FI85813C - Foerfarande foer framstaellning av en enteralisk icke-adjuvanserad vaccin. - Google Patents

Description

1 85813

MENETELMÄ ENTERAALISEN EI-ADJUVANTOIDUN ROKOTTEEN VALMISTAMISEKSI - FÖRFARANDE FÖR FRAMSTÄLLNING AV EN ENTERALISK ICKE-ADJUVANSERAD VACCIN

5 Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ente- raalisen (suolistoliukoisen), ei-adjuvantoidun monobak-teerisen rokotteen valmistamiseksi, joka sisältää tapettuja Haemophilus influenza-, Streptococcus pneumoniae- , Pseudomonas aeruginosa- tai Staphylococcus au-10 reus-organismeja. Enteraalista ei-adjuvantoitua rokotetta voidaan käyttää ehkäisemään akuutteja limakal-voinfektioita kroonista limakalvotautia sairastavissa ihmisissä.

Akuutit keuhkoputkentulehdustapaukset ovat 15 tupakoitsijoiden pääasiallinen terveysongelma ja ne ovat erityisesti kroonisesta obstruktiivisesta keuhkosairaudesta (COLD) kärsivien potilaiden sairastumisen ja kuoleman syynä. Näiden potilaiden ylemmissä hengitysteissä on tavallisesti Haemophilus influenzae-20 ja/tai Streptococcus pneumoniae-kasvupesäkkeitä ja on katsottu, että isäntäbakteerin tasapainon siirtyminen infektiota suosivaan suuntaan näillä bakteereilla aiheuttaa välittömästi akuutin keuhkoputkentulehduksen. Lapset, joilla on kystinen fibrioosi, kärsivät taval-25 lisesti Pseudomonas aeruqinosan ja Staphylococcus au-reuksen aiheuttamista kroonisista infektioista.

Polybakteerisia rokotteita, jotka sisältävät valikoiman tapettuja bakteereja, jotka puolestaan liittyvät tavallisesti hengitysteiden infektioihin, on 30 ollut saatavilla useita vuosia. Polybakteeriset rokotteet sisältävät tavanomaisen tyyppistä adjuvanttia, jonka tarkoitus on vakiintuneen metodologian mukaan lisätä potilaan vastetta antigeenille, ja siten aikaansaada lisääntynyt immuniteetti. Adjuvantti voi olla 35 kemiallinen agenssi. Vaihtoehtoisesti, monet eri organismit itsessään toimivat ei-spesifisellä tavalla aktivoiden immuunisysteemiä. Tällainen adjuvantin si- 2 85313 sältävä polybakteerinen rokote on ollut kaupallisesti saatavilla suun kautta nautittavassa tablettimuodossa. Tabletit ovat enteropäällysteisiä mahdollistaen vatsalaukun ohittamisen/ jonka jälkeen tapahtuu suoleen 5 liittyvän imukudoksen stimulointi. Kuitenkin, näiden polybakteeristen rokotteiden tehoon ollaan oltu pettyneitä hoidettaessa hengitysteiden akuutteja infektioita ihmisillä, joilla on krooninen limakalvotulehdus.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tuoda 10 esiin menetelmä enteraalisen ei-adjuvantoidun rokotteen valmistamiseksi, jota voidaan käyttää limakalvojen pinnoilla olevia infektioita vastaan ihmisillä, joilla on pitkäaikainen limakalvotulehdus.

Esillä oleva keksintö tuo esiin menetelmän 15 enteraalisen ei-adjuvantoidun monobakteerisen rokotteen valmistamiseksi, joka sisältää tapettuja bakteereja immunisaatioon bakteerien limakalvoalueilla aiheuttamia infektioita vastaan. Menetelmälle on tunnusomaista, että bakteerit tapetaan, lyofilisoidaan ja/tai kuiva-20 taan, sekoitetaan kantajiin, täyteaineisiin ja apuaineisiin ja saatetaan terapeuttisesti käyttökelpoisen, enteraaisen farmaseuttisen koostumuksen muotoon. Esimerkkinä näistä bakteereista mainittakoon Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeru-25 qinosa ja Staphylococcus aureus. Eräs edullinen rokote koostuu tapetuista Haemophilus influenzae-bakteereis-ta. Esillä olevan keksinnön mukaisen rokotteen eräänä erityisenä piirteenä on, että tapettuun bakteerikantaan ei lisätä mitään adjuvanttia, so. rokote stimuloi vain 30 rajoitettua antigeenistä vastetta. Adjuvantit, joita tavallisesti lisätään rokotteisiin, ja jotka puuttuvat esillä olevan keksinnön mukaisesta rokotteesta, ovat tapettuja bakteereja, joiden tiedetään aiheuttavan voimakkaan antigeenisen vasteen, ja joita ovat esim. 35 tapettu Mycobacterium tuberculosis, kuten Bacillus Cal-mette-Guerln (BCG), tai tapettu Corynebacterium parvum, ollen valikoima lähisukuisia bakteereja, jolloin jokai- 3 85813 nen laji toimii adjuvanttina toiselle bakteerilajille, tai epäorgaanisia polymeerisiä materiaaleja, esim. alumiinioksidi tai alumiinifosfaatti, joka on hyödyllinen erityisesti parenteraalisissa (ruoansulatuskanavan 5 ulkopuolinen) rokotteissa.

Keksinnön mukaiset enteraaliset rokotteet voivat olla tablettien muodossa, erityisesti entero-päällysteisinä tabletteina, granuloina, kapseleina tai lääkerakeina tarkoitettuna suun kautta annettaviksi, 10 tai rokotteet voivat olla esim. peräpuikkoina tarkoitettuina peräaukon kautta annettaviksi. Yksikköannos voi sisältää noin 109 - 1013 bakteeria, edullisesti noin ΙΟ10 - 1012 bakteeria, jotka ovat sopivassa orgaanisessa tai epäorgaanisessa kantajassa.

15 Sopivina kantajina toimivat erityisesti täyte aineet kuten sokerit, esim. laktoosi, sakkaroosi, man-nitoli tai sorbitoli, selluloosavalmisteet ja/tai kal-siumfosfaatit esim. trikalsiumfosfaatti tai kalsiumve-tyfosfaatti, aminohapot esim. glysiini, kantajina voi-20 vat olla myös sideaineet kuten tärkkelyspastat, joista mainittakoon esim. maissi-, vehnä-, riisi- tai perunatärkkelys, gelatiini, tragantti, metyyliselluloosa, hydroksipropyylimetyyliselluloosa, natriumkarboksime-tyyliselluloosa ja/tai polyvinyylipyrrolidoni ja/tai, 25 haluttaessa, kantajina voivat olla hajoitusaineet, .v. kuten edellä mainitut tärkkelykset, myös karboksimetyy- litärkkelys, ristisidottu polyvinyylipyrrolidoni, agar, alginiinihappo tai sen suola kuten natriumalginaat-ti. Apuaineita ovat erityisesti virtausta säätelevät 30 aineet ja liukuaineet, esim. silika, talkki, steariini-happo tai sen suolat, kuten magnesiumstearaatti tai kalsiumstearaatti, ja/tai polyetyleeniglykoli lisäksi sapen eritystä lisäävät aineet, esim. natriumtauroko-laatti, natriumtauroglykokolaatti tai härän sappi. Lää-35 kerakeet päällystetään sopivilla päällysteillä, jotka voivat olla mahanesteille resistenttejä. Päällysteinä käytetään mm. konsentroituja sokeriliuoksia, jotka 4 85313 voivat sisältää arabikumia, talkkia, polyvinyylipyrro-lidonia, polyetyleeniglykolia ja/tai titaanidioksidia, lakkaliuoksia sopivissa orgaanisissa liuottimissa tai liuotinseoksissa; tai valmistettaessa päällysteitä, 5 jotka ovat resistenttejä mahanesteille, käytetään sopivia selluloosavalmisteiden liuoksia kuten asetyylisel-luloosaftalaattia tai hydroksipropyylimetyyliselluloo-saftalaattia. Väriaineita tai pigmenttejä voidaan lisätä tablettien tai lääkerakeiden päällysteisiin esim. Ι-ΙΟ dentifioimistarkoituksessa tai aktiivisen sisällön erilaisten annoksien erottamisessa. Tuotteet, jotka aikaansaavat antigeenisen vasteen, so. adjuvantit, eivät sisälly keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun rokotteen kantajiin tai apuaineisiin.

15 Keksinnön mukaiset menetelmät rokotteiden valmistamiseksi ovat sinänsä tunnettuja.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti bakteereja viljellään, sitten tapetaan, lyofilisoidaan ja/tai kuivataan, sekoitetaan kantajiin, täyteaineisiin ja 20 apuainesiin ja saatetaan terapeuttisesti käytettävän enteraalisen farmaseuttisen koostumuksen muotoon tekniikan tasossa tunnettujen menetelmien mukaisesti. Bakteerit voidaan kasvattaa alustoilla esim. agaralustoil-la, jotka sisältävät erilaisia ravinteita, esim. veri-25 tai "suklaa"- agaralustoilla, tai fermentaatioliuoksis-sa suspensioina, jolloin ravinteet ovat liuokoisessa muodossa, joista mainittakoon esim. maitohydrolysaatit, laktalbumiinihydrolysaatit, maissisiirapit, glukoosi, tärkkelykset, trypsiinisoijaliemi ja vastaavat, sekä 30 kasvua edistävät aineet, esim. hormonit ja koentsyymit, jotka ovat myös seerumilaimennosten muodossa, esim. hevosen seerumi tai vasikan sikiöseerumi. Viljelmä täytyy pitää tarkasti aseptisissa olosuhteissa ja haluttaessa pieniä määriä antibiotteja esim. basitrasiinia voidaan 35 lisätä ei-toivottujen bakteerien liikakasvun ehkäisemiseksi.

Organismit tapetaan esimerkiksi formaliinilla, li 5 85813 fenolilla tai eetterillä, lisäksi ne voidaan homogenisoida ja pestä perusteellisesti. Tapettujen bakteerien steriilisyys täytyy testata huolellisesti, esim. siir-rostamalla sellaiseen aineeseen tai agaralustaan, jossa 5 elinkykyisten bakteerien tiedetään kasvavan nopeasti. Farmaseuttiset valmisteet tarkoitettuna suun tai peräaukon kautta annettaviksi saadaan tapetuista bakteereista tavanomaisilla lyofilisointi-, kuivaus-, sekoitus-, granulointi- ja/tai päällystysmenetelmillä ste-10 rilleissä olosuhteissa.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja rokotteita voidaan käyttää ehkäisemään akuutteja limakalvoinfektioita kroonista limakalvotautia sairastavissa ihmisissä, jolloin keksinnön mukaista rokotetta 15 annetaan sitä tarvitsevalle potilaalle. Edullisesti annetaan 1-3 yksikköannosta rokotetta, joka sisältää ΙΟ10 - 1012 tapettua bakteeria 2-5 peräkkäisinä päivinä. Voidaan tarvita useampia kuin yksi hoitokuuri ja edullisesti annetaan kolme hoitokuuria noin 3-5 vii-20 kon välein.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmisteut rokotteet ovat käyttökelpoisia potilaille, jotka sairastavat pitkäaikaisia tauteja limakalvojen alueilla esim. hengitysteissä, silmässä, urogenitaalisysteemissä 25 ja suolistossa. Nämä limakalvoalueet muodostavat osan yleistä limakalvosysteemiä, johon liittyy limakalvojen välistä soluliikennettä. Tietyt infektiot rajoittuvat limakalvoalueelle ja eivät siten ole alttiina verivirran vasta-aineille. Esillä olevan keksinnön mukaisesti 30 valmistetuissa rokotteissa antigeeni annetaan enteraa-lisesti, so. suoleen, ja aktivoidut solut sitten kiertävät veren mukana kiinnittyen etäisiin limakalvoaluei-siin, missä ne erittävät niiden vasta-ainetta limakalvojen pinnalle tai toimivat suoraan limakalvojen pin-35 noilla.

Keksinnön mukaisesti valmistetut rokotteet ovat on erityisen tehokkaita saamaan aikaan immunitee- 6 85813 tia hengitysteiden, erityisesti keuhkoputken, akuutteja bakteerisia infektioita vastaan kroonisen tulehduksen aikana. Pitkäaikaiset keuhkosairaudet ovat vallitsevia potilailla, jotka ovat tupakoitsijoita tai entisiä 5 tupakoitsijoita. Näihin voivat kuulua potilaat, jotka sairastavat kroonista keuhkosairautta, kuten kroonista keuhkoputkentulehdusta ja muita tauteja, jotka liittyvät tupakoimiseen, ja lapset, jotka kärsivät kystiseen fibrioosiin liittyvästä keuhkosairaudesta.

10 Yllättäen on ilmennyt, että rokotteiden im munisaation tehokkuus johtuu adjuvanttien puuttumisesta, jotka adjuvantit tavallisesti sisältyisivät tämänkaltaisiin rokotemuotoihin suojaavan efektin lisäämistä varten. Syytä tähän ei täysin tiedetä, mutta se johtuu 15 ilmeisesti herkästä tasapainosta, joka vallitsee limakalvossa suppressori- ja auttajamekanismeissa immuniteetin muodostuessa. B-solujen vasta-aineiden tuotantoa säätelee T-solut, joihin kuuluu auttaja- ja suppressorisolut, vaikkakin niiden tarkkaa toimintaa 20 limakalvosysteemissä ei tiedetä. Potilailla, joilla on kroonisesti tulehtunut keuhkoputki (esim. krooninen keuhkoputkentulehdus), suppressori T-solut voivat olla vallitsevina siten, että stimulaatiovaikutuksen tai adjuvantin tuloksena onkin immuunisysteemin suppressio 25 (aiotun aktivaation sijasta). Adjuvantin puuttuessa esiintyy rajoittunut vaste, joka ei ole riittävä laukaisemaan suppressorimekanismia. Tämä on pelkästään hypoteesi, mutta on yllättäen havaittu, että kroonista keuhkoputkentulehdusta sairastavalla potilaalla ylimää-30 räistä bakteeria lisättäessä H. influenzae-rokotteeseen saa aikaan rokotteen, joka ei pysty suojaamaan akuuttia keuhkoputkentulehdusta vastaan.

Malliesimerkki keksinnön havainnollistamiseksi Keksinnön mukaisesti valmistetun rokotteen 35 tehokkuus osoitetaan kaksois-sokko-, prospektiivi- ja placebo-kontrolloidulla kokeella, joka tehtiin 67 vakiintunutta kroonista obstruktiivista keuhkotautia 7 85813 sairastavalle potilaalle. Kukaan potilaista ei käyttänyt steroideja tai immunosuppressiivisia lääkeaineita, mutta moni otti tarvittaessa bronkodilaatio-lääkkeitä ja antibiootteja.

5 Neljä ryhmää testattiin: kaksi placebo-ryhmää, joista toinen ryhmä otti glukoositabletteja ja toinen ryhmä enteropäällysteisiä tabletteja, jotka oli valmistettu samalla tavoin kuin keksinnön mukaiset monobak-teeriset rokotteet ja aiemmin tunnetut polybakteeriset 10 rokotteet. Kolmas ryhmä otti erästä tapettua polybak-teeristä rokotetta, joka edusti läheisintä tunnettua rokotetta, jonka tiedettiin olevan tehokas hengitysteiden bakteeri-infektioiden profylaksiassa normaaleilla terveillä ihmisillä. Jokainen enteropäällysteinen 15 tabletti sisälsi 1.5 x 109 H. influenzae, 109 Staphylococcus aureus, 109 jokaista S. pneumoniae tyyppiä I, II ja III, 109 Streptococcus, ja 25 mg Fel Bovis sicc. (härän sappi). Nämä tabletit on valmistanut Swiss Serum (Berne) ja niitä myydään Buccalin Berna® nimellä. Nel-20 jäs ryhmä otti keksinnön mukaisesti valmistettua rokotetta enteropäällysteisinä tabletteina, joista jokainen sisälsi 10u tapettua H. influenzae-bakteeria kuten on kuvattu myöhemmin esimerkissä.

Ennen koetta, aikana nolla, keuhkolääkäri 25 arvioi jokaisen potilaan. Standardoitu ja monipuolinen kyselykaavake täytettiin. Lisäksi keuhkojen toiminta arvioitiin spirometrillä ja otettiin kurkku- ja yskös-viljelyt.

Jokaisessa akuutissa ylemmässä tai alemmassa 30 hengitystieinfektiossa täytettiin "infektiokyselyloma-ke" ja otettiin yskösnäyte viljelyä varten. Akuutit keuhkoputkentulehdustapaukset määriteltiin ysköksen määrän ja märkäisyyden lisääntymisenä. Tulehdukseen ·· tavallisesti liittyi lisääntynyt hengästyneisyys, kuume ·'*· 35 ja antibiottihoito.

Kolme tablettikuuria annettiin 0, 28 ja 56 päivinä. Molemmille placeboille ja keksinnön mukaisesti β 85813 valmistetulle monobakteeriselle rokotteelle kuuri käsitti: kaksi tablettia, jotka otettiin ennen aamiaista joka päivä kolmen peräkkäisen päivän ajan. Polybaktee-risen rokotteen tapauksessa jokainen kuuri annettiin 5 valmistajan ohjeiden mukaisesti, so. 1 tabletti päivänä 1, 2 tablettia päivänä 2, ja 4 tablettia päivänä 3. Kokeen lopuksi toistettiin vielä spirometritesti. Ainoat potilaat, jotka menetettiin tutkimuksesta olivat ne, jotka kuolivat tutkimuksen aikana (taulukko 1).

10 84 päivän tutkimusperiodin tulokset on esitet ty taulukossa 2. Mitään merkittäviä eroja akuuttien ylemmän hengitystieinfektioiden esiintymistiheydessä ei ole havaittavissa näiden neljän ryhmän välillä. Kuitenkin, sekä akuutteihin (akuuttiin) keuhkoputkentulehdus-15 tapauksii(ee)n, (alempien hengitysteiden infektio, P < 0.005) altistuneiden koehenkilöiden lukumäärässä, että akuuttien keuhkoputkentulehdustapauksien (P > 0.002) absoluuttisessa määrässä, havaitaan merkittävää vähentymistä henkilöillä, joille on annettu keksinnön mu-20 kaisesti valmistettua tapettua H. influenzae-rokotetta. Tapettu suun kautta annettava H.influenzae-rokote antoi 90 % suojan verrattuna placebo-ryhmään, kun taas moni-valenssinen rokote ei antanut mitään suojaa.

H. influenzae-bakteerin eristysprosentti oli 25 69 % akuutin keuhkoputkentulehduksen aikana otetuista yskösnäytteistä verrattuna S. pneumonlae-bakteerin eristysprosenttiin 8 %. Bakteriologia toteutettiin kuten tavallisesti: vanutuppo, jolla oli otettu näyte kurkusta ja yskös siirrostettiin suoraan veriagar- ja 30 suklaa-agaralustojen päälle. H. influenzae-eristyksien identifiointiin käytettiin Gram-värjäystä, kasvupesäke-morfologiaa suklaa-agarissa, "satellitismia" staphylo-coccus-viivoja pitkin veriagaralustoilla ja X- ja V-te-kijoiden kasvuriippuvuutta. S. pneumoniae- eristeiden 35 identifioimiseen käytettiin Gram-värjäystä, kasvupesä-ke-morfologiaa ja alfa-hemolyysiä veriagaralustoilla ja optochin-herkkyyttä.

9 85813

Ei ole mitään merkittävää korrelaatiota bakteerikanta jän määrällä ja taudin kehittymisellä akuutin keuhkoputkentulehduksen tapauksissa. Neljän viikon kuluttua kokeesta kasvupesäkemuodostus oli samanlaista 5 placeboa ja monibakteerista rokotetta ottavilla henkilöillä, mutta vähäisempää niillä potilailla, joita hoidettiin monobakteerisella rokotteella, vaikka ero ei riittänyt merkittäväksi. Seuraavien kahden kuukauden aikana oli kasvupesäkkeiden määrissä pudotusta place-10 bo-ryhmällä 28 %, polybakteerisella rokoteryhmällä 39 %, ja monobakteerisella ryhmällä 56 %. Kuitenkin mono-bakteerisen rokoteryhmän kasvupesäkkeiden määrän suunta kohti suurempaa pudotusta ei ole riittävän merkittävä.

Mitään eroja vasta-ainetasojen käyttäytymises-15 sä ei voitu havaita näiden neljän ryhmän välillä. On yllättävää, että monitehoisen rokotteen tapauksessa syljen vasta-aineet eivät lisäänny, vaikka näiden tiedetään lisääntyvän normaaleissa terveissä aikuisissa. Tämä tukee teoriaa, jonka mukaan normaalien terveiden 20 potilaiden ja pitkäaikaisten limakalvosairauksia sairastavien potilaiden immuunisysteemeissä on eroa.

jö 8 581 3 “7 ϊ : ‘ & & . .

t) rH H CN fO M · * ' ' * \j co σ% σ> o fj ' c · * * · 2* « o o o ·«· C O) . · rt

A S

tn rt Ä .....

0 tn_____ rH tn rt -rl G · rt G : -p rt g ti -¾ 3 «Ό «Λ r-i rt co tr» o o •n tn 10 . . . .

rH ^ O O »"4 »—·

id fd aJ

A E rt ^ g___;__’__ ^•§|.3 tn rt 3 ,χ -P td

-|J g .p «M »Λ rl O

1 ia s sSsl____

Ui

d di 3 O CM <M O

9 .5 J2 g 9¾____ •1 3 •S ftj ~ ~ " ^ siä_____ ____

' ~ tl C

V o m ^ O AO UI <T

3 3.2'i ~ ^ rH ^ tfl ftSr____ o\ «

. VO

CM CM OO ·

• * M

jj +1 CM r-» -M

O |5j in -h -H f* rt m «m ό "t

rl VO VO VO VO

-P

tn ———-- " <3 rH O VO ΓΉ Γ-· ΓΗ •n 5g r-l i—I rH rl s----s--—r- r S g ES§8

nl w c g P

o rH «M 3) „ to -H 6 u M .p *3 g -P rt g M 2 2.* G tn i» 33 rt O e S h a) -P c

rH 3 5 §,·& υ tn tn rt -H

rt «a e 2} 2 υ -* ·η -p P

rt Ή rH 0753 rt rt .¾ $

Il 11 8581 3 S c 1 _ I' H 10 P ' · · y ’ ra o M -H!j3 · · « 1:¾

Tj <u!p · S H' c

υ rrt ,_i fO fO

φ . -* cg ·-· ** · M 'U «*** m {5 -ri n «n r-t »h C CO P p «-4 p « co en (Ö _5 *H >i ....

•n £ CU P

O e +* P

0 -H 2' ?

(0 β G

•I x oj

(ti 551 w A

(0 I g 0 co e q x g o p (ti rH w e (ti iti >i <U ati

X +J Ό M

P β P P ati (OCUDiOatirtcnen p •H C -H g — ™ ~ β p <U P co

0) P si X P

O) β (1) (ti P 0 β Ή d P X (ti G o

O < g P X

' X_____

O

P

•H I

U\ P

CU Di

CU! C G

p1 CU <u X Tl A, (ti' P Ό r» n o) -H CU p p ^ C CU-H >· ^ ·"* Γ* C fti g +J ^ p 3 (ti ati <U co P co p Ή >i

<U ati < P

a C ati iti O g “I----- p p 3 co P X >i

G X 0 P

(0 φΗ P· > P Di (ti C! C C ..

-p -h ω o) * £ s ~ P Ό X «*» ^ 0) CP «M O Ό

β P rö P

β p p CU

(ti β P g β P CU CU’

(ti X O P P

p 5* P

P - — —

0 CU I

β -P co i o) x S cu o p 75 co g o G ö p x β _ (ti β o s S*« o s ·§ I e s s cg S « e en .¾ ^4 ^ m -O *h ^ X O O Xp β p a| X -S -S 2*3 -Hfljg β u u £>~. o co ί> ρ p « ca Po X p

β P P V 9 cu p O

iti O. A, X P e M ___ i2 8581 3

Esimerkki: H.influenzae-bakteeria sisältävän rokotteen valmistus

Haemophilus influenzae tyyppi B No. 7279 (NIH 1946) viljellään suspensiona pääasiassa casaminohappoja 5 sisältävässä kasvatusliuoksessa, kuten on kuvattu julkaisussa P. Andersson, J.Pitt ja D.H. Smith, Infection and Immunity 13, 581-589 (1976). Kasvatusliuos sisältää 1 % casaminohappoja (Difco), 0.5 % hiivauutetta (Dif-co), 0.05 M natriumfosfaattipuskuria ja 0.5% glukoosia, 10 ja johon on lisätty hevosen verta (laimennus 1:1000) ja 1 pg/ml nikotiiniamidiadeniinidinukleotidia (Sigma). Tästä saadaan noin 1.3 x 109 kasvupesäkkeen muodostavaa yksikköä per ml (CFU/ml) ja kaikkiaan 8 x 1013 eläviä soluja. Samoihin tuloksiin päädytään käyttämällä 15 Eugon-kasvualustaliuosta casaminohappojen tilalla (7 x 10e CFU/ml). Viljelmät osoitetaan puhtaiksi testaamalla api 20B identifioimiskitillä kuten myös mikroskooppisella tarkastelulla. Organismi on tunnetusti pleomorfi-nen nesteviljelmässä.

20 Solut kerätään jatkuvalla sentrifugoinnilla, pestään kolme kertaa käyttäen fysiologista suolaliuosta ja inaktivoidaan suspendoimalla 0.5 % formaliinin suolaliuokseen, jolloin konsentraatioksi saadaan 5 x 109 CFU/ml. Kolmen päivän kuluttua steriilisyys testataan 25 siirrostamalla näyte kasvuliuokseen ja CHB-agaril-le. Minkään organismin kasvua ei ilmene seitsemän päivän inkubaation 36°C jälkeen. Inaktivoidut solut lyofi-lisoidaan käyttämällä suojaavaa väliainetta, joka koostuu dextran- 40/laktoosista. Suojaavan väliaineen puut-30 tuessa havaitaan huomattavaa solujen rikkoutumista. Kaikki varotoimenpiteet otetaan huomioon lyofili-soinnin aikana tuotteen steriilisyyden säilyttämiseksi. Valmistustilat, myös kylmäkuivauskammio, desinfioidaan. Käytetään steriilejä tarjottimia, astioita sekä 35 muita välineitä ja steriiliä ilmaa johdetaan kammioon ·*": kuivauksen loppuvaiheessa. Tällä menetelmällä saatujen 8 x 1013 lyofilisoitujen solujen paino on 75.8 g ( 10u

II

i3 8581 3 solua per 0.1 g).

Tabletit valmistetaan lyofilisoiduista tapetuista Haemophilus influenzae-bakteereista seuraavan kaavan mukaisesti: 5 granulointi: lyofilisoidut bakteerit 100 mg natrium taurokolaatti 25 mg laktoosi 100 mg 10 granuloiva aine: alkoholi 95SG tyyppi F3 qs

Kuiva seos: maissitärkkelys 10 g polyplasdoni XL 7.5 mg magnesiumstearaatti 4 mg 15 Puristuspaino on 246.5 mg, jolloin tabletin

kovuus on 5 kg (Monsanto) ja tabletin hajoamisaika pH

6.8 fosfaattipuskurissa on 14 minuuttia.

Tabletit päällystetään päällystysliuoksella joka sisältää: 20 selluloosa-asetaattiftalaatti 12 g propyleeniglykoli 3 g

Tween 80R® 1 g alkoholi abs. 40 ml rautaoksidi punapigmentti 0.30 g 25 rautaoksidi keltapigmentti 1.20 g asetoni tilavuuteen 100 ml

Enteropäällysteiset tabletit painavat 265 mg omaten pidemmän kuin 2 tunnin hajoamisajan 0.1 N HC1-liuoksessa ja 16 minuutin hajoamisajan pH 6.8 fosfaat-30 tipuskurissa.

Keksintö tuo siten esiin enteraalisen ei-adju-vantoidun monobakteerirokotteen valmistusmenetelmän.

Keksinnön mukaisesti valmistetut rokotteet kykenevät aikaansaamaan paremman immuniteetin hengitys-35 teiden, erityisesti keuhkoputken, akuutteja bakteeri— infektioita vastaan kroonisen tulehduksen vallites-sa: ja on erityisen käyttökelpoinen tupakoitsijoille ja • · * · i4 8581 3 entisille tupakoitsijoille.

l! • · ·

Claims (4)

1. Menetelmä enteraalisen ei-adjuvantoidun monobakteerisen rokotteen valmistamiseksi, joka sisäl- 5 tää tapettuja bakteereja immunisaatioon limakalvoaluei-den bakteeri-infektiota vastaan, tunnettu siitä, että menetelmässä tapetaan Haemophilus influenzae-, Streptococcus pneumoniae-, Pseudomonas aeruginosa- tai Staphylococcus aureus-bakteereja, tapetut bakteerit 10 lyofilisoidaan ja/tai kuivataan, tapetut, lyofilisoidut ja/tai kuivatut bakteerit sekoitetaan valinnaisesti farmaseuttisen kantajan kanssa, ja tapetuista, lyofili-soiduista ja/tai kuivatuista bakteereista muodostetaan terapeuttisesti sopiva enteraalinen farmaseuttinen 15 koostumus.

1= 85813

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunn ettu siitä, että tapetuista, lyofilisoi-duista ja/tai kuivatuista bakteereista valmistetaan enteropäällysteisiä tabletteja, granulaatteja, kapse- 20 leita tai lääkerakeita suun kautta annettaviksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tapetuista, lyofi-lisoiduista ja/tai kuivatuista bakteereista valmistetaan peräpuikkoja peräaukon kautta annettaviksi.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukai- . .·. nen menetelmä, tunnettu siitä, että tapetuista, lyofilisoiduista ja/tai kuivatuista bakteereista tehdään yksikköannos-muoto, joka sisältää ΙΟ10 - 1012 bak-teeria/yksikköannos. V:: 30 • » » · · »· · • · 16 8581 3