kulturer blev dyrket til sen log-fase ved 30 °C og 300 25 omdr./min. Cellerne blev titreret på plader af YM plus 2 vægt/vol.-% glucose ved 30 °C. Cellerne blev høstet ved centrifugering og vasket med kold "Tris"-HCI, 70 mM, pH 8,2. Vaskede celler blev resuspenderet i ”Tris"-HCI, 70 mM, pH 8,2 med 10 mM EDTA og blev frosset-optøet tre gange ved en procedure, som ligner den, der er beskrevet af Garcia, R.C., et al. (European Journal of 30 Biochemistry 43, 93-105, (1974)). Denne procedure brød cellerne, hvilket vi- DK 174575 B1 10 ste sig ved suspensionernes forøgede viskositet og det fuldstændige tab af cellelevedygtighed (en overlevende pr. 106) efter denne behandling. De fros-set-optøede lysater blev frosset i aliquoter ved -80 °C. Proteinkoncentratio-nen blev bestemt ved BIO RAD prøvning (BIO RAD Laboratories, Richmond, 5 California, USA.) og fundet at være 5-7 mg celleprotein pr. ml. lysat.

Biosytetisk prøvningsprocedure

Som beskrevet i lelpi, L., Couso, R.O., and Dankert, M.A., FEBS Letters 130,

253-256 (1981), blev en aliquot af frosset-optøet lysat (ækvivalent med 300-400 ug protein), DNAse 1(10 pg/ml) og MgCh (8 mM) præinkuberet ved 20 10 °C i 20 minutter. Der tilsattes et lige så stort volumen 70 mM "Tris”-HCI, pH

8,2, med de ønskede radiomærkede sukkernucleotider (UDP-glucose og GDP-mannose), med eller uden UDP-glucuronsyre, og blandingen blev inkuberet ved 20 °C. Til forskellige tider blev reaktionerne stoppet ved tilsætning af EDTA til 4 mM. Prøverne blev centrifugeret, og pillerne blev vasket to gan-15 ge med puffer. Supernatanterne blev kombineret, der tilsattes bærer-xanthan (100 μρ), og xanthanet plus syntetiseret polymer blev udfældet med ethanol (60%)/KCI (0,8%). Den udfældede polymer blev resuspenderet i vand og genudfældet to gange til for at fjerne ikke-inkorporeret mærke. Radioaktivitet inkorporeret i gummifraktionen blev bestemt i en væskescintillationstæller, og 20 dataene blev forarbejdet til angivelse af inkorporering som pmol.

TABEL 1

Inkorporering af mærkede sukkerstoffer i gummi ved hjælp af frosset-optøet cellelysat af X. campestris B1459 S4-L

Gummifraktion (pmol)

Inkubationsblanding [3H]man [14C]glc glc/man +UDPG, GDPM 98 201 2,1 +UDPG, GDPM, UDP-GA 1540 1562 1,0 dpm/pmo 3H = 442 14C = 37,5 DK 174575 B1 11 UDPG = UDP-glucose glc = glucose GDPM = GDP-mannose man = mannose UDP-GA = UDP-g!ucuronsyre dmp = henfald pr. minut 5 pmol = picomol

Cellelysater af B1459 S4-L blev inkuberet ved 20 °C i 30 minutter og forarbejdet til at give gummifraktionerne som beskrevet i teksten. Det molære forhold mellem glucose og mannose er forholdet mellem pmol inkorporeret car-bon-14 og pmol tritium-mærkede sukkerstoffer i gummifraktionerne.

10 I nærvær af alle tre sukkerbestanddele var forholdet mellem glucose og mannose 1,0:1, som forventet for xanthangummi. Når UDP-glucuronsyre manglede, var forholdet 2,1:1; se tabel 1. Dette forhold stemmer overens med den hypotese, at polysaccharidet dannes af trimer-enheder, som er mellemprodukter ved xanthangummibiosyntese-reaktionsvejen.

15 Et impuls-jagt-forsøg in vitro viste, at lipid-forbundet cellobiose (en glucose-dimer) blev forarbejdet til lipid-forbundet trimer (glucose-glucose-mannose) og derefter til polytrimergummi. Et fryse-optønings-lysat af stamme B1459 S4-L blev fremstillet som beskrevet ovenfor. UDP-[14C]glucose blev tilsat til lysatet omfattende "impulsen", og radiomærket cellobiose akkumuleredes på 20 lipidbæreren under en inkubation på 13 minutter. "Jagten” bestod i tilsætning af 100 ganges overskud af umærket UDP-glucose såvel som GDP-[3H]man-nose. Aliquoter af inkubationsblandingen af lysat og sukkernucleotider blev udtaget til forskellige tider og forarbejdet til frembringelse afen organisk ekstrakt (lipidbærer-forbundet fraktion) og en vandig fraktion (indeholdende 25 gummi). Oligosacchariderne i den organiske ekstrakt blev syrehydrolyseret fra lipidbæreren, dephosphoryleret, adskilt ved tyklagschromatografi, fjernet fra chromatogrammerne, og radio-mærkningen kvantiseret. Resultaterne er anført i tabel 2.

TABEL 2 DK 174575 B1 12

UDP-[14C]glucoses skæbne ved impuls-jagt-forsøg in vitro med cellelysater af B1459 S4-L

Impuls (12 min) 9 pmol Lipid-forbundet cellobiose 5 Jagt (4 min) 1 pmol Lipid-forbundet cellubiose 10 pmol Lipid-forbundet trimer

Jagt (16 min) 0,5 pmol Lipid-forbundet cellobiose 6 pmol Lipid-forbundet trimer 3 pmol Opløselig polytrimer 10 Jagt (48 min) 0,2 pmol Lipid-forbundet cellobiose 0,4 pmol Lipid-forbundet trimer _10 pmol_Opløselig polytrimer_

Forsøgsbetingelserne og forarbejdningen af den organiske fraktion og den 15 opløselige gummifraktion er beskrevet i teksten til eksempel 1.

Den mærkede glucose fra UDP-[14C]glucose blev, som det ses i tabel 2, umiddelbart inkorporeret i lipid-forbundet cellobiose i ’’impulsen". Efter tilsætning af GDP-mannose og overskud af UDP-glucose (jagten), blev den mærkede cellobiose hurtigt omdannet til mærket lipid-forbundet trimer, som 20 senere blev detekteret som polytrimergummi i den vandige fraktion, omkring 16 minutter efter at jagten begyndte. Dette viser forstadie-produkt-forholdene for UDP-glucose, lipid-forbundet cellobiose, lipid-forbundet trimer og polytrimergummi og deres forhold til xanthanbiosyntese-reaktionsvejen.

EKSEMPEL 2 25 Dette eksempel viser det molære forhold mellem glucose og mannose i polytrimergummi syntetiseret in vitro af en glycosyltransferase-IV-deficient mutant.

Fremgangsmåde til fremstilling af lysatet er beskrevet ovenfor i eksempel 1.

Den stamme, som anvendtes til at fremstille lysatet, var den der er betegnet 30 ATCC No. 53195. Lysatet tilsattes 1,2 eller 3 nucleotidbelastede sukkerstof- DK 174575 B1 13 fer bestående af UDP-[14C]glucose alene, UDP-[14C]glucose og GDP-[3H]-mannose eller UDP-[14C]glucose, GDP-[3H]mannose og umærket UDP-glucuronsyre. 30 minutter efter tilsætningen af sukkersubstraterne blev den vandige fraktion forarbejdet og analyseret som beskrevet i eksempel 1. Re-5 sultaterne er vist i tabel 3. Når der var to sukkersubstrater, UDP-glucose og CDP-mannose, til stede i inkubationsblandingen, blev det molære forhold mellem glucose og mannose i gummien fundet at være 2,4:1. Når alle tre sukkersubstrater blev inkuberet sammen med lysatet, havde den resulterende gummi et molært forhold mellem glucose og mannose på 2,3:1.

10 TABEL 3

Inkorporering af mærkede sukkerstoffer i polvtrimeraummi ved hiælp af frosset-optøet cellelvsat af ATCC nr. 53195

Gummifraktion (pmol)

Reaktionsblanding [3H]man [14C]glc glc/man +2 UDPG, GDPM 71 174 2,4 +3 UDPG, GDPM, UDP-GA 65 152 2,3 dpm/pmol 3H = 340 14C = 40

Forkortelserne er forklaret i forbindelse med tabel 1.

Cellelysater af ATCC nr. 53195 blev inkuberet ved 20 °C i 30 minutter i de 15 angivne reaktionsblandinger og forarbejdet til opnåelse af gummifraktionerne som beskrevet i eksempel 1. Det angivne molære forhold mellem glucose og mannose er forholdet mellem pmol inkorporeret carbon-14 og pmol tritium-mærkede sukkerstoffer i de forarbejdede fraktioner.

Tilstedeværelsen af UDP-glucuronsyre har ingen virkning på forholdet mel-20 lem glucose og mannose inkorporeret i en polysaccharidpolymer, når det anvendte cellefrie lysat er fra en glycosyltransferase-IV-deficient mutant. Den biokemiske fænotype af mutantlysatet, når det inkuberes med alle tre sukkerstoffer, an analog med fænotypen af vildtype-lysatet, når det inkuberes DK 174575 B1 14 med kun to sukkersubstrater, ved at de in vitro producerede gummier begge har et molært forhold mellem glucose- og mannose-dele på omkring 2:1.

EKSEMPEL 3

Dette eksempel viser, at det trimere mellemprodukt, som polymeriseres til 5 dannelse af polytrimergummi, har den samme anomere konfiguration af sukkerstofferne som i xanthangummi. Desuden viser det, at mannosen i tri'meren er knyttet til den ikke-reducerende glucose af cellobiosen i det lipid-forbundne mellemprodukt.

α-mannosidase (EC 3.2.1.24) og β-glucosidase (EC 3.2.1.21) blev anvendt til 10 enkeltvis eller i rækkefølge at behandle det trimere oligosaccharid, som var blevet syntetiseret og dobbeltmærket in vitro som beskrevet i eksempel 1. a-mannosidase vil hydrolysere terminale usubstituerede mannoserester tilknyttet via en a-1 -binding, β-glucosidase vil hydrolysere terminale usubstituerede D-glucosylrester tilknyttet via en β-1 -binding.

15 Trimeren blev fjernet fra lipidet og dephosphoryleret. Den blev derpå deace-tyleret ved basebehandling, såsom pH12 i 2-3 timer, fordi α-mannosidase ikke kan genkende acetylerede mannosedele.

Resultaterne var som følger. Behandling af trimert oligosaccharid med β-glucosidase efterlod det uændret. Når α-mannosidase blev anvendt til at be-20 handle det trimere oligosaccharid, dannedes cellobiose og mannose. Når det trimere oligosaccharid blev behandlet først med α-mannosidase og derefter med β-glucosidase, dannedes glucose og mannose. Resultaterne bekræfter, at mannose er knyttet til den ikke-reducerende glucose ved en α-binding i det trimere mellemprodukt, og at glucosedelene er β-forbundet. Dette bekræfter, 25 at trimeren er et mellemprodukt i den normale xanthan-enzymreaktionsvej.

EKSEMPEL 4

Dette eksempel viser de metoder til mutagenese og screening, som blev anvendt til at frembringe mutantstammerne, som er xanthangummideficiente på grund af en læsion i genet for glycosyltransferase IV.

DK 174575 B1 15

Xanthomonas campestris, genetisk mærket med en chromosomal resistens over for streptomycin, blev anvendt som recipient i en konjugation med E. co-li LE392 indeholdende plasmidet pRK2013::Tn10. Plasmidet pRK2013 indeholder Tn903, som koder for kanamycinresistens (Figurski, D.H. and Helin-5 ski, D.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1648-1652 (1979)), og plasmidet kan ikke replikeres i Xanthomonas (Ditte, G. et al, ovenfor). Transposonet Tn10 koder for resistens over for tetracyclin. Der blev selekteret transkonju-ganter, som var resistente over for streptomycin og kanamycin eller over for streptomycin og tetracyclin. De førstnævnte forekom med en frekvens på 10 omkring 4 x 10'6/recipient og var antageligvis resultatet af en transposition af Tn903. De sidstnævnte forekom med en frekvens på omkring 3 x 10'6/reci-pient og var antageligvis resultat af en transposition af Tn10 ind i genomet af Xanthomonas campestris.

Auxotropher blev fundet blandt disse transkonjuganter med en frekvens på 15 ca. 2%; deres behov var vidt fordelt blandt de forskellige næringskrav. Dette viser, at disse transposoner ikke har et særligt foretrukket locus for indsætning i Xanthomonas. Der blev selekteret prototrophe revertanter af auxotro-pherne, og de fleste blev fundet at være lægemiddel-sensitive; dette tyder på, at auxotrophierne var forårsaget af transposonindsætning.

20 For at screene for xanthangummi-deficiente mutanter blandt de dobbelt resistente transkonjuganter, blev Congo Rødt farvestof, som forhøjer den morfologiske skelnen mellem xanthangummiproducerende og ikke-producerende kolonier, tilsat til de faste medier. Kolonimorfologi blev undersøgt efter 7-12 dages inkubation ved 30 °C. Xanthangummideficiente mutanter blev fundet 25 med en frekvens på omkring 10-4.

For at identificere en glycosyltransferase-IV-mutant blandt de xanthangummideficiente mutanter blev der fremstillet fryse-optønings-lysater af hver. Der tilsattes radiomærket UDP-glucose og GDP-mannose med eller uden UDP-glucuronsyre. De ønskede mutanter fremstillede en gummi med et gluco-30 se/mannose-forhold på omkring 2:1, uanset tilstedeværelsen af UDP- glucuronsyre. Der blev fundet flere mutanter af denne beskrivelse; de indeholder læsioner på grund af Tn1 O-indsætning. Der blev også fundet mutanter DK 174575 B1 16 induceret af Tn903, som havde denne fænotype. Desuden er der blevet isoleret mutanter med denne fænotype, som var induceret af nitrosoguanidin.

EKSEMPEL 5

Dette eksempel viser anvendelsen af en glycosyltransferase-IV-deficient mu-5 tant til at producere polytrimergummi in vivo.

Til opnåelse af in vivo syntetiserede gummier blev 5 I hver af vild-type NRRL B-1459 S4-L og den glycosyltransferase-IV-deficiente mutant fra eksempel 4 (ATCC nr. 53195) dyrket aerobt i en fermentor ved 28-32 °C med pH-værdien reguleret til området 6,0 - 8,0. Der anvendtes et minimalmedium in-10 deholdende ammoniumsulfat, 2 g/l citronsyre, 30 g/l glucose og sporelementer. Efter 145 timer blev gummierne udvundet og renset. Cellerne blev fjernet ved centrifugering, og gummierne udfældet fra væsken ved tilsætning af isopropylalkohol (55 vol.-%) og natriumchlorid (0,5 vægt/vol.-%). Bundfaldene blev opsamlet ved filtrering og genopløst i vand. Gummierne blev genud-15 fældet med isopropylalkohol (55 vol.-%) uden salt og genopløst i vand. Præparaterne blev dialyseret over for vand under anvendelse af membrandialy-serør med molekylvægtafskæring i tre dage.

Glucose-mannoseforholdene blev bestemt ved fuldstændig syrehydrolyse af polysacchariderne med efterfølgende analyse ved højydelses-væskecbroma-20 tografi (HPLC), og de blev fundet at stemme overens med de forhold, som blev fundet for de in vitro syntetiserede polymere. Den glycosyltransferase-IV-deficiente mutant betegnet ATCC nr. 53195 fremstillede en gummi med et glucose/mannose-forhold på omkring 2,15:1, medens vildtypen fremstillede en gummi med et forhold på omkring 0,96:1.

25 Andre in vivo producerede prøver af polytrimergummi blev prøvet ved HPLC eller ved enzymatiske analyser af sukkerstofferne efter syrehydrolyse. For de 24 gennemførte analyser lå de molære forhold mellem glucose og mannose i området fra 1,43:1 til 2,44:1. Gennemsnitsforholdet var (1,90 ± 0,15):1 forpo-lytrimer fremstillet af den glycosyltransferase-IV-deficiente mutantstamme.

DK 174575 B1 17

Ved HPLC-anaiysen af den in vivo producerede polytrimer vistes også inden for detekterbare grænser: (1) fraværet af glucuronsyre; (2) fraværet af pyru-vat; (3) tilstedeværelsen af acetat; (4) fraværet af andre sukkerstoffer end glucose og mannose.

5 EKSEMPEL 6

Dette eksempel viser, at polytrimeren giver vandige opløsninger, som udviser forbedrede rheologiske egenskaber sammenlignet med xanthangummi over et område af temperaturer og uorganisk-salt-koncentrationer.

Der blev fremstillet opløsninger af polytrimergummi (syntetiseret in vivo ifølge 10 eksempel 5) og xanthangummi (renset Pfizer "Flocon 4800”) i en koncentration på 1000 ppm i vand indeholdende 10 vægt-% natriumchlorid. Polytrimergummi viser væsentligt større viskositet end xanthangummi over et bredt område af forskydningshastigheder (fig. 2).

Forholdet mellem polytrimer-viskositet og xanthan-viskositet ved stuetempe-15 ratur varierer med vandets saltholdighed og er mellem 2 og 2.5 over et saft-holdighedsområde på 0-20 vægt-% natriumchlorid, som vist i fig. 3. Forholdet mellem polytrimer-viskositet og xanthan-viskositet varierer også med polymerkoncentrationen (fig. 4). Endelig stiger forbedringen i polytrimer-viskositet i forhold til xanthan-viskositet med temperaturen over et område på 25-75 °C 20 for vandsaltholdigheder på 0-20 vægt-% natriumchlorid (fig. 5).

Claims (12)

1. Vandopløseligt polysaccharid af xanthangummitypen, kendetegnet ved, at det i det væsentlige ikke indeholder nogen glucuron-syredele i dets sidekæder og har et D-glucose/D-mannose-forhold på om- 5 kring 2:1, idet D-glucose-delene er forbundet med hinanden i β-[1 .^-konfiguration, og D-mannose-delene er forbundet med D-glucosedelene i a-[1,3]-konfiguration, almindeligvis til alternerende glucoseringe.

2. Polysaccharid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man-nose-delene er acetyleret i 6-0-stillingen.

3. Polysaccharid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man- nose-delene ikke er acetyleret i 6-0-stillingen.

4. Vandig opløsning af et polysaccharid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polysaccharidet er til stede i opløsningen i mængder på over 0,001 vægt-%.

5. Opløsning ifølge krav 4, kendetegnet ved, at polysac charidet er til stede i opløsningen i mængder på over 1 vægt-%.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et polysaccharid ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at et egnet dyrkningsmedium podes med mikroorganismen ATCC nr. 53195 eller ATCC nr. 53196, henholdsvis 20 en glycosyltransferase-IV-deficient og en UDP-glucuronsyre-deficient mutant af Xanthomonas campestris NRRL B-1459 S4-L, eller en fra en af disse to mikroorganismer afledt mutant med i det væsentlige samme egenskaber, og at det podede dyrkningsmedium inkuberes ved en egnet temperatur og ved egnede opløste oxygenniveauer til dannelse af det ønskede produkt.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at polysaccharidet udvindes fra dyrkningsmediet ved udfældning eller ultrafiltrering.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, kendetegnet ved, at mikroorganismen er ATCC nr. 53195. DK 174575 B1

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, kendetegnet ved, at mikroorganismen er ATCC nr. 53196.

10. Mikroorganisme til brug ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den er mikroorganismen ATCC nr. 5 53195 eller ATCC nr. 53196.

11. Fremgangsmåde til forøgelse af viskositeten af et vandigt medium, kendetegnet ved, at et polysaccharid ifølge ethvert af kravene 1-3 opløses i mediet i en ønskelig koncentration.

12. Fremgangsmåde til udvinding af olie fra en olieførende underjordisk for-10 mation, kendetegnet ved, at en opløsning indeholdende et polysaccharid ifølge krav 1-3 injiceres i en brønd til udpresning af indfanget olie fra den porøse klippe, og at den udpressede olie opsamles.