<Desc/Clms Page number 1>
EMI1.1
Description DERIVES CHIMIOLUMINESCENTS HETEROCYCLIOUES.
Objet de l'invention.
La présente invention concerne des dérivés chimioluminescents d'acridinium ainsi qu'un conjugué comprenant un de ces dérivés, lié à un composant biologique spécifique.
Un autre aspect de l'invention concerne la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant ce conjugué ou un de ces dérivés, et l'utilisation du conjugué ou d'un de ces dérivés chimioluminescents pour le dosage et/ou la détection d'un composé biologique spécifique.
Arrière-plan technologique à la base de l'invention.
La chimioluminescence est une formation de lumière obtenue par une réation chimique. Le mécanisme général de cette réaction a été notamment décrit par
EMI1.2
Schuster et al (Advances in Physical Organic Chemistry, 187-238 (1984)) par la réaction suivante : A- B*-B + hv
Le composé A, par une réaction chimique, physique ou biochimique (le plus souvent par une oxydation avec un peroxyde) donne un produit à un état excité ("B*") qui revient à l'état fondamental par l'émission de lumière (hv).
Ce procédé de chimioluminescence est largement utilisé en chimie analytique et en biologie clinique, notamment pour les immunodosages (chemoluminescence immuno
<Desc/Clms Page number 2>
assay ou"CLIA").
Les demandes de brevet EP-A-273115, EP-A-257541 et EP-A-263657 décrivent des composés chimioluminescents hétérocycliques dérivés d'acridinium, de phénantridiniumn de quinolénium et d'isoquinolénium et leurs isomères, eventuellement conjugués à des antigènes, des anticorps ou des acides nucléiques pour être utilisés dans des tests de chimioluminescence.
Le pouvoir chimioluminescent de ces dérivés est calculé par l'émission de lumière engendrée au contact de l'eau oxygénée en milieu alcalin. Des études réalisées par F. McCapra (Accounts of Chemical Research (1976), 9,6, p. 201-209) ont permis d'établir un mécanisme de chimioluminescence des composés d'acridinium. Il postule
EMI2.1
la formation d'un intermédiaire réactionnel excité (dioxétane) qui se décompose en CO, et en méthylacridone. Il implique également le déplacement par HO, dun groupement partant Y. Ce déplacement serait, selon la théorie généralement admise, possible pour des dérivés présentant un groupement Y possédant un pKa inférieur à celui de l'eau oxygénée (pKa < 12).
EMI2.2
La demande de brevet W095/l9976 décrit des dérivés hétérocycliques d'acridinium, de phénantridinium, de quinoléinium et d'isoquinolénium ainsi que leurs isomères et dérivés quelconques obtenus par substitution, améliorés, en particulier des dérivés stables et/ou présentant une chimioluminescence élevée, notamment lorsque la valeur du pKa du groupement partant est élevée, de préférence lorsque le pKa est supérieur à 12.
EMI2.3
Buts de l'invention.
La présente invention a pour but d'obtenir des dérivés d'acridinium apparentés chimiquement à ceux décrits dans la demande de brevet W095/19976 précitée, de synthèse aisée, qui offrent en outre de nombreuses possibilités d'adaptation comportant notamment une série de modifications chimiques telles que le greffage d'un bras (spacer), le but étant entre autres d'orienter le couplage
<Desc/Clms Page number 3>
vers des fonctions habituellement peu accessibles lors du marquage de protéines telles que les groupements phénols et thiols.
La présente invention a également pour but d'obtenir des dérivés chimioluminescents caractérisés par une courbe dose-réponse permettant leur utilisation dans le dosage et/ou le diagnostic sur une large plage de concentration.
Un dernier but de la présente invention est d'obtenir une trousse de diagnostic comprenant ledit dérivé chimioluminescent actif et/ou stable.
Elements caractéristiques de l'invention.
La présente invention concerne des dérivés d'acridinium chimioluminescents de formule :
EMI3.1
dans laquelle R1 à Ru sont des substituants n'empêchant pas l'expression de la chimioluminescence, étant entendu que l'un au moins des substi tuants R12 et R comporte, comme élément unique ou comme élément de liaison au dérivé d'acridinium, un atome autre que la carbone.
De préférence, dans les dérivés chimioluminescents selon l'invention, A est un ion complémentaire choisi parmi les ions halogéno, nitrate, sulfate, iodomercurate, trifluorométhanesulfonate, tartrate et phtalate, R1 à Ru sont 1'hydrogène ou des radicaux de
<Desc/Clms Page number 4>
type Ru ou B-R14 où B représente un groupe ou un atome de liaison et R14 représente un radical hydrocarboné pouvant contenir un ou plusieurs hétéroatomes, Ru et Ru sont des substituants identiques ou différents dont la fonction porte sur la chimioluminescence et sur le couplage,
l'un des substi tuants R12 et R13 comportant comme élément unique un atome d'halogène ou comportant comme élément de liaison au dérivé d'acridinium un atome choisi parmi les azotides et les chalcogènes, tandis que l'autre des substituants R12 et R13 est semblable aux substi tuants R1 à Ru, à l'exception de l'hydrogène.
De préférence, dans les dérivés chimioluminescents selon l'invention, B représente dans la formule B-R, un groupe - (CH2) n - où n représente un nombre entier de 1 à 5, B représente également un groupe contenant un azotide ou représente un chalcogène, de préférence un groupe azoté ou l'oxygène deux fois liés, R14 étant tel que défini précédemment. Et plus particulièrement, R14 est un radical choisi parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylkyle éventuellement substitués.
Plus particulièrement encore, dans ces dérivés chimiol uminescents, R1 et Ru sont l'hydrogène, l'un des substi tuants R12 et R13 est un substituant choisi parmi les halogènes et les groupes B-R14, l'autre des substituants R12 et Ri étant semblable à B-R ou à Ru, B et Ru étant tels que définis précédemment.
Selon une forme d'exécution préférée, de l'invention, les dérivés chimioluminescents sont les composés ; [1-éthoxy-1-(4-carboxyphényl)-1-iminométhane]-10méthylacridinium-9-carboxylate ou [1-éthoxy-1-[4-(2-bromoéthoxy)-phényl]-1iminométhane)-10-méthylacridinium-9-carboxylate ou
<Desc/Clms Page number 5>
(l-chloro-l-phényl-l-iminométhane)-lO- méthylacridinium-9-carboxylate ou
EMI5.1
[l-benzyloxy-l- (4-carboxyphényl)-l-iminométhane]- lO-méthylacridinium-9-carboxylate ou [1-chloro-l- (3-cyanophényl)-1-iminométhane]-10méthylacridinium-9-carboxylate ou [1-chloro-l- (2,4, 5,-trifluorophényl)-l- iminométhane]-10-méthylacridinium-9-carboxylate ou
EMI5.2
(l-chloro-l-perfluorophényl-l-iminométhane)-lOméthylacridinium-9-carboxylate.
Ces dérivés sont désignés par les références OX1 à OX, respectivement et leurs formules de structure sont reprises au tableau 1 qui suit.
<Desc/Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 1 <SEP> : <SEP> dérivés <SEP> de
<tb> type <SEP> OX <SEP> synthétisés <SEP> Dérivé <SEP> R12 <SEP> R13
<tb> # <SEP> OX1 <SEP> # <SEP> O
<tb> CH2
<tb> CH3
<tb> OX2 <SEP> # <SEP> O
<tb> CH2
<tb> CH3
<tb> OX3 <SEP> # <SEP> Cl
<tb> OX4 <SEP> # <SEP> O
<tb> CH2
<tb> I <SEP> 1
<tb> # <SEP> #
<tb> OX5 <SEP> # <SEP> Cl
<tb> OX6 <SEP> # <SEP> Cl
<tb> OX7 <SEP> #
<tb> CI
<tb> F
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
Un autre aspect de l'invention concerne le conjugué comprenant un dérivé chimioluminescent selon l'invention lié à un composant biologique spécifique.
On entend par"composé biologique spécifique", toute molécule biologique (lipide, saccharide, protéine, peptide, acide nucléique,...) ou ensemble de molécules biologiques, spécifiques d'une espèce (virale, bactérienne, végétale, animale ou autre), d'un individu, d'une pathologie (telle que le cancer ou causée par un agent viral, bactérien ou autre), d'une activité ou d'un système biochimique (telle qu'une réaction enzymatique,...).
Ledit composant biologique est susceptible d'être détecté et/ou dosé, ou susceptible de servir au dosage et/ou à la détection d'un composant biologique spécifique.
De préférence, ce composé biologique spécifique est choisi parmi le groupe constitué par les anticorps, les haptènes, les antigènes, les acides nucléiques, les agonistes, les transporteurs cellulaires, les acides gras, les lipides et/ou un mélange d'entre eux.
La présente invention concerne également la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant le conjugué ou un des dérivés chimioluminescents selon l'invention et l'utilisation du conjugué et/ou d'un dérivé chimioluminescent selon l'invention pour le dosage et/ou la détection d'un composé biologique spécifique.
Brève description des Figures.
La figure 1 représente un schéma général de préparation des dérivés OX.
La figure 2 représente le schéma de synthèse du dérivé OX7.
La figure 3 illustre la cinétique des Ac (anticorps) marqués par OX3, OX5, OX6 et OX7.
Les figures 4 à 6 illustrent la stabilité des Ac marqués par OX6, OX7 et OX5 respectivement.
Dans les figures 3 à 6, le signal est exprimé par le rapport entre l'intensité (en RLU) mesurée au temps t et l'intensité (en RLU) mesurée au temps t=0.
<Desc/Clms Page number 8>
La figure 7 représente l'évolution de la concentration en produit OX7 en fonction du temps dans un tampon à pH 8.
La figure 8 représente un exemple de dosage de TSH avec Ac marqué par OX7.
La figure 9 représente le spectre infrarouge du pentafluorobenzaldéhyde.
La figure 10 représente le spectre infrarouge de la pentafluorobenzaldoxime.
La figure 11 représente le spectre infrarouge de la pentafluorobenzaldoxime chlorée.
La figure 12 représente le spectre infrarouge du produit de couplage de la pentafluorobenzaldoxime chlorée avec le chlorure de l'acide 9-acridine carboxylique, étant le 9-acridine carboxylate de 1-chloro-1-perfluorophényl-1- iminométhane.
Les figures 13 à 15 représentent les spectres infrarouge des marqueurs OX7, OX5 et OX6.
Les figures 16 à 18 représentent les spectres de masse des marqueurs OX5, OX6 et OX7.
Les composés OX dont les formules sont reprise au tableau 1, ont tous été préparés en suivant le schéma général de préparation décrit dans la figure 1. Leurs synthèses ont nécessité la synthèse de l'aldéhyde de départ (II) lorsque celui-ci n'était pas directement disponible.
La première étape consiste à former l'oxime (III) par réaction entre l'aldéhyde (II) et de l'hydroxylamine.
La réaction est réalisée dans un tampon à pH 4,5-5.
La chloroxime (IV) est préparée par barbotage de chlore dans une solution d'oxime.
Les chloro-dérivés ont été obtenus directement par couplage de la chloroxime au noyau acridine. Les 3 autres dérivés ont été préalablement traités par un équivalent d'alcoolate sodique avant l'étape de couplage au noyau acridine. L'alcoolate est préparé à partir de sodium et de l'alcool correspondant.
<Desc/Clms Page number 9>
Les composés IV ou IVb sont couplés au chlorure d'acide carboxylique dans un solvant organique additionné de NET3.
Les produits V ou Vb sont méthylés par le couple de réactifs CH3I/HgCI2 ou le triflate de méthyle.
EXEMPLES EXEMPLE 1 : MODES OPERATOIRES COMMUNS A CERTAINS DERIVES (FIG. 1).
1. Synthèse de l'aldéhyde II (pour les dérivés
OX6 et OX7).
Les aldéhydes employés dans la synthèse des dérivés OX6 et OX7 ont été réalisés par réduction des chlorures d'acides correspondants (chlorure d'acide 2,4, 5trifluorobenzoïque ou 2,3, 4,5, 6-pentafluorobenzoïque). Le protocole utilisé est le suivant : un équivalent de chlorure d'acide est mis en présence d'l, l équivalents de Bu3SnH dans du THF. Après réaction, le THF est évaporé sous vide et le résidu traité par de l'eau. Ce dernier est ensuite extrait par de l'éther de pétrole (Eb 400 C) puis passé sur charbon. L'aldéhyde est obtenu par évaporation sous vide.
2. Formation de l'oxime III (pour tous les dérivés).
Un équivalent d'aldéhyde dissous dans le l'éthanol est additionné d'eau et de cinq équivalents de chlorhydrate d'hydroxylamine. Le pH est ajusté à une valeur de 5 par ajout de Na OH à 5 %. Le solvant organique est évaporé et l'oxime formée est extraite au toluène. La solution organique est séchée sur NaSO et passée sur charbon. ELle est ensuite concentrée sous vide et additionnée de pétroléine 400 C. Le refroidissement de la solution à -200 C provoque la cristallisation de l'oxime.
3. Transformation en chloroxime IV (pour tous les dérivés).
La chloroxime est préparée par barbotage de chlore dans une solution d'oxime dans un mélange CHCI3/dioxane préalablement refroidi à 00 C. La réaction est complète et la chloroxime (III) est directement obtenue par évaporation des solvants suivie, lorsque la chloroxime
<Desc/Clms Page number 10>
est solide à température ambiante, d'une recristallisation par ajout de pétroléine 400 C. (la chloroxime des dérivés OX6 et OX7 est liquide).
EMI10.1
4. Etape de réaction avec un alcoolate (pour dérivés OXI, OX2 et OX4).
Obtention du produit IVb.
L'alcoolate est préparé par réaction entre un équivalent de sodium et d'un équivalent d'alcool (éthanol ou phénol). La réaction est effectuée dans l'alcool lorsque c'est possible (éthanol) ou dans l'acétone (phénol).
Un équivalent de chloroxime dissous dans l'acétone est directement mis en réaction avec un équivalent d'alcoolate. Le pH du milieu est ajusté à 4,5 par ajout de HCI concentré et le précipité formé (NaCI) est éliminé par filtration ou par centrifugation. La solution est additionnée d'eau. L'évaporation des solvants organiques provoque la cristallisation du produit.
5. Couplage à l'acridine (pour tous les dérivés).
Obtention du produit VIb.
L'acide acridine carboxylique est transformé en chlorure d'acide dans du chlorure de thionyle porté à reflux. Après transformation complète de l'acide, le chlorure de thionyle est évaporé sous vide.
Un équivalent des composés préparés aux étapes 3
EMI10.2
(OX3, OX5, OX6 et OX7) ou 4 (OX1, OX2 et OX4) sont couplés avec un équivalent de chlorure d'acide acridine carboxylique dans du THF additionné d'un excès de pyridine.
Le THF est évaporé sous vide et le résidu repris dans du toluène. On lave la phase toluénique à l'eau puis on la sèche sur du sulfate sodique anhydre. Le produit formé est soit cristallisé par ajout d'éther de pétrole (Eb 400 C) à la solution (OX1, OX2, OX3, OX4 et OX5) ou chromatographié sur une colonne de silice en utilisant une phase toluène /acétate d'éthyle/acide acétique en propotions 2/1/0, 01 (OX6 et OX7). Les fractions correspondant au premier produit qui sort de la colonne sont récupérées et
<Desc/Clms Page number 11>
concentrées sous vide. L'addition d'éther de pétrole (Eb 400 C) provoque la cristallisation du produit.
6. Méthylation des composés (pour tous les dérivés).
Les produits obtenus à l'étape 5 sont méthylés par le couple de réactifs CH3I/HgCI2. La réaction est réalisée sur un mélange intime de 50 mg de produit avec 50 mg de HgCl2 additionné de 1 ml de CH3I. Elle se déroule dans une bombe portée à 1100 C durant 2h30. Après réaction, la bombe est réfrigérée à -200 C. Après refroidissement et décantation du contenu de la bombe, le surnageant est éliminé et les cristaux de produit méthylé sont lavés successivement par du CH31 puis par de l'éther diéthylique. Le produit méthylé peut éventuellement être recristallisé dans un mélange acétone/éther diéthylique.
EXEMPLE 2 : SYNTHESE DE LA SONDE OX7 (FIG. 2) OU
EMI11.1
(l-CHLORO-l-PERFLUOROPHENYL-l-IMINOMETHANE)-lOMETHYLACRIDINIUM-9-CARBOXYLATE.
1. Préparation de la pentafluorobenzaldoxime (I).
20 g de pentafluorobenzaldéhyde sont mis en solution dans 400 ml d'éthanol. D'autre part, 25 g de chlorhydrate d'hydroxylamine sont solubilisés dans 200 ml d'eau. La solution aqueuse est ajoutée à la solution alcoolique et le pH de la solution résultante est amené à 5 par addition de NaOH 2N. Après transformation complète (CCM), on cristallise l'oxime par évaporation de l'éthanol de la solution. Le produit est isolé par filtration et lavé abondamment à l'eau. 17,8 g de pentafluorobenzaldoxime sont récupérés après séchage du précipité (rendement 82 %).
2. Préparation de la chloropentafluorobenzaldoxime (II).
1 g de pentafluorobenzaldoxime est mis en solution dans 15 ml d'un mélange dioxanne-chloroforme (1 : 1). Cette solution est refroidie à 00 C et saturée par du chlore. Après 90 minutes de réaction, la transformation est complète (CCM). Les solvants et l'excès de chlore sont éliminés sous pression réduite et le résidu est utilisé tel quel dans l'étape suivante.
<Desc/Clms Page number 12>
3. Couplage de la chloropentafluorobenzaldoxime (II) au chlorure de l'acide 9-acridine carboxylique (III).
1,05 g d'acide 9-acridine carboxylique est transformé en chlorure d'acide par traitement au chlorure de thionyle (10 ml) contenant une trace de N, Ndiméthylformamide pendant 90 minutes à 850 C. L'excès de chlorure de thionyle est éliminé sous dépression. Le chlorure d'acide (III) obtenu sous forme de chlorhydrate est mis en suspension dans 20 ml de tetrahydrofurane et neutralisé par 5 équivalents (2400 Ml) de triéthylamine.
Le produit obtenu à l'étape précédente est dilué dans 10 ml de tétrahydrofurane et additionné à la solution de chlorure d'acide. Après 30 minutes de réaction, le solvant est éliminé sous dépression et le résidu est solubilisé dans un minimum de chloroforme. La phase organique est lavée trois fois par 40 ml d'eau, décantée et séchée sur sulfate sodique anydre. Le solvant est éliminé au rotavapor et le résidu est dilué par un minimum de toluène et abandonné à la cristallisation à 00 C pendant une nuit. Le produit est filtré, lavé par du toluène froid puis par de l'éther de pétrole. Il est ensuite séché sous vide en présence d'un desséchant. 1,8 g de produit (IV) sont récupérés après séchage (rendement 85 %).
4. N-méthylation du produit (IV) et obtention du traceur chimioluminescent OX7 (V).
50 mg du produit (IV) sont mis en solution dans 2 ml de dichlorométhane anhydre et traités par 800 Ml d'une solution à 10% de trifluorométhanesulfonate de méthyle dans le dichlorométhane. Après 4h de réaction, le produit désiré est précipité par addition modérée d'éther dans le milieu réactionnel. Le traceur est isolé par filtration et lavé successivement par de l'éther diéthylique puis par de l'éther de pétrole. 50 mg de produit (V) sont récupérés (rendement 73%).
<Desc/Clms Page number 13>
Points de Fusion et données chromatographiques.
EMI13.1
<tb>
<tb>
Composé <SEP> NO <SEP> Point <SEP> de <SEP> fusion <SEP> ( C) <SEP> Rf <SEP> CCM <SEP> Rf <SEP> CCM <SEP> SIL
<tb> SIL <SEP> G/UVRPISW/UV
<tb> 1 <SEP> 131 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 70
<tb> IV <SEP> 206-207 <SEP> 0,77 <SEP> 0,31
<tb> V <SEP> 210-213 <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 27
<tb>
EMI13.2
Phases Mobiles CCM SIL GfUV254 : toluène/acétate d'éthyle/acide acétique (2 :
1 : 0, 04).
CCM DIL RP18WfUV254 : acétonitrile/tampon phosphate 0,1 M pH=3 (60 : 40 heptanesulfonate sodique : 0,1 %).
EXEMPLE 3 : ESSAIS EXPERIMENTTAUX SUR LES SONDES OX.
1. Rendement de chimioluminescence
Le rendement de chimioluminescence des dérivés OX ne peut pas être déterminé lorsque les molécules sont à l'état libre. Il est mesuré après couplage de ces produits à une protéine. A titre d'exemple, pour les dérivés OX5,
OX6 et OX7, le taux d'incorporation sur la protéine est mesuré par une méthode fluorescente.
Pour OX7, on peut aussi quantifier la fluorescence émise par un dérivé de dégradation : l'acridone. Le rendement quantique de la molécule de OX7 conjuguée à un anticorps anti-hCG a été évalué à 1, 1019 RLU/mole.
2. Cinétique d'émission
Toutes les cinétiques d'émission enregistrées avec des dérivés OX sont très rapides. Plus de 95 % du signal est émis dans la seconde suivant l'injection du réactif déclenchant la réaction chimioluminescente. Même couplés, les dérivés de chloroximes conservent cette cinétique particulièrement rapide. A titre d'exemple, la figure 3 reprend les cinétiques observées sur des anticorps (Ac) marqués par les chloro-dérivés.
3. Etude de stabilité
De tous les oximes synthétisés, les chloroximes apparaissent de loin les plus stables en présence de
<Desc/Clms Page number 14>
protéines. Des mesures réalisées par spectrométrie de masse sur OX7 ne montrent aucune variation significative du spectre de la molécule après une incubation de 45 minutes dans un mélange acétonitrile/eau (proportions 50/50).
Cette stabilité chimique permet d'envisager le couplage de la sonde aux protéines via la fonction halogénée de la molécule. Toutes les mesures de stabilité effectuées montrent que les oximes OX5, OX6 et OX7 augmentent fortement leur stabilité en milieu aqueux après couplage aux protéines. Les premiers résultats d'une étude de stabilité sur des anticorps marqués par ces sondes sont donnés dans les figures 4,5 et 6. Cette étude est réalisée à 25 C dans des tampons (0,1 M phosphate, 0, 15 M NaCl, 0,1 % NaN3, 0,1 % BSA) à pH 5,6 et 7.
Dans les conditions expérimentales décrités ciaprès, les premiers résultats montrent que la stabilité des traceurs diminue avec la basicité du milieu, ce qui est lié à la nature des sondes. Ils montrent également que le traceur OX5 est nettement moins stable que les traceurs OX6 et OX7. Les cassures observées entre t=470 et t=560 heures sur les courbes des figures 4 et 5 à pH 5 et 6 permettent difficilement de conclure sur la stabilité exacte des traceurs OX6 et OX7 à pH 5 et 6. Toutefois, le traceur OX7 apparaît comme étant le plus stable des trois, et ce plus particulièrement a pH 5. Cette importante stabilité à pH 5 permet d'envisager une longue conservation du traceur à 40 C. D'un autre côté, la stabilité de celui-ci à pH 7 permet d'envisager tous les immunodosages possible à ce pH.
La stabilité de la sonde OX7 est très sensible au pH. En milieu acide (pH 5) la stabilité du composé est nettement plus élevée qu'en milieu basique (pH 8). Lorsque la sonde est fixée à une protéine, sa stabilité augmente fortement et ce quelque soit le pH testé.
3.1 STABILITE DE LA SONDE OX7 NON COUPLEE A PH 8.
La stabilité de la sonde libre a été testée à 250 C dans un milieu identique à celui employé dans les
<Desc/Clms Page number 15>
réactions de marquage (pH du milieu : 8). La dégradation du produit a été suivie par analyse HPLC en utilisant comme support chromatographique une colonne (4x125 mm) des Lichrosphères RP-18 (5 Mm) et comme phase mobile un mélange acétonitrile/eau additionné d'acide décane sulfonique, d'hydroxyde de tétraméthyle ammonium et d'acide trifluoroacétique (pH final : 2,5).
La figure 7 présente l'évolution de la concentration en produit OX7 en fonction du temps dans un tampon à pH 8.
L'ajustement paramétrique des données présentées par une fonction de type : Y = A* exp (-B*X) + C a conduit aux résultats suivants :
EMI15.1
<tb>
<tb> Paramètre <SEP> Valeur <SEP> Approx. <SEP> SE <SEP> 95% <SEP> intervalle <SEP> de <SEP> coif <SEP> iarceA <SEP> 633 <SEP> constant
<tb> B <SEP> 0,0415 <SEP> 1,96 <SEP> E-03 <SEP> 0,036 <SEP> à <SEP> 0,046
<tb> C <SEP> 0 <SEP> constant
<tb>
R2=0,992 ; Sy. x= 18,42 @
Le temps de demi-vie de la sonde libre obtenu en utilisant l'ajustement paramétrique est de 17 minutes.
3.2 STABILITE DE LA SONDE OX7 COUPLEE A UN ANTICORPS.
La stabilité de la sonde OX7 couplée à un anticorps a été testée à pH 5,6 et 7. Elle a été évaluée par mesure de l'activité chimioluminescente d'échantillons de protéine marquée vieillis dans des tampons phosphate/NaCl additionnés de protéines. L'ajustement paramétrique des données recueillies à pH 6 et 7 conduit à des temps de demi-vie de l'ordre de 600 et 375 heures. Par contre à pH 5, le temps de demi-vie est nettement plus important (les faibles variations de signal enregistrées sur une période d'environ 2 mois ne permettent pas un ajustement paramétrique valable).
4.1 MARQUAGE D'ANTICORPS ANTI-TSH PAR LA SONDE OX7
25 ig d'anticorps en solution dans 100 J. de tampon de marquage (solution 0, 1 M phosphate de sodium, 0,15 M NaCl ajustée à pH 8,0) sont additionnés de 10 pl
<Desc/Clms Page number 16>
d'une solution de OX7-méthyltriflate dans l'acétonitrile (solution 0,5 mg/ml). Après homogénéisation, le mélange réactionnel est incubé durant 15 minutes à température ambiante. L'excès de sonde OX7 est neutralisé par ajout de 100 Ml d'une solution de lysine dans le tampon de marquage (solution 1,5 mg/ml). Après une nouvelle incubation de 5 minutes à température ambiante, le milieu est chromatographié sur une colonne (50x1 cm) de séphadex G25.
La colonne chromatographique est équilibrée et éluée avec un tampon 0,1 M phosphate, 0,15 M NaCl. 0,1 % NaN3 contenant de la BSA (lg/1) et ajusté à p 5,0. Les fractions chromatographiques sont lues par mesure de chimioluminescence. Les fractions correspondant au pic
EMI16.1
d'anticorps sont rassemblées et conservés dans le tampon de purification à une température de 4 C.
4.2 DOSAGE DE TSH AVEC LES ANTICORPS MARQUES PAR OX7.
Un dosage non optimisé de la TSH a été réalisé en suivant un protocole identique à un dosage IRMA commercial avec des anticorps anti-TSH marqués par la sonde OX7. Le protocole utilisé comporte les étapes suivantes : 'préparation du traceur par dilution du pic d'anticorps marqués dans un tampon traceur à pH 7,0 (dilution 50x) ; 'remplissage des différents tubes coatés avec 200 gl de
EMI16.2
standards (0, 0, 15, 0, 5, 1. 5, 4, 15, 50 et 85 Ml/ml) ; 'agitation durant 2h à température ambiante ; . aspiration du contenu de chaque tube ; 'rinçage des tubes avec un tampon de lavage (opération réalisée 2 fois) et élimination de la phase liquide par aspiration ; 'lecture de la chimioluminescence des différents tubes.
La courbe de calibration obtenue (Fig. 8) montre que des anticorps marqués par la sonde OX7 peuvent parfaitement convenir comme traceur chimioluminescent dans le cadre d'un dosage nécessitant une grande sensibilité.
<Desc / Clms Page number 1>
EMI1.1
Description HETEROCYCLIOUS CHEMOLUMINESCENT DERIVATIVES.
Subject of the invention.
The present invention relates to chemiluminescent derivatives of acridinium as well as a conjugate comprising one of these derivatives, linked to a specific biological component.
Another aspect of the invention relates to the diagnostic and / or assay kit comprising this conjugate or one of these derivatives, and the use of the conjugate or of one of these chemiluminescent derivatives for the assay and / or detection of a specific biological compound.
Technological background underlying the invention.
Chemiluminescence is a formation of light obtained by a chemical reaction. The general mechanism of this reaction has been described in particular by
EMI1.2
Schuster et al (Advances in Physical Organic Chemistry, 187-238 (1984)) by the following reaction: A- B * -B + hv
Compound A, by a chemical, physical or biochemical reaction (most often by oxidation with a peroxide) gives a product in an excited state ("B *") which returns to the ground state by the emission of light ( H v).
This chemiluminescence process is widely used in analytical chemistry and clinical biology, in particular for immunoassays (immunoluminescent chemoluminescence
<Desc / Clms Page number 2>
assay or "CLIA").
Patent applications EP-A-273115, EP-A-257541 and EP-A-263657 describe heterocyclic chemiluminescent compounds derived from acridinium, quinolenium phenantridiniumn and isoquinolenium and their isomers, possibly conjugated with antigens, antibodies or nucleic acids for use in chemiluminescence tests.
The chemiluminescent power of these derivatives is calculated by the emission of light generated in contact with hydrogen peroxide in an alkaline medium. Studies by F. McCapra (Accounts of Chemical Research (1976), 9.6, p. 201-209) have established a mechanism for chemiluminescence of acridinium compounds. He is applying
EMI2.1
the formation of an excited reaction intermediate (dioxetane) which decomposes into CO, and into methylacridone. It also involves the displacement by HO, of a leaving group Y. This displacement would, according to generally accepted theory, be possible for derivatives having a group Y having a pKa lower than that of hydrogen peroxide (pKa <12).
EMI2.2
Patent application WO95 / l9976 describes heterocyclic derivatives of acridinium, phenanthridinium, quinolinium and isoquinolenium as well as their isomers and any derivatives obtained by substitution, improved, in particular stable derivatives and / or having a high chemiluminescence, in particular when the value of the pKa of the leaving group is high, preferably when the pKa is greater than 12.
EMI2.3
Aims of the invention.
The object of the present invention is to obtain acridinium derivatives chemically related to those described in the aforementioned patent application WO95 / 19976, which are easy to synthesize, which also offer numerous possibilities for adaptation, including in particular a series of chemical modifications. such as grafting an arm (spacer), the aim being inter alia to orient the coupling
<Desc / Clms Page number 3>
towards functions that are usually difficult to access when labeling proteins such as phenol and thiol groups.
The present invention also aims to obtain chemiluminescent derivatives characterized by a dose-response curve allowing their use in the assay and / or diagnosis over a wide concentration range.
A final object of the present invention is to obtain a diagnostic kit comprising said active and / or stable chemiluminescent derivative.
Characteristic elements of the invention.
The present invention relates to chemiluminescent acridinium derivatives of formula:
EMI3.1
in which R1 to Ru are substituents which do not prevent the expression of chemiluminescence, it being understood that at least one of the substituents R12 and R comprises, as a single element or as a binding element to the acridinium derivative, a atom other than carbon.
Preferably, in the chemiluminescent derivatives according to the invention, A is a complementary ion chosen from the halogen, nitrate, sulfate, iodomercurate, trifluoromethanesulfonate, tartrate and phthalate ions, R1 to Ru are hydrogen or radicals of
<Desc / Clms Page number 4>
type Ru or B-R14 where B represents a group or a connecting atom and R14 represents a hydrocarbon radical which may contain one or more heteroatoms, Ru and Ru are identical or different substituents whose function relates to chemiluminescence and to coupling,
one of the substituents R12 and R13 comprising as a single element a halogen atom or comprising as connecting element to the acridinium derivative an atom chosen from azotides and chalcogens, while the other of the substituents R12 and R13 is similar to the substituents R1 to Ru, except for hydrogen.
Preferably, in the chemiluminescent derivatives according to the invention, B represents in the formula BR, a group - (CH2) n - where n represents an integer from 1 to 5, B also represents a group containing an azotide or represents a chalcogen , preferably a nitrogen group or twice-linked oxygen, R14 being as defined above. And more particularly, R14 is a radical chosen from the group consisting of optionally substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl and heteroarylkyl.
More particularly still, in these cheminescent derivatives, R1 and Ru are hydrogen, one of the substituents R12 and R13 is a substituent chosen from halogens and the groups B-R14, the other of the substituents R12 and Ri being similar to BR or Ru, B and Ru being as defined above.
According to a preferred embodiment of the invention, the chemiluminescent derivatives are the compounds; [1-ethoxy-1- (4-carboxyphenyl) -1-iminomethane] -10methylacridinium-9-carboxylate or [1-ethoxy-1- [4- (2-bromoethoxy) -phenyl] -1iminomethane) -10-methylacridinium- 9-carboxylate or
<Desc / Clms Page number 5>
(1-chloro-1-phenyl-1-iminomethane) -10-methylacridinium-9-carboxylate or
EMI5.1
[l-benzyloxy-l- (4-carboxyphenyl) -l-iminomethane] - lO-methylacridinium-9-carboxylate or [1-chloro-l- (3-cyanophenyl) -1-iminomethane] -10methylacridinium-9-carboxylate or [1-chloro-l- (2,4, 5, -trifluorophenyl) -l- iminomethane] -10-methylacridinium-9-carboxylate or
EMI5.2
(1-chloro-1-perfluorophenyl-1-iminomethane) -lOmethylacridinium-9-carboxylate.
These derivatives are designated by the references OX1 to OX, respectively, and their structural formulas are given in Table 1 below.
<Desc / Clms Page number 6>
EMI6.1
<tb>
<tb>
Table <SEP> 1 <SEP>: <SEP> derived <SEP> from
<tb> type <SEP> OX <SEP> synthesized <SEP> Derivative <SEP> R12 <SEP> R13
<tb> # <SEP> OX1 <SEP> # <SEP> O
<tb> CH2
<tb> CH3
<tb> OX2 <SEP> # <SEP> O
<tb> CH2
<tb> CH3
<tb> OX3 <SEP> # <SEP> Cl
<tb> OX4 <SEP> # <SEP> O
<tb> CH2
<tb> I <SEP> 1
<tb> # <SEP> #
<tb> OX5 <SEP> # <SEP> Cl
<tb> OX6 <SEP> # <SEP> Cl
<tb> OX7 <SEP> #
<tb> CI
<tb> F
<tb>
<Desc / Clms Page number 7>
Another aspect of the invention relates to the conjugate comprising a chemiluminescent derivative according to the invention linked to a specific biological component.
The term "specific biological compound" means any biological molecule (lipid, saccharide, protein, peptide, nucleic acid, ...) or set of biological molecules, specific to a species (viral, bacterial, plant, animal or other) , an individual, a pathology (such as cancer or caused by a viral, bacterial or other agent), an activity or a biochemical system (such as an enzymatic reaction, ...).
Said biological component is capable of being detected and / or measured, or capable of being used for assaying and / or detecting a specific biological component.
Preferably, this specific biological compound is chosen from the group consisting of antibodies, haptens, antigens, nucleic acids, agonists, cell transporters, fatty acids, lipids and / or a mixture of them.
The present invention also relates to the diagnostic and / or assay kit comprising the conjugate or one of the chemiluminescent derivatives according to the invention and the use of the conjugate and / or of a chemiluminescent derivative according to the invention for the assay and / or the detection of a specific biological compound.
Brief description of the Figures.
FIG. 1 represents a general diagram for the preparation of the OX derivatives.
FIG. 2 represents the synthesis scheme of the OX7 derivative.
FIG. 3 illustrates the kinetics of the Ab (antibodies) labeled with OX3, OX5, OX6 and OX7.
Figures 4 to 6 illustrate the stability of the Ab labeled with OX6, OX7 and OX5 respectively.
In Figures 3 to 6, the signal is expressed by the ratio between the intensity (in RLU) measured at time t and the intensity (in RLU) measured at time t = 0.
<Desc / Clms Page number 8>
FIG. 7 represents the evolution of the concentration of product OX7 as a function of time in a buffer at pH 8.
FIG. 8 represents an example of TSH assay with Ac labeled with OX7.
Figure 9 shows the infrared spectrum of pentafluorobenzaldehyde.
Figure 10 shows the infrared spectrum of pentafluorobenzaldoxime.
Figure 11 shows the infrared spectrum of chlorinated pentafluorobenzaldoxime.
FIG. 12 represents the infrared spectrum of the coupling product of chlorinated pentafluorobenzaldoxime with 9-acridine carboxylic acid chloride, being 1-chloro-1-perfluorophenyl-1-iminomethane 9-acridine carboxylate.
FIGS. 13 to 15 represent the infrared spectra of the markers OX7, OX5 and OX6.
FIGS. 16 to 18 represent the mass spectra of the markers OX5, OX6 and OX7.
The OX compounds, the formulas of which are given in Table 1, were all prepared by following the general preparation scheme described in FIG. 1. Their syntheses required the synthesis of the starting aldehyde (II) when the latter does not was not directly available.
The first step is to form the oxime (III) by reaction between the aldehyde (II) and hydroxylamine.
The reaction is carried out in a buffer at pH 4.5-5.
Chloroxime (IV) is prepared by bubbling chlorine through an oxime solution.
The chloro-derivatives were obtained directly by coupling of chloroxime to the acridine nucleus. The other 3 derivatives were previously treated with an equivalent of sodium alcoholate before the step of coupling to the acridine nucleus. The alcoholate is prepared from sodium and the corresponding alcohol.
<Desc / Clms Page number 9>
Compounds IV or IVb are coupled to the carboxylic acid chloride in an organic solvent supplemented with NET3.
Products V or Vb are methylated by the pair of reactants CH3I / HgCI2 or methyl triflate.
EXAMPLES EXAMPLE 1: OPERATING MODES COMMON TO CERTAIN DERIVATIVES (FIG. 1).
1. Synthesis of aldehyde II (for derivatives
OX6 and OX7).
The aldehydes used in the synthesis of the OX6 and OX7 derivatives were produced by reduction of the corresponding acid chlorides (2,4, 5trifluorobenzoic acid chloride or 2,3, 4,5, 6-pentafluorobenzoic acid). The protocol used is as follows: one equivalent of acid chloride is placed in the presence of 1.1 equivalents of Bu3SnH in THF. After reaction, the THF is evaporated in vacuo and the residue treated with water. The latter is then extracted with petroleum ether (Eb 400 C) and then passed over charcoal. The aldehyde is obtained by evaporation under vacuum.
2. Formation of oxime III (for all derivatives).
One equivalent of aldehyde dissolved in ethanol is added with water and five equivalents of hydroxylamine hydrochloride. The pH is adjusted to a value of 5 by adding 5% Na OH. The organic solvent is evaporated and the oxime formed is extracted with toluene. The organic solution is dried over NaSO and passed over charcoal. It is then concentrated under vacuum and added with 400 C petrolein. The cooling of the solution to -200 C causes the oxime to crystallize.
3. Transformation into chloroxime IV (for all derivatives).
The chloroxime is prepared by bubbling chlorine into an oxime solution in a CHCl3 / dioxane mixture previously cooled to 00 C. The reaction is complete and the chloroxime (III) is directly obtained by evaporation of the solvents followed, when the chloroxime
<Desc / Clms Page number 10>
is solid at room temperature, recrystallization by adding 400 C petrolein (the chloroxime of the OX6 and OX7 derivatives is liquid).
EMI10.1
4. Reaction step with an alcoholate (for OXI, OX2 and OX4 derivatives).
Obtaining the product IVb.
The alcoholate is prepared by reaction between an equivalent of sodium and an equivalent of alcohol (ethanol or phenol). The reaction is carried out in alcohol when possible (ethanol) or in acetone (phenol).
One equivalent of chloroxime dissolved in acetone is directly reacted with one equivalent of alcoholate. The pH of the medium is adjusted to 4.5 by adding concentrated HCl and the precipitate formed (NaCl) is removed by filtration or by centrifugation. Water is added to the solution. The evaporation of organic solvents causes the product to crystallize.
5. Coupling to acridine (for all derivatives).
Obtaining the VIb product.
The acridine carboxylic acid is transformed into acid chloride in thionyl chloride brought to reflux. After complete transformation of the acid, the thionyl chloride is evaporated under vacuum.
An equivalent of the compounds prepared in steps 3
EMI10.2
(OX3, OX5, OX6 and OX7) or 4 (OX1, OX2 and OX4) are coupled with an equivalent of acridine carboxylic acid chloride in THF supplemented with an excess of pyridine.
The THF is evaporated in vacuo and the residue taken up in toluene. The toluene phase is washed with water and then dried over anhydrous sodium sulfate. The product formed is either crystallized by adding petroleum ether (Eb 400 C) to the solution (OX1, OX2, OX3, OX4 and OX5) or chromatographed on a silica column using a toluene / ethyl acetate / acetic acid in propotions 2/1/0, 01 (OX6 and OX7). The fractions corresponding to the first product leaving the column are recovered and
<Desc / Clms Page number 11>
concentrated in vacuo. The addition of petroleum ether (Eb 400 C) causes the product to crystallize.
6. Methylation of the compounds (for all derivatives).
The products obtained in step 5 are methylated by the pair of CH3I / HgCl2 reagents. The reaction is carried out on an intimate mixture of 50 mg of product with 50 mg of HgCl2 added with 1 ml of CH3I. It takes place in a bomb brought to 1100 C for 2h30. After reaction, the bomb is refrigerated at -200 C. After cooling and decanting of the contents of the bomb, the supernatant is removed and the crystals of methylated product are washed successively with CH31 and then with diethyl ether. The methylated product can optionally be recrystallized from an acetone / diethyl ether mixture.
EXAMPLE 2: SYNTHESIS OF THE OX7 PROBE (FIG. 2) OR
EMI11.1
(l-CHLORO-l-PERFLUOROPHENYL-l-IMINOMETHANE) -lOMETHYLACRIDINIUM-9-CARBOXYLATE.
1. Preparation of pentafluorobenzaldoxime (I).
20 g of pentafluorobenzaldehyde are dissolved in 400 ml of ethanol. On the other hand, 25 g of hydroxylamine hydrochloride are dissolved in 200 ml of water. The aqueous solution is added to the alcoholic solution and the pH of the resulting solution is brought to 5 by addition of 2N NaOH. After complete transformation (TLC), the oxime is crystallized by evaporation of the ethanol from the solution. The product is isolated by filtration and washed thoroughly with water. 17.8 g of pentafluorobenzaldoxime are recovered after drying of the precipitate (yield 82%).
2. Preparation of chloropentafluorobenzaldoxime (II).
1 g of pentafluorobenzaldoxime is dissolved in 15 ml of a dioxane-chloroform mixture (1: 1). This solution is cooled to 00 C and saturated with chlorine. After 90 minutes of reaction, the transformation is complete (TLC). Solvents and excess chlorine are removed under reduced pressure and the residue is used as is in the next step.
<Desc / Clms Page number 12>
3. Coupling of chloropentafluorobenzaldoxime (II) to 9-acridine carboxylic acid chloride (III).
1.05 g of 9-acridine carboxylic acid is transformed into acid chloride by treatment with thionyl chloride (10 ml) containing a trace of N, Ndimethylformamide for 90 minutes at 850 C. The excess of thionyl chloride is eliminated under depression. The acid chloride (III) obtained in the form of the hydrochloride is suspended in 20 ml of tetrahydrofuran and neutralized with 5 equivalents (2400 Ml) of triethylamine.
The product obtained in the previous step is diluted in 10 ml of tetrahydrofuran and added to the acid chloride solution. After 30 minutes of reaction, the solvent is removed under vacuum and the residue is dissolved in a minimum of chloroform. The organic phase is washed three times with 40 ml of water, decanted and dried over anydre sodium sulfate. The solvent is removed on a rotary evaporator and the residue is diluted with a minimum of toluene and left to crystallize at 00 C overnight. The product is filtered, washed with cold toluene and then with petroleum ether. It is then dried under vacuum in the presence of a desiccant. 1.8 g of product (IV) are recovered after drying (yield 85%).
4. N-methylation of the product (IV) and obtaining of the chemiluminescent tracer OX7 (V).
50 mg of the product (IV) are dissolved in 2 ml of anhydrous dichloromethane and treated with 800 ml of a 10% solution of methyl trifluoromethanesulfonate in dichloromethane. After 4 hours of reaction, the desired product is precipitated by moderate addition of ether to the reaction medium. The tracer is isolated by filtration and washed successively with diethyl ether and then with petroleum ether. 50 mg of product (V) are recovered (yield 73%).
<Desc / Clms Page number 13>
Melting points and chromatographic data.
EMI13.1
<tb>
<tb>
Compound <SEP> NO <SEP> <SEP> point of <SEP> merge <SEP> (C) <SEP> Rf <SEP> CCM <SEP> Rf <SEP> CCM <SEP> SIL
<tb> SIL <SEP> G / UVRPISW / UV
<tb> 1 <SEP> 131 <SEP> 0, <SEP> 87 <SEP> 0, <SEP> 70
<tb> IV <SEP> 206-207 <SEP> 0.77 <SEP> 0.31
<tb> V <SEP> 210-213 <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 27
<tb>
EMI13.2
CCM SIL GfUV254 Mobile Phases: toluene / ethyl acetate / acetic acid (2:
1: 0, 04).
TLC DIL RP18WfUV254: acetonitrile / 0.1 M phosphate buffer pH = 3 (60: 40 sodium heptanesulfonate: 0.1%).
EXAMPLE 3: EXPERIMENTAL TESTS ON OX PROBES.
1. Chemiluminescence yield
The chemiluminescence yield of the OX derivatives cannot be determined when the molecules are in the free state. It is measured after coupling of these products to a protein. For example, for OX5 derivatives,
OX6 and OX7, the rate of incorporation into the protein is measured by a fluorescent method.
For OX7, we can also quantify the fluorescence emitted by a degradation derivative: acridone. The quantum yield of the OX7 molecule conjugated to an anti-hCG antibody was evaluated at 1.1019 RLU / mole.
2. Emission kinetics
All the emission kinetics recorded with OX derivatives are very fast. More than 95% of the signal is emitted in the second following the injection of the reagent triggering the chemiluminescent reaction. Even when coupled, chloroxime derivatives retain this particularly rapid kinetics. For example, Figure 3 shows the kinetics observed on antibodies (Ac) labeled with chloro-derivatives.
3. Stability study
Of all the oximes synthesized, chloroximes appear by far the most stable in the presence of
<Desc / Clms Page number 14>
proteins. Measurements carried out by mass spectrometry on OX7 do not show any significant variation in the spectrum of the molecule after an incubation of 45 minutes in an acetonitrile / water mixture (proportions 50/50).
This chemical stability makes it possible to envisage coupling the probe to the proteins via the halogenated function of the molecule. All the stability measurements carried out show that the oximes OX5, OX6 and OX7 greatly increase their stability in an aqueous medium after coupling to the proteins. The first results of a stability study on antibodies labeled with these probes are given in FIGS. 4,5 and 6. This study is carried out at 25 ° C. in buffers (0.1 M phosphate, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN3, 0.1% BSA) at pH 5.6 and 7.
Under the experimental conditions described below, the first results show that the stability of the tracers decreases with the basicity of the medium, which is linked to the nature of the probes. They also show that the OX5 tracer is significantly less stable than the OX6 and OX7 tracers. The breaks observed between t = 470 and t = 560 hours on the curves of FIGS. 4 and 5 at pH 5 and 6 make it difficult to conclude on the exact stability of the tracers OX6 and OX7 at pH 5 and 6. However, the tracer OX7 appears as being the most stable of the three, and more particularly at pH 5. This important stability at pH 5 makes it possible to envisage a long conservation of the tracer at 40 C. On the other hand, the stability of the latter at pH 7 allows to consider all possible immunoassays at this pH.
The stability of the OX7 probe is very sensitive to pH. In an acid medium (pH 5) the stability of the compound is much higher than in a basic medium (pH 8). When the probe is attached to a protein, its stability greatly increases regardless of the pH tested.
3.1 STABILITY OF THE UNCoupled OX7 PROBE AT PH 8.
The stability of the free probe was tested at 250 C in a medium identical to that used in the
<Desc / Clms Page number 15>
labeling reactions (pH of the medium: 8). The degradation of the product was followed by HPLC analysis using as column chromatographic support a column (4x125 mm) of RP-18 Lichrospheres (5 Mm) and as mobile phase an acetonitrile / water mixture added with decane sulfonic acid, hydroxide tetramethyl ammonium and trifluoroacetic acid (final pH: 2.5).
FIG. 7 shows the evolution of the concentration of product OX7 as a function of time in a buffer at pH 8.
Parametric adjustment of the data presented by a function of type: Y = A * exp (-B * X) + C has led to the following results:
EMI15.1
<tb>
<tb> Parameter <SEP> Value <SEP> Approx. <SEP> SE <SEP> 95% <SEP> interval <SEP> of <SEP> coif <SEP> iarceA <SEP> 633 <SEP> constant
<tb> B <SEP> 0.0415 <SEP> 1.96 <SEP> E-03 <SEP> 0.036 <SEP> to <SEP> 0.046
<tb> C <SEP> 0 <SEP> constant
<tb>
R2 = 0.992; Sy. x = 18.42 @
The half-life of the free probe obtained using the parametric adjustment is 17 minutes.
3.2 STABILITY OF THE OX7 PROBE COUPLED TO ANTIBODY.
The stability of the OX7 probe coupled to an antibody was tested at pH 5.6 and 7. It was evaluated by measuring the chemiluminescent activity of samples of labeled protein aged in phosphate / NaCl buffers supplemented with proteins. Parametric adjustment of the data collected at pH 6 and 7 leads to half-life times of the order of 600 and 375 hours. On the other hand, at pH 5, the half-life time is much longer (the small signal variations recorded over a period of approximately 2 months do not allow a valid parametric adjustment).
4.1 LABELING OF ANTI-TSH ANTIBODIES BY THE OX7 PROBE
25 μg of antibody in solution in 100 J. of labeling buffer (0.1 M sodium phosphate solution, 0.15 M NaCl adjusted to pH 8.0) are added with 10 μl
<Desc / Clms Page number 16>
of a solution of OX7-methyltriflate in acetonitrile (solution 0.5 mg / ml). After homogenization, the reaction mixture is incubated for 15 minutes at room temperature. The excess of OX7 probe is neutralized by adding 100 ml of a lysine solution to the labeling buffer (solution 1.5 mg / ml). After a further 5 minute incubation at room temperature, the medium is chromatographed on a column (50 × 1 cm) of Sephadex G25.
The chromatographic column is balanced and eluted with a 0.1 M phosphate, 0.15 M NaCl buffer. 0.1% NaN3 containing BSA (lg / 1) and adjusted to p 5.0. The chromatographic fractions are read by measurement of chemiluminescence. The fractions corresponding to the peak
EMI16.1
antibodies are collected and stored in the purification buffer at a temperature of 4 C.
4.2 DETERMINATION OF TSH WITH ANTIBODIES MARKED BY OX7.
A non-optimized TSH assay was carried out following a protocol identical to a commercial IRMA assay with anti-TSH antibodies labeled with the OX7 probe. The protocol used comprises the following stages: preparation of the tracer by diluting the peak of labeled antibodies in a tracer buffer at pH 7.0 (50x dilution); filling of the different coated tubes with 200 g of
EMI16.2
standard (0, 0, 15, 0, 5, 1.5, 4, 15, 50 and 85 ml / ml); 'stirring for 2 hours at room temperature; . aspiration of the contents of each tube; '' rinsing the tubes with a washing buffer (operation performed twice) and elimination of the liquid phase by aspiration; reading of the chemiluminescence of the different tubes.
The calibration curve obtained (Fig. 8) shows that antibodies labeled with the OX7 probe can be perfectly suitable as a chemiluminescent tracer in the context of an assay requiring high sensitivity.