FI90542B - Chemiluminescent acridine derivatives, their preparation and their use in luminescence immunoassays - Google Patents
Chemiluminescent acridine derivatives, their preparation and their use in luminescence immunoassays Download PDFInfo
- Publication number
- FI90542B FI90542B FI873609A FI873609A FI90542B FI 90542 B FI90542 B FI 90542B FI 873609 A FI873609 A FI 873609A FI 873609 A FI873609 A FI 873609A FI 90542 B FI90542 B FI 90542B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- group
- conjugate
- formula
- sample
- antibody
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
- C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D219/00—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems
- C07D219/04—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Abstract
Description
1 905421 90542
Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissäChemiluminescent acridine derivatives, their preparation and their use in luminescence immunoassays
Keksinnön kohteena ovat kemiluminoivat akridiini-5 johdannaiset, menetelmät niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä.The invention relates to chemiluminescent acridine-5 derivatives, to processes for their preparation and to their use in luminescence immunoassays.
Luminoivilla yhdisteillä on jo monipuolista käyttöä. Niitä käytetään indikaattoreina eläinkokeissa, ent-syymi-immunoanalyyseissä ja luminesenssi-immunoanalyy-10 seissä (vrt. W.P. Collins "Alternative Immunoassays",Luminescent compounds already have a wide range of uses. They are used as indicators in animal experiments, enzyme immunoassays and luminescence immunoassays (cf. W.P. Collins, "Alternative Immunoassays",
Verlag John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985), mutta niitä käytetään myös nukleiinihappohybridointianalyyseis-sä (vrt. J.A. Matthews ym. "Analytical Biochemistry", 151, 205 - 209, 1985). Lisäksi kemiluminoivia yhdisteitä 15 käytetään "flow injection analyysin" yhteydessä, "post column" -detektoreina nestekromatografiässä, virtaustut-kimuksessa ja keinotekoisissa valolähteissä.Verlag John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985), but are also used in nucleic acid hybridization assays (cf. J.A. Matthews et al., Analytical Biochemistry, 151, 205-209, 1985). In addition, chemiluminescent compounds 15 are used in "flow injection analysis", as "post column" detectors in liquid chromatography, flow studies, and artificial light sources.
Kemiluminesenssi-immunoanalyysien yhteydessä huomattavampaa merkitystä on saavuttanut erityisesti kaksi 20 kerniluminoivien merkkiaineiden rakennetyyppiä. Kyseessä ovat tällöin toisaalta luminoli- tai isoluminolijohdannaiset, joita ovat selostaneet H.R. Schroeder ym., "Methods in Enzymology", Academic Press Inc., New York, Voi. LVII, 1978, 424 ff, samoin kuin ne, joita on selos-25 tettu GB-patenteissa 2 008 247 ja 2 041 920, DE-patentti-julkaisuissa 2 618 419 ja 2 618 511, samoin kuin EP-pa-tenttihakemuksessa 137 071. Yleiskatsaus isoluminoliyh-disteiden käytöstä käytännön sovellutuksissa luminesens-si-indikaattoreina on löydettävissä julkaisusta W.G.In the context of chemiluminescent immunoassays, two structural types of core-luminescent markers in particular have become more important. These are, on the other hand, the luminol or isoluminol derivatives described by H.R. Schroeder et al., Methods in Enzymology, Academic Press Inc., New York, Vol. LVII, 1978, 424 et seq., As well as those described in GB patents 2,008,247 and 2,041,920, DE patent publications 2,618,419 and 2,618,511, as well as in EP patent application 137,071 An overview of the use of isoluminol compounds in practical applications as luminescence indicators can be found in WG
• 30 Wood, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 1984, 905 - 918.• 30 Wood, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22, 1984, 905-918.
Toisaalta akridiniumesteriyhdisteille on löytynyt käyttöä myös kemiluminoivina merkkiaineina. Niiden kaltaisia akridiniumestereitä tunnetaan myös US-patentin 3 352 791, GB-patenttien 1 316 363 ja 1 461 877 sekö EP-35 patenttihakemuksen 82 636 perusteella. Akridiniumesterien 2 > Π 5 42 käyttöä merkkiaineina immunoanalyyseissä on selostettu julkaisussa Weeks ym., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1 474 -1 479. Myös fenantridiniumesterien käyttö merkkiaineena luminesenssi-immunoanalyyseissä tunnetaan jo EP-patentti-5 hakemuksen 170 415 perusteella.On the other hand, acridinium ester compounds have also found use as chemiluminescent markers. Such acridinium esters are also known from U.S. Patent 3,352,791, GB Patents 1,316,363 and 1,461,877, and EP-35 Patent Application 82,636. The use of acridinium esters 2> 42 5 42 as markers in immunoassays is described in Weeks et al., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1474-1479. The use of phenanthridinium esters as a marker in luminescence immunoassays is also known from EP-A-5 170,415.
Akridiniumesterien kemiluminointi voidaan käynnistää lisäämällä alkalista H202-liuosta. Kemiluminoinnin mekanismista vakuuttavan selostuksen on esittänyt F. McCapra, Acc. Chem. Res. 9, 201, 1976. Tällöin ratkaiseva 10 merkitys on ilmeisesti poistuvan ryhmän laadulla sekä va-lokvanttituoton että myös hydrolyyttisen stabiilisuuden kannalta.The chemiluminescence of acridinium esters can be initiated by the addition of an alkaline H 2 O 2 solution. A convincing account of the mechanism of chemiluminescence has been given by F. McCapra, Acc. Chem. Res. 9, 201, 1976. In this case, the quality of the leaving group is obviously of decisive importance both for the photon quantum yield and also for the hydrolytic stability.
Toistaiseksi jo tunnettujen akridiniumesterien etuna luminoli- ja isoluminoliyhdisteisiin nähden on 15 suurempi valokvanttituotto, johon myöskään indikaattoriin sitoutuneilla proteiineilla ei ole haitallista vaikutusta (vrt. Weeks ym., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1 474 -1 479).The advantage of the acridinium esters already known over the luminol and isoluminol compounds is that they have a higher photonquant yield, which is also not adversely affected by the indicator-bound proteins (cf. Weeks et al., Clin. Chem. 29/8 (1983), 1474-1479).
Vaikkakin EP-patenttihakemuksen 82 636 perusteella 20 tunnetuilla akridiniumfenyyliestereillä kemiluminoinnin aktivoitumisessa mietojen hapetusaineiden vaikutuksesta on erinomaisen suuri näyttöherkkyys, niillä on käytännön sovellutusten kannalta häiritseviä varjopuolia. Ennen kaikkea fenyyliesterisidos on vesipitoisissa seoksissa jo 25 huoneen lämpötilassakin hyvin labiili. Lisäksi siinä mainituissa hapetusolosuhteissa akridiniumfenyyliestereillä esiintyy valoemissiota, joka vasta noin 10 sekunnin kuluttua on vaimentunut oleellisesti, se on yli 95-%risesti. Tähän verrattuna toisten ei isotooppisten 30 analyysimenetelmien mittausajat ovat huomattavasti ly hyempiä ja mahdollistavat siten suuremman näytteiden läpikulun.Although the acridinium phenyl esters known from EP patent application 82 636 have an excellent high sensitivity in activating chemiluminescence by mild oxidizing agents, they have drawbacks that are disruptive for practical applications. Above all, the phenyl ester bond is very labile in aqueous mixtures even at 25 room temperature. In addition, under the oxidation conditions mentioned therein, acridinium phenyl esters exhibit light emission which, after only about 10 seconds, is substantially attenuated, that is, more than 95%. In comparison, the measurement times of other non-isotopic analytical methods are considerably shorter and thus allow a higher sample throughput.
Tämän keksinnön tehtävänä oli sen vuoksi saada käytettäväksi uusia akridiniumjohdannaisia, joilla suu-35 ren valokvanttituoton ohella on nopeampi reaktiokinetiik- 3 90542 ka ja mahdollistavat siten lyhyet mittausajat luminesens-si-immunoanalyysissä.It is therefore an object of the present invention to provide novel acridinium derivatives which, in addition to a high photonquant yield, have a faster reaction kinetics and thus allow short measurement times in a luminescence immunoassay.
Keksinnön kohteena on kaavan (I) mukainen, kemilu-minoiva akridiniumjohdannainen 5 R1 L yf IL J (i» io 0=C-R4 jossa R1 on vety tai 1-10 hiiliatomia sisältävä alkyy-15 liryhmä, R* on kaavan (V) mukainen substituoitu sulfon-amidiryhmä .X-R5 (V) 20 ^"S02-R6 tai kaavan (VI) mukainen substituoitu sulfonamidiryhmä /R6 25 _NC (VI) ^so2-x-r5 tai kaavan (II) mukainen tioalkyyli- tai tioaryyliryhmä '30 -S - X - R5 (II) jolloin X on haaroittunut tai suora C^-Cs-alkyleeniryhmä tai orto-, meta- tai parafenyleeniryhmä, R5 on kaavan III mukainen ryhmä ·· ·-: 35 4 90542 0 V| II / , -C-O-N (III) ^- 5 O' R6 on fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu 1-4 hiiliatomia sisältävällä alkoksilla, ja A© on anioni, jolla ei ole haitallista vaikutusta kemiluminointiin.The invention relates to a chemiluminescent acridinium derivative of the formula (I) R1 L yf IL J (i 010 0 = C-R4 in which R1 is hydrogen or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, R * is of the formula (V) substituted sulfonamide group. X-R5 (V) 20 ^ "SO2-R6 or a substituted sulfonamide group of formula (VI) / R6_NC (VI) ^ so2-x-r5 or a thioalkyl or thioaryl group of formula (II) ' 30 -S - X - R 5 (II) wherein X is a branched or straight C 1 -C 5 alkylene group or an ortho, meta or paraphenylene group, R 5 is a group of formula III ·· · -: 35 4 90542 0 V | II / , -CON (III) ^ - 5 O 'R6 is a phenyl group which may be substituted by alkoxy having 1 to 4 carbon atoms, and A © is an anion which has no adverse effect on chemiluminescence.
Biologisesti mielenkiintoisilla aineilla tarkoite-10 taan ennen kaikkea antigeenejä. Tämän käsitteen piiriin sisältyvät myös hormonit, steroidit, lääkeaineet, lääke-ainemetaboliitit, toksiinit, alkaloidit ja myös vasta-aineet.Biologically interesting substances are primarily antigens. Also included in this concept are hormones, steroids, drugs, drug metabolites, toxins, alkaloids, and also antibodies.
Kemiluminointiin haitallisesti vaikuttamaton anio-15 ni voi olla tetrafluoriboraatti-, perkloraatti-, haloge- nidi-, alkyylisulfaatti-, halogeenisulfonaatti-, alkyyli-sulfonaatti- tai aryylisulfonaattianioni. Myöskin jokaista muuta anionia voidaan käyttää, mikäli se ei sammuta tai heikennä kemiluminointia.The anion-15 which does not adversely affect the chemiluminescence may be a tetrafluoroborate, perchlorate, halide, alkyl sulfate, halosulfonate, alkyl sulfonate or aryl sulfonate anion. Any other anion can also be used as long as it does not quench or degrade chemiluminescence.
20 Yleensä akridiniumjohdannaisiksi valitaan sellai sia, joissa X on metyleeni-, etyleeni-, propyleeni- tai orto-, meta- tai para-fenyleeniryhmä. Akridiniumjohdan-naisten vesiliukoisuuden parantamiseksi näissä ryhmissä voi olla myös heteroatomeja sisältäviä, hydrofiilisiä 25 substituentteja.In general, acridinium derivatives are selected from those in which X is a methylene, ethylene, propylene or ortho, meta or para-phenylene group. To improve the water solubility of acridinium derivatives, these groups may also have hydrophilic substituents containing heteroatoms.
Erityinen merkitys keksinnön mukaisten akridinium-johdannaisten käyttömahdollisuuksien kannalta on substi-tuentilla R5. Valitsemalla tämä ryhmä sopivalla tavalla akridiinijohdannainen saa niin suuren reaktiivisuuden, 30 että se jo lievissä olosuhteissa voi selektiivisesti muodostaa sidoksen osoitettavan biologisen aineen reaktioky-kyisen ryhmän kanssa. Keksinnön mukaisissa yhdisteissä R5 on I: 5The substituent R5 is of particular importance for the use of the acridinium derivatives according to the invention. By appropriately selecting this group, the acridine derivative has such a high reactivity that it can, even under mild conditions, selectively form a bond with a reactive group of the biological substance to be detected. In the compounds of the invention R5 is I: 5
0 °>H0 °> H
-C-O-N (HI) 5-C-O-N (HI) 5
Lisäksi ensisijaisina pidetään myös akridiniumjohdannaisia, joissa R1 on metyyliryhmä. Erityisen usein käytetään sen vuoksi keksinnön mukaisia akridiniumyhdis-teitä, jotka vastaavat kaavaa IVIn addition, acridinium derivatives in which R1 is a methyl group are also preferred. The acridinium compounds of the invention corresponding to the formula IV are therefore particularly frequently used
10 CH-310 CH-3
\J\ J
lii II ^ 15 X ° Vn (iv)lii II ^ 15 X ° Vn (iv)
cHcH
20 joissa A:11a ja X:llä on edellä mainitut merkitykset.20 wherein A: 11a and X have the meanings given above.
Kun keksinnön mukaisissa akridiniumjohdannaisissa tähde R4 on sulfoniamiditähde, silloin se voi vastata ensisijaisesti kaavaa VWhen the residue R4 in the acridinium derivatives of the invention is a sulfonamide residue, it may correspond primarily to formula V
. ; 25 ^ x-R5 -N<^ (V) so2-r6. ; 25 ^ -R5 -N <^ (V) so2-r6
tai kaavaa VIor formula VI
: 30 /R6 -N (VI) >VnSsso2-x-r5 35 joissa X:llä ja R5:llä on edellä mainitut merkitykset ja 6 90542 R6 on kaavassa V fenyyliryhmä, jossa voi myös olla subs-tituenttina alkoksi, jossa on 1 - 4 hiiliatomia.: 30 / R6 -N (VI)> VnSsso2-x-r5 35 in which X and R5 have the meanings given above and 6 90542 R6 in the formula V is a phenyl group which may also have an alkoxy having 1 to 4 as a substituent. 4 carbon atoms.
Tämän keksinnön mukaisen akridiniumjohdannaisluo-kan tyypilliset edustajat vastaavat kaavaa VII 5 CH, ^ Il i 1 αθ 10 ϊ >nTypical representatives of the acridinium derivative class of this invention correspond to formula VII 5 CH, ^ i i 1 αθ 10 ϊ> n
O N-X-C-O-NO N-X-C-O-N
\ ^ s02-C3 15 '- jossa Ailia ja X:llä on edellä mainitut merkitykset.\ 2 SO2-C3 15 '- wherein Al and X have the meanings given above.
Tämän keksinnön myötä saadaan siis käytettäväksi kaksi uutta akridiniumyhdisteiden luokkaa, jolloin toiselle luokalle on ominaista tioliesteriryhmittymä ja toi-20 selle sulfoniamidirakenne. Akridiniumasyylisulfoniamidi-johdannaisten stabiilisuus on suurempi, tioliesterien kinetiikka on nopeampi kuin tähän saakka tunnettujen akri-diniumfenyyliesteriyhdisteiden. Molemmilla yhdisteluokil-la on sen lisäksi suurempi valontuotto.Thus, the present invention provides two new classes of acridinium compounds, one class characterized by a thiol ester moiety and the other a sulfonamide structure. The stability of acridinium acylsulfonamide derivatives is higher, the kinetics of thiol esters are faster than those of hitherto known acridinium phenyl ester compounds. In addition, both classes of compounds have a higher light output.
25 Keksinnön mukaisten akridiniumyhdisteiden, joissa on tioliesteripitoisia poistuvia ryhmiä, merkittävänä etuna on EP-patenttihakemuksen 82 636 perusteella tunnettuihin akridiniumfenyyliestereihin verrattuna valoemis-sion oleellisesti nopeampi reaktiokinetiikka. Siten esi-30 merkin 1 mukaisesti valmistettu keksinnön mukainen akri-diniumtioesteri (yhdiste 6) yhden sekunnin mittausaikana antaa 10 kertaa suuremman valontuoton samoissa hapetus-olosuhteissa. Tämä suuri valontuotos samanaikaisten lyhyiden mittausaikojen ohella mahdollistaa oleellisesti 35 suuremman näyteläpäisyn luminometrissä.A significant advantage of the acridinium compounds of the invention having thiol ester-containing leaving groups is the substantially faster reaction emission kinetics of the acridinium phenyl esters known from EP patent application 82,636. Thus, the acridinium thioester (Compound 6) of the invention prepared according to Example 1 in Example 1 gives a 10-fold increase in light output under the same oxidation conditions. This high light output in addition to the simultaneous short measurement times allows for a substantially 35 higher sample transmission in the luminometer.
Il 7 90542Il 7 90542
Siten kuvio 1 esittää esimerkin 1 mukaisesti valmistetun akridiniumtioesterin (yhdiste 6) vasta-ainekon-jugaatin valoemission kinetiikkaa ja kuvio 2 4-(2-sukkii-ni-imidyyli-oksikarbonyylietyyli)fenyyli-10-metyyliakri-5 dinium-9-karboksylaatti-metosulfaatin (EP-patenttihakemus 82 636, sivu 10) vasta-ainekonjugaatin valoemission kinetiikkaa. 100 μ1:η suuruisten kulloinkin kyseessä olevien merkkiaineliuosten kemiluminointi herätetään lisäämällä 350 μΐ 0,05-mol. KCl/NaOH-puskuria pH 13 + 0,1 % H202 ja 10 tallennetaan 10 sekunnin ajanjaksoin.Thus, Figure 1 shows the light emission kinetics of an antibody conjugate of the acridinium thioester (Compound 6) prepared according to Example 1 and Figure 2 shows the kinetics of 4- (2-succinimidyloxycarbonylethyl) phenyl-10-methylacryl-5-dinium-9-carboxylate methosulfate. (EP patent application 82 636, page 10) the kinetics of light emission of an antibody conjugate. The chemiluminescence of the respective tracer solutions of 100 μ1 η is induced by adding 350 μΐ 0,05 mol. KCl / NaOH buffer pH 13 + 0.1% H 2 O 2 and 10 are stored at 10 second intervals.
Kuviossa 1 maksimi valoemissio saavutetaan jo 0,66 sekunnin kuluttua ja on pudonnut 0,88 sekunnin kuluttua jo jälleen puoleen. Sitä vastoin kuviossa 2 maksimi valo-emissio saavutetaan vasta 1,77 sekunnin kuluttua ja on 15 pudonnut vasta 2,88 sekunnin kuluttua jälleen puoleen.In Fig. 1, the maximum light emission is reached after 0.66 seconds and has dropped again after 0.88 seconds. In contrast, in Fig. 2, the maximum light emission is reached only after 1.77 seconds and has dropped to half again only after 2.88 seconds.
Kuvioista 1 ja 2 ilmenee, että keksinnön mukaisil la tioalkyyliesterityyppisillä yhdisteillä on selvästi lyhyempi valoemissioaika kuin läheisimmillä tekniikan tasosta tunnetuilla yhdisteillä (EP-A 82 636). Kuvioista la 20 ja 2a puolestaan ilmenee, että myös keksinnön mukaisilla asyylisulfonamidityyppisillä yhdisteillä on sama tekninen teho. Näissä kuvioissa on verrattu keksinnön mukaisten asyylisulfonamidityyppisten yhdisteiden (ASAM) ja tunnettujen fenyyliesterityyppisten yhdisteiden (AE) valoemis-25 siokinetiikkaa keskenään. Tuloksista havaitaan, että keksinnön mukaiset asyylisulfonamidityyppiset yhdisteet osoittavat välittömästi mittauksen alettua huomattavasti korkeamman signaalin kuin tunnetut fenyyliesterityyppiset yhdisteet. Täten kaikilla keksinnön mukaisilla yhdisteil-30 lä on sama tekninen teho.It can be seen from Figures 1 and 2 that the thioalkyl ester type compounds according to the invention have a clearly shorter light emission time than the closest compounds known from the prior art (EP-A 82 636). Figures 1a, 20 and 2a, on the other hand, show that the acylsulfonamide-type compounds according to the invention also have the same technical effect. These figures compare the photokinetic kinetics of the acylsulfonamide-type compounds of the invention (ASAM) and the known phenyl ester-type compounds (AE). The results show that the acylsulfonamide-type compounds according to the invention show a significantly higher signal than the known phenyl ester-type compounds immediately after the start of the measurement. Thus, all the compounds of the invention have the same technical potency.
Täysin odottamatonta on, että amidityppeen sulfo-nyylisubstituoidulla akridinium-9-karboksyylihappoamidil-la on erinomainen kemiluminointi, sillä tunnettua on, että akridinium-9-karboksyylihappoamidilla päinvastoin kuin 35 akridinium-9-karboksyylihappoestereillä ei esiinny min- 8 90542 käänlaista kemiluminointia (vrt. F. McCapra, W.It is completely unexpected that the sulfonyl-substituted acridinium-9-carboxylic acid amide of the amide nitrogen has excellent chemiluminescence, as it is known that acridinium-9-carboxylic acid amide, in contrast to 35 acridinium-9-carboxylic acid esters, does not show McCapra, W.
Carruthers ja J.K. Sutherland: Progress in Organic Chem., Voi. 8, 231 - 277, 1973, Butterworth, Lontoo).Carruthers and J.K. Sutherland: Progress in Organic Chem., Vol. 8, 231-277, 1973, Butterworth, London).
Keksinnön mukaisia akridinium-9-karboksyylihappo-5 tioestereitä voidaan valmistaa seuraavaa tietä:The acridinium-9-carboxylic acid-5 thioesters of the invention can be prepared by the following route:
Akridiinin annetaan reagoida Lehmstedfin ja Hundertmark'in julkaisussa Ber. 63, 1229 (1930) esittämän menetelmän mukaisesti etanoli/jääetikassa ja kaliumsyani-din läsnä ollessa 9-syaaniakridiiniksi. Tästä saadaan 10 uudelleen kiteyttämisen jälkeen antamalla reaktion tapahtua rikkihapon ja natriumnitriitin kanssa Lehmstedfin ja Wirth'in julkaisussa Ber. 61, 2044 (1928) selostaman menetelmän mukaisesti akridiini-9-karboksyylihappoa. Antamalla akridiini-9-karboksyylihapon reagoida tionyylik- 15 loridin kanssa, saadaan kaavan VIII mukaista yhdistettä r2-000~ r3 | (VIII)Acridine is reacted in Lehmstedf and Hundertmark, Ber. 63, 1229 (1930) in ethanol / glacial acetic acid and in the presence of potassium cyanide to 9-cyanoacridine. This is obtained after recrystallization by allowing the reaction to take place with sulfuric acid and sodium nitrite in Lehmstedf and Wirth, Ber. 61, 2044 (1928) according to the method described in Acridine-9-carboxylic acid. Reaction of acridine-9-carboxylic acid with thionyl chloride gives a compound of formula VIII r2-000 ~ r3 | (VIII)
AA
20 OY20 OY
jossa Y merkitsee klooria. Halogeenin asemesta Y:n paikalle yhdisteeseen VIII voidaan sijoittaa myös oksikarbo-nyyli-C1.5-alkyyli-, oksikarbonyyliaryyli- tai imidatsoli-diryhmä.where Y is chlorine. Instead of halogen, an oxycarbonyl-C 1-5 alkyl, oxycarbonylaryl or imidazole group can also be placed in place of Y in compound VIII.
25 Happokloridin (VIII) annetaan sitten reagoida kaa van IX mukaisen tiolikarboksyylihapon, HS-X-COOH (IX) 30 esim. 2-merkaptobentsoehapon kanssa aikalisissä olosuhteissa tioliesterikarboksyylihapoksi, joka sen jälkeen esteröidään tähteen R5 valmistamiseen soveltuvan yhdisteen, esimerkiksi N-hydroksisukkiini-imidin kanssa. Tämän jälkeen akridiiniyhdisteen 10-asema alkyloidaan kirjaili- 9 90542 suuden tuntemien menetelmien mukaisesti. Metylointiin soveltuu ennen kaikkea trimetyylioksoniumtetrafluoriboraat-ti, joskin myös dimetyylisulfaatin, metyylifluorisulfonaa-tin, tolueenisulfonihappometyyliesterin tai trifluorime-5 taanisulfonihappometyyliesterin kanssa saadaan hyviä kemi-luminoivan akridiumyhdisteen saantoja.The acid chloride (VIII) is then reacted with a thiol carboxylic acid of formula IX, HS-X-COOH (IX), e.g. 2-mercaptobenzoic acid, under temporal conditions to give a thiol ester carboxylic acid, which is then esterified with a compound suitable for the preparation of residue R5, e.g. N-hydroxysuccinimide. . The 10-position of the acridine compound is then alkylated according to methods known in the art. Trimethyloxonium tetrafluoroborate is particularly suitable for methylation, although good yields of the chemiluminescent acridium compound are also obtained with dimethyl sulfate, methyl fluorosulfonate, toluenesulfonic acid methyl ester or trifluoromethanesulfonic acid methyl ester.
Keksinnön mukaisten akridinium-sulfoniamidijohdannaisten valmistamiseksi lähdetään myös akridiini-9-karbok-syylihappokloridista (VIII). Tämän yhdisteen annetaan sit-10 ten reagoida primaarisen tai sekundaarisen sulfoniamidin, ensisijaisesti suojatun kaavan X mukaisen sulfoniamidi-karboksyylihapon H 0 15 R6 - S02 - N - X - C - OZ (X) tai kaavan XI mukaisen suojatun sulfoniamidikarboksyyli-haponThe acridinium sulfonamide derivatives according to the invention are also prepared from acridine-9-carboxylic acid chloride (VIII). This compound is then reacted with a primary or secondary sulfonamide, preferably a protected sulfonamide carboxylic acid of formula X H 0 15 R 6 - SO 2 - N - X - C - OZ (X) or a protected sulfonamide carboxylic acid of formula XI
20 H20 H
R6 - N - S02 - X - COOZ (XI) kanssa, joissa kaavoissa X:llä ja R^:lla on edellä mainitut merkitykset ja Z on karboksiryhmää suojaava tähde, 25 joka sen jälkeen lohkaistaan pois. Tätä reaktiota varten suojaryhmänä voidaan käyttää esimerkiksi N-bentseenisulfo-nyyliglysiinibentsyyliesteriä. Suojaryhmän lohkaisemisen jälkeen syntyvä happo muutetaan sitten sopivan, esimerkiksi N-hydroksisukkiini-imidin kanssa, tähteeksi R^. Tästä 30 saadaan kemiluminoivaa akridiniumyhdistettä kirjallisuuden tuntemin menetelmin alkyloimalla 10-asemassa oleva typpi.With R 6 - N - SO 2 --X - COOZ (XI), in which formulas X and R 1 have the meanings given above and Z is a carboxy protecting group which is then cleaved off. For this reaction, for example, N-benzenesulfonylglycine benzyl ester can be used as a protecting group. The acid formed after cleavage of the protecting group is then converted to the appropriate residue, for example with N-hydroxysuccinimide. From this, a chemiluminescent acridinium compound is obtained by alkylation of the nitrogen at the 10-position by methods known in the literature.
Saadut akridiniumyhdisteet voivat sitten reagoida biologisesti mielenkiintoisen aineen, esim. antigeenin, 35 vasta-aineen, hormonin, lääkeaineen, lääkeainemetaboliit-tien, toksiinin tai alkaloidin kanssa luminoivaksi yhdis- 10 90542 teeksi. Tällöin akridiniumjohdannainen sitoutuu joko suoraan tai siltamolekyylin, kuten polylysiinin, polyglutamii-nihapon tai polyvinyyliamiinin välityksellä biologisesti mielenkiintoiseen aineeseen muodostaen stabiilin, immuno-5 logisesti aktiivisen konjugaatin. Tätä konjugaattia nimitetään myös merkkiaineeksi ja sitä käytetään seuraavassa selostetuissa luminesenssi-immunoanalyyseissä. Keksinnön mukaista luminesenssi-immunoanalyysiä varten, antigeenin määrittämiseksi nestenäytteessä asianmukaisen tai Sandwich-10 menetelmän mukaisesti, tarvitaan ainakin yksi immunologi-sesti aktiivinen komponentti, joka on kiinnittyneenä kiinteään faasiin ja lisäksi luminoivaa merkkiainetta. Lumi-nesenssi-immunoanalyysi voidaan sitten suorittaa eri tavoin.The resulting acridinium compounds can then react with a biologically interesting agent, e.g., an antigen, antibody, hormone, drug, drug metabolite, toxin, or alkaloid, to form a luminescent compound. In this case, the acridinium derivative binds either directly or via a bridge molecule such as polylysine, polyglutamic acid or polyvinylamine to the biologically interesting substance to form a stable, immunologically active conjugate. This conjugate is also referred to as a tracer and is used in the luminescence immunoassays described below. For the luminescence immunoassay of the invention, at least one immunologically active component attached to the solid phase and in addition a luminescent label is required to determine the antigen in a fluid sample according to the appropriate or Sandwich-10 method. The placebo immunoassay can then be performed in various ways.
15 Eräänä mahdollisuutena on se, että antigeenin kans sa spesifisesti reagoivia kiinnitettyjä vasta-aineita inku-boidaan tutkittavan nesteen näytteen ja antigeenin ja ke-miluminoivan akridiniumjohdannaisen (antigeenimerkkiaine) konjugaatin kanssa, näyte ja sitoutumaton merkkiaine ero-20 tetaan, sitoutunut merkkiaine saatetaan hapetusaineen yhteyteen valoemission aiheuttamiseksi ja sitten mitatusta valoemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.One possibility is that the attached antibodies that specifically react with the antigen are incubated with a sample of the test fluid and the conjugate of the antigen and the chemiluminescent acridinium derivative (antigen marker), the sample and the unbound marker are separated, the bound marker is brought into contact with the oxidant. and then the amount of antigen present is determined from the measured intensity of light emission.
Toisena mahdollisuutena aluminesenssi-immunoanalyy-25 sin suorittamiseksi on se, että antigeenin kanssa spesifisesti reagoivaa kiinnitettyä vasta-ainetta tutkittavan nesteen näytteen kanssa inkuboidaan toisen, spesifisesti reagoivan vasta-aineen ja kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin kanssa, näyte ja sitoutumaton, merkit-30 ty konjugaatti erotetaan, sitoutunut, merkitty konjugaat-ti saatetaan hapetusaineen yhteyteen, valoemission aiheuttamiseksi ja mitatusta valoemission voimakkuudesta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.Alternatively, to perform an aluminescence immunoassay, an incubated antibody of a specific antibody that specifically reacts with the antigen is incubated with a sample of the test fluid and another chemiluminescent acridinium derivative conjugate, and the unbound conjugate is labeled. the bound, labeled conjugate is contacted with an oxidizing agent to cause light emission, and the amount of antigen present is determined from the measured intensity of light emission.
Edellä mainitut luminesenssi-immunoanalyysit voi-35 daan suorittaa myös siten, että tutkittava neste erotetaan t! 11 90542 kiinnittyneestä vasta-aineesta ennen merkityn konjugaatin lisäämistä.The above-mentioned luminescence immunoassays can also be performed by separating the liquid to be examined. 11,90542 of bound antibody prior to addition of labeled conjugate.
Toisissa keksinnön mukaisesti suoritettavissa olevissa luminesenssi-immunoanalyyseissä kiinnitettynä ei ole 5 vasta-aine, vaan antigeeni.In other luminescence immunoassays according to the invention, the attached is not an antibody but an antigen.
Siten vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa kiinnitettyä antigeeniä voidaan inkuboida tutkittavan nesteen näytteen ja vasta-aineen ja kemiluminoivan akridi-niumjohdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, sitten näyte 10 ja sitoutumaton merkitty konjugaatti erotetaan ja sen jälkeen sitoutunut, merkitty konjugaatti saatetaan yhteen ha-petusaineen kanssa. Tällöin tapahtuu valoemissiota, jonka voimakkuudesta voidaan määrittää läsnä olevan antigeenin määrä.Thus, the attached antigen that specifically reacts with the antibody can be incubated with a solution of the test fluid sample and the conjugate of the antibody and the chemiluminescent acridinium derivative, then Sample 10 and the unbound labeled conjugate are separated, and then the bound, labeled conjugate is combined with the oxidant. In this case, light emission occurs, the intensity of which can be used to determine the amount of antigen present.
15 Eräs muu muunnelma perustuu siihen, että vasta-ai neen kanssa spesifisesti reagoivaa, kiinnitettyä antigeeniä inkuboidaan vasta-aineen ja kemiluminoivan akridinium-johdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, reagoitumaton, merkitty konjugaatti erotetaan, lisätään näytettä tutkit-20 tavasta nesteestä, sen jälkeen näyte erotetaan uudelleen, sitoutunut merkitty konjugaatti saatetaan yhteen hapetus-aineen kanssa valoemission aiheuttamiseksi ja tästä määritetään sitten läsnä olevan antigeenin määrä.Another variation is based on incubating the attached antigen that specifically reacts with the antibody with a solution of the conjugate of the antibody and the chemiluminescent acridinium derivative, separating the unreacted, labeled conjugate, adding a sample of the test fluid, then re-separating the sample. , the bound labeled conjugate is contacted with an oxidizing agent to cause light emission and then the amount of antigen present is determined.
Lopuksi luminesenssi-immunoanalyysi voidaan suorit-25 taa myös sillä tavalla, että vasta-aineen kanssa spesifisesti reagoivaa kiinnitettyä antigeeniä inkuboidaan vasta-aineen ja kemiluminoivan akridiniumjohdannaisen konjugaatin liuoksen kanssa, lisätään näyte tutkittavasta nesteestä, näyte ja sitoutumaton konjugaatti erotetaan, si-30 toutunut, merkitty konjugaatti saatetaan yhteen hapetusai-neen kanssa ja sitten mitatusta valoemissiosta määritetään läsnä olevan antigeenin määrä.Finally, the luminescence immunoassay can also be performed by incubating the attached antigen that specifically reacts with the antibody with a solution of the antibody and the chemiluminescent acridinium derivative conjugate, adding a sample of the test fluid, separating the sample, and binding the unbound conjugate. the conjugate is contacted with an oxidizing agent and then the amount of antigen present is determined from the measured light emission.
Keksinnön mukaisten akridiniumyhdisteiden valmistus esitetään esimerkein 1-3.The preparation of the acridinium compounds of the invention is illustrated by Examples 1-3.
12 90 54212 90 542
Esimerkki 1 9-syaaniakridiini (1)Example 1 9-Cyanoacridine (1)
Akridiiniin (10 g), joka on 45 ml:ssa etanolia, lisätään 3,3 ml jääetikkaa ja tiputtamalla liuos, jossa on 5 5,25 g kaliumsyanidia 8 ml:ssa vettä, reaktioseosta läm mitetään kiehuttaen kaksi tuntia, jäähdytetään ja haihtuvat osat imetään pois vakuumissa. Jäännöstä sekoitetaan 30 ml:n kanssa 2-norm. NaOH, suodatetaan ja kahteen kertaan 2 norm. NaOH:11a ja vedellä pesemisen jälkeen tuot-10 teen annetaan olla jonkin aikaa kosteana ilmassa. Raaka-tuotetta sekoitetaan metyleeniklorissa, liukenematon aine suodatetaan erilleen ja pestään metyleenikloridilla, yhdistetyt orgaaniset faasit haihdutetaan kuiviin ja raaka syaaniakridiini kiteytetään uudelleen n-butyyliasetaa-15 tista.To acridine (10 g) in 45 ml of ethanol is added 3.3 ml of glacial acetic acid and a solution of 5.25 g of potassium cyanide in 8 ml of water is added dropwise, the reaction mixture is heated to reflux for two hours, cooled and the volatiles are filtered off with suction. away in a vacuum. The residue is mixed with 30 ml of 2-norm. NaOH, filtered and after washing twice with 2N NaOH and water, the product is allowed to remain humid in the air for some time. The crude product is stirred in methylene chloride, the insoluble matter is filtered off and washed with methylene chloride, the combined organic phases are evaporated to dryness and the crude cyanoacridine is recrystallized from n-butyl acetate.
Saanto: 50 %. Sulamispiste: 183 - 5°C.Yield: 50%. Melting point: 183-5 ° C.
IR: 2230 cm-1IR: 2230 cm-1
Akridiini-9-karboksyylihappo (2) 9-syaaniakridiini (5 g) lisätään hitaasti annoksit-20 tain 40 ml:aan väkevää H2SO^ ja seosta lämmitetään kaksi tuntia 90 - 95°C:ssa; sen jälkeen kun on lisätty 8,5 g NaN02 sekoitetaan edelleen kaksi tuntia tässä lämpötilassa. Kuuma liuos lisätään nopeasti sekoittaen 620 ml:aan ... jäävettä, sakka suodatetaan erilleen ja liuotetaan mahdol- 25 lisimman pieneen määrään 2-norm. NaOH. Liuos suodatetaan ja tehdään happameksi 50-%:isella H2SO(j:llä, erilleen laskenut akridiini-9-karboksyylihappo suodatetaan eril-leen ja kuivataan vakuumissa.Acridine-9-carboxylic acid (2) 9-Cyanoacridine (5 g) is slowly added portionwise to 40 ml of concentrated H 2 SO 4 and the mixture is heated for two hours at 90-95 ° C; after the addition of 8.5 g of NaNO2, stirring is continued for two hours at this temperature. The hot solution is added with rapid stirring to 620 ml of ... ice water, the precipitate is filtered off and dissolved in as little 2-norm as possible. NaOH. The solution is filtered and acidified with 50% H 2 SO 4, the separated acridine-9-carboxylic acid is filtered off and dried in vacuo.
Saanto: 95 %. Sulamispiste: 288 - 9°C.Yield: 95%. Melting point: 288-9 ° C.
·. 30 IR: 3440 (br), 3 200 (br), 2600-2500 (br), 1980; 1650; 1605; 1420 cm"1·. IR: 3440 (br), 3,200 (br), 2600-2500 (br), 1980; in 1650; in 1605; 1420 cm "1
Akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridi (3)Acridine-9-carboxylic acid hydrochloride (3)
Akridiini-9-karboksyylihappo (5 g) lisätään annoksittain 50 ml:aan vastatislattua SOCI2 ja lämmitetään kie-35 huttaen viisi tuntia; kirkas liuos konsentroidaan tislaamalla, kunnes alkaa muodostua sakkaa, saostuminen täyden- I, 13 90542 netään lisäämällä sykloheksaania ja jäähdyttämällä- Suodattamalla sakka erilleen ja kuivaamalla vakuumissa saadaan akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridia. Saanto: 90 %. Sulamispiste: 223°C.Acridine-9-carboxylic acid (5 g) is added portionwise to 50 ml of freshly distilled SOCl 2 and heated at reflux for five hours; the clear solution is concentrated by distillation until a precipitate begins to form, the precipitation is completed by adding cyclohexane and cooling. The precipitate is filtered off and dried in vacuo to give acridine-9-carboxylic acid chloride hydrochloride. Yield: 90%. Melting point: 223 ° C.
5 Alkuaineanalyysi (laskettu yhdisteelle C^H^CINO x HC1) Laskettu: C 60,5 H 2,8 H 5,0 Cl 25,5 Saatu: C 59,4 H 3,3 N 5,0 Cl 25,2 (Fenyyli-21-karboksyylihappo)akridiini-9-tiokarbok-sylaatti (4) 10 Akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridi (30 g) suspendoidaan 720 ml:aan metyleenikloridia, lisätään tiosalisyylihappoa (17,7 g) ja 50 ml trietyyliamii-nia, sen jälkeen kirkastuvaa liuosta sekoitetaan 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun liuotin on 15 imetty pois, jäännökseen lisätään 35 g soodaa ja 1 400 ml vettä, saatua liuosta konsentroidaan, kunnes ilmestyy sakkaa, tämä suodatetaan erilleen. Suodos kyllästetään NaCl:lla ja myöskin tällöin alas laskenut sakka suodatetaan erilleen. Yhdistettyjen sakkojen vesiliuos tehdään 20 80°C:ssa happameksi jääetikkahapolla, alas laskenut sakka suodatetaan erilleen ja kuivataan vakuumissa.Elemental analysis (calculated for C 12 H 12 ClNO x HCl) Calculated: C 60.5 H 2.8 H 5.0 Cl 25.5 Found: C 59.4 H 3.3 N 5.0 Cl 25.2 ( Phenyl-21-carboxylic acid) acridine-9-thiocarboxylate (4) Acridine-9-carboxylic acid chloride hydrochloride (30 g) is suspended in 720 ml of methylene chloride, thiosalicylic acid (17.7 g) and 50 ml of triethylamine are added, then the clarifying solution is stirred for 10 minutes at room temperature. After the solvent has been filtered off with suction, 35 g of soda and 1400 ml of water are added to the residue, and the resulting solution is concentrated until a precipitate appears, which is filtered off. The filtrate is saturated with NaCl and also the precipitate which has fallen off is filtered off. The aqueous solution of the combined precipitates is acidified with glacial acetic acid at 80 [deg.] C., the precipitate formed is filtered off and dried in vacuo.
Saanto: 80 %. Sulamispiste: 261 - 5°C.Yield: 80%. Melting point: 261-5 ° C.
NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 7,6-8,4 ppm, kompleksinen multipletti IR: 1680 cm-1 (s), 1720 (m) 1260 (s) 25 21 -(sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli)fenyyliakri-diini-9-tiokarboksylaatti (5)NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 7.6-8.4 ppm, complex multiplet IR: 1680 cm-1 (s), 1720 (m) 1260 (s) δ 21- (succinimidoyloxycarbonyl) phenylacridine -9-thiocarboxylate (5)
Suspensioon, jossa on 10 g tioliesterikarboksyyli-happoa 190 ml:ssa kuivaa tetrahydrofuraania, lisätään 30 0°C:ssa 3,2 g N-hydroksisukkiini-imidiä, sitten -20°C:ssa 6,9 g disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC) ja sen jälkeen sekoitetaan -20°C:ssa kaksi tuntia, sitten yön ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun on lisätty 0,28 ml jää-' : etikkaa, sekoitetaan tunnin ajan, sitten lisätään etyyli- 35 asetaattia (25 ml) ja sakka suodatetaan erilleen. Suodos haihdutetaan kuiviin ja klooribentseenistä uudelleen- 14 90 542 kiteyttämisen jälkeen saadaan vaaleankeltaista 2'-(sukkiini -imidoyylioksikarbonyyli)fenyyliakridiini-9-tiokarboksy-laattia.To a suspension of 10 g of thiol ester carboxylic acid in 190 ml of dry tetrahydrofuran is added 3.2 g of N-hydroxysuccinimide at 30 ° C, then 6.9 g of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) at -20 ° C. and then stirred at -20 ° C for two hours, then overnight at room temperature. After the addition of 0.28 ml of glacial acetic acid, the mixture is stirred for 1 hour, then ethyl acetate (25 ml) is added and the precipitate is filtered off. The filtrate is evaporated to dryness and recrystallization from chlorobenzene gives a pale yellow 2 '- (succinimidoyloxycarbonyl) phenylacridine-9-thiocarboxylate.
Saanto: 80 %. Sulamispiste: 198 - 200°C.Yield: 80%. Melting point: 198-200 ° C.
5 IR: 1810 cm"1, 1780, 1745, 1225, 1205 NMR (DMSO), 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s. 4Ή), 7,7-8,4 ppm (m, 12H) 21 -(sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli)fenyyli-10-10 metyyliakridinium-9-tiokarboksylaatti-tetrafluori- boraatti (6) 3 g N-hydroksisukkiini-imidiesteriä (5) lämmitetään 7,8 g:n kanssa trimetyylioksoniumtetrafluoriboraattia 40 ml:ssa 1,2-dikloorietaania kahdeksan tuntia 80°C:ssa 15 ja sen jälkeen sekoitetaan yön ajan huoneen lämpötilassa. Sakka suodatetaan erilleen ja kiehautetaan 1,2-dikloori-etaanin kanssa. Yhdistetyt orgaaniset faasit haihdutetaan kuiviin ja kiteytetään uudelleen asetoni-di-isopropyyli-eetteriseoksesta.Δ IR: 1810 cm -1, 1780, 1745, 1225, 1205 NMR (DMSO), 100 MHz): δ = 2.95 ppm (s. 4Ή), 7.7-8.4 ppm (m, 12H) - (succinimidoyloxycarbonyl) phenyl 10-10 methyl acridinium 9-thiocarboxylate tetrafluoroborate (6) 3 g of N-hydroxysuccinimide ester (5) are heated with 7.8 g of trimethyloxonium tetrafluoroborate in 40 ml of 1,2- dichloroethane for eight hours at 80 [deg.] C. and then stirred overnight at room temperature, the precipitate is filtered off and boiled with 1,2-dichloroethane, the combined organic phases are evaporated to dryness and recrystallized from acetone-diisopropyl ether.
20 Saanto: 40 %. Sulamispiste: 245°C.20 Yield: 40%. Melting point: 245 ° C.
IR: 3440 cm"1 (br), 1800, 1780, 1740(s), 1670, 1065(s) NMR (DMSO, 100 MHz); 5= 3,0 ppm (s, 4H), 4,95 ppm (s, hieman leventyn.3H), 7,9-8,6 (m, 10H), 9,9 ppm (d, 2H) 25IR: 3440 cm -1 (br), 1800, 1780, 1740 (s), 1670, 1065 (s) NMR (DMSO, 100 MHz); δ = 3.0 ppm (s, 4H), 4.95 ppm ( s, slightly broadened (3H), 7.9-8.6 (m, 10H), 9.9 ppm (d, 2H)
Esimerkki 2Example 2
Sukkiini-imidoyylioksikarbonyylimetyyli-10-metyy-liakridinium-9-tiokarboksylaatti-tetrafluoriboraatin valmistus, lähtemällä happokloridista (3) ja tioglykoli-30 haposta, tapahtuu yhdisteen (6) synteesin mukaisesti. Yk--- sityisten synteesivaiheiden saannot samoin kuin tuotteiden (7) - (9) spektroskooppiset ominaisuudet on esitetty seu-raavassa:The preparation of succinimidoyloxycarbonylmethyl 10-methylacridinium 9-thiocarboxylate tetrafluoroborate, starting from acid chloride (3) and thioglycolic acid, takes place according to the synthesis of compound (6). The yields of the general synthetic steps as well as the spectroscopic properties of the products (7) to (9) are shown below:
Karboksimetyyliakridiini-9-tiokarboksylaatti (7) 35 Saanto: 60 %. Sulamispiste: 218°C (hajoten).Carboxymethyl acridine-9-thiocarboxylate (7) 35 Yield: 60%. Melting point: 218 ° C (decomposes).
l· 15 90542 IR: 3440 cm-1 (br) , 2400(br), 1950(br), 1710(m), 1660(s), 1070(m) NMR (DMSO, 100 MHz): δ= 4,25 ppm (s, 2H); 7,6-8,4 (m, 8H) 5 Sukkiini-imidoyylioksikarbonyylimetyyliakridiini-9- tiokarboksylaatti (8)1 · 15 90542 IR: 3440 cm-1 (br), 2400 (br), 1950 (br), 1710 (m), 1660 (s), 1070 (m) NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 4, 25 ppm (s. 2H); 7.6-8.4 (m, 8H) Succinimidoyloxycarbonylmethylacridine-9-thiocarboxylate (8)
Saanto: 80 %.Yield: 80%.
IR: 3440 cm-1 (br), 2930, 1820, 1785, 1740(a), 1205, 1165 NMR (DMSO, 100 MHz); 6= 2,95 ppm (s, 4H), 4,77 ppm (s, 2H), 10 7,6-8,3 ppm (m, 8H)IR: 3440 cm-1 (br), 2930, 1820, 1785, 1740 (a), 1205, 1165 NMR (DMSO, 100 MHz); Δ = 2.95 ppm (s, 4H), 4.77 ppm (s, 2H), δ 7.6-8.3 ppm (m, 8H)
Sukkiini-iInidoyylioksikarbonyyl·imetyyli-10-metyyli-akridinium-9-tiokarboksylaatti-tetrafluoriboraat-ti (9) 15 Saanto: 40 %. Sulamispiste: 250°C.Succinimidoyloxycarbonylmethyl 10-methylacridinium 9-thiocarboxylate tetrafluoroborate (9) Yield: 40%. Melting point: 250 ° C.
IR: 3440 cm"1 (br) , 1810, 1780, 1735(a), 1538, 1350, 1060 NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,9 ppm (s, 4H), 4,8 (s, 2H), 4,9 ppm, (s, 3H), 7,7-9,0 (m, 8H) 20IR: 3440 cm -1 (br), 1810, 1780, 1735 (a), 1538, 1350, 1060 NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2.9 ppm (s, 4H), 4.8 (s, 2H), 4.9 ppm, (s, 3H), 7.7-9.0 (m, 8H) 2 O.
Esimerkki 3 N-bentseenisulfonyyli-N-(bentsyylioksikarbonyyli-metyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi (10) 3,3 g:aan N-bentseenisulfonyyliglysiinibentsyyli-25 esteriä, joka on 110 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisätään 130 mg 4-(dimetyyliamino)pyridiiniä ja 6 ml trietyyli-amiinia, 10 minuutin kuluttua lisätään 3 g akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridia ja muodostunutta suspensiota lämmitetään kuusi tuntia kiehuttaen. Sakka 30 suodatetaan erilleen, liuotin imetään pois, jäännös liuotetaan metyleenikloridiin ja sekoitetaan lyhyt aika 2-norm. NaOH:n kanssa. MgSO^:lla kuivaamisen jälkeen orgaaninen faasi haihdutetaan kuiviin ja saatu jäännös kiteytetään uudelleen tolueeni/heptaaniseoksesta.Example 3 N-Benzenesulfonyl-N- (benzyloxycarbonylmethyl) acridine-9-carboxylic acid amide (10) To 3.3 g of N-benzenesulfonylglycine benzyl ester in 110 ml of tetrahydrofuran is added 130 mg of 4- (dimethylamino) pyridine and 6 ml of triethylamine, after 10 minutes 3 g of acridine-9-carboxylic acid hydrochloride are added and the resulting suspension is heated at reflux for six hours. The precipitate 30 is filtered off, the solvent is filtered off with suction, the residue is dissolved in methylene chloride and stirred briefly for 2-norm. With NaOH. After drying over MgSO 4, the organic phase is evaporated to dryness and the residue obtained is recrystallized from toluene / heptane.
35 Saanto: 70 %. Sulamispiste: 58°C.Yield: 70%. Melting point: 58 ° C.
16 90542 IR: 3440 cm-1 (br), 1735, 1680, 1357, 1165 NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 5,2 ppm (s, 2H), 5,3 ppm (s, 2H), 7,0-8,4 ppm (m, 18H ) 5 N-bentseenisulfonyyli-N-(karboksimetyyli)akridiini- 9-karboksyylihappoamidi (11) I g N-bentseenisulfonyyli-N-(bentsyylioksikarbo-nyylimetyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidia hydrataan 60 ml:ssa jääetikkaa lisäämällä 2 ml väkevää HC1 ja Pd/C:tä 10 (10 %) huoneen lämpötilassa ja normaalipaineessa; reaktion päätyttyä katalyytti suodatetaan pois, suodoksesta saadaan kuiviin haihduttamalla karboksyylihappoa keltaisena kiinteänä aineena.16 90542 IR: 3440 cm-1 (br), 1735, 1680, 1357, 1165 NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 5.2 ppm (s, 2H), 5.3 ppm (s, 2H), δ .0-8.4 ppm (m, 18H) δ N-Benzenesulfonyl-N- (carboxymethyl) acridine-9-carboxylic acid amide (11) 1 g of N-benzenesulfonyl-N- (benzyloxycarbonylmethyl) acridine-9-carboxylic acid amide is hydrogenated 60 in ml of glacial acetic acid by adding 2 ml of concentrated HCl and Pd / C at 10 (10%) room temperature and normal pressure; after completion of the reaction, the catalyst is filtered off, the filtrate is dried by evaporation of the carboxylic acid as a yellow solid.
NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 5,0 ppm (s, 2H), 7,1-8,5 ppm (m, 1 3H) 15NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 5.0 ppm (s, 2H), 7.1-8.5 ppm (m, 13H)
Yhdisteen (11) annetaan reagoida N-hydroksisukkii-ni-imidin kanssa samalla tavalla kuin valmistettaessa yhdistettä (5), N-bentseenisulfonyyli-N-(sukkiini-imidoyyli-oksikarbonyylimetyyliakridiini-9-karboksyylihappoamidiksi 20 (12). (12) kvaternoidaan (6):n yhteydessä selostetulla ta valla N-bentseenisulfonyyli-N-(sukkiini-imidoyylioksikar-bonyylimetyyli)-10-metyyliakridinium-9-karboksyylihappo-amidi-tetrafluoriboraatiksi (13) .Compound (11) is reacted with N-hydroxysuccinimide in the same manner as in the preparation of compound (5) to give N-benzenesulfonyl-N- (succinimidoyloxycarbonylmethylacridine-9-carboxylic acid amide 20 (12). (12) is quaternized (6). ) to N-benzenesulfonyl-N- (succinimidoyloxycarbonylmethyl) -10-methylacridinium-9-carboxylic acid amide tetrafluoroborate (13).
Esimerkki 4 25 N-fenyyli-N-(4-bentsyylioksikarbonyylibentseeni- sulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi (14) II g:aan 4-(N-fenyylisulfamido)bentsoehappobentsyy-liesteriä, joka on 300 ml:ssa metyleenikloridia, lisätään 360 mg 4-(dimetyyliamino)pyridiiniä ja 16,6 ml trietyyli- 30 amiinia, 10 minuutin kuluttua lisätään 8,34 g akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridia (3) ja lämmitetään kiehuttaen 16 tuntia. Jäähdytettyä liuosta sekoitetaan lyhyen ajan 2-norm. NaOH:n kanssa, erotettu orgaa-ninen faasi pestään vedellä, kuivataan Na2S0^:lla ja haih-35 dutetaan kuiviin. Jäännös kiteytetään uudelleen tolueeni/ - heptaaniseoksesta.Example 4 N-Phenyl-N- (4-benzyloxycarbonylbenzenesulfonyl) acridine-9-carboxylic acid amide (14) To II g of 4- (N-phenylsulfamido) benzoic acid benzyl ester in 300 ml of methylene chloride is added 360 mg 4- (dimethylamino) pyridine and 16.6 ml of triethylamine, after 10 minutes 8.34 g of acridine-9-carboxylic acid hydrochloride (3) are added and the mixture is heated at reflux for 16 hours. The cooled solution is stirred briefly for 2-norm. With NaOH, the separated organic phase is washed with water, dried over Na2SO4 and evaporated to dryness. The residue is recrystallized from toluene / heptane.
I: 17 90542I: 17 90542
Saanto: 70 %. Sulamispiste: 161 - 163°C.Yield: 70%. Melting point: 161-163 ° C.
NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 5,5 ppm (s,2H), 6= 6,8-8,6 ppm (m,22H) N-fenyyli-N-(4-karboksibentseenisulfonyyli)akridii-5 ni-9-karboksyylihappoamidi-hydrobromidi (15) 8,58 g N-fenyyli-N-(4-bentsyylioksikarbonyylibent-seenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidia (14) lämmitetään 30 ml:ssa 33-%:ista HBr:n jääetikkaliuosta kaksi tuntia 60°C:ssa, jäähdyttämisen jälkeen siihen lisätään 10 60 ml di-isopropyylieetteriä, sakka suodatetaan imussa erilleen ja kuivataan vakuumissa.NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 5.5 ppm (s, 2H), δ = 6.8-8.6 ppm (m, 22H) N-phenyl-N- (4-carboxybenzenesulfonyl) acridin-5-one -9-carboxylic acid amide hydrobromide (15) 8.58 g of N-phenyl-N- (4-benzyloxycarbonylbenzenesulfonyl) acridine-9-carboxylic acid amide (14) are heated in 30 ml of 33% HBr glacial acetic acid solution for two hours. At 60 [deg.] C., after cooling, 60 ml of diisopropyl ether are added, the precipitate is filtered off with suction and dried in vacuo.
Saanto: 95 %. Sulamispiste: 255°C.Yield: 95%. Melting point: 255 ° C.
NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 6,8-9 ppm (m) 15 N-fenyyli-N-(4-sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli- bentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoami-di (16) 5,63 g:aan N-fenyyli-N-(4-karboksibentseenisulfonyyli) akridiini-9-karboksyylihappoamidi-hydrobromidia (15), 20 joka on 250 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisätään 2,8 ml trietyyliamiinia, jäähdytetään -15°C:seen ja lisätään 0,96 ml kloorimuurahaishappoetyyliesteriä. Sekoitetaan 20 minuuttia, lisätään 1,15 g N-hydroksisukkiini-imidiä, sekoitetaan kolme tuntia -15°C:ssa, annetaan lämmetä huo-25 neen lämpötilaan ja sen jälkeen sekoitetaan yön ajan. Sakka suodatetaan pois, suodos haihdutetaan kuiviin, jäännös liuotetaan metyleenikloridiin, saatu liuos pestään vedellä, NaHCO^-liuoksella ja vedellä ja kuivataan Na2S04:lla. Orgaaninen faasi haihdutetaan kuiviin ja 30 jäännös kiteytetään uudelleen tolueenista.NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 6.8-9 ppm (m) N-phenyl-N- (4-succinimidoyloxycarbonylbenzenesulfonyl) acridine-9-carboxylic acid amide (16) 5.63 g: To N-phenyl-N- (4-carboxybenzenesulfonyl) acridine-9-carboxylic acid amide hydrobromide (15) in 250 ml of tetrahydrofuran, 2.8 ml of triethylamine are added, cooled to -15 ° C and 0, 96 ml of chloroformic acid ethyl ester. Stir for 20 minutes, add 1.15 g of N-hydroxysuccinimide, stir for 3 hours at -15 ° C, allow to warm to room temperature and then stir overnight. The precipitate is filtered off, the filtrate is evaporated to dryness, the residue is dissolved in methylene chloride, the solution obtained is washed with water, NaHCO3 solution and water and dried over Na2SO4. The organic phase is evaporated to dryness and the residue is recrystallized from toluene.
Saanto: 50 %. Sulamispiste 226°C (hajoten).Yield: 50%. Melting point 226 ° C (decomposed).
: NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6= 6,8-8,7 ppm (m,17H) 18 90542 N-fenyyli-N-(4-sukkiini-imidoyylioksikarbonyyli-bentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9-karb-oksyylihappoamidi-fluorisulfonaatti (17) 1,16 g N-fenyyli-N-(4-sukkiini-imidoyylioksikarbo-5 nyylibentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappoami-dia (16) sekoitetaan 60 ml:ssa 1,2-dikloorietaania 0,3 ml:n kanssa metyylifluorisulfonaattia 24 tuntia huoneen lämpötilassa, alas laskeutunut sakka suodatetaan erilleen ja kuivataan vakuumissa.: NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2.95 ppm (s, 4H), δ = 6.8-8.7 ppm (m, 17H) 18 90542 N-phenyl-N- (4-succinimidoyloxycarbonyl -benzenesulfonyl) -10-methylacridinium-9-carboxylic acid amide fluorosulfonate (17) 1.16 g of N-phenyl-N- (4-succinimidoyloxycarbon-5-ylbenzenesulfonyl) acridine-9-carboxylic acid amide (16) are stirred 60 in ml of 1,2-dichloroethane with 0.3 ml of methyl fluorosulfonate for 24 hours at room temperature, the precipitate which has settled is filtered off and dried in vacuo.
10 Saanto: 65 %.Yield: 65%.
IR: 3420 cm"1 (br), 3100(br), 1805(w), 1770(m) 1745(a), 1700(m), 1385(m), 1280(m), 1255(a), 1230(a), 1205(a), NMR(DMS0, 100 MHz): 5= 2,95 ppm (s,4H), 6= 4,75 ppm (s,br, 3H), 6= 7,0-9,0 ppm (m,17H) 15IR: 3420 cm -1 (br), 3100 (br), 1805 (w), 1770 (m) 1745 (a), 1700 (m), 1385 (m), 1280 (m), 1255 (a), 1230 (a), 1205 (a), NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2.95 ppm (s, 4H), δ = 4.75 ppm (s, br, 3H), δ = 7.0-9 .0 ppm (m, 17H) 15
Massaspektri: m/z = 594 : M+ (kationi)Mass spectrum: m / z = 594: M + (cation)
Esimerkki 5 N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9-20 karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatin (21) valmistus lähtemällä 4-/“N- (4 '-metoksifenyyli) sulfamido_/bentsoehappo-bentsyyliesteristä ja akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridista (3) tapahtuu yhdisteen (17) synteesin mukaisesti (ks. esimerkkiä 4). Yksityisten synteesivaiheiden i 25 saannot samoin kuin spektroskooppiset ominaisuudet on esitetty seuraavassa.Example 5 Preparation of N- (4-methoxyphenyl) -N- (4-succinimidoyloxycarbonylbenzenesulfonyl) -10-methylacridinium-9-20 carboxylic acid amide fluorosulfonate (21) starting from 4- [N- (4'-methoxyphenyl) sulfamido] from benzoic acid benzyl ester and acridine-9-carboxylic acid chloride hydrochloride (3) according to the synthesis of compound (17) (see Example 4). The yields as well as the spectroscopic properties of the individual synthetic steps i 25 are shown below.
N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-bentsyylioksikarbonyyli-bentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappo-amidi (18) 30 Saanto: 70 %. Sulamispiste: 182 - 183°C.N- (4-Methoxy-phenyl) -N- (4-benzyloxycarbonyl-benzenesulfonyl) -acridine-9-carboxylic acid amide (18) 30 Yield: 70%. Melting point: 182-183 ° C.
: NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6= 5,5 ppm (s,2H), 6= 6,35-6,63 ppm (a,br,2H), 6= 7,05-7,2 ppm (d,br,2H), 6= 7,35-3,5 ppm (m,17H) ti 19 90542 N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-karboksibentseenisulfo-nyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi-hydrobro-midi (19): NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 3.5 ppm (s, 3H), δ = 5.5 ppm (s, 2H), δ = 6.35-6.63 ppm (a, br, 2H) , Δ = 7.05-7.2 ppm (d, br, 2H), δ = 7.35-3.5 ppm (m, 17H) t 19,90542 N- (4-methoxyphenyl) -N- (4- carboxybenzenesulfonyl) acridine-9-carboxylic acid amide hydrobromide (19)
Saanto: 95 %. Sulamispiste: 273°C (hajoten).Yield: 95%. Melting point: 273 ° C (decomposed).
5 NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6= 6,4-6,6 ppm (d,br, 2H), δ= 7,05-7,2 ppm (d,br,2H), 6 = 7,7-8,5 ppm (m,12H) N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)akridiini-9-karbok-10 syylihappoamidi (20)Δ NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 3.5 ppm (s, 3H), δ = 6.4-6.6 ppm (d, br, 2H), δ = 7.05-7.2 ppm ( d, br, 2H), δ = 7.7-8.5 ppm (m, 12H) N- (4-methoxyphenyl) -N- (4-succinimidoyloxycarbonylbenzenesulfonyl) acridine-9-carboxylic acid amide ( 20)
Saanto: 50 %. Sulamispiste: 232 - 234°C.Yield: 50%. Melting point: 232-234 ° C.
NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6 = 3,5 ppm (s,3H), 6= 6,4-6,6 ppm (d,br,2H), 6*7,05-7,25 ppm (d,br,2H), 6= 7,8-8,6 ppm (m,12H) IR: 3050 cm-1 1305(w), 1730(m), 15 1740(b), 1700(m), 1505(m), 1370(m), 1250(a), 1200(b), 1185 N-(4-metoksifenyyli)-N-(4-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridi-20 nium-9-karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatti (21)NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2.95 ppm (s, 4H), δ = 3.5 ppm (s, 3H), δ = 6.4-6.6 ppm (d, br, 2H), Δ = 7.05-7.25 ppm (d, br, 2H), δ = 7.8-8.6 ppm (m, 12H) IR: 3050 cm-1 1305 (w), 1730 (m), 15 1740 (b), 1700 (m), 1505 (m), 1370 (m), 1250 (a), 1200 (b), 1185 N- (4-methoxyphenyl) -N- (4-succinimidoyloxycarbonylbenzenesulfonyl) -10-Methylacridine-20-sodium-9-carboxylic acid amide fluorosulfonate (21)
Aine ei saostu erilleen reaktion aikana, se saadaan talteen haihduttamalla liuos kuiviin ja sekoittamalla jäännöstä di-isopropyylieetterin kanssa.The substance does not precipitate during the reaction, it is recovered by evaporating the solution to dryness and stirring the residue with diisopropyl ether.
.*·. Saanto: 80 %.. * ·. Yield: 80%.
. .·. 25 NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6= 3,5 ppm (s,3H), : 6= 4,8 ppm (s,br,3H), 6= 6,45-6,7 ppm (d,br,2H), 6= 7,2-7,4 pprn (d,br,2H), 6= 7,7-9 ppm (m,12H). . ·. NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2.95 ppm (s, 4H), δ = 3.5 ppm (s, 3H), δ = 4.8 ppm (s, br, 3H), δ = 6.45-6.7 ppm (d, br, 2H), δ = 7.2-7.4 ppm (d, br, 2H), δ = 7.7-9 ppm (m, 12H)
Massaspektri: m/z = 624 M+ (kationi) 30 IR; 3440 cm"1 (br), 3100, 2950, 1805(w), 1775(m), 1740(b), 1695(m), 1610(m), 1505(m), 1375(m), 1280(m), 1250(b), 1205(b).Mass spectrum: m / z = 624 M + (cation) 30 IR; 3440 cm -1 (br), 3100, 2950, 1805 (w), 1775 (m), 1740 (b), 1695 (m), 1610 (m), 1505 (m), 1375 (m), 1280 (m ), 1250 (b), 1205 (b).
Esimerkki 6 35 N-(4-metoksifenyyli)-N-(3-sukkiini-imidoyylioksi- karbonyyli-bentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridinium-9- 20 90 5 42 karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatin (25) valmistus lähtemällä 3-/N-(4'-metoksifenyyli)sulfamidojbentsoehappo-bentsyyliesteristä ja akridiini-9-karboksyylihappokloridi-hydrokloridista (3) tapahtuu yhdisteen (17) synteesin mu-5 kaisesti (ks. esimerkkiä 4). Yksityisten synteesivaiheiden saanto samoin kuin spektroskooppiset ominaisuudet on esitetty seuraavassa.Example 6 35 Preparation of N- (4-methoxyphenyl) -N- (3-succinimidoyloxycarbonylbenzenesulfonyl) -10-methylacridinium-9-2090 5 42 Preparation of carboxylic acid amide fluorosulfonate (25) starting from 3- / N- (4 '-methoxyphenyl) sulfamidobenzoic acid benzyl ester and acridine-9-carboxylic acid chloride hydrochloride (3) follow the synthesis of compound (17) (see Example 4). The yield of the private synthetic steps as well as the spectroscopic properties are shown below.
N- (4-metoksifenyyli)-N-(3-bentsyylioksikarbonyyli-bentseenisulfonyyli)akridiini-9-karboksyylihappo-10 amidi (22)N- (4-Methoxy-phenyl) -N- (3-benzyloxycarbonyl-benzenesulfonyl) -acridine-9-carboxylic acid-10-amide (22)
Saanto: 70 %. Sulamispiste 168 - 170°C.Yield: 70%. Melting point 168-170 ° C.
NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6 = 5.45 ppm (s,2H), 6= 6,5 ppm (s,br,2H), 6= 7,1 ppm (br,2H), 6= 7,3-3,8 ppm (m,17H ) 15 N- (4-metoksifenyyli)-N-(3-karboksibentseenisulfo-nyyli)akridiini-9-karboksyylihappoamidi-hydrobro-midi (23)NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 3.5 ppm (s, 3H), δ = 5.45 ppm (s, 2H), δ = 6.5 ppm (s, br, 2H), δ = 7.1 ppm (br, 2H), δ = 7.3-3.8 ppm (m, 17H) N- (4-methoxyphenyl) -N- (3-carboxybenzenesulfonyl) acridine-9-carboxylic acid amide hydrobromide (23 )
Saanto: 90 %. Sulamispiste: 264 C.Yield: 90%. Melting point: 264 C.
20 NMR(DMSO, 100 MHz): 6= 3,5 ppm (s,3H), 6= 6.4-6,6 ppm (d,br,2H), 6= 7,0-7,2 ppm (d,br,2H), 6= 7,6-8,8 ppm (m,12H) N-(4-metoksifenyyli)-N-(3-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)akridiini-9-karbok-25 syylihappoamidi (24)NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 3.5 ppm (s, 3H), δ = 6.4-6.6 ppm (d, br, 2H), δ = 7.0-7.2 ppm (d, br, 2H), δ = 7.6-8.8 ppm (m, 12H) N- (4-methoxyphenyl) -N- (3-succinimidoyloxycarbonylbenzenesulfonyl) acridine-9-carboxylic acid amide (24)
Saanto: 50 %. Sulamispiste: 223 - 225°C.Yield: 50%. Melting point: 223-225 ° C.
NMR (DMSO, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (a,4H), 6= 3,5 ppm (s,3H), 5=6,4-6,6 ppm (d,br,2H), 6= 7,0-7,2 ppm (d,br,2H), 6= 7,4- 8,9 ppm (m,12H) 30 iR. 3500 cm"1 (br), 3060, 2950, 2840, 1805(v), 1785(m), 1740(a), 1700(m), 1510(m), 1380(m), 1250(m), 1205(m), 1165(m) 2i 90 542 N- (4-metoksifenyyli) -N- (3-sukkiini-imidoyylioksi-karbonyylibentseenisulfonyyli)-10-metyyliakridi-nium-9-karboksyylihappoamidi-fluorisulfonaatti (25) Saanto: 90 %.NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2.95 ppm (a, 4H), δ = 3.5 ppm (s, 3H), δ = 6.4-6.6 ppm (d, br, 2H), Δ = 7.0-7.2 ppm (d, br, 2H), δ = 7.4-8.9 ppm (m, 12H) δ IR. 3500 cm -1 (br), 3060, 2950, 2840, 1805 (v), 1785 (m), 1740 (a), 1700 (m), 1510 (m), 1380 (m), 1250 (m), 1205 (m), 1165 (m) 2i 90 542 N- (4-methoxyphenyl) -N- (3-succinimidoyloxycarbonylbenzenesulfonyl) -10-methylacridinium-9-carboxylic acid amide fluorosulfonate (25) Yield: 90%.
5 NMR(DMS0, 100 MHz): 6= 2,95 ppm (s,4H), 6= 3,55 ppm (s,3H), 6= 4,8 ppm (s,br,3H), 6 = 6,45-6,7 (d,br,2H), δ= 7,05-7,3 ppra (d,br,2H), 6= 7,5-8,9 ppm (m,12H) IR: 3500 cm"1 (br), 3080, 2950, 1805(w), 1780(m), 1740(s),35 1700(m), 1610(m), 1510(m), 1380(m), 1250(s), 1205(s), 1170(s) 10Δ NMR (DMSO, 100 MHz): δ = 2.95 ppm (s, 4H), δ = 3.55 ppm (s, 3H), δ = 4.8 ppm (s, br, 3H), δ = 6 , 45-6.7 (d, br, 2H), δ = 7.05-7.3 ppra (d, br, 2H), δ = 7.5-8.9 ppm (m, 12H) IR: 3500 cm -1 (br), 3080, 2950, 1805 (w), 1780 (m), 1740 (s), 35 1700 (m), 1610 (m), 1510 (m), 1380 (m), 1250 (s) ), 1205 (s), 1170 (s) 10
Esimerkki 7Example 7
Merkkiaineen valmistus x-fetoproteiini-kemilumine-senssi-immunoanalyysiä varten 100 ^,ul vasta-ainetta (1 mg/ml) , 11,5 ^ul esimer-15 kin 1 mukaisesti valmistettua akridiniumtioesteriä (yhdiste 6) (1 mg/ml DMSO:ssa) ja 600 ^ul konjugaatiopusku- ria (0,01-mol. fosfaattia, pH 8,0) inkuboidaan 15 minuuttia. Sen jälkeen lisätään 200 ^ul lysiiniä (10 mg/ml) ja inkuboidaan edelleen 15 minuuttia. Tämä erä siirretään 20 PD-10-pylvääseen (Sephadex G 25 Medium, 0,1-mol. fosfaattia, pH 6,3, liuottimena). Kootaan 10 pisaran fraktioita. Yksityisistä fraktioista testataan sopivan laimennuksen :jälkeen niiden kemiluminesenssiaktiivisuus (350 ^ul hape-. tinta: 0,1 % Η£θ2^3 0,1-nomr. NaOH:ssa). Merkkiainefrak- . .·. 25 tiot (1. aktiivisuuspiikki) yhdistetään ja varastoidaan 4°C:ssa.Preparation of tracer for x-fetoprotein chemiluminescence immunoassay 100 μl of antibody (1 mg / ml), 11.5 μl of acridinium thioester prepared according to Example 1 (Compound 6) (1 mg / ml DMSO: and 600 μl of conjugation buffer (0.01 M phosphate, pH 8.0) are incubated for 15 minutes. 200 [mu] l of lysine (10 mg / ml) are then added and incubated for a further 15 minutes. This batch is applied to 20 PD-10 columns (Sephadex G 25 Medium, 0.1 M phosphate, pH 6.3, as solvent). Collect 10 drop fractions. The individual fractions are tested after suitable dilution: for their chemiluminescence activity (350 .mu.l of oxidant: 0.1% .mu.l .2 .mu.l in 0.1 .mu.N NaOH). Tracer fraction. . ·. Thio (activity peak 1) are pooled and stored at 4 ° C.
Esimerkki 8 . o^-fetoproteiinin kemiluminesenssi-immunoanalyysin suorittaminen 30 50 ^ul standardi/näytettä ja 150 ^ul puskuria (fos- : faatti? 0,1-mol., pH 6,3, 1 % Tween 20, 0,1 % naudanseeru- ; mialbumiinia, 0,1-mol. NaCl, 0,01 % NaN^) ravistellaan 15 minuuttia monoklonaalisella anti-AFF-vasta-aineella pinnoitetuissa pienissä putkissa. Sen jälkeen pestään kaksi 35 kertaa 1 ml :11a puskuria.Example 8. Performing chemiluminescence immunoassay for o 2 -fetoprotein 30 50 standard / sample and 150 buffer (phosphate 0.1 mol, pH 6.3, 1% Tween 20, 0.1% bovine serum; mialbumin, 0.1 M NaCl, 0.01% NaN 2) is shaken for 15 minutes in small tubes coated with anti-AFF monoclonal antibody. Then wash two 35 times with 1 ml of buffer.
22 90 54222 90 542
Sopivana laimennuksena lisätään 200 ^ul merkkiainetta ja ravistellaanl5 minuuttia. Pestään uudelleen kaksi kertaa 1 ml :11a puskuria. Kemiluminointimittaus aloitetaan 350 ^ul:lla hapetinta (0,1 % H2°2 0,1-norm. NaOH:ssa, 5 kahden sekunnin mittausaika).200 μl of tracer is added at a suitable dilution and shaken for 15 minutes. Wash again twice with 1 ml of buffer. The chemiluminescence measurement is started with 350 [mu] l of oxidant (0.1% H2 O2 in 0.1 N NaOH, 5 second measurement time).
Kuvio 3 esittää tyypillistä immuuni-kemiluminomet-risen analyysin (ICMA) standardikäyrän kulkua oi-fetopro-teiinin (AFP) osalta.Figure 3 shows the typical course of a standard immuno-chemiluminometric analysis (ICMA) curve for oi-fetoprotein (AFP).
t:t:
Claims (15)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3628573 | 1986-08-22 | ||
| DE3628573A DE3628573C2 (en) | 1986-08-22 | 1986-08-22 | Chemiluminescent acridine derivatives, processes for their preparation and their use in luminescence immunoassays |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI873609A0 FI873609A0 (en) | 1987-08-20 |
| FI873609A FI873609A (en) | 1988-02-23 |
| FI90542B true FI90542B (en) | 1993-11-15 |
| FI90542C FI90542C (en) | 1994-02-25 |
Family
ID=6307971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI873609A FI90542C (en) | 1986-08-22 | 1987-08-20 | Chemiluminescent acridine derivatives, their preparation and their use in luminescence immunoassays |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0257541B1 (en) |
| JP (2) | JPH0699401B2 (en) |
| AT (2) | ATE223903T1 (en) |
| CA (1) | CA1341402C (en) |
| DE (4) | DE3645292C2 (en) |
| DK (1) | DK171437B1 (en) |
| ES (2) | ES2182835T3 (en) |
| FI (1) | FI90542C (en) |
| GR (1) | GR3019470T3 (en) |
| IE (1) | IE74678B1 (en) |
| NO (1) | NO171725C (en) |
| PT (1) | PT85563B (en) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0082636B2 (en) * | 1981-12-11 | 2006-10-18 | The Welsh National School of Medicine | Luminescent labelling materials and procedures |
| US4745181A (en) * | 1986-10-06 | 1988-05-17 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Polysubstituted aryl acridinium esters |
| DE3750503T2 (en) * | 1986-10-22 | 1995-02-09 | Abbott Lab | Chemiluminescent acridinium and phenantridinium salts. |
| FR2625565A1 (en) * | 1987-12-31 | 1989-07-07 | London Diagnostics Inc | Improved chemiluminescent esters, thioesters and amides, and analyses employing them |
| NZ227506A (en) * | 1987-12-31 | 1992-06-25 | London Diagnostics Inc | Specific binding assays using chemiluminescent compounds |
| US6002007A (en) * | 1988-02-20 | 1999-12-14 | Dade Behring Marburg Gmbh | Special chemiluminescent acridine derivatives and the use thereof in luminescence immunoassays |
| DE3844954C2 (en) * | 1988-02-20 | 1998-07-16 | Hoechst Ag | Special chemiluminescent acridine derivatives and their use in luminescent immunoassays |
| US4950613A (en) * | 1988-02-26 | 1990-08-21 | Gen-Probe Incorporated | Proteted chemiluminescent labels |
| AU634716B2 (en) * | 1988-08-01 | 1993-03-04 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Method for detection of an analyte using acridinium esters and liposomes |
| US5227489A (en) * | 1988-08-01 | 1993-07-13 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Stable hydrophilic acridinium esters suitable for liposome encapsulation |
| US5241070A (en) * | 1988-09-26 | 1993-08-31 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium esters and uses thereof |
| US5663074A (en) * | 1988-09-26 | 1997-09-02 | Chiron Diagnostics Corporation | Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium ester conjugates and syntheses thereof |
| EP0511366A1 (en) * | 1990-11-21 | 1992-11-04 | Beckman Instruments, Inc. | Chemiluminescent compounds |
| DE4041080A1 (en) | 1990-12-21 | 1992-06-25 | Behringwerke Ag | METHOD FOR DETERMINING AN ANALYT |
| DE4228839A1 (en) | 1992-08-29 | 1994-03-03 | Behringwerke Ag | Methods for the detection and determination of mediators |
| US5491072A (en) * | 1993-05-17 | 1996-02-13 | Lumigen, Inc. | N-alkylacridan carboxyl derivatives useful for chemiluminescent detection |
| BE1008216A4 (en) * | 1994-01-25 | 1996-02-20 | Biocode Sa | HETEROCYCLIC CHEMOLUMINESCENT DERIVATIVES. |
| ATE248220T1 (en) * | 1994-06-24 | 2003-09-15 | Dade Behring Marburg Gmbh | METHOD FOR STABILIZING MOLECULES SENSITIVE TO HYDROLYSIS |
| JPH10502958A (en) * | 1994-07-15 | 1998-03-17 | アボツト・ラボラトリーズ | Enhanced chemiluminescence signal |
| WO1996027785A1 (en) * | 1995-03-03 | 1996-09-12 | Abbott Laboratories | Article and method for conducting chemiluminescent reaction |
| US5731148A (en) * | 1995-06-07 | 1998-03-24 | Gen-Probe Incorporated | Adduct protection assay |
| EP0761652A1 (en) * | 1995-08-01 | 1997-03-12 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Acridinium compound having a plurality of luminescent groups and binding groups, and conjugate thereof |
| KR100259761B1 (en) | 1996-03-15 | 2000-07-01 | 타이도 나오카타 | Reagents for labelling sh groups, process for the preparation of them and method for labeling with them |
| JP3338061B2 (en) * | 1996-07-16 | 2002-10-28 | オランダ国 | Dibenzodihydropyridine carboxylate esters and their use in chemiluminescent analysis |
| BE1011206A4 (en) * | 1997-06-11 | 1999-06-01 | Biocode Sa | HETEROCYCLIC DERIVATIVES chemiluminescent. |
| EP1496050A1 (en) | 2003-07-08 | 2005-01-12 | Roche Diagnostics GmbH | Novel chemiluminescent compounds and their use |
| WO2005015214A1 (en) | 2003-07-30 | 2005-02-17 | Roche Diagnostics Gmbh | Novel chemiluminescent compounds and their use |
| DE602004027737D1 (en) | 2003-07-30 | 2010-07-29 | Roche Diagnostics Gmbh | NEW CHEMILUMINESCENSE COMPOUNDS AND ITS USE |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1461877A (en) * | 1974-02-12 | 1977-01-19 | Wellcome Found | Assay method utilizing chemiluminescence |
| GB2008247B (en) * | 1977-11-17 | 1982-12-15 | Welsh Nat School Med | Detecting or quantifying substances using labelling techniques |
| EP0082636B2 (en) * | 1981-12-11 | 2006-10-18 | The Welsh National School of Medicine | Luminescent labelling materials and procedures |
-
1986
- 1986-08-22 DE DE3645292A patent/DE3645292C2/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-22 DE DE3628573A patent/DE3628573C2/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-08-19 AT AT94119395T patent/ATE223903T1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-08-19 ES ES94119395T patent/ES2182835T3/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 DE DE3751659T patent/DE3751659D1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 ES ES87112022T patent/ES2083949T3/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 EP EP87112022A patent/EP0257541B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 EP EP94119395A patent/EP0647628B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 DE DE3752357T patent/DE3752357D1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-19 AT AT87112022T patent/ATE132490T1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-08-20 FI FI873609A patent/FI90542C/en not_active IP Right Cessation
- 1987-08-20 PT PT85563A patent/PT85563B/en unknown
- 1987-08-20 NO NO873520A patent/NO171725C/en not_active IP Right Cessation
- 1987-08-21 CA CA000545036A patent/CA1341402C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-21 JP JP62206622A patent/JPH0699401B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-21 DK DK437187A patent/DK171437B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-08-21 IE IE224587A patent/IE74678B1/en not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-06-14 JP JP6131617A patent/JP2766780B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-29 GR GR960400849T patent/GR3019470T3/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0699401B2 (en) | 1994-12-07 |
| PT85563A (en) | 1987-09-01 |
| EP0257541A3 (en) | 1988-11-30 |
| DE3628573A1 (en) | 1988-02-25 |
| EP0647628B1 (en) | 2002-09-11 |
| DK437187A (en) | 1988-02-23 |
| NO873520L (en) | 1988-02-23 |
| DE3645292C2 (en) | 1997-12-11 |
| DE3752357D1 (en) | 2002-10-17 |
| NO171725C (en) | 1993-04-28 |
| EP0257541B1 (en) | 1996-01-03 |
| JP2766780B2 (en) | 1998-06-18 |
| FI873609A (en) | 1988-02-23 |
| JPS6357572A (en) | 1988-03-12 |
| IE872245L (en) | 1988-02-22 |
| IE74678B1 (en) | 1997-07-30 |
| ES2083949T3 (en) | 1996-05-01 |
| PT85563B (en) | 1990-05-31 |
| GR3019470T3 (en) | 1996-06-30 |
| ES2182835T3 (en) | 2003-03-16 |
| DE3751659D1 (en) | 1996-02-15 |
| DK437187D0 (en) | 1987-08-21 |
| ATE132490T1 (en) | 1996-01-15 |
| JPH07179428A (en) | 1995-07-18 |
| DK171437B1 (en) | 1996-10-28 |
| NO171725B (en) | 1993-01-18 |
| CA1341402C (en) | 2002-11-26 |
| EP0647628A1 (en) | 1995-04-12 |
| EP0257541A2 (en) | 1988-03-02 |
| FI873609A0 (en) | 1987-08-20 |
| DE3628573C2 (en) | 1994-10-13 |
| IE960911L (en) | 1988-02-22 |
| NO873520D0 (en) | 1987-08-20 |
| ATE223903T1 (en) | 2002-09-15 |
| FI90542C (en) | 1994-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI90542B (en) | Chemiluminescent acridine derivatives, their preparation and their use in luminescence immunoassays | |
| US5783699A (en) | Chemiluminescent acridinium salts | |
| US5532171A (en) | Phenothiazine derivatives, their production and use | |
| US5340716A (en) | Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label | |
| US4687747A (en) | Phenanthridinium ester as a labelling compound in luminometric immunoassay | |
| DK175493B1 (en) | Particular chemoluminescent acridinium derivatives and their use in luminescence immunoassay | |
| GB2026158A (en) | Chemiluminescent naphthalene - 1,2 - dicarboxylic acid hydrazide-labelled conjugates | |
| US6171520B1 (en) | Reagents for labeling SH groups, process for the preparation of them and method for labeling with them | |
| US6002007A (en) | Special chemiluminescent acridine derivatives and the use thereof in luminescence immunoassays | |
| US4822878A (en) | Cyclic anhydride derivatives of chromophors | |
| JP3248628B2 (en) | Chemiluminescent compound and assay method using the same | |
| JP3325370B2 (en) | Chemiluminescent compound and assay method using the same | |
| US4226992A (en) | Amino-functionalized naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrozides | |
| DK173875B1 (en) | New chemiluminescent 9-carboxy-acridinium cpds. - and their conjugates with biologically interesting substances, used in luminescence immunoassay | |
| IE83772B1 (en) | Acridinium derivatives and their use in luminescence immunoassays | |
| DK173972B1 (en) | Luminescence compound containing chemoluminescent acridinium derivative and luminescence immunoassay making use of the compound | |
| IE19960911A1 (en) | Acridinium derivatives and their use in luminescence immunoassays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: DADE BEHRING MARBURG GMBH |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: DADE BEHRING MARBURG GMBH |
|
| MA | Patent expired |