FI85582C - Foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt aktivt fluorerad diaminoalkynderivat. - Google Patents

Description

1 85582

Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen fluoratun diaminoal-kyynijohdannaisen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uuden farmaseutti-5 sesti käyttökelpoisen fluoratun diaminoalkyynijohdannaisen ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi. Tämä yhdiste on polyamiinien muodostukseen organismeissa osallistuvan dekarboksylaasientsyymin (ornitii-nidekarboksylaasin) inhibiittori.

10 Ornitiinin dekarboksyloituminen putreskiiniksi, or- nitiinidekarboksylaasientsyymin (ODC) katalysoima reaktio, on ensimmäinen vaihe polyamiinien spermidiini ja spermiini biosynteesissä. Spermidiiniä muodostuu aktivoidun aminopropyyliryhmän siirtyessä S-adenosyyli-S-metyyli-15 homokysteamiinistä putreskiiniin, kun taas spermiiniä muo dostuu toisen aminopropyyliryhmän siirtyessä spermidii-niin. S-adenosyyli-S-metyylihomokysteamiinia muodostuu S-adenosyylimetioniinin (SAM) dekarboksylaatiossa, reaktiossa, jota katalysoi S-adenosyylimetioniinidekarboksylaasi-20 entsyymi (SAM-DC).

Polyamiinien, joita esiintyy eläinkudoksissa ja mikro-organismeissa, tiedetään olevan tärkeässä osassa solujen kasvussa ja proliferaatiossa. Solujen kasvun ja proliferation alkamiseen liittyy sekä huomattava ODC-ak-- 25 tiivisuuden kasvu että putreskiinin ja polyamiinien pitoi suuden kasvu. Vaikka ei tarkasti tiedetä mekanismia, jolla polyamiinit osallistuvat solujen kasvuun ja proliferaa-tioon, näyttää siltä, että polyamiinit saattavat edistää makromolekyyliprosesseja, kuten DNA-, RNA- tai proteiini-30 synteesiä. Polyamiinitasojen tiedetään olevan korkeita alkiokudoksessa, kiveksissä, mahanpuoleisissa eturauhasissa ja kateenkorvassa, kasvainkudoksessa, ihon psoriasis-vaurioalueilla, ja muissa nopeasti kasvavissa tai lisääntyvissä soluissa.

; 35 Koska putreskiini on sekä spermidiinin että sper- miinin esiaste, ornitiinin muuttumisen putreskiiniksi es- 2 85582 tämisen esimerkiksi ODC:n inhibition kautta pitäisi estää näiden polyamiinien synteesi ja saada siten aikaan suotuisia fysiologisia vaikutuksia.

Olemme julkistaneet US-patenttijulkaisussa 4 139 5 563 sen tiedon, että mm. yhdisteet, joilla on kaava

R C=CH

I I

H2N-CH-(CH2)2-CH-NH2 (A) 10 jossa R on vety tai C^_^-alkyyli, ovat ornitiinidekarbok-sylaasin inhibiittoreita.

Lisäksi olemme US-patenttijulkaisussa 4 421 768 julkistaneet tiedon, että yhdisteet, joilla on kaava

15 CF H, Λ C=CH

l P 3-p i h2n-ch-(ch2)2-ch-nh2 (B) jossa p on 1 tai 2, ovat myös ornitiinidekarboksylaasin inhibiittoreita.

20 Tämä keksintö koskee menetelmää yhdisteen valmista miseksi, jolla on kaava

C ξ CH I

H2N - CH2 - CF2 - ch2 - CH - NH2 (I) 25 eli 1,4-diamino-2,2-difluoriheks-5-yynin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän happoadditiosuolan valmistamiseksi, jossa menetelmässä vastaavan alkoholin, jolla on kaava 30

C ξ CH

... : I

h2n - ch2 - cf2 - ch2 - CH - OH (II) aminosuojattua johdannaista käsitellään ftalimidillä, jol-35 loin saadaan yhdiste, jolla on kaava

II

3 85582

C i CH I

H2N - CH2 - CF2 - CH2 - CH - ftalimido (III) minkä jälkeen ftalimidoryhmä muutetaan sinänsä tunnetulla 5 tavalla primaariseksi aminoryhmäksi, jolloin saadaan kaavan I mukainen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

Kaavan I mukainen yhdiste inhiboi ornitiinidekar-boksylaasientsyymiä (ODC) in vitro ja in vitro ja saa ai-10 kaan putreskiini- ja spermidiinipitoisuuksien alenemisen soluissa, joissa tapahtuu polyamiinien aktiivista biosynteesiä. Yhdisteen hiiliketju on substituoitu kahdella fluoriatomilla ketjunsisäisesti. Edellä esitetystä julkaisuista tunnetut yhdisteet ovat joko fluorittomia (US-pa-15 tenttijulkaisu 4 139 563) tai sisältävät fluoriatomin terminaalisessa hiiliatomissa (US-patenttijulkaisu 4 421 768). Uskotaan, että ketjunsisäinen fluoraus saa aikaan kaavan 1 mukaisen yhdisteen tehokkaan sitoutumisen entsyymiin substraattina, jolloin se inhiboi entsyymin vaiku-20 tusta. Kaavan I mukainen yhdiste on siten käyttökelpoinen epätoivottavan solujen kasvun tai proliferaation torjumiseen nisäkkäissä. Tämä yhdiste on käyttökelpoinen farmakologinen aine sellaisten sairauksien tai tilojen hoitoon, joille tiedetään olevan luonteenomaista korkea ODC-aktii-25 visuus. Yhdiste on erityisesti hyödyllinen systeemisesti käytettynä estämään kasvainkudosten kasvua nisäkkäissä, eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun hoitoon ja torjumaan patogeenisten loisalkueläinten kasvua infektoituneissa kotieläimissä ja ihmisissä.

30 Kaavan I mukaista yhdistettä voidaan käyttää myös tutkittaessa ODC-inhibition esiintymistä ja fysiologista toimintatapaa biologisissa järjestelmissä ja sen suhdetta patologisiin prosesseihin.

Ymmärrettäneen, että kaavan I mukaisen yhdisteen ____: 35 aminoryhmä voi olla substituoitu millä tahansa ryhmällä, jonka tiedetään olevan lohkaistavissa in vivo (entsymaat- 4 B5582 tisesti tai kemiallisesti), jolloin muodostuu vapaa amino-ryhmä. Yhdisteet, jotka sisältävät tällaisia lohkeavia substituentteja, ja jotka ovat siten in vivo muutettavissa kaavan I mukaiseksi yhdisteeksi, ovat ekvivalenttisia kaa-5 van I mukaisen yhdisteen kanssa tämän keksinnön tarkoituksiin. Tällaisia johdannaisia voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla. Eräs tässä yhteydessä edullinen johdannainen on N-glutamyylijohdannainen.

Näiden yhdisteiden ODC-aktiivisuus voidaan määritit) tää in vitro Metcalfin et ai. [J. Am. Chem. Soc. 100 (1978) 2551] kuvaamalla tavalla. Kaavan I mukaisen yhdisteen ODC-aktiivisuus voidaan määrittää in vivo C. Danzinin menetelmällä [Biochemical Pharmacology 28 (1979) 627].

Valaiseviin esimerkkeihin tämän keksinnön mukaises-15 ti valmistettavan yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävistä suoloista kuuluvat myrkyttömät happoadditiosuolat, joita muodostavat epäorgaaniset hapot, kuten vetyklori-di-, vetybromidi-, rikki- ja fosforihappo, tai orgaaniset hapot, kuten orgaaniset karboksyylihapot, esimerkiksi sa-20 lisyyli-, maleiinimaloni-, viini-, sitruuna- ja askorbii-nihappo, ja orgaaniset sulfonihapot, esimerkiksi metaani-sulfonihappo.

Otaksutaan, että keksinnön mukaisesti valmistettava yhdiste on ornitiinidekarboksylaasin "substraatin indusoi-; 25 ma irreversiibeli inhibiittori". Tällaiset inhibiittorit tunnetaan alalla myös "entsyymin aktivoimina irreversiibeleinä inhibiittoreina", "itsemurhaentsyymi-inhibiitto- reina", "K -inhibiittoreina" tai "mekanismiin perustuvi-

Cdi na inhibiittoreina". Jotta yhdiste olisi substraatin indu-30 soima irreversiibeli entsyymi-inhibiittori, tulee sen olla substraatti kohde-entsyymille ja sisältää latentti reaktiivinen ryhmä, joka on altis menettämään suojauksensa entsyymin normaalin katalyyttisen toiminnan seurauksena. Latentin reaktiivisen ryhmän suojauksen poistuminen ent-..... 35 syymin vaikutuksesta muodostaa reaktiivisen funktionaalisen ryhmän, joka alkyloi entsyymin aktiivisessa kohdassa I: 5 85582 esiintyvän nukleofiilisen ryhmän. Inhibiittorin ja entsyymin välille syntyy siten aktiiviseen kohtaan kovalenttinen sidos, mikä johtaa entsyymin irreversiibeliin inaktivoitu-miseen. Tällaiset inhibiittorit ovat äärimmäisen spesifi-5 siä, sillä inhibiittorin täytyy olla kohde-entsyymin substraatti, ja vaaditaan inhibiittorin biologista muuttumista kohdeentsyymin vaikutuksesta, ennen kuin entsyymi inakti-voituu. Vaikka otaksutaan, että yleiskaavan I mukainen yhdiste yleensä toimii substraatti-indusoidulla mekanis-10 millä, voi inhibitio tapahtua muillakin mekanismeilla, kuten kompetitiivisen inhibition kautta.

Termi "kasvainkudos" tarkoittaa tässä yhteydessä käytettynä sekä hyvä- että pahanlaatuisia kasvaimia ja siihen sisältyvät leukemiat, lymfoomat, melanoomat ja sar-15 koomat. Termillä "kasvainkudoksen kasvun kontrollointi" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä nopeasti lisääntyvän kasvaimen kasvun hidastamista, keskeyttämistä sal-paamista tai pysäyttämistä vaihtolämpöisessä eläimessä. Tulisi ymmärtää, ettei kaavan I mukaisen yhdisteen antami-20 nen saa aikaan "parantumista" kasvaimesta siinä mielessä, että kasvainkudos tuhoutuisi tai eliminoituisi kokonaan hoidettavasta eläimestä.

Kaavan I mukaista yhdistettä voidaan antaa potilaalle kasvainkudosten kasvun kontrolloimiseksi muiden 25 hoitomenetelmien yhteydessä tai yhdistettynä sytotoksisiin lääkkeisiin, joiden tiedetään olevan käyttökelpoisia syövän kemoterapiaan. Kaavan I mukaista yhdistettä voidaan antaa esimerkiksi kasvaimen kirurgisen poiston, sädehoidon, hormonihoidon, immunoterapian tai paikallisen lämpö-30 hoidon yhteydessä. Lisäksi, ja edullisesti, kaavan I mukaista yhdistettä voidaan antaa potilaalle yhdistettynä kemialliseen sytotoksiseen aineeseen, jonka tiedetään olevan käyttökelpoinen kasvainten kemoterapiaan. Kun tällaista yhdistelmähoitoa käytetään kasvaimen hoitoon, voidaan ; 35 kemoterapeuttista syöpälääkettä antaa annoksena, jonka tiedetään olevan tehokas kasvaimen hoitoon. Kaavan I mu- 6 85582 kainen yhdiste voi kuitenkin saada aikaan additiivisen tai synergistisen vaikutuksen kemoterapeuttisen aineen kanssa kyseessä olevaa kasvainta vastaan. Käytettäessä kasvaimen vastaista yhdistelmähoitoa voi annettavan kemoterapeutti-5 sen aineen annostus siten olla pienempi kuin käytettäessä tätä ainetta yksinään. Kemoterapeuttista ainetta voidaan kaavan I mukaiseen yhdisteeseen yhdistettynä siten antaa pienempinä annoksina tai harvemmin kuin yksinään käytettävää kemoterapeuttista ainetta.

10 Mitä tahansa kemoterapeuttista syövänvastaista ai netta voidaan käyttää yhdistettynä kaavan I mukaiseen yhdisteeseen. Syövän kemoterapiaan yleisesti käytettäviä lääkkeitä kuvataan julkaisussa The Medical Letter, 22, nro 24 (Issue 571), 28. marraskuuta 1980, julk. The Medical 15 Letter, Inc., New Rochalle, N.Y., 10801. Valaisevia esimerkkejä sytotoksisista kemoterapeuttisistä aineista ovat syklofosfamidi, metotreksaatti, prednisoni, 6-merkaptopu-riini, prokarbotsiini, daunorubisiini, vinkristiini, vin-desiini, vinblastiini, klorambusiili, sytosiiniarabinosi-20 di, 6-tioguaniini, tio-TEPA, 5-fluoriurasiili 5-fluori-2-deoksiuridiini, 5-atsasytidiini, typpisinappi, l,2-bis(2-kloorietyyli)-l-nitrosourea (BCNU), 1-(2-kloorietyyli)-3-sykloheksyyli-1-nitrosourea (CCNU), busulfaani, adriamy-siini, bleomysiini, sykloleusiini ja metyyliglyoksaali-‘25 bis(guanyylihydratsoni) MGBG). Muut syövän kemoterapia-aineet ovat alan ammattihiehille tuttuja.

Kaavan I mukaisen yhdisteen nopeasti lisääntyvän kasvainkudoksen kasvunopeutta kontrolloiva vaikutus voidaan todeta tavanomaisissa eläinkasvainmalleissa oraalisen 30 tai parenteraalisen annon jälkeen. Kasvainten vastaiset vaikutukset voidaan osoittaa esimerkiksi seuraavilla mal-] leiliä: (a) L1210-leukemia hiirissä, (b) EMT 6-kasvain

Balb/c-hiirissä, (C) 7,12-dimetyylibentsantraseeni-indu-soitu (DMBA-indusoitu) rintasyöpä rotissa tai (d) Morris - : 35 7288 C tai 5123 -hepatooma Buffalo-rotissa. Kemoterapeut- li 7 B5582 tisiin aineisiin yhdistetyn yhdisteen kasvainten vastaiset vaikutukset voidaan myös osoittaa eläinmalleilla.

Kun pahanlaatuisen kasvainsairauden hoidossa annetaan kaavan I mukaista yhdistettä yhdessä kemoterapeutti-5 sin aineen kanssa, voi kemoterapeuttisen aineen terapeuttinen vaikutus vahvistua, niin että kemoterapeuttisen aineen aikaansaama remissio voi edistyä ja kasvainkudoksen uudelleenkasvu hidastua tai estyä. Tällainen yhdistelmähoidon käyttö mahdollistaa siten kemoterapeuttisen aineen 10 käytön pienempinä annoksina tai harvemmin annettavina yk-sittäisannoksina. Siten minimoidaan kemoterapeuttisen aineen haitalliset ja/tai heikentävät sivuvaikutukset parantaen samalla kasvainten vastaisia vaikutuksia. Termillä "yhdistelmähoito" tarkoitetaan kaavan I mukaisen yhdisteen 15 antamista välittömästi ennen kemoterapian aloittamista, samanaikaisesti kemoterapian kanssa tai kemoterapian lopettamista tai keskeyttämistä välittömästi seuraavana ajanjaksona.

Kun kemoterapia johtaa kasvaimen remissioon eivätkä 20 kaikki kasvainsolut tuhoudu, voidaan kasvaimen uudelleen-kasvua estää tai hidastaa määräämättömän pitkän aikaa jatkamalla hoitoa kaavan I mukaisella yhdisteellä. Siten kaavan I mukaista yhdistettä voidaan antaa kasvaimen kasvun pysäyttämiseksi tai hidastamiseksi sellaisina ajanjaksoi-25 na, joina kemoterapia sytotoksisella aineella saattaa olla tilapäisesti keskeytyksissä.

Edullinen sytotoksinen aine käytettäväksi yhdistelmähoidossa kaavan I mukaisen yhdisteen kanssa on metyyli-glyoksaalibis(guanyylihydratsoni), josta käytetään tässä 30 lyhennettä MGBG ja joka myös on S-adenosyylimetioniinide-karboksylaasin inhibiittori. MGBG:n aktiivisuus kemotera-peuttisena aineena kasvainsairauksien hoidossa on hyvin dokumentoitua. Esimerkiksi W.A Knightin et ai. mukaan [Cancer Treat. Rep. 43 (1979) 1933] MGBG-annos annettuna . 35 laskimonsisäisesti kerran tai kahdesti viikossa potilail- 8 85582 le, joilla on pitkälle edennyt virtsarakko-, ruokatorvi-, keuhko-, haima-, paksusuoli-, munuais-, rinta- ja eturauhassyöpä, jyväsolukarsinooma, adenokarsinooma, lym-fooma, hepatooma, melanooma, leukemia tai Edwingin sarkoo-5 ma, sai aikaan mitattavissa olevan kasvaimen regression monissa hoidetuista potilaista ja sairauden täydellisen katoamisen kahdessa hoidetuista 65 potilaasta.

Annettava MGBG-määrä voi olla alalla kasvainten hoitoon tehokkaaksi tiedetty määrä. Lääkäri määrittää te- 10 hokkaat ja myrkyttömät annostukset kussakin tapauksessa ottaen huomioon kunkin potilaan tilan. Voidaan esimerkiksi 2 infusoida annos 250 - 500 mg/m ruumiin pinta-alaa 100 ml:ssa 5-%:ista dekstroosin vesiliuosta 30 min:n aikana kerran tai kahdesti viikossa. Yhdistelmähoito kaavan I 15 mukaisen yhdisteen kanssa parantaa kasvainkudoksen vastetta MGBG:n sytotoksiselle vaikutukselle ja mahdollistaa pienempien MGBG-yksittäisannosten käytön ja hoidon lyhyemmän keston verrattuna pelkän MGBG:n käyttöön.

Sopiva annostus kaavan I mukaista yhdistettä käy-20 tettäväksi yhdistelmähoidossa yhdessä MGBG:n tai muiden syövän kemoterapia-aineiden kanssa voi olla mikä tahansa määrä, joka estää riittävästi polyamiinibiosynteesiä kasvaimen kasvunopeuden kontrolloimiseksi tai paremman vasteen saavuttamiseksi yhdisteen yhteydessä annettavalle 25 sytotoksiselle aineelle.

Termillä "patogeenisten loisalkueläinten kasvua kontrolloiva" tarkoitetaan tässä käytettynä alkueläinten replikoitumisen hidastamista, keskeyttämistä, tukahduttamista tai pysäyttämistä infektoituneessa isännässä. Kaavan 30 I mukainen yhdiste on käyttökelpoinen T.b. bruceita (joka aiheuttaa trypanosomiaasia karjassa), T.b. rhodesiensea (joka aiheuttaa unitautia ihmisessä), itiöloisia, esimerkiksi Eimeria tenellaa (joka aiheuttaa suolistokokkidioo-sia siipikarjassa, esimerkiksi kanoissa, kalkkunoissa ja ... 35 ankoissa) ja plasmodien eksoerytrosyyttistä muotoa, esi- 9 85582 merkiksi Plasmodium falciparumia (joka aiheuttaa malariaa ihmisissä) vastaan.

Kaavan I mukaisen yhdisteen alkueläinten vastainen vaikutus voidaan osoittaa in vivo tai in vitro tavanomai-5 silla mikrobiologisilla testausmenetelmillä. Yhdisteen vaikutus T.b. bruceita ja T.b. rhodesiensea vastaan voidaan määrittää infektoiduissa hiirissä antamalla tutkittavaa yhdistettä rajoittamattomasti päivittäin (3-15 vrk infektoinnin jälkeen) liuoksena juomavedessä. Aktiivisuu-10 den osoittaa eliniän pidentyminen (verrattuna hoitamattomiin vertailueläimiin) tai loisten poissaolo verestä. Yhdisteen itiöloisten vastainen vaikutus voidaan määrittää infektoiduissa kanoissa, esimerkiksi E. tenellalla infektoiduissa kanoissa, antamalla tutkittavaa yhdistettä päi-15 vittäin rajoittamattomasti (infektointia edeltävästä päivästä viidenteen infektoinnin jälkeiseen päivään) liuoksena juomavedessä. Umpisuolivauriot arvioidaan tavanomaisin vaurioiden arvostelumenettelyin. [katso Reid., Am. J. Vet. Res. 30 (1969) 447 ja Avian Coccidiosis, toim. P. 20 Long, British Poultry Science. Ltd., Edinburgh]. Yhdisteen malarian vastainen vaikutus (P falsiparum) voidaan määrittää tavanomaisella maljaviljelykokeella in vitro [katso K. Rieckmann, et ai., Lancet 1 (1978) 2]. Malarian vastainen vaikutus voidaan määrittää myös erityisissä hiirikannois-25 sa, jotka on infektoitu P. berghein oksierytrosyyttisellä muodolla. Tässä kokeessa annetaan yhdistettä rajoittamattomasti juomavedessä aloittaen kaksi päivää ennen infektointia ja lopettaen 28 päivän kuluttua siitä. Aktiivisuutta mitataan kuolintapausten merkittävällä vähenemisel-30 lä vertailueläimiin nähden tai eliniän merkittävällä pitenemisellä.

Tämä keksinnön mukaisesti valmistettua yhdistettä voidaan antaa eri tavoin halutun vaikutuksen saavuttamiseksi. Yhdistettä voidaan antaa yksinään tai farmaseuttis-35 ten valmisteiden muodossa joko oraalisesti tai parenteraa- 10 85582 lisesti, ihonalaisesti, laskimonsisäisesti tai intraperi-toneaalisesti. Annettava uuden yhdisteen määrä vaihtelee ja voi olla mikä tahansa vaikuttava määrä. Annettava vaikuttava määrä yhdistettä voi potilaan, hoidettavan tilan 5 ja anottavan mukaan vaihdella noin 5 mg:sta noin 500 mg:aan painokiloa kohden vuorokaudessa. Yhdisteen yksikkö-annokset voivat sisältää esimerkiksi noin 10 - 500 mg yhdisteitä ja sitä voidaan antaa esimerkiksi 1-4 kertaa vuorokaudessa.

10 Termiä "yksikköannosmuoto" käytetään tässä yhtey dessä yhden tai useamman annoksen sisältävästä muodosta, joka sisältää jonkin määrän aktiivista aineosaa sekoitettuna tai muulla tavalla yhdistettynä laimennus- tai kantaja-aineeseen, jolloin mainittu määrä on sellainen että 15 normaalisti tarvitaan yksi tai useampia ennalta määrättyjä yksiköitä yhteen terapeuttiseen antokertaan. Moniannosmuo-tojen, kuten nesteiden tai uritettujen tablettien, ollessa kyseessä mainittu ennalta määrätty yksikkö on osa monian-nosmuodosta, kuten 5 ml (teelusikallinen) nesteen määrästä 20 tai puolikas tai neljännes uritetusta tabletista.

Keksinnön mukaisesti valmistettua aktiivista yhdistettä käytetään normaalisti farmaseuttisina formulaatioi-ta. Tällaisia formulaatioita valmistetaan farmasian alalla sinänsä tunnetulla tavalla ja ne sisältävät tavallisesti 25 kaavan I mukaista aktiivista yhdistettä sekoitettuna tai muuten yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja- tai laimennusaineeseen. Näiden formulaatioiden valmistamiseksi aktiivinen aine sekoitetaan tavallisesti kantajaan tai laimennetaan laimennusaineella tai suljetaan tai 30 pakataan kapseliin, taskuun, pussiin, paperiin tai muuhun säiliöön. Kantaja tai laimennusaine voi olla kiinteä, puo-likiinteä tai nestemäinen materiaali, joka toimii aktiivisen aineosan kantaja-, jatke- tai väliaineena. Soveltuvat kantajat tai laimennusaineet ovat sinänsä hyvin tunnettu-35 ja.

I; li 85582

Formulaatiot voidaan tehdä enteraaliseen tai paren-teraaliseen käyttöön soveltuviksi ja niitä voidaan antaa potilaalle tablettien, kapselien, peräpuikkojen, liuosten, suspensioiden tms. muodossa. Jäljempänä olevissa esimer-5 keissä annetaan valaisevia esimerkkejä soveltuvista farmaseuttisista formulaatioista.

Jos keksinnön mukaisessa menetelmässä jossakin kuvatuista reaktiovaiheista jokin reagenssi osallistuisi epätoivottavaan reaktioon kyseessä olevissa reaktio-olo-10 suhteissa, suojataan aminoryhmä sinänsä tunnetulla tavalla liittämällä siihen sopiva suojausryhmä. Suojausryhmä valitaan ottaen huomioon kyseessä olevan reaktion luonne ja se, miten helppo suojausryhmä on poistaa vapaan aminoryh-män muodostamiseksi. Suojausryhmä voi olla esimerkiksi 15 asyyliryhmä, esimerkiksi alempi alkanoyyliryhmä, esimer kiksi asetyyli-, propionyyli-, trifluoriasetyyli- tms. ryhmä; aroyyliryhmä, esimerkiksi bentsoyyli-, toluoyyli-tms. ryhmä; alempi alkoksikarbonyyliryhmä, esimerkiksi metoksikarbonyyli-, etoksikarbonyyli-, tert-butoksikarbo-20 nyyli- tms. ryhmä. Aminoryhmän molemmat vetyatomit voivat olla yhden suojausryhmän, esimerkiksi ftalyyliryhmän subs-tituoimia. Suojausryhmät tuodaan yhdisteeseen sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi antamalla amiinin reagoida alemman alkanoyyli- tai aroyylikloridin, anhydridin, sul-• 25 fonyylikloridin, tert-butoksikarbonyloksimino-2-fenyyli- asetonitriilin [(BOC^-Oin] tai di-tert-butyylidikarbonaa-tin [(BOC^Otn] kanssa.

Suojausryhmän poistaminen halutun reaktion mentyä loppuun voidaan tehdä sinänsä tunnetulla, kyseessä oleval-30 le suojausryhmälle soveltuvalla tavalla. Mainittu poisto on tavallisesti hydrolyyttinen lohkaisu, jossa käytetään vahvaa orgaanista tai mineraalihappoa, kuten esimerkiksi trifluorietikkahappoa, vetykloridihappoa tms, tai se tehdään vetykloridikaasulla vedettömissä olosuhteissa. Sel-35 laisten olosuhteiden, jotka pelkistävän tyydyttymättömän i2 85582 sidoksen, tai reagenssien, kuten vetybromidihapon, jotka reagoivat tyydyttymättömän sidoksen kanssa, käyttöä tulee välttää. Käytettävät liuottimet valitaan suojausryhmän poistossa vallitsevien olosuhteiden mukaan. Esimerkiksi 5 eettereitä, kuten esimerkiksi dietyylieetteriä voidaan käyttää vetykloridikaasun avulla tehtävässä lohkaisussa. Siinä tapauksessa, että on määrä suojata asetyleeniryhmä, on edullinen suojausryhmä trialkyylisilyyliryhmä, erityisesti trimetyylisilyyliryhmä, joka on helppo tuoda yhdis-10 teeseen antamalla vapaan asetyleenisen ryhmän reagoida trialkyylisilyylikloridin kanssa. Trialkyylisilyyliryhmä on helppo poistaa emäshydrolyysillä, jolloin asetyleeninen ryhmä vapautuu.

Menetelmässä käytettävä kaavan III mukainen ftali-15 midoyhdiste on saatavissa sinänsä tunnetulla tavalla kä-sittelmällä kaavan II mukaisen yhdisteen aminosuojattu johdannainen ftalimidillä trialkyyli- tai triaryylifosfii-nin ja dietyyliatsodikarboksylaatin läsnäollessa vedettömässä aproottisessa liuottimessa. Tavallisesti käytetään 20 1-3 ekvivalenttia ftalimidiä, fosfiinia ja dietyyliatso- dikarboksylaattia kutakin yhtä ekvivalenttia kohden kaavan II mukaisen yhdisteen johdannaista, jolloin reaktiolämpö-tila on 10 - 100 °C ja reaktio kestää 18 - 24 tuntia. Kätevä fosfiini on trifenyylifosfiini ja kätevä aproottinen 25 liuotin tetrahydrofuraani.

Ftalimidoryhmä voidaan muuttaa sinänsä tunnetulla tavalla vaadittavaksi primaariseksi aminoryhmäksi. Ftalimidoryhmä voidaan lohkaista esimerkiksi hydrolyyttisesti kuumentamalla yhdistettä kuuman mineraalihapon, edullises-30 ti vetykloridi- ja etikkahappojen seoksen, kanssa. Happoja, jotka reagoivat asetyleenisten sidosten kanssa, esimerkiksi vetybromidihappoa, ei tietenkään voida käyttää. On edullista vapauttaa aminoryhmä kuumentamalla, edullisesti palautusjäähdyttäjän alla, ftalimidojohdannaista 35 hydratsiinin tai metyyliamiinin kanssa polaarisessa orgaa- li i3 8 5 582 nisessa liuottimessa, erityisesti alkoholissa. On kätevää käyttää metyylihydratsiinia metanolissa.

Edullinen aminoryhmän suojausryhmä kaavan III mukaiselle yhdisteelle on ftalimidoryhmä, jolloin halutun, 5 kaavan I mukaisen yhdisteen molemmat aminoryhmät voidaan vapauttaa samanaikaisesti.

Kaavan II mukainen yhdiste voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla antamalla etynyylimagnesiumhalo-genidin, edullisesti bromidin, reagoida vastaavan aldehy-10 din, jolla on seuraava yleinen kaava IV, aminosuojatun johdannaisen kanssa: h2n-ch2-cf2-ch2-cho (IV) 15 On kätevää tehdä reaktio tetrahydrofuraanissa ja muodostaa etynyylimagnesiumhalogenidi in situ lisäämällä etyylimag-nesiumhalogenidia asetyleenillä kyllästettyyn tetrahydro-furaaniin. Edullinen aminoryhmän suojausryhmä on tälläkin kertaa ftalimidoryhmä.

20 Kaavan IV mukainen yhdiste voidaan valmistaa sinän sä tunnetulla tavalla hapettamalla vastaavan olefiinin, jolla on yleinen kaava V, aminosuojattu johdannainen: h2n-ch2-cf2-ch2-ch=ch2 (V) 25

Soveltuvia hapettimia ovat kaliumpermanganaatti, osmium-tetroksidi ja tässä yhteydessä edullisesti otsoni. Käytettäessä otsonia on edullista johtaa otsoni liuoksen läpi, joka sisältää olefiinin aproottisessa liuottimessa, esi-30 merkiksi dikloorimetaanissa, ja lisätä sitten dimetyyli-sulfidia otsonireaktiovälituotteen pelkistämiseksi.

Kaavan V mukainen yhdiste voidaan valmistaa vastaavasta alkoholista, jolla on seuraava yleinen kaava VI, muuttamalla sinänsä tunnetulla tavalla hydroksyyliryhmä 35 primaariseksi aminoryhmäksi: i4 8 5 582 HO-CH2-CF2-CH2-CH=CH2 (VI)

On kätevää tehdä muuttaminen vastaavan tosyylioksi-, me-5 syylioksi- tai, edullisesti, trifluorimetyylisulfonyyliok-siyhdisteen kautta käsittelemällä kaavan VI mukainen alkoholi tosyylikloridilla, mesyylikloridilla tai trifluorime-tyylisulfonyylianhydridillä emäksen, kuten pyridiinin, läsnä ollessa aproottisessa liuottimessa, erityisesti di-10 kloorimetaanissa. Välituote käsitellään sitten alkalime-talliftalimidillä polaarisessa orgaanisessa liuottimessa, edullisesti dimetyyliformamidissa, jolloin muodostuu vastaava ftaiimidojohdannainen. Ftalimidojohdannaista käytetään tavallisesti aminosuojattuna johdannaisena, jota tar-15 vitaan reagoivana aineena kaavan V mukaisen yhdisteen valmistamiseksi. Aminoryhmä voidaan kuitenkin tarvittaessa vapauttaa esimerkiksi käsittelemällä mineraalihapolla tai hydratsiinilla.

Kaavan VI mukainen alkoholi voidaan pelkistämällä 20 vastaava esteri, jolla on seuraava yleinen kaavan VII, pelkistimellä, kuten boorihydridillä, joka pelkistää selektiivisesti esteriryhmän: r1o2c-cf2-ch2-ch-ch2 (VII) 25 jossa on Cj^-alkyyli.

Kun R on alkyyli, voidaan kaavan VI mukainen alkoholi valmistaa käsittelmällä kaavan VII mukainen esteri vastaavalla litium- tai magnesiumalkyylihalogenidilla, 30 jolloin saadaan vastaava ketoni, jolla on seuraava yleinen kaava VIII: R' oc-cf2-ch2-ch=ch2 (VIII) jossa R' on C^^-alkyyli.

Il 35 is 85582

Kaavan VIII mukainen ketoni pelkistetään sitten halutuksi alkoholiksi esimerkiksi boorihydridillä. Edellä mainituilla menetelmillä saadut yhdisteet voidaan eristää joko sellaisinaan tai happoadditiosuoloinaan. Happoaddi-5 tiosuolat ovat edullisesti soveltuvien happojen, kuten tässä hakemuksessa aiemmin mainittujen happojen, kanssa muodostettuja farmaseuttisesti hyväksyttäviä, myrkyttömiä additiosuoloja. Farmaseuttisesti hyväksyttävien happoaddi-tiosuolojen lisäksi kuuluu happoadditiosuolojen piiriin 10 muitakin suoloja, kuten esimerkiksi pikriini- ja oksaali-happosuolat; ne voivat toimia välituotteina yhdisteiden puhdistuksessa tai muiden, esimerkiksi farmaseuttisesti hyväksyttävien, happoadditiosuolojen valmistuksessa, tai ne ovat käyttökelpoisia emästen identifioinnissa tai ka-15 rakterisoinnissa.

Tuloksena oleva happoadditiosuola voidaan muuttaa vapaaksi yhdisteeksi tunnetuin menetelmin, esimerkiksi käsittelemällä se alkali- tai maa-alkalimetallihydroksi-dilla tai -alkoksidilla, alkalimetalli- tai maa-alkalime-20 tallikarbonaatilla tai -vetykarbonaatilla, trialkyyliamii- nilla, tai anioninvaihtohartsilla.

Tuloksena oleva happoadditiosuola voidaan muuttaa myös toiseksi happoadditiosuolaksi tunnetuin menetelmin; esimerkiksi epäorgaanisen hapon kanssa muodostettu suola 25 voidaan käsitellä jonkin hapon natrium-, barium- tai ho-peasuolalla soveltuvassa laimennusaineessa, johon tuloksena oleva epäorgaaninen suola ei liukene, jolloin se erottuu reaktioväliaineesta. Happoadditiosuola voidaan muuttaa toiseksi happoadditiosuolaksi myös käsittelemällä anionin-30 vaihtimella.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

ie 85582

Esimerkki 1 1,4-diamino-2,2-difluoriheks-5-yyni A) 2,2-difluoripent-4-en-l-oll (kaava VI) 5 Liuos, joka sisältää etyyli-2,2-difluoripent-4- enoaattia (kaava VII; R1 on C2H,-) (146,8 g, 0,9 mol) etanolissa (350 ml), lisätään tipoittain 1 tunnin aikana liuokseen, joka sisältää natriumboorihydridiä (34 g, 0,9 mol) absoluuttisessa etanolissa (550 ml), huoneen lämpöti-10 lassa. Reaktioseoksen havaitaan lämpenevän lisäyksen aikana. Seos jäähdytetään 25 min:n kuluttua suola-jääseoksella noin 16 °C:seen ja lisäystä jatketaan tässä lämpötilassa. Sekoitusta jatketaan vielä 30 min jäähauteen lämpötilassa ja sitten 2 tuntia huoneen lämpötilassa.

15 Reaktioseos haihdutetaan, jäännös liuotetaan di- kloorimetaaniin (500 ml) ja liuokseen lisätään 4 N rikkihappoa (350 ml), mikä aiheuttaa voimakkaan vedyn kehittymisen. Liuos laimennetaan vedellä (500 ml) ja uutetaan sitten dikloorimetaanilla (4 x 250 ml). Yhdistetyt orgaa-20 niset uuteliuokset pestään rikkihapolla (kahdesti, 200 ml, 2 N) ja kyllästetyllä suolaliuoksella, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja väkevöidään 25 °C:ssa vesisuihkupumpul-la aikaansaadussa alipaineessa.

Tislaamalla konsentraatti saadaan 2,5-difluoripent-25 4-en-l-olia, kp. 48 - 50 "C/ll mmHg, värittömänä, liikkuvana öljynä (110,8 g, kvantitatiivinen saanto).

1H-NMR, CDC13, delta 6,1 - 5,7 (1 H, m); 5,3 (2 H, leveä d); 3,70 (2 H, t, J = 12 Hz); 3,2 (1 H, leveä s); 2,70 (2 H, dt, J = 6, 15 Hz).

30 19F-NMR, CDC13/C6F6,-54 (tt, J * 12,15 Hz).

B) 2,2-difluoripent-4-enyylitrifluorimetyylisulfo- naattl

Vaiheessa A valmistetun alkoholin (78 g, 0,64 mol) liuokseen dikloorimetaanissa (500 ml) ja pyridiinissä 35 (55,3 g, 0,7 mol) lisätään 0 °C:ssa liuos, joka sisältää trifluorimetyylisulfonyylianhydridiä (204 g, 0,7 mol) di- i7 85582 kloorimetaanissa, 0,75 tunnin aikana pitäen lämpötila 5 °C:na suola-jääseoksella jäähdyttämällä. Kun lisäys on saatettu loppuun, reaktioseoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan, sekoitetaan 0,5 tuntia, jäähdytetään 0 5 °C:seen ja lisätään sitten vettä (350 ml). Muodostuvat kerrokset erotetaan, vesikerros uutetaan dikloorimetaanil-la (2 x 500 ml), yhdistetyt orgaaniset faasit pestään vedellä (2 x 200 ml), kuivataan natriumsulfaatilla ja väke-vöidään pyöröhaihduttimella.

10 Konsentraatti tislataan vesisuihkupumpulla aikaan saatavassa alipaineessa. Kp. 50 - 52 °C, 134 g (83 %), 1H-NMR, CDC13, delta 5,8 (1 H, m); 5,3 (2 H, m); 4,50 (2 H, t, J = 11 Hz); 2,77 (2 H, dt, J = 7, 16 Hz) 19F-NMR, CDClg/CgFg, -88 (s), -57 (tt, J - 11, 16 Hz).

15 C) 2,2-difluoripent-4-enyyliftalimidi (kaava V; suojausryhmä ftalyyli)

Kaliumftalimidi (123 g 0,67 mol) lisätään sekoittaen edellä vaiheessa B valmistetun 2,2-difluoripent-4-enyylitrifluorimetyylisulfonaatin (130 g, 0,51 mol) liuok-20 seen dimetyyliformamidissa (1,2 1). Seosta pidetään 120 °C:n lämpötilassa 21 tuntia, minä aikana suurin osa kiinteästä aineesta liukenee.

Kun seos on jäähdytetty huoneen lämpötilaan, lisätään vettä (2 1) pitäen lämpötila 20 °C:na. Kiinteä aine 25 liuotetaan lisäämällä dietyylieetteriä, eetterikerros erotetaan ja vesikerros uutetaan dietyylieetterillä (3 x 1,7 1). Yhdistetyt orgaaniset faasit pestään 2 N natriumhyd-roksidiliuoksella (3 x 150 ml) ja vedellä (3 x 500 ml), kuivataan (MgS04) ja haihdutetaan, jolloin saadaan 2,2-di-30 fluoripent-4-enyyliftalimidiä (114,8 g, 90 %) valkeana kiinteänä aineena, sp. 74 - 77 °C.

1H-NMR, CDC13, delta 7,87 (4 H, m); 5,9 (1 H, m); 5,3 (2 H, m); 4,10 (2 H, t, J - 14 Hz); 2,75 (2 H, dt, J - 7, 16 Hz).

35 19F-NMR, CDC13/C6F6, -60,5 (tt, j = 16, 14 Hz).

ie 85582

Dietyylieetterin ja pentaanin seoksesta kiteytetyn näyteen sp. on 78 - 80 °C.

Alkuaineanalyysi yhdisteelle C13HuN02F2:

Laskettu: C, 62,15; H, 4,41; N, 5,58 % 5 Mitattu: C, 62,53; H, 4,51; N, 5,63 %.

D) 2,2-difluori-l-ftalimidobutan-4-aali (kaava IV; suojausryhmä ftalyyli)

Vaiheessa C valmistetun 2,2-difluoripent-4-enyyli-ftalimidin (18 g, 72 mmol) liuos dikloorimetäänissä (500 10 ml) jäähdytetään hiilihappojääasetonihauteessa ja liuokseen johdetaan otsonia (0,5 mmol/min), kunnes havaitaan sininen väri. Otsonivirtaus pysäytetään ja lisätään dime-tyylisulfidi (60 ml) yhtenä annoksena. Jäähdytyshaude poistetaan ja seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa yön 15 yli· Dikloorimetaani ja ylimääräinen dimetyylisulfidi poistetaan pyöröhaihdutuksella. Jäännös siirretään dikloo-rimetaaniin (100 ml), pestään kyllästetyllä natriumbikarbonaatin vesiliuoksella (3 x 40 ml), kahdesti vedellä (50 ml) ja sitten kyllästetyllä NaCl-liuoksella, kuivataan 20 natriumsulfaatilla ja poistetaan liuotin pyöröhaihdutti- mella, jolloin saadaan 2,2-difluori-l-ftalimidobutan-4-aalia (18,1 g, 100 %) valkeana kiinteänä aineena (sp. 76 -78 °C).

1H-NMR, CDC13, delta 9,87 (1 H, m); 7,87 (4 H, m); 4,22 (2 25 H, 5, J = 14 Hz); 3,07 (2 H, dt, J, 2, 17 Hz).

19F-NMR, CDC13/C6F6, -64 (ddd, J = 17, 14, 2 Hz).

Jos reaktioseosta sekoitetaan vain 1-2 tuntia dimetyylisulfidin lisäämisen jälkeen on aldehydin pääasiallisena epäpuhtautena otsonidi 3-( 2,2-difluori-3-ftal-30 imidopropyyli)l,2,4-trioksalaani.

1H-NMR, CDClg, delta 7,53 (4 H, m); 5,60 (1 H, t, J = 5 Hz); 5,22 (1 H, s); 5,13 (1 H, s); 4,17 (2 H, t, J - 14 Hz); 2,45 (2 H, kaksois-t, J - 5, 16 Hz).

19F-NMR, CDC13/C6F6, -62 (m).

35 i9 8 5 582 E) 2,2-difluori-l-ftalimidoheks-5-yn-4-oli (kaava II; suojausryhmä ftalyyli)

Hiilihappojäällä jäähdytettyä tetrahydrofuraania (1 1) kyllästetään asetyleenillä yhden tunnin ajan. Sitten 5 tähän liuokseen lisätään etyylimagnesiumbromidia (2 M liuos dietyylieetterissä, 40 ml, 80 mmol) noin 15 minrn aikana ja asetyleenivirtaa pidetään yllä 30 min tämän lisäyksen lopetuksen jälkeen. Vaiheessa D valmistetun 2,2-difluori-l-ftalimidobutan-4-aalin (72 mmol) liuos tetra-10 hydrofuraanissa (150 ml) lisätään sitten tipoittain 15 min:n aikana ja seosta sekoitetaan typen alla yksi tunti antaen sen samalla lämmetä huoneen lämpötilaan. Seos kaadetaan 1 N vetykloridihappoon (1 1) ja uutetaan dietyyli-eetterillä (3 x 750 ml). Yhdistetyt orgaaniset uuteliuok-15 set pestään kyllästetyllä NaCl-liuoksella, kuivataan nat-riumsulfaatilla ja väkevöidään.

Tuote käsitellään aktiivihiilellä metanolissa. Kiteyttämällä tämä materiaali etyyliasetaatin ja heksaanin seoksesta ja käsittelemällä emäliuokset kromatografisesti 20 (500 g Si02, 70 - 230 meshiä, etyyliasetaatti-heksaaniseos 1:1) saadaan kaikkiaan 6,58 g 2,2-difluori-l-ftalimido-heks-5-yn-4-olia, joka on riittävän puhdasta käytettäväksi vaiheessa F. Kokonaissaanto 33 %, Rf (etyyliasetaatti-heksaaniseos 1:1) 0,69. Metanolista uudelleenkiteytetyn näyt-25 teen sp. on 172 - 174 °C.

1H-NMR, CD3OD/(CD3)2SO, delta 7,87 (4 H, m); 4,67 (1 H, dt, J * 2 Hz); 4,5 - 3,7 (2 H, m); 3,03 (1 H, d, J = 2 Hz); 2,40 (2 H, ddd, J = 18, 15, 6 Hz).

19F-NMR, CDCWC.F,, -64 (m).

^ ^ + + 30 Massaspektri: (NH3/DCI) m/e 297 (MNH4 , 70 %); 280 (MH ; 100 %); 262 (20 %); 242 (50 %); 160 (75 %).

Alkuaineanalyysi yhdisteelle C14H11N03F2:

Laskettu: C, 60,22; H, 3,97; N, 5,02 %

Mitattu: C, 59,55; H, 4,06; N, 5,13 %.

35 20 8 5 5 8 2 F) 2,2-difluori-ly4-bis(ftalimido)-heks-5-yynl (kaava III; suojausryhmä ftalyyli) Dietyyliatsidikarboksylaatti (7,5 ml, 47,4 mmol) lisätään jääkylmään liuokseen, joka sisältää 2,2-difluori-5 l-ftalimidoheks-5-yn-4-olia (valmistettu vaiheessa E, 8,88 g, 31,8 mmol), trifenyylifosfiinia (16,7 g, 63,7 mmol) ja ftalimidiä (5,12 g, 34,8 mmol) tetrahydrofuraanissa (500 ml), typen alla 10 min:n aikana. Seosta sekoitetaan 0 °C:ssa kaksi tuntia ja sitten huoneen lämpötilassa 65 tun-10 tia. Tetrahydrofuraani poistetaan pyöröhaihduttimella ja jäännös puhdistetaan flash-kromatografiällä (800 g Si02, 230 - 400 meshiä, etyyliasetaatin ja heksaanin seos 1:1). Kerätään kaksi sarjaa fraktioita. 2,2-difluori-4-bis(ftal-imido)-heks-5-yyniä ja trifenyylifosfiinia sisältävät 15 fraktiot pestään dietyylieetterillä, jolloin saadaan kohtuullisen puhdasta bisftalimidiä, kun taas 2,2-difluori- 1,4-bis(ftalimido)-heks-5-yyniä ja N,N'-dikarbetoksihyd-ratsiinia sisältävät fraktiot pestään metanolilla. Kolon-ni huuhdotaan lopuksi etyyliasetaatilla. Tälläkin kertaa 20 pesu metanolilla antaa tulokseksi bisftalimidia. Eristetään kaikkiaan 4,85 g (36 %) haluttua tuotetaa, Rf (etyyli-asetaatti-heksaaniseos 1:1) 0,34.

Metanolilla vielä kerran pestyn näytteen sulamispiste on 201 - 203 °C.

25 1H-NMR, CDClg, delta 7,77 (8 H, m); 5,60 (1 H, ddd, J - 9, 4, 2 Hz); 4,08 (2 H, t, J = 14 Hz); 3,5-2,5 (2 H, m); 2,43 (1 H, d, J = 2 Hz).

19F-NMR. CDC13/C6F6, -59 (m).

Massaspektri; (EI), m/e 408 (M+, 5 %); 388 (m-HF, 30 30 15 %); 380 (5 %); 368 (10 %); 345 (20 %); 241 (95 %); 194 (100 %); 160 (80 %).

Alkuaineanalyysi yhdisteelle C22H14N2F204:

Laskettu: C, 64,71, H, 3,46; N, 6,86 %

Mitattu: C, 63,86; H, 3,51; N, 6,83 %.

35 2i 85 582 G) 2,2-dlfluorlheks-5-yynl-l,4-dlamiini-bis-t-bu-tyyllkarbamaatti (kaava I; suojausryhmä BOC)

Metyyllhydratsiini (2,46 ml, 46 mmol) lisätään vai-5 heessa F valmistetun 2,2-difluori-l,4-bis(ftalimido)-heks- 5-yynin (4,85 g, 11,9 mmol) liuokseen metanolissa (50 ml) ja tetrahydrofuraanissa (50 ml) ja liuosta pidetään 80 eC:ssa palautusjäähdyttäjän alla (kiehuu lievästi) typpi suojakaasuna 22 tuntia. Sitten seos jäähdytetään huoneen 10 lämpötilaan ja väkevöidään pyöröhaihduttimella, lopuksi atseotrooppisena seoksena etanolin kanssa.

Jäännös suspendoidaan metanolin (200 ml), veden (10 ml) ja väkevän suolahapon (20 ml) seokseen ja sekoitetaan 30 min. Kiintoaineet poistetaan suodattamalla ja pestään 15 vedellä. Yhdistetyt suodokset haihdutetaan kuiviin.

Jäännös liuotetaan veteen (25 ml) ja tetrahydrofuraaniin (25 ml). Lisätään natriumkarbonaattia (5 g) ja di-tert-butyylidikarbonaattia (10 g, 45,9 mmol) ja seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa yön yli.

20 Seos uutetaan dietyylieetterillä (3 x 50 ml). Yh distetyt uutteet pestään kyllästetyllä NaCl-liuoksella, kuivataan natriumsulfaatilla ja haihdutetaan. Jäännökselle tehdään flash-kromatografia (noin 200 g Si02, 230 - 400 meshiä, pentaani-dietyylieetteriseos 2:1), jolloin saadaan 25 2,2-difluoriheks-5-yyni-l, 4-diamiini-bis-5-butyylikarba- maattia (2,2 g, 53 %, Rf 0,31)

Pentaanista kiteytetyn näytteen sulamispiste on 108 -115 °C.

1H-NMR, CDC13, delta 4,8 (3 H, m); 3,57 (2 H, dt, J - 6,14 30 Hz); 2,3 (3 H, m); 1,47 (18 H, s).

19F-NMR, CDC13/C6F6, -59.

H) 2,2-difluoriheks-5-yyni-l,4-diamiinidihydroklo- ridi (kaava I; dihydrokloridihappoadditiosuola) 35 Vetykloridihapon kyllästetty liuos dietyylieette- rissä (20 ml) lisätään vaiheessa G valmistetun 2,2-difluo- 22 8 5582 riheks-5-yyni-l,4-diamino-bis-t-butyylikarbamaatin (2,2 g, 6,3 mmol) liuokseen dietyylieetterissä (10 ml). Seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 4 vrk. Saostuma otetaan talteen, pestään di-etyylieetterillä ja uudelleenkiteyte-5 tään metanolin ja di-isopropyylieetterin seoksesta, jolloin saadaan 2,2-difluoriheks-5-yyni-l,4-diamiinidihydro-kloridia valkeana, ei-hygroskooppisena kiinteänä aineena (1,09 g, 78 %), joka sulaa hajoten yli 200 °C:n lämpötilassa.

10 1H-NMR, D20:HD0 = delta 4,50, delta 3,50 (2 H, dd, J - 15, 18 Hz); 3,00 (1 H, d, J = 2 Hz); 2,7 (s, H, m). Liuotin peittää H-4-signaalin.

Alkuaineanalyysi yhdisteelle C6H12N2F2C12 Laskettu: C, 32,60; H, 5,47; N, 12,67 % 15 Mitattu: C, 32,41/32,55; H, 5,31/5,36; N, 12,60/12,78 %.

Seuraavissa farmaseuttisia koostumuksia käsittelevissä esimerkeissä 1,4-diamino-2,2-difluoriheks-5-yynistä käytetään termiä "aktiivinen aineosa". Lääkeaineen määrän säätäminen saattaa olla välttämätöntä tai toivottavaa lää-20 keaineen aktiivisuusasteen mukaan, kuten alalla hyvin tiedetään.

Esimerkki 2

Kovia gelatiinikapseleita kuvaava koostumus on seu- raava: 25 a) aktiivista aineosaa 20 mg b) talkkia 5 mg c) laktoosia 90 mg

Formulaatio valmistetaan johtamalla kuivat jauheet hienojakoisen seulan läpi ja sekoittamalla ne hyvin keske-30 nään. Jauhe pakataan sitten koviin gelatiinikapseleihin täyttö painon ollessa 115 mg/kapseli.

Esimerkki 3

Tablettikoostumuksia valaisee seuraava koostumus: a) aktiivista aineosaa 20 mg 35 b) tärkkelystä 43 mg c) laktoosia 45 mg d) magnesiumstearaattia 2 mg li 23 8 5 5 8 2

Rakeet, joita saadaan sekoittamalla laktoosi yhdisteeseen (a) ja osaan tärkkelyksestä ja rakeistamalla tärk-kelystahnan kanssa, kuivataan, seulotaan ja sekoitetaan magnesiumstearaatin kanssa. Seos puristetaan 110 mg:n pai-5 noisiksi tableteiksi.

Esimerkki 4

Injektoitavaa suspensiota valaisee seuraava koostumus, joka on lihaksensisäisesti ruiskutettava 1 ml:n ampulli: 10 paino-% a) aktiivista aineosaa 1,0 b) polyvinyylipyrrolidonia 0,5 c) lesitiiniä 0,25 d) injektioihin tarkoitettua 15 vettä, täytetään 100,0:ksi

Ainekset sekoitetaan, homogenoidaan ja pakataan 1 ml:n ampulleihin, jotka suljetaan ja autoklavoidaan 20 min 121 °C:ssa. Kukin ampulli sisältää 10 mg/ml uutta yhdistettä (a).

20 Esimerkki 5 mg/peräpuikko

Aktiivista aineosaa 50

Kaakaovoita 950 Lääkeaine jauhetaan, johdetaan seulan B.S. nro 100 25 läpi ja hierotaan sulatettuun kaakaovoihin lämpötilassa 45 "C tasaiseksi suspensioksi. Seos sekoitetaan hyvin ja kaadetaan muotteihin, joiden nimelliskapasiteetti on 1 g, jolloin saadaan peräpuikkoja.

Esimerkki 6 30 Kaavan I mukaisten yhdisteiden ODC-inhibointiaktii- visuus voidaan osoittaa in vivo seuraavalla menettelyllä: Sprague-Dawley-kannan urosrotille (paino 200 - 220 g) annetaan ravintoa ja vettä rajoittamattomasti ja pidetään ne säännöllisissä valaistusolosuhteissa (12 tuntia valoisaa, 35 12 tuntia pimeää). Lääkkeet injektoidaan intraperitoneaa- lisesti (liuotettuina 0,9-%:iseen suolaliuokseen) tai an- 24 85582 netaan letkuruokinnalla (veteen liuotettuina). Vertailu-eläiminä käytetään fysiologista suolaliuosta tai vettä saavia rottia. Eläimet tapetaan katkaisemalla niska 5-6 tunnin kuluttua lääkkeen annosta ja mahanpuoleinen etu-5 rauhanen ja kateenkorva irrotetaan nopeasti ja käsitellään välittömästi. Kudokset homogenoidaan kolminkertaisen tilavuuden kanssa 30 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 7,1), joka sisältää 0,1 mmol/1 EDTA:a, 0,25 mol/1 sakkaroosia, 0,1 mmol/1 pyridoksaalifosfaattia ja 5 mmol/1 ditiotreito-10 lia. Ornitiinidekarboksylaasiaktiivisuudet määritetään 1000 g:sta eturauhashomogenaatin supernatanttia ja koko kateenkorvahomogenaatista suurin piirtein Onon et ai. kuvaamalla menetelmällä (Biochem. Biophys. Acta 284 (1972) 285] .

15 Esimerkki 7

Kaavan 1 mukaisen yhdisteen aktiivisuus ornitiini-dekarboksylaasin (0DC:n) inhibiittoreina voidaan osoittaa in vitro seuraavalla menettelyllä:

Ornitiinidekarboksylaasi (ODC) preparoidaan rottien, joi-20 hin on injektoitu tioasetamidia (150 mg/painokilo) 18 tuntia ennen teurastusta, maksoista ja puhdistetaan puhtaus-asteeltaan noin kymmenkertaiseksi käsittelmällä hapolla pH-arvossa 4,6 Onon et ai. menetelmällä [Biochem. Biophys. Acta 284 (1972) 285]. ODC-varastoiiuos sisältää proteiinia 25 (16 mg/ml), natriumfosfaattipuskuria (30 mM, pH 7,1), di- tiotreitolia (5 mmol/1) ja pyridoksaalifosfaattia (0,1 mmol/1). Tämän varastoliuoksen ominaisaktiivisuus on 0,12 nmol C02:a/min mg:aa kohden proteiinia. Tyypillisessä kokeessa sekoitetaan 320 μΐ tätä varastoiiuosta ajanhetkellä 30 0 80 pl:aan inhibiittorin vesiliuosta ja inkuboidaan 37 °C:ssa. Eri ajanhetkillä siirretään 50 μ1:η annoksia 1 ml:aan määritysväliainetta, joka sisältää natriumfosfaat-tia (30 mmol/1, pH 7,1), ditiotreitolia (5 mmol/1), pyridoksaalifosfaattia (0,1 mmol/1), L-ornitiinia (0,081 pmol) 35 ja DL-[l-^C]ornitiinia (0,043 pmol, 58 Ci/mol, Amersham) suljetussa astiassa, johon on sijoitettu suodatinpaperi, I; 25 85582 joka on kostutettu 50 piellä hyamiinihydroksidiliuosta (1 mol/1). Reaktion annetaan edetä 60 min 37 °C:ssa ja pysäytetään sittenlisäämällä 0,5 ml 40-%:ista trikloorietikka-happoa. Annetaan seistä vielä 30 min ja tehdään suodatin-5 paperiin absorboituneen C02:n laskenta tavanomaisessa tui-kelaskentaseoksessa. KT (näennäinen dissosiaatiovakio) ja T50 (puoliintumisaika) äärettömässä inhibiittoripitoisuu-dessa lasketaan Kitzin ja Wilsonin menetelmällä [J. Biol. Chem. 237 (1962) 3245].

10

Claims (4)

1. 26 8 5 582 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti aktiivisen fluoratun di-aminoalkyynijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava 5 C ξ CH I h2n - ch2 - cf2 - ch2 - CH - nh2 (I) tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän happoadditiosuolan 10 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vastaavan alkoholin, jolla on kaava C ξ CH I h2n - ch2 - cf2 - ch2 - CH - OH (II) 15 aminosuojattua johdannaista käsitellään ftalimidillä, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava C h CH l
2. 20 H2N - CH2 - CF2 - CH2 - CH-ftalimido (III) minkä jälkeen ftalimidoryhmä muutetaan sinänsä tunnetulla tavalla primaariseksi aminoryhmäksi, jolloin saadaan kaavan I mukainen yhdiste tai sen farmaseuttisesti hyväksyt-25 tävä suola. I; 27 85582 Förfarande för framställning av ett terapeutiskt aktivt fluorerad diaminoalkynderivat med formeln 5 C ξ CH l h2n - ch2 - cf2 - ch2 - CH - nh2 (I) eller för framställning av dess farmaceutiskt godtagbara 10 syraadditionssalt, kännetecknat därav, att ett aminoskyddat derivat av motsvarande alkohol med formeln C ξ CH I
3. 15 H2N - CH2 - CF2 - CH2 - CH - OH (II) behandlas med ftalimid, varvid en förening med formeln C s CH I
4. 20 H2N - CH2 - CF2 - CH2 - CH-ftalimido (III) erhälls, varefter ftalimidogruppen förvandlas pä ett i och för sig kända sätt tili en primär aminogrupp, varvid fö-reningen med formeln I eller dess farmaceutiskt godtagbara 25 sait erhälls.