FI85194C - Bestaemning av kliniska parametrar med hjaelp av en enzymatisk immunoprocess. - Google Patents

Description

85194

Kliiniseen parametrien määrittäminen entsymaattisella immunoprosessilla

Bestämning av kliniska parametrar med hjälp av en 5 enzymatisk immunoprocess 10

Oheinen keksintö kohdistuu diagnostiseen menetelmään sekä välineeseen kliinisten parametrien määrittämiseksi kvalitatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti entsymaattisella immunoprosessilla käyttäen affiniteet-tikromatografiaa. Keksinnön kohteena on erityisesti patenttivaatimuk-15 sen 1 mukainen menetelmä sekä patenttivaatimuksen 10 mukainen väline.

Keksintö on erityisen käyttökelpoinen biologisten aineiden analysoimiseksi biologisista nesteistä, kuten virtsasta, plasmasta, verestä, tulehdusnesteestä, kudosuutteista, jne.

20

Immunoentsyymaattisia diagnostisia tekniikoita on tunnettu alalla jo kauan. Ne perustuvat vasta-aineen ja sen antigeenin väliseen reaktioon, joko vasta-aineen tai antigeenin ollessa tällöin konjugoituneena sellaiseen entsyymiin, joka tuottaa ilmaisevan reaktion (joka on luon-25 teeltaan kromogeeninen tai muun kaltainen), kun se saatetaan kosketuksiin sopivan substraatin kanssa. Tämän jälkeen tämä entsyymillä merkitty, antigeenin ja vasta-aineen välinen kompleksi aiheuttaa, saatettaessa se kosketuksiin ilmaisevan substraatin kanssa, sellaisen reaktion, jonka avulla mielenkiinnon kohteena oleva antigeeni tai vasta-. . 30 aine voidaan määrittää kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti.

Kaikkien nykyään diagnostiikassa käytettävien entsymaattisten immuno-tekniikoiden haittana ovat tietyt puutteellisuudet, jotka johtuvat olennaisesti näihin tekniikkoihin liittyvistä mutkikkaista ja herkistä 35 toimenpiteistä sekä pitkistä inkubointiajöistä, joiden välissä reak-tiojärjestelmä on pestävä toistuvasti.

Näin ollen tällaisten tekniikoiden käyttö rajoittuu päteviin labo- 2 85194 ratorioihin, kun taas niiden yleisempi käyttö, esimerkiksi näytteen-ottopaikalla tai jopa yksityiskodeissa, on toistaiseksi ollut mahdotonta. Vaikka nämä perinteiset menetelmät eivät aiheutakaan mitään erityisiä vaikeuksia alan asiantuntijalle, niin kuitenkin koetulosten 5 käsittelyyn ja tulkitsemiseen liittyy ongelmia, joiden ratkaiseminen on hyvin vaikeata, ellei mahdotontakin, kouluttamattomalle henkilölle.

Alalla tunnetaan esimerkiksi tekniikka, joka tunnetaan nimensä lyhenteenä "ELISA" (enzyme - linked immunosorbent assay, entsyymiin kytket-10 tyyn immunosorbenttiin perustuva koe, Immunochem., 8, 871-874, 1971). Tämä tekniikka edellyttää pitkien reaktio- ja inkubointiaikojen sekä toistuvien pesutoimenpiteiden lisäksi huolellista toimintaa ja reak-tiojärjestelmän käsittelyä.

15 Toisaalta "EMIT”-tekniikan rajoituksena on se, ettei sillä voida määrittää molekyylejä, joiden molekyylipaino on suuri.

Lopuksi, alalla "FIA"- tekniikkana tunnettu menetelmä edellyttää erityisten määrittävien instrumenttien käyttöä.

20

Edellä mainitut diagnostiset tekniikat kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkiksi julkaisussa "Enzyme Immunoassay", E. Ishikawa, T. Kawai, K. Miyai, Igaku-Shoin-Tokyo-New York (1981).

25 Edellä esitetyn perusteella on ilmeistä, että sellainen entsymaat- tiseen immuunireaktioon perustuva diagnostinen tekniikka olisi hyvin käyttökelpoinen, jossa tekniikassa helppo ja nopea käyttö yhdistyisi mainituille immunoentsymaattisille menetelmille tunnusomaiseen herkkyyteen ja spesifisyyteen.

30 Tässä keksinnössä vältytään alalla aikaisemmin tunnetuissa tekniikoissa esiintyviltä ongelmilta siten, että keksinnössä aikaansaadulla menetelmällä ja laitteella voidaan määrittää jopa kvantitatiivisesti luonteeltaan mielivaltaisia kliinisiä parametrejä ilman, että menetel-35 mässä olisi turvauduttava mihinkään erityiseen toimenpiteeseen.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on pääasiallisesti tunnusomaista se, 3 85194 mitä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa ja keksinnön mukaiselle välineelle on pääasiallisesti tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 10 tunnusmerkkiosassa.

5 Keksinnön mukaisesti biologinen neste, josta halutaan määrittää kliinisiä parametrejä, johdetaan ylöspäin tai alaspäin sopivalla tavalla muotoillun kantajan läpi, joka kantaja käsittää: (a) alussa tai keskivaiheilla sijaitsevan vyöhykkeen, johon koetta mahdollisesti häiritsevät aineet voivat adsorboitua; 10 (b) vyöhykkeen, johon on edeltäkäsin adsorboitu palautuvasti yhtä tai useampaa antigeeniä tai entsyymillä merkittyä vasta-ainetta, jota on saatu muodostumaan yhtä tai useampaa, määritettäville kliinisille parametreille spesifistä epitooppia vastaan (N.R. Jerne, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 24; 1985, 810-816); 15 (c) edeltävän vyöhykkeen vieressä sijaitsevan lisävyöhykkeen, johon on immobilisoitu tunnettuja tekniikoita käyttäen vasta-aineita tai antigeenejä, jotka muodostavat määritettävät kliiniset parametrit, määränä, joka on yhtä suuri tai suurempi kuin entsyymillä merkittyjen vasta-aineiden tai antigeenien määrä. Tässä vyöhykkeessä voidaan myös 20 käyttää vasta-aineita, jotka on muodostettu yhtä tai useampaa, vyöhykkeessä (b) vasta-aineiden tunnistamasta epitoopista (epitoopeista) poikkeavaa epitooppia vastaan (kerrostekoe). Tässä tapauksessa kromo-geeniset substraatit entsyymillä merkittyjä vyöhykkeen (b) vasta-aineita varten tulisi sitoa vyöhykkeeseen (c).

25 Nämä kromogeeniset substraatit voidaan vaihtoehtoisesti adsorboida palautuvasti alempana sijaitsevaan vyöhykkeeseen. Vaihtoehtoisesti, tähän vyöhykkeeseen (c) on voitu immobilisoida vastavasta-aine, joka on spesifinen antigeenin ja vasta-aineen väliselle kompleksille, missä 30 tapauksessa vyöhyke (b) jaetaan puolestaan kahteen osaan niin, että ensimmäiseen osaan on esimerkiksi adsorboitu entsyymillä merkittyä antigeeniä ja toinen osa sisältää vastaavaa vasta-ainetta tai päinvastoin.

(d) Vyöhykkeen, johon on adsorboitu kromogeeninen substraatti vyöhyk-35 keessä (b) läsnäolevaa, antigeeniin tai vasta-aineeseen konjugoitua entsyymiä varten, tai yhtä tai useampaa kantajaa, joka sallii biologisten nesteiden virtaamisen (kerrostekoe).

* 85194

Biologinen neste, joka virtaa kantajan läpi ylös- tai alaspäin painovoiman, kapillaarivoimien, kromatografiän tai diffuusion avulla, saatetaan ensin kosketuksiin vyöhykkeen (b) kanssa, jolloin mahdollisesti läsnäoleva antigeeni tai vasta-aine reagoi täydentävien, entsyy-5 millä merkittyjen vasta-aineiden tai antigeenin kanssa.

Täten muodostunut kompleksi, tai yhdistynyt järjestelmä, nousee ylöspäin tai laskeutuu alaspäin kromatografisesti kantajaa pitkin, jolloin se kulkee vyöhykkeen (c) läpi, jossa vyöhykkeessä (c) liiallinen ent-10 syymillä merkitty vasta-aine tai antigeeni, mikäli läsnä, sitoutuu täydentävään, immobilisoituun antigeeniin tai vasta-aineeseen. Kerros-tekokeen tapauksessa tämä spesifinen kompleksi sitoutuu kerrosteelli-sen kokonaisuuden muodostaen.

15 Sen jälkeen, kun näyteneste on kulkenut välivyöhykkeen läpi, jossa vyöhykkeessä mahdollisesti määritystä häiritsevät aineet saadaan poistetuiksi, esimerkiksi adsorptiolla, kemiallisesti sitomalla, hajottamalla, jne., entsyymillä merkitty, antigeenin ja vasta-aineen välinen kompleksi saavuttaa kromogeenisen substraatin, jolloin muodostuvaa 20 väriä (positiivinen koe) voidaan käyttää sekä kvantitatiiviseen että kvalitatiiviseen määritykseen, esimerkiksi vertaamalla väriasteikkoon. Toisaalta, mikäli biologisessa nesteessä ei ole läsnä kliinistä parametriä (negatiivinen koe), niin yhdessä tapauksessa entsyymillä merkitty antigeeni tai vasta-aine kiinnittyy täydellisesti vyöhykkeeseen 25 (c) immunokemiallisen reaktion seurauksena, jolloin se ei voi saavut taa kromogeenista substraattia; ja toisessa tapauksessa (kerrostekoe) entsyymillä merkitty vasta-aine ei kiinnity vyöhykkeeseen (c), ja virtaava biologinen neste huuhtelee värin, joka muodostuu vasta-aineeseen konjugoituneen entsyymin edetessä, pois vyöhykkeestä (negatiivi-30 nen koe).

Toisin sanoen, järjestelmä perustuu biologisessa nesteessä läsnäolevan antigeenin tai vasta-aineen ja immobilisoidun antigeenin tai vasta-aineen väliseen kilpailuun, joka immobilisoitu antigeeni tai vasta-35 aine toimii negatiivisen vasteen tapauksessa joko entsyymillä merkityn vasta-aineen tai antigeenin salpaajana estäen sen kulkeutumisen kromogeenista substraattia sisältävään vyöhykkeeseen; tai toisessa tapauk- 5 85194 sessa epäreaktiivisena materiaalina, joka ei kykene sitomaan entsyymillä merkittyjä vasta-aineita.

Keksinnön mukainen kantajaväline voi olla muodoltaan liuska, nauha, 5 kalvo, putki, malli, pullo, imupaperikiekko, jne. Eri komponentit voidaan adsorboida tai immobilisoida joko suoraan välineen muodostavaan materiaaliin, tai välineen sisällä olevaan sopivaan kiinteään kantajaan, tai ne voidaan kiinnittää sen pinnalle geelinä, jauheena, rakeina, mikrohelminä, helminä, jne.

10 Välineen ja kiinteiden kantajien tai tukiaineiden valmistusmateriaalit eri reaktiovyöhykkeissä voivat olla samoja tai erilaisia. Esimerkkejä sopivista materiaaleista ja kantajista ovat lasi, silikan johdannaiset, paperi tai selluloosan johdannaiset, metallit, polymee-15 rit, kuten polyvinyylikloridi, polystyreeni, polybutadieeni, nylon, polyakryyliamidit, metakrylaatit, jne., polysakkaridit tai polyolit, tärkkelys, ihmisen tai eläimen stabiloidut punaiset verisolut, epäorgaaniset aineet kuten BaS04, Ti02, kaoliini, piimää, jne. Tämä väline on mielellään läpikuultamatonta materiaalia lukuunottamatta määritys-20 vyöhykettä, joka on läpinäkyvä.

Sidos, jolla antigeeni tai vasta-aine immobilisoidean mainittuihin materiaaleihin, voidaan saada aikaan fysikaalisin tai kemiallisin menetelmin (esteri- tai amidisidoksena, jne.), kuten US-patenttijul-25 kaisussa 4 003 988 sekä seuraavissa julkaisuissa esitetään: B.K. Van Weemen ja A.H.W. Schuurs, Febs Letters - Voi. 15, No. 3 - June, 1971, sivut 232-5; P. Leinikki ja Suvi Passila, J. Clin. Path., 1976, 29, sivut 1116-20; B.R. Brodeur, F.E. Ashton et B.B. Diena, The Journal of Medical Micorbiology - Voi. 15, No. 1, 1981, sivut 1-9; A. Voller 1., 30 D.E. Bidwell 2, A. Bartlett 2, D.G. Fleck 3, M. Perkins 3 ja B. Olade-hin 3, J. Clin. Path., 1976, 29, sivut 150-3: Howard H. Weetall, Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides - Vol. 1.

Immobilisoimattomien komponenttien sitominen adsorboimalla tapahtuu 35 toisaalta tunnettujen tekniikoiden mukaisesti, ja se on hyvin tunnettua affiniteettikromatografian alalla.

6 85194

Sekä immobilisoidut että entsyymillä merkityt, keksinnössä käyttökelpoiset vasta-aineet voivat olla polyklonaalisia tai monoklonaa-lisia, kokonaisia vasta-aineita tai niiden kappaleita, joista mainittakoon esimerkiksi Fab' ja F(ab')2. Ne voivat mahdollisesti olla seok-5 sena keskenään ja ne voivat olla spesifisiä antigeenin yhdelle tai useammalle aktiiviselle kohdalle.

Antigeenien tai vasta-aineiden merkitseminen entsyymillä voidaan toteuttaa tunnetuilla tekniikoilla, esimerkiksi niillä, jotka esitetään 10 edellä mainitussa julkaisussa "Enzyme Immunoassay", käyttäen mitä tahansa sellaista entsyymiä, joka tuottaa värireaktion substraatin kanssa, ja niistä voidaan mainita esimerkkeinä peroksidaasi, alkalinen fosfataasi, β-galaktosidaasi ja muut vastaavat. Tällaiset entsyymit voidaan konjugoida esimerkiksi glutaraldehydin, dimaleimidin sekä 15 niiden estereiden kanssa noudattaen tekniikoita, jotka kuvataan edellä mainitun julkaisun "Enzyme Immunoassay" sivuilla 54-113.

Sekä vasta-aineet että antigeenit voidaan kiinnittää kantajaan asettamatta rajoituksia niiden määrille, jotka voivat vaihdella joka ta-20 pauksessa alueella 1-10 mg/cm2, riippuen kyseessä olevasta analyyy-sistä, edellyttäen ainoastaan, että immobilisoitua komponenttia ja entsyymillä merkittyä komponenttia tulisi olla läsnä vähintään stökio-metrisesti yhtäsuuret määrät. Kuten edellä mainittiin, kvantitatiivinen määritys on mahdollinen siten, että kehittyneen värin voimakkuus 25 määritetään joko mielivaltaisella tavalla tai käyttäen sopivaa laitetta heijastumisen mittaamiseksi.

Lopuksi, alussa tai keskivaiheilla sijaitseva erotusvyöhyke voi koostua yksinomaan sellaisesta materiaalista, joka kykenee toimimaan kro-30 matografisena kantajana, ja jonka pinnalle voidaan adsorboida etukä teen aineita, jotka poistavat tehokkaasti tunnistavaa reaktiota häiritseviä yhdisteitä. Näin ollen keksinnössä voidaan käyttää: ionin-vaihtohartseja raskasmetallien kelatoimiseksi; immobilisoituja entsyymejä urean tai muiden metaboliittien hajottamiseksi; antiproteiinin 35 vasta-aineita albumiinin poistamiseksi; vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä määritettävän antigeenin kaltaisille molekyyleille, jne.

7 85194

Edellä kuvatun menetelmän ja välineen avulla keksinnössä saadaan aikaan keino monien erilaisten kliinisten parametrien määrittämiseksi yksinkertaisesti, nopeasti ja täsmällisesti. Näistä parametreistä voidaan mainita esimerkiksi peptidihormonit, kuten HCG, LH, steroidi -5 hormonit kuten progesteroni, estroni-glukuronidi, pregnanedioli-gluku-ronidi, sekä muut klinisesti hyvin mielenkiintoiset parametrit, kuten streptolysiini, immuuniglobuliinit, virukset, kuten herpes-virukset, HTLV-3-virus, jne. Tämän lisäksi samaan kantajaan voidaan kiinnittää useita entsyymillä merkittyjä antigeenejä ja/tai vasta-aineita yhdessä 10 vastaavien immobilisoitujen vasta-aineiden ja/tai antigeenien kanssa, jolloin lukuisia kliinisiä parametrejä voidaan määrittää samanaikaisesti, kun eri vyöhykkeissä on läsnä vastaava määrä kromogeenisia substraatteja, jotka tuottavat mielellään eri värejä reagoidessaan entsyymillä merkittyjen eri kompleksien kanssa.

15

Liitteenä olevissa piirustuksissa, jotka esittävät kaavamaisesti keksinnön eräitä edullisia suoritusmuotoja keksintöä millään tavalla rajoittavina esimerkkeinä, symboli tarkoittaa antigeeniä; symboli 0””0 esittää immobilisoitua antigeeniä; symboli (y*'"' ^ 20 esittää entsyymiin konjugoitua antigeeniä, kun taas symbolit ) (' )—O')— esittävät samalla tavalla vastaa vasti vasta-ainetta, immobilisoitua vasta-ainetta sekä entsyymiin konjugoitua vasta-ainetta. Lopuksi, symboli l·· tarkoittaa kromogeenista substraattia, (^J·—tarkoittaa immobilisoitua 25 vastavasta-ainetta, ja nuoli esittää järjestelmään johdetun nesteen kulkusuuntaa.

Mainituissa piirustuksissa: 30 Kuvio 1 esittää kaavamaisesti järjestelmää, joka mahdollistaa keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti antigeenin määrittämisen, ja siihen kuuluva kantaja (liuska, putki tai muu väline) käsittää ensimmäisen vyöhykkeen, joka sisältää määritettävälle antigeenille spesifisen, entsyymillä merkityn vasta-aineen, ensimmäisen vyöhykkeen vieressä 35 sijaitsevan toisen vyöhykkeen, joka sisältää immobllisoidun antigeenin, ja jota seuraa erotusvyöhyke ja lopuksi vyöhyke, jonka pinnalle on kiinnitetty kromogeeninen substraatti. Kun kantajana käytetään 8 85194 putkea, niin sen päät voidaan sulkea huokoisilla septumeilla.

Kuvio 2 esittää sitä tapausta, jossa määritetään vasta-aine. Tässä suoritusmuodossa, toisin kuin edellisessä tapauksessa, biologinen 5 neste saatetaan valumaan alaspäin nuolen osoittamaan suuntaan, jolloin se joutuu peräjälkeen kosketuksiin ensin entsyymillä merkityn antigeenin kanssa, sitten immobilisoidun vasta-aineen kanssa ja viimeksi kromogeenisen substraatin kanssa, jota substraattia voidaan lisätä järjestelmän pohjalta ulostulevaan liuokseen sen sijaan, että se olisi 10 adsorboitu kiinteään kantajaan.

Kuvio 3 esittää kuvion 1 mukaisessa tapauksessa eri liikkumisvaiheita niissä olosuhteissa, kun koe on positiivinen (+) tai negatiivinen (-) (eli kun kyseistä antigeeniä on läsnä tai se puuttuu).

15

Kuvio 4 esittää toista, kuvion 1 kaltaista suoritusmuotoa, josta se eroaa siinä suhteessa, että immobilisoitu antigeeni on agglutinoitu etukäteen entsyymillä merkityn vasta-aineen kanssa; näin ollen biologisessa nesteessä mahdollisesti läsnäoleva antigeeni kilpailee immo-20 bilisoidun antigeenin kanssa merkityn vasta-aineen vapauttamiseksi, jolloin tämä viimeksi mainittu voi kulkeutua kromogeenista substraattia kohden.

Kuvio 5 esittää lisämuunnosta antigeenien määrittämiseen sopivasta 25 menetelmästä. Tässä tapauksessa kantajan käsittämä ensimmäinen vyöhyke sisältää entsyymillä merkityn antigeenin, kantajan käsittämään toiseen vyöhykkeeseen on adsorboitu vastaavaa vasta-ainetta, ja kolmas vyöhyke sisältää immobilisoitua vastavasta-ainetta (esimerkiksi Sepharose-proteiini-A tai anti-IgC, joka on sidottu yhdisteeseen PVC), joita 30 seuraa jälleen kromogeeninen substraatti; Tässäkin tapauksessa ainoastaan kilpailu biologisessa nesteessä läsnäolevan vapaan antigeenin kanssa saa aikaan sen, että entsyymillä merkitty antigeeni saavuttaa substraatin, kun taas vasta-aineen ja antigeenin välinen kompleksi pysyy kiinnittynnenä vasta-vasta-aineeseen.

Kuviot 6a ja 6b esittävät erityyppisen välineen poikkileikkausta ja tasokuvaa ylhäältäpäin katsoen. Väline käsittää kantavan liuskan 2, 35 9 85194 jossa on reikiä 1, joiden läpi neste voi kulkea, sekä läpäisemättömän läpinäkyvän päällyksen 3, joka tekee mahdolliseksi kromogenia sisältävän kerroksen 4 visuaalisen tarkastelun. Tässä tapauksessa väri voidaan arvioida joko näköhavainnon perusteella, kun määritys on kva-5 litatiivinen, tai heijastusmittarilla, kun määritys on kvalitatiivinen.

Esitettyjen suoritusmuotojen tarkoitus on yksinomaan havainnollistaa keksinnön periaatteita sitä millään tavalla rajoittamatta. Näin ollen, 10 esimerkiksi, erillisten vyöhykkeiden koko voi vaihdella kulloinkin kyseessä olevassa tapauksessa, ja nämä koot ovat yleensä muutamasta millimetristä muutamaan senttimetriin. Ohessa ei myöskään kuvata tiettyjä yksityiskohtia, jotka tekevät keksinnön mukaisen kantajan käyttökelpoisemmaksi. Näistä yksityiskohdista voidaan mainita kantajan kan-15 nattimet, välineet biologisen nesteen ottamiseksi (imemällä), merkinnät, jotka osoittavat kantajan sen puolen tai pään, johon biologista nestettä laitetaan, väriasteikot, jotka on sijoitettu kromogeenista substraattia sisältävien vyöhykkeiden yhdelle puolelle, jne.

20 Keksinnön mukaiset välineet voivat olla myös sellaisia symmetrisiä välineitä, joiden kumpaankin päähän on sisällytetty entsyymillä merkittyä komponenttia, ja jossa näiden päiden jälkeen seuraavat edellä kuvatut peräkkäiset vyöhykkeet, millä estetään se, ettei nestettä laitettaisi välineeseen epäasianmukaisesti. Tämän lisäksi kodeissa 25 käyttöä ajatellen väline voidaan tehdä yksinkertaisesti pakatuiksi kompakseiksi yksiköiksi, jotka ovat tarvittaessa steriilejä, stabiileja, olosuhteisiin mukautettuja, jne.

Edellä esitetyn perusteella on selvää, että keksinnön mukainen mene-30 telmä ja väline ovat hyvin monipuolisia ja käytännöllisiä, ja että niitä voidaan käyttää monissa erilaisissa kliinisissä analyyseissa ilman erityistä laitteistoa tai tarpeellisia toimenpiteitä. Tämän lisäksi, ja ennen kaikkea, niiden avulla analyysitulokset saadaan lyhyessä, tavallisesti minuutteina laskettavassa ajassa.

Keksintöä selitetään edelleen käyttäen apuna seuraavaa esimerkkiä, joka ei pyri rajoittamaan millään tavalla keksinnön henkeä tai tavoitteita .

35 10 85 1 94

ESIMERKKI

a. Yhdisteeseen PVC immobilisoidun HCG:n valmistaminen 5 100 grammaa yhdistettä PVC, jonka hiukkaskoko on 200 μ, käsitellään 37 °C.n lämpötilassa yli yön HCG-liuoksessa, jonka pitoisuus on 50 yksikköä/ml, ja joka on valmistettu fosfaattipuskuriin, pH 7,2. Pinnoitettu polymeeri pestään viidesti samalla puskurilla, ja sitä kuivataan 37 eC:n lämpötilassa 10 tuntia.

10 b. Peroksidaasilla merkityn anti-HCG:n valmistus

Kaniinista saatu anti-HCG (10 ml) saostetaan kolmeen kertaan 18-pro-senttisella vedettömällä natriumsulfaatilla, ja tuote otetaan talteen 15 10 millilitrasta tislattua vettä kunkin saostuskerran jälkeen. Tämän jälkeen tuotetta dialysoidaan yksi yö +4 eC:n lämpötilassa pitoisuudeltaan 10 mmol olevaa fosfaattipuskuria, pH 7,2, vastaan.

Dialysoitua liuosta käsitellään 100 milligrammalla peroksidaasia RZ 20 3.00 ja 25 millilitralla 25-prosenttista glutaraldehydiä 48 tunnin ajan +4 °C:n lämpötilassa. Liuos eluoidaan Sephadex G150-geelin läpi, joka geeli on tasapainotettu natriumkloridilla, 50 mmol. Eluoitua . . anti-HCG:n ja peroksidaasin välistä kompleksia voidaan säilyttää -20 °C:n lämpötilassa.

25 c. Merkityn, kantajaan adsorboidun vasta-aineen valmistus 50 grammaa lasia käsitellään 5 millilitralla anti-HCG:n ja peroksidaasin välistä kompleksia, joka on laimennettu suhteessa 1:500 fosfaatti-30 puskuriin, 10 mmol, pH 7,2, ja tuotetta kuivataan yön yli ____ 37 °C:n lämpötilassa.

d. Kantajaan adsorboidun kromopeenin valmistus ' : 35 50 grammaa lasia käsitellään 50 milligrammalla tetrametyylibentsi- diiniä, joka on liuotettu 5 millilitraan DMSO-vettä.

i Π 85194 e. Kolonnin täyttäminen

Lasikolonni (sisähalkaisija 3,5 mm, korkeus 15 cm) täytetään pohjasta huippuun seuraavilla materiaaleilla: adsorboitu anti-HCG-peroksidaasi, 5 immobilisoitu HCG, adsorboitu kromogeeni, joita valmistettiin edellä.

Lasikolonnin molemmat päät suljetaan pumpulilla tai sopivilla huokosilla tulpilla.

10 f. Analyysin toteuttaminen

Edellä kuvattu kolonni saatetaan kosketuksiin analysoitavan virtsan kanssa, joka virtsa nousee kolonnissa ylöspäin kapillaarivoimien seurauksena. Mikäli virtsassa on läsnä yhdistettä HCG, se sitoutuu kolon-15 nin ensimmäisen osan sisältämään anti-HCG-peroksidaasiin; jatkaessaan nousemista kolonnissa se ei tuota enää agglutinaatioreaktiota kolonnin toisen osan sisältämän immobilisoidun HCG:n kanssa, vaan se jatkaa kulkuaan ylöspäin kolonnin viimeiseen osaan, jonka sisältämä kromo-geeninen substraatti muodostaa sinistä väriainetta reagoidessaan ent-20 syymin kanssa. Kerrostekokeen tapauksessa kompleksi sidotaan spesifisesti vyöhykkeeseen (c) immunokemiallisella reaktiolla, ja sininen väri saadaan kehittymään entsyymin ja kromogeenisen substraatin välisen reaktion seurauksena, ja tämä sininen väri määritetään vyöhykkeessä (c). Toisaalta, mikäli virtsassa ei ole läsnä yhdistettä HCG, niin 25 kolonnin ensimmäisen osan anti-HCG-peroksidaasi liikkuu vapaasti ylöspäin ja saavuttaa kolonnissa immobilisoitua HCG:tä sisältävän vyöhykkeen, joka immobilisoitu HCG sitoo anti-HCG-peroksidaasin immunoke-miallisen reaktion seurauksena, jolloin se ei voi saavutaa kromogee-nista substraattia. Tällöin ei kehity väriä. Kerrostekokeen tapaukses-30 sa anti-HCG-peroksidaasi ei sitoudu vyöhykkeeseen (c), vaan huuhtoutuu siitä, jolloin väriä ei myöskään kehity.

Edellä kuvattua prosessia voidaan myös soveltaa alaspäin valuvaan nesteeseen perustuviin järjestelmiin.

35

Claims (18)

1. Menetelmä kliinisten parametrien kuten esim. peptidihormonien, steroidihormonien, streptolysiinin, immuuniglobuliinien ja virusten 5 määrittämiseksi biologisista ylöspäin tai alaspäin kulkevista nesteistä entsymaattisella immuuniprosessilla, tunnettu siitä, että menetelmässä biologinen neste saatetaan peräkkäin kosketuksiin: (a) kiinteään kantajaan palautuvasti adsorboituneiden, entsyymillä 10 merkittyjen, määritettävälle aineelle spesifisten vasta-aineiden tai antigeenien kanssa; (b) eri tai samaan kiinteään kantajaan immobilisoitujen vasta-aineiden, antigeenien, vastavasta-aineiden tai antigeenin ja vasta-aineen 15 välisten kompleksien kanssa, joista immobilisoitu määrä on vähintään stökiometrisesti yhtäsuuri entsyymillä merkittyjen määritettävää ainetta vastaavien vasta-aineiden tai antigeenien kanssa; ja (c) yhden tai useamman kromogeenisen substraatin kanssa, joka subs-20 traatti kykenee tuottamaan ilmaisevan reaktion vasta-aineisiin tai antigeeneihin konjugoitujen entsyymien kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ennenkuin biologinen neste saatetaan kosketuksiin kromogeenisen 25 substraatin kanssa se johdetaan sellaisen kromatografisen materiaalin läpi, johon materiaaliin on voitu adsorboida aineita, jotka kykenevät poistamaan kyseistä analyysiä häiritseviä yhdisteitä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu 30 siitä, että käytettäessä sitä antigeenin määrittämiseen biologinen neste saatetaan peräkkäin kosketuksiin: (a) kiinteään kantajaan palautuvasti adsorboituneen täydentävän, entsyymillä merkityn vasta-aineen kanssa; ; 35 (b) saman antigeenin kanssa, jota antigeeniä on immobilisoitu kiinteään kantajaan määränä, joka on vähintään stökiometrisesti yhtäsuuri 13 85194 kuin entsyymillä merkityn vasta-aineen määrä; (c) kromogeenisen substraatin kanssa.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytettäessä sitä vasta-aineen määrittämiseen biologinen neste saatetaan peräkkäin kosketuksiin: (a) palautuvasti kiinteään kantajaan adsorboituneen, täydentävän, 10 entsyymillä merkityn antigeenin kanssa; (b) saman vasta-aineen kanssa, jota vasta-ainetta on immobilisoitu kiinteään kantajaan määränä, joka on vähintään stökiometrisesti yhtä suuri kuin entsyymillä merkityn antigeenin määrä; sekä 15 (c) kromogeenisen substraatin kanssa.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytettäessä sitä antigeenin määrittämiseen biologinen 20 neste saatetaan peräkkäin kosketuksiin: (a) palautuvasti kiinteään kantajaan adsorboituneen saman, entsyymillä merkityn antigeenin kanssa; 25 (b) palautuvasti kiinteään kantajaan adsorboituneen täydentävän vasta- aineen kanssa; (c) antigeenin ja vasta-aineen väliselle kompleksille spesifisen, kiinteään kantajaan immobilisoidun vastavasta-aineen kanssa; sekä 30 (d) kromogeenisen substraatin kanssa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä useiden kliinisten parametrien määrittämiseksi samanaikaisesti, tunnettu siitä, että 35 samaan kiinteään kantajaan on kiinnitetty vastaavat, entsyymillä merkityt vasta-aineet tai antigeenit sekä vastaavat immobilisoidut vasta-aineet tai antigeenit, ja että kullekin käytetylle erilliselle entsyy- i4 85 1 94 mille spesifiset kromogeeniset substraatit on kiinnitetty erillisiin kantaj iin.

7. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menete-5 lmä, tunne ttu siitä, että mainitut kantajat, jotka voivat olla samaa tai eri materiaalia eri komponenttien tapauksessa, on valmistettu lasista tai silikan johdannaisista, paperista tai selluloosan johdannaisissta, polymeereistä, polysakkarideista tai polyoleista, kaoliinista, titaanidioksidista Ti02, bariumsulfatista BaS04, piimaas-10 ta, metalleista tai stabiloiduista punaisista verisoluista.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 5-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tätä menetelmää käytetään peptidihormo-nien (HCG, LH), steroidihormonien, proteiinien, streptolysiinin ja 15 virusten määrittämiseen.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1,2,6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sitä käytetään immunoglobuliinien sekä muiden, diagnostisesti mielenkiintoisten vasta-aineiden määrittämiseen. 20

10. Väline kliinisten parametrien kuten esim. peptidihormonien, steroidihormonien, streptolysiinin, immunoglobuliinien ja virusten määrittämiseksi, jota voidaan kuljettaa mukana, ja joka perustuu ylöspäin tai alaspäin kulkeviin biologisiin nesteisiin, ja joka on putken, 25 mallin, liuskan, imupaperikiekon, pullon tai kalvon muodossa, tunnettu siitä, että mainittu väline koostuu: (a) alussa tai keskivaiheilla sijaitsevasta erotusvyöhykkeestä, johon on voitu adsorboida sellaisia aineita, jotka kykenevät poistamaan 30 mahdollisesti läsnäolevia, kyseistä analyysiä todennäköisesti häiritseviä yhdisteitä; (b) vyöhykkeestä, johon on adsorboitu etukäteen yksi tai useampi entsyymillä merkitty, määritettäville kliinisille parametreille spesi- 35 finen vasta-aine tai antigeeni; mahdollisesti määritettäessä antigeeniä kantajaan kiinnitetty vasta-aine on agglutinoitu etukäteen entsyymillä merkityn antigeenin kanssa, i 15 85 1 94 (c) mikäli vaiheessa b) mainittuun vyöhykkeeseen ei ole agglutinoitu kantajaan kiinnitettyä vasta-ainetta, edelliseen vyöhykkeeseen rajoittuvasta muusta vyöhykkeestä, johon määritettävinä kliinisinä parametreinä toimivia vasta-aineita, antigeenejä, vastavasta-aineita tai 5 vasta-aineen ja antigeenin välisiä komplekseja on immobilisoitu tunnettuja tekniikoita käyttäen määrinä, jotka ovat vähintään yhtä suuria kuin entsyymillä merkittyjen vasta-aineiden tai antigeenien määrät; ja (d) vyöhykkeestä, johon kromogeeniset substraatit on adsorboitu anti-10 geeniin tai vasta-aineeseen konjugoituja entsyymejä varten.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen väline, joka käsittää yhtä tai useampaa sellaista materiaalia, joka valitaan lasin, metallien, synteettisten tai luonnollisten polymeerimateriaalien ja paperin joukos- 15 ta, ja johon materiaaliin voidaan kiinnittää geelinä, jauheena, rakei-na, mikropalloina tai kalvoina sopivia kantajamateriaaleja, jotka ovat samaa tai eri materiaalia kussakin erillisessä vyöhykkeessä, ja jotka kantajamateriaalit valitaan tärkkelyksen, piimään, kaoliinin, barium-sulfaatin BaS0A ja titaanidioksidin Ti02 joukosta. 20

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen väline, tunnettu siitä, että alussa tai keskivaiheilla sijaitseva vyöhyke (a) käsittää häiritseviä yhdisteitä poistavina aineina ioninvaihtohartseja, entsyymejä kuten ureaasia tai proteaasia, hapettavia tai pelkistäviä ainei- 25 ta, vasta-aineita tai antigeenejä.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukainen väline, tunnet- t u siitä, että käytettäessä sitä antigeenin määrittämiseen se käsittää: 30 (a) ensimmäisen vyöhykkeen, johon on adsorboitunut palautuvasti täydentävää, entsyymillä merkittyä vasta-ainetta; (b) ensimmäisen vyöhykkeen vieressä sijaitsevan vyöhykkeen, johon on 35 immobilisoitu samaa antigeeniä määränä, joka on vähintään yhtäsuuri kuin entsyymillä merkityn vasta-aineen määrä; i6 85 1 94 (c) seuraavan vyöhykkeen, jossa tapahtuu kromatografinen erottaminen ja valinnaisesti häiritsevien yhdisteiden poistaminen; (d) viimeisenä sijaitsevan loppuvyöhykkeen, joka sisältää kromogeeni-5 sen substraatin entsyymiä varten.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että käytettäessä sitä vasta-aineiden määrittämiseen se käsittää: 10 (a) ensimmäisen vyöhykkeen, johon on adsorboitunut palautuvasti täydentävää, entsyymillä merkittyä antigeeniä; (b) ensimmäisen vyöhykkeen vieressä sijaitsevan vyöhykkeen, johon on 15 immobilisoitu samaa vasta-ainetta määränä, joka on vähintään yhtä suuri kuin entsyymillä merkityn antigeenin määrä; (c) erotusvyöhykkeen; sekä 20 (d) kromogeenisesti ilmaisevan vyöhykkeen.

15. Patenttivaatimusten 10-12 mukainen väline, tunnettu siitä, että antigeeniä määritettäessä väline käsittää ensimmäisen vyöhykkeen, joka sisältää entsyymillä merkittyä antigeeniä, toisen vyöhyk- 25 keen, johon on adsorboitu palautuvasti vasta-ainetta, vyöhykkeen, joka sisältää immobilisoitua vastavasta-ainetta, sekä lopuksi erottavan ja kromogeenisesti ilmaisevan vyöhykkeen.

16. Jonkin patenttivaatimuksen 10-15 mukainen väline, tunnet-30 t u siitä, että useita kliinisiä parametrejä samanaikaisesti määritettäessä kumpikin erillisistä vyöhykkeistä (a) ja (b), vastaavasti, sisältää vastaavan lukumäärän entsyymillä merkittyjä vasta-aineita tai antigeenejä sekä immobilisoituja antigeenejä tai vasta-aineita, ja että väline käsittää useita kromogeenisesti ilmaisevia vyöhykkeitä. 35

17. Jonkin patenttivaatimuksen 10-16 mukainen väline, tunnet - t u siitä, että sillä voidaan määrittää HCG- tai LH-hormoni tai muita 17 85 1 94 peptidihormoneita, progesteroni, estroni-glukuronidi, pregnanedioli-glukuronidi tai muita steroidihormoneja, streptolysiini, immunoglobu-liineja ja/tai viruksia.

18. Jonkin patenttivaatimuksen 10-17 mukainen väline, tunnet- t u siitä, että koko väline on muuten läpikuultamatonta materiaalia (materiaaleja) lukuunottamatta määritysvyöhykettä, joka on valmistettu läpinäkyvästä materiaalista (materiaaleista). ie 85194