FI85986C - Enzymprodukt och foerfarande foer framstaellning daerav. - Google Patents

Description

85986

Entsyymivalmiste ja menetelmä sen tuottamiseksi

Esillä olevan keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 johdannon mukainen entsyymivalmiste.

Keksintö koskee myös patenttivaatimuksen 3 johdannon mukaista menetelmää sen tuottamiseksi.

Tekniikan tason osalta viitataan seuraaviin julkaisuihin: 1. Honda, H. et ai., System. Appi. Microbiol. 8 (1986), 152-157 2. Honda, H. et ai., Can. J. Microbiol. 31 (1985), 538-542 3. Esteban et ai.. Can. J. Microbiol. 28 (1982), 733-739 4. US-patenttijulkaisu 3,826,715 (1974), Horikoshi et ai.

5. Poutanen, K. ja Puls, J., Appi. Microb. Biotechnol. 28 (1988), 425-432

Alkaalisella ksylanaasilla tarkoitetaan ksylaania hajoitta-vaa entsyymiä, joka toimii alkaalisella pH-alueella. Tällaisia entsyymejä voidaan käyttää helpottamaan jäännösligniinin poistoa alkaalisesta selluloosamassasta.

On tunnettua, että alkalofHiisillä bakteerikannoilla, kuten Bacillus-sukuun kuuluvilla kannoilla, voidaan tuottaa ksyla-naaseja, jotka toimivat alkaalisella pH-alueella. Yleensä näiden bakteerien tuottama ksylanaasi-aktiivisuus on kuitenkin niin alhainen, että entsyymin tuottaminen niillä on tehotonta ja kallista. Kahdessa ensimmäisessä viitejulkaisuissa [1, 2] on selostettu ksylanaasin tuottamista kannalla Bacillus sp. No. C-125. Julkaisuissa annettujen tietojen mukaan tuotettu ksylanaasiaktiivisuus oli 0,8...1 U/ml, mikä vastaa kataleiksi laskettuna aktiivisuutta 90...100 nkat/ml. Vastaavasti on Esteban työtovereineen [3] tuottanut ksyla-naasia Bacillus drculans WL-12-kannalla, jolloin ksylanaasin aktiivisuus oli noin 2...20 nkat/ml, optimi-pH-arvo ollessa 5,5___7.

2 85986

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa tunnettuun tekniikkaan liittyvät epäkohdat ja saada aikaan korkean ksy-lanaasiaktiivisuuden omaava entsyymivalmiste.

Keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että kasvattamalla määrättyä Bacillus circulans-kantaa, nimittäin ATCC-numerolla 21783 talletettua Bacillus circulans-kantaa, ksylaanipitoisella alustalla alkaalisessa pH-arvossa saadaan aikaan kasvatusliuos, jolla on korkea ksylanaasiaktiivisuus. Verrattaessa Honda et al:n julkaisuissa esitettyihin tuloksiin päästään keksinnön avulla jopa 50-kertaisiin aktiivisuuksiin. Aktiivisuusero on vieläkin suurempi, eli £ 200-kertainen, suhteessa toisen B. circulans-kannan tuottamaan ksylanaasiin (Esteban et ai, [3]).

B. circulans ATCC 21783:a on aikaisemmin käytetty amylaasin tuottamiseen [4], viitejulkaisussa on myös tarkkaan kuvattu mainitun bakteerikannan tärkeimpiä parametrejä. Kirjallisuudesta ei kuitenkaan löydy minkäänlaisia tietoja sen soveltuvuudesta β-ksylanaasin tuottamiseen.

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle ratkaisulle on pääasiallisesti tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on puolestaan tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 3 tunnusmerkki-osassa.

Tässä hakemuksessa käytetyllä termillä "entsyymivalmiste" tarkoitetaan mitä tahansa sellaista tuotetta, joka sisältää ainakin yhden entsyymin. Niinpä entsyymivalmiste voi olla esim. entsyymiä tai entsyymejä sisältävä kasvatusliuos, eristetty entsyymi tai kahden tai useamman entsyymin seos.

Kasvattamalla mikro-organismia Bacillus circulans kantaa ATCC 21783 aikalisissä olosuhteissa saadaan aikaan kasvatus-liuos, joka sisältää ainakin kaksi β-ksylanaasientsyymiä, joiden isoelektriset pisteet (pl) ovat noin 8,8 ja noin 3 85986 8,4...8,5. Entsyymien näitä isoelektrisiä pisteitä vastaavien elektroforeesilla määritettyjen molekyylipainojen on arvioitu olevan 28 000 ja vastaavasti 28 000 tai 25 000. Keksinnön mukainen entsyymivalmiste sisältää ainakin toista edellä mainittua entsyymiä. Edullisesti se käsittää kasvatus-liuoksen, joka sisältää molemmat entsyymit.

Menetelmän avulla valmistetun kasvatusliuoksen β-ksylanaasi-aktiivisuus on sopivimmin ainakin noin 2000 nkat/ml, edullisesti ainakin noin 3000. Kuten seuraavista suoritusesimer-keistä käy ilmi, olemme saaneet aikaan kasvatusliuoksia, joiden aktiivisuus on jopa 4500...5000 nkat/ml.

Korkean ksylanaasiaktiivisuuden lisäksi käyttämämme B. drculans-kannan kasvatusliuos sisältää muitakin entsyymejä, lähinnä ksylaanin sivuketjuja tai muita hemiselluloo-sakomponentteja hydrolysoivia entsyymejä. Liuoksen ksylanaa-sin ohella tärkeimpien entsyymien aktiivisuudet ovat seuraa-vat: β-ksylosidaasi 0...100 nkat/ml, α-arabinosidaasi 0...50 nkat/ml, asetyyliksylaaniesteraasi 0...10 nkat/ml, α-glukuronidaasi 0...20 nkat/ml ja β-mannanaasi 0...50 nkat/ml.

B. drculans ATCC 21783:a kasvatetaan keksinnön mukaan kasvatusalustassa, joka hiililähteenä sisältää ksylaani-yhdisteitä. Alusta tehdään alkaliseksi, eli sen pH asetetaan arvoon noin 7... noin 11. Edullisesti sen pH asetetaan arvoon noin 8...noin 9,5. Kasvatusalustan alkalisuuden säätöön voidaan käyttää sopivien alkalisten yhdisteiden vesiliuoksia, edullisesti käytetään natriumkarbonaattia. Ksylaaniläh-teistä tulevat kyseeseen etenkin lehtipuuksylaanit, erityisesti koivu- ja pyökkiksylaani. Kasvatus voidaan suorittaa esim. ravisteluviljelmänä taikka fermentorissa. Kasvatus-alustan pH-arvon säätö on helpommin toteuttavissa fermento-•V rissa.

i 4 85986 i Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa ravistelukas- vatuksessa käytetään hiililähteenä koivuksylaania.

Kasvatusalusta sisältää typpilähteenä esim. peptonia tai maissinliotusvettä. Muita vaihtoehtoisia typpilähteitä ovat urea, lihauute, hiivauute ja kaseiinihydrolysaatit. Kasvatus-alustassa voi lisäksi olla ravintosuoloja ja hivenaineita. Kationeista mainittakoon kalsium-, magnesium-, mangaani-, ammonium- ja rautaionit ja anioneista fosfaatti-, sulfaatteja kloridi-ionit.

Kasvatus suoritetaan normaalisti noin 20°C:n...noin 50eC:n lämpötilassa, kasvatusajan ollessa noin 12... noin 96 tuntia. Näistä olosuhteista voidaan kuitenkin tarvittaessa poiketa.

Keksinnön avulla saavutetaan huomattavia etuja. Niinpä olemme yllättäen voineet todeta, että saatava keksinnön mukaisella entsyymivalmisteella on korkean aktiivisuutensa lisäksi myös laaja aktiivisuus-pH-alue. Niinpä se liuottaa ksy-laania vielä alkaalisella pH-alueella £ 9.

Keksinnön mukainen ksylanaasin kasvatusliuos soveltuu erittäin hyvin käytettäväksi nimenomaan sellun valkaisussa, esim. valkaisukemikaalien, kuten klooridioksidin, käytön vähentämiseksi. Samalla voidaan tehokkaasti vähentää sellun jään-nöskemikaalinen määrää. Koska kasvatusliuoksen sellulaasi-aktiivisuus on erittäin alhainen (£ 0,05 FPU), voidaan sitä käyttää sellaisenaan massan käsittelyyn, ilman että sillä olisi selluloosaa hajottavaa - ja siten massan laatua huonontavaa - vaikutusta. Kasvatusliuoksen β-ksylosidaasi-aktiivisuus on kohtuullisen korkea, mistä syystä pH-arvossa 7 ksylaanin hydrolyysin päätuote on ksyloosi. Korkeammissa pH-arvoissa monosakkaridia muodostuu vähemmän, mikä ilmeisesti johtuu β-ksylosidaasin alhaisesta pH-stabiilisuudesta.

Haluttaessa voidaan valmistetut β-ksylanaasientsyymit erottaa ja puhdistaa sinänsä tunnettujen menetelmien avulla.

Keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan muutaman ei-rajoittavan esimerkin avulla. Esimerkeissä 1-3 5 85986 on selostettu β-ksylanaasia sisältävän kasvatusliuoksen valmistusta ja esimerkissä 4 on selvitelty kasvatusliuoksen ksylaania liuottavaa vaikutusta.

Valmistettujen kasvatusliuosten ksylanaasiaktiivisuus on määritetty käyttäen Poutasen ja Puisin [5] kuvaamaa menetelmää. Substraattina on 1 % Larchwood xylan (toimittaja: Sigma), 50 mM natriumsitraattipuskuria, pH 6,5.

Esimerkki 1. Bacillus circulans ATCC 21783-kannan kasvatus ravisteluvilj elmänä

Kavatettiin Bacillus circulans kantaa ravisteluvilj elmänä 50 ml:n liuostilavuudessa 250 ml:n astiassa. Kasvatuslämpö-tila oli 28®C. Kasvatusalusta sisälsi koivuksylaania 10 g/1, hiivauutetta 5 g/1, peptonia 2,5 g/1, K2HPO4 0,5 g/1, MgS04-7H20 0,125 g/1, (NH4)2S04 0,25 g/1, NaCl 0,125 g/1, CaCl2·2H20, 0,025 g/1, MnS04 H20 0,0025 g/1, FeS04-7H20 0,0025 g/1.

Autoklavoituun kasvatusalustaan lisättiin erikseen steriloitua 10 %:sta Na2C03~liuosta 2 ml/50 ml. Siirrosteena käytet-. . tiin yli yön Tryptic Soy-alustalla kasvanutta kasvustoa.

Kolmen vuorokauden jälkeen ksylanaasiaktiivisuus sentrifu-goidussa kasvatusalustassa oli 3000 nkat/ml.

Alku-pH oli noin 9,5 ja kasvatuksen aikana se laski noin arvoon 7.

Esimerkki 2. Bacillus circulans ATCC 21783-kannan kasvatus fermentorissa

Kasvatettiin Bacillus circulans kantaa laboratoriofermento-rissa. Kasvatusalusta sisälsi pyökkiksylaania 20 g/1, maissinliotusvettä 20 ml/1, K2HP04 0,54 g/1, MgS04*7H20 0,15 g/1. Kasvatuslämpötila oli 30*C ja pH pidettiin arvossa 8...8,4. Alku-pH asetettiin natriumkarbonaattiliuoksella. Kasvatuksen aikana pH-arvoa säädettiin automaattisesti ammoniumhydroksidilisäyksillä.

6 85986

Kolmen vuorokauden kasvatuksen jälkeen ksylanaasiaktiivisuus kasvatusliuoksessa oli 4500 nkat/ml.

Esimerkki 3. Bacillus circulans ATCC 21783-kannan kasvatus

Kasvatettiin Bacillus circulans kantaa laboratoriofermento-rissa esimerkin 2 mukaisissa kasvatusolosuhteissa mitä tulee lämpötilaan ja pH-arvoon. Hiililähteenä käytettiin pyökki-ksylaania 20 g/1. Muut alustan komponentit olivat samat kuin esimerkissä 1. Kolmen vuorokauden kasvatuksen jälkeen ksylanaasiaktiivisuus sentrifugoidussa kasvualustassa oli 4000 nkat/ml.

Ksylanaasiaktiivisuuden lisäksi kasvatusliuoksesta analysoitiin muiden entsyymien aktiivisuudet, jotka olivat seuraa-vat: β-ksylosidaasi 40 nkat/ml, a-arabinosidaasi 10 nkat/ml, asetyyliksylaaniesteraasi 2 nkat/ml, a-glukuronidaasi 5 nkat/ml ja β-mannanaasi 10 nkat/ml.

Esimerkki 4. Ksylaanln hydrolysolntl

Deasetyloitua ksylaania hydrolysoitiin esimerkin 3 mukaisella entsyymivalmisteella. Hydrolyysiliuoksen pH asetettiin sitraatti-fosfaattipuskurilla arvoihin 6, 7, 8, 9 ja 10. Ksylanaasia käytettiin 100 nkat/g ksylaania. Käsittelyn jälkeen ksylaanista oli liuennut hiilihydraatteja seuraavasti: pH liuenneet hiilihydraatit (% alkuperäisestä ksylaanista) 6 15,5 7 18,6 8 14,1 : 9 13,9 10 8,5

Claims (12)

1. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että se on sellaisen kasvatusliuok-sen muodossa, joka sisältää kummatkin β-ksylanaasientsyymit.
2. 3. Menetelmä β-ksylanaasipitoisen entsyymivalmisteen tuottamiseksi, joka entsyymivalmiste on oleellisesti vapaa sellulaasiaktiivisuudesta, tunnettu siitä, että mikro-organismin Bacillus clrculans kantaa ATCC 21783 kasva-tetaan noin 12...noin 96 tuntia kasvatusalustalla, joka sisältää hiililähteen, typpilähteen sekä mineraalisuoloja ja jonka pH on noin 7...noin li ja lämpötila noin 20*C...noin 50°C ja haluttaessa erotetaan ksylanaasiaktiivisuuden omaava(t) entsyymi(t).
3. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kasvatusalustan pH pidetään arvossa noin 8...noin 9,5.
4. 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiililähteenä käytetään lehtipuuksylaania.
5. 6. Jonkin patenttivaatimuksen 3-5 mukainen menetelmä, joka suoritetaan ravisteluviljelmänä, tunnettu siitä, että hiililähteenä käytetään koivuksylaania. 8 85986
6. 7. Patenttivaatimuksen 3 mukaan tuotetun entsyymivalmisteen käyttö selluloosamassan valkaisussa. 9 85986 1. β-xylanashaltig enzymprodulct, kännetecknad av att - den är framställd genom odling av stammen ATCC 21783 av mikroorganismen Bacillus drculans pä ett alkaliskt näringsmedium, - den innehäller ätminstone den ena av tvä β-xylanaser, vars med elektrofores bestämda molekylvikter uppgär tili ca 28.000 respektive ca 25.000...ca 28.000 och vars isoelektriska punkter är 8,8 respektive ca 8,4... 8,5, och - den är väsentligen fri frän cellulasaktivitet.
7. 2. Enzymprodukt enligt patentkrav 1, känneteck-n a d av att den är i form av en odlingslösning som inne-häller bägge β-xylanasenzymerna.
8. 3. Förfarande för framställning av en β-xylanashaltig enzymprodukt, som är väsentligen fri frän cellulasaktivitet, kännetecknat av att stammen ATCC 21783 av mikroorganismen Bacillus drculans odlas cirka l2...cirka 96 tim-mar pä ett näringsmedium, som innehäller en kolkälla, en kvävekälla samt mineralsalter och vars pH uppgär tili ca 7...ca 11 och temperatur tili ca 20"C...cirka 50° och, om sä önskas, avskiljs enzymet (enzymerna) med xylanasaktivitet.
9. 4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att pH för näringsmediet hälles vid ett värde pä ca 8... ca 9,5.
10. 5. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att säsom kolkälla används lövträxylan.
11. 6. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-5, vilket utförs säsom en skakodling, kännetecknat av att säsom kolkälla används björkxylan. 10 85986
12. 7. Användningen av ett enzymprodukt framställt enligt patentkrav 3 vid blekning av cellulosamassa.