FI84431C - Foerfarande foer framstaellning av ett fibronektinbindande cellyteprotein. - Google Patents

Description

1 84431

Menetelmä fibronektiiniä sitovan solun pintaproteiinin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ett fibronektinbindande cellyteprotein

Esillä oleva keksintö kohdistuu solun pintaproteiiniin, jolla on kyky sitoa fibronektiiniä, fibrinogeeniä, kollageeniä ja/ tai la-miniinia, menetelmään sen valmistamiseksi, sekä myös tällaisen solun pintaproteiinin käyttöön.

Esillä olevan keksinnön päämääränä on saada aikaan mahdollisuus fibronektiinin, fibrinogeenin, kollageenin ja/tai laminiinin suojaamiseksi traumaattisessa haavakudoksessa patogeenisten bakteerikantojen kiinnittymisen estämiseksi fibronektiiniin, fibrino-geeniin, kollageeniin ja/tai laminiiniin.

Stafylokokkeja ja streptokokkeja pidetään usein ryhmänä gram-posi-tiivisia bakteereja, jotka kehittävät märkäistä ainetta (märkää) tulehduksiin, niin kutsuttuja patogeenisiä kokkeja. Tämä ryhmä ei sisällä ainoastaan klassisia Staphylococcus aureusta ja Streptococcus pyogenesiä (ryhmän A streptokokki), vaan myös muita stafylokokkeja ja streptokokkeja, kuten Staphylococcus epidermis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hyicus, ryhmien B, C, G ja H streptokokit, viridans-streptokokit, jne. Jopa gram-negatiiviset bakteerit, kuten Escherichia coli saattavat aiheuttaa tällaisia infektioita.

Nämä patogeeniset bakteerikannat aiheuttavat erilaisia tulehduksia ihmisessä ja eläimissä aina pienistä itsestään parantuvista ihotulehduksista vakaviin sepsiksiin (verenmyrkytys). Infektoi-tuessaan näillä kannoilla eläimet eivät ainoastaan kärsi, vaan aiheutuu myös suuria taloudellisia vahinkoja eläinten omistajille tuotannon keskeytyessä. Lypsylehmien utaretulehdus on tällainen taloudellista vahinkoa aiheuttava infektio.

2 84431

Ihmisessä tällaiset bakteerikannat aiheuttavat mm. sydänläpän tulehduksia, mutta myös muita tulehduksia kuten yleisesti tunnettua "sairaalatautia", so., useimmiten avoimen haavan tulehdus, joka on vaikeasti parantuva, voi tuottaa suuria määriä märkää ja voi aiheuttaa uudelleenleikkaamisen. Erityisesti sydänläpän tulehdukset uhkaavat riskiryhmiä, jotka jo ovat sairaalahoidossa.

Käytetty termi haava tarkoittaa, että tavallisesti peittävä epi-teelisolukerros ja muut pintakerrokset ovat vahingoittuneet mekaanisen, kemiallisen tai muun vaikutuksen kautta. Termi haava voidaan tässä jakaa kahteen pääryhmään, nimittäin: pintahaavoihin ja syviin haavoihin. Termillä pintahaava tarkoitetaan vammaa kehon pinnalla tai pinnalla, joka on suorassa yhteydessä kehon aukkoihin, so., ruoansulatuskanava, suuaukko, virtsaputki, maito-tiehyet, jne. Termillä syvä haava tarkoitetaan vammaa kehon sisällä, jonka on aiheuttanut väkivaltainen ulkoinen hyökkäys tai kirurginen viilto eri kudoksiin.

Kun haava syntyy, ilmaantuu haavakudokseen fibronektiiniä, fibri-nogeeniä, kollageeniä ja/tai laminiinia. Nämä proteiinit muodostavat yhdessä niin kutsuttujen proteoglukaanien kanssa verkkorakenteen eri tukikudoksiin, ja se on rakenne, johon sidekudos (fib-roblastit) ja epiteelisolut kasvavat luonnollisessa haavan parantumisessa .

Haavan luonnollisen parantumisen voivat kuitenkin estää siihen kerääntyvät patogeeniset bakteerit, ensisijaisesti pyogeeniset kokit ja toiseksi muut patogeeniset kannat, kuten E. coli ja muut gram-negatiiviset sauvanmuotoiset bakteerit.

Esimerkkejä tällaisesta bakteerien kerääntymisestä vaurioituneeseen kudokseen ovat: i) kerääntyminen haavoihin ihossa ja sidekudoksessa, jotka haavat on aiheuttanut mekaaninen väkivalta, kemiallinen vahinko ja/-tai terminen vahinko; ii) kerääntyminen haavoihin limakalvoissa, kuten suuontelossa, maitorauhasissa, virtsaputkessa tai vaginassa; 3 84431 iii) kerääntyminen sidekudosproteiineihin, jotka on saanut aikaan pieni kudosvaurio (mikroleesio) epiteelin ja endoteelin (utaretulehdus, sydänläppätulehdus) yhteydessä.

Nyt on yllättäen osoittautunut mahdolliseksi eristää proteiineja bakteerisolun pinnoista, jotka proteiinit kiinnittyvät fibronek-tiiniin, fibrinogeeniin, kollageeniin ja/tai laminiiniin, jotka solun pintaproteiinit saadaan yllä mainituista bakteerikannoista.

Tällaisia solun pintaproteiineja voidaan siten käyttää haavojen hoitoon, esimerkiksi proteiinireseptoreiden blokeeraamiseen tai immunisoimiseen (rokottamiseen). Viimeksi mainitussa tapauksessa keho kehittää spesifisiä vasta-aineita, jotka voivat suojata tällaista solun pintaproteiinia sisältävien bakteerikantojen tunkeutumista vastaan. Tällöin vasta-aineet estävät bakteerikantojen kiinnittymisen vahingoittuneeseen kudokseen.

Esillä olevan keksinnön tunnusmerkit ilmenevät mukaanliitetyistä patenttivaatimuksista.

Esillä olevan keksinnön avulla on siten saatu aikaan, että voidaan tehokkaasti estää patogeenisten bakteerikantojen kerääntyminen traumaattiseen haavakudokseen.

Käytettäessä esillä olevia solun pintaproteiineja immunisointi-tarkoitukseen (rokotus) nisäkkäille ihminen mukaanluettuna, dis-pergoidaan proteiini steriiliin, isotoniseen suolaliuokseen, valinnaisesti samalla lisäten farmaseuttisesti hyväksyttävää dis-pergointiainetta.

Sopiva annos immuniteetin saavuttamiseksi on 0,5-4 ^ug solun pintaproteiinia yhtä ruumiinpainokiloa ja immunosointiruisketta kohden. Pysyvän immuniteetin saavuttamiseksi tulisi rokottaminen suorittaa kolmena peräkkäisenä kertana 1-3 viikon välein. Lisäksi, immunisointi suoritetaan tieteen ja testatun käytännön mukaisesti .

4 84431 Käytettäessä esillä olevia solun pintaproteiineja paikalliseen käyttöön dispergoidaan proteiini isotoniseen suolaliuokseen pitoisuuteen 25-200^ug/ml. Sitten haavoja käsitellään sellaisella määrällä, jolla saadaan ainoastaan täydellisesti kasteltua haavan pinta. Täten käytetään tavanomaiseen haavaan vain pari millilit-raa liuosta tällä tavoin. Käsittelyn jälkeen käyttäen proteiini-liuosta haavat pestään sopivasti isotonisella suolaliuoksella tai jollain muulla sopivalla haavanhoitoliuoksella.

Alla on esitetty nuorten lehmien immunosointi utaretulehdusta vastaan. Paikallista solun pintaproteiinien käyttöä voidaan myös käyttää utaretulehduksen estämiseksi käsittelemällä utareita/nän-nejä solun pintaproteiineja sisältävällä liuoksella, joka estää patogeenisten, utaretulehdusta aiheuttavien organismien kiinnittymisen niihin.

Keksinnön mukaisesti voidaan käyttää erilaisia sitomisominaisuuk-sia omaavien solun pintaproteiinien seoksia, erityisesti, jos infektoivan bakteerikannan sitomisominaisuudet ovat tuntemattomat, ja on suuri tarve laajan bakteerien aiheuttaman epideemisen tulehduksen nopeaksi estämiseksi; tai tulehduksen on aiheuttanut bakteerien seos.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavassa muutamiin esimerkkeihin viitaten.

Esimerkki

Staphylococcus aureus -kantaa, joka sitoutuu fibronektiiniin, kasvatettiin nestemäisellä alustalla (TS-lihaliemi), tryptikaasi-soija-uute (Oxoid, Ltd., Englanti).

Kasvun loputtua bakteerit eristettiin sentrifugoimalla ja pestiin suolaliuoksella (0,9 % NaCl vedessä). Sitten bakteerit hajotet- ... ® tnn bakteriolyyttisen entsyymin avulla (Lysostaphin, Sigma, 5 84431 5 mg/litra soluviljelmää). Fibronektiiniin sitoutuvat komponentit eristettiin affiniteettikromatografialla käyttäen dekstraani-geeliin (Sepharose, CL-4B, syanobromiaktivoitu) sidottua immobili-soitua fibronektiiniä· Sitten fibronektiiniin sitoutuvat komponentit eluoitiin lisäämällä kaotrooppisia ioneja (esimerkiksi NaSCN, KSCN) vesiliuoksessa. Eluointi voidaan suorittaa myös käyttäen hapanta liuosta, etikkahappoliuosta, jonka pH on 3.

Eristettiin fibronektiiniin sitoutuvia komponentteja, jotka käsittävät proteiineja, joiden molekyylipanot ovat alueella 11 000-165 000 edullisesti 40 000-165 000. Proteiinit voivat käsittää hiilihydraattitähteen, jolloin siis se on proteiinitähde, joka on fibronektiiniin sitoutuva, mikä on osoitettavissa tosiasialla, että vaikutus eliminoituu täysin proteaasikäsittelyn jälkeen, tai o kuumentamisen 80-100 C:een jälkeen.

Saatujen proteiinikomponenttien aminohappokoostumus ilmenee alla olevasta taulukosta:

Taulukko

Aminohappo Tähdettä/1000 aminohappoa M =165K / M =87K w w

Asparagiinihappo 146 134

Treoniini 107 103

Seriini 65 78

Glutamiini 171 151

Proliini 62 58

Glysiini 79 84

Alaniini 46 47 a)

Kysteiini 2,3 e.m.

Väliini 78 86 b)

Metioniini 5,8 e.m.

Isoleusiini 47 38 6 84431

Leusiini 40 46

Tyrosiini 23 41

Fenyylialaniini 20 36

Tryptofaani24 31

Histidiini 32 30

Lysiini 63 66

Arginiini 12 a) Aminohappo määritetty näytteen performaattihapetuksen jälkeen b) Aminohappo laskettu absorbanssista 280 nm:lla ja tyrosiinisi-sällöstä.

e.m. = ei määritetty.

Esimerkissä on käytetty affiniteettikromatografiaa proteiinin puhdistamisessa/eristämisessä. Muita biokemiallisia erotusmenetelmiä ovat ioninvaihtokromatografia ja molekyylisiivilöinti; elektroforeesi mukaanlukien isotakoforeesi; elektrofokusointi.

Tavanomaisella S. aureus-viljelmällä saadaan yllä oleva solun pintaproteiini. Reseptoreiden tehokasta teollista tuotantoa varten rokotteeksi ja muuhun hoitoon geeni täytyy kloonata sopivassa organismissa korkeiden saantojen aikaansaamiseksi.

Puhdistettu fibronektiiniin sitoutuva solun pintaproteiini on osoittautunut olevan immunogeeninen kanien ja märehtijöiden immunisoinnissa, ja on niissä kehittänyt vasta-aineiden tuotannon.

Koe 1 SRB-hiehojen (1. vasikan saanut lehmä) rokottaminen fibronektii-niä sitovalla proteiinilla yllä olevan esimerkin mukaisesti.

Kolme SRB-hiehoa (ruotsalaista punavalko-karjaa) rokotettiin ihonalaisesti rintakehän alueelle käyttäen 400^um fibronektiiniä sitovaa komponenttia (Mp 165 000 ja 87 000). Nämä injektiot toistettiin kahdesti 14 päivän välein. Vasta-aineen toteaminen see- 7 84431 rumissa ja maidossa ELISA-menetelmän avulla (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) osoitti, että suurissa maidon ja seerumin laimennoksissa oli havaittavissa erittäin voimakas immunovaste jo toisen immunisoinnin hetkellä.

Kaksi viikkoa toisen injektion jälkeen, so. kolmannen immunisoin-tiruiskeen antohetkellä immunovasteen katsottiin olevan tarpeeksi kehittynyt kokeellisen utaretulehduksen (mastitis) aiheuttamiseksi kolmelle eläimelle. Nämä kolme eläintä samoin kuin kaksi kont-rollieläintä samasta karjalaumasta altistettiin kokeelliselle utaretulehdukselle käyttäen voimakkaasti utarepatogeenista kantaa, joka oli eristetty akuutista naudan mastitiksesta (S. aureus) utaretulehduksen kehittämiseksi näissä viidessä eläimessä. Koe suoritettiin pesemällä, dispergoimalla isotoniseen suolaliuokseen ja sitten ruiskuttamalla nänniin ja utareonteloon käyttäen standardoitua injektiotekniikkaa, 500 bakteeria lihaliemi alustalla (TS-lihaliemi) kasvatetusta bakteeriviljelmästä.

Saatiin seuraavat tulokset: i) hyvin niukkaa kasvua tietyissä rokotetuista lehmistä saaduissa maitonäytteissä, vain; ii) hyvin korkeita määriä bakteereita useimmissa rokottamattomista eläimistä saaduissa maitonäytteissä; iii) solunlaskentamäärityksillä saatiin yleensä alhaisia solulukuja rokotetuissa eläimissä; iv) solulaskentamäärityksillä saatiin yleensä korkeita solulukuja rokottamattomissa eläimissä; v) rokotetut eläimet tuottivat muuttumattomia maitotilavuuksia; vi) rokottamattomilla eläimillä maitotilavuudet laskivat huomattavasti (10 %); vii) akuutin faasin reagenssien tyyppiä "C reaktiivinen proteiini" ja albumiinin määritys rokotetuista eläimistä ei osoittanut muutosta ennen siirrostusta saatuihin arvoihin verrattuna; viii) akuutin faasin reagenssien tyyppiä "C reaktiivinen proteiini" ja albumiinin määritys rokottamattomissa eläimissä osoitti voimakkaasti nousseita arvoja.

e 84431

Tulokset osoittivat, että vasta-aineita fibronektiiniä sitovaa proteiinia vastaan erittyy utareeseen ja niitä on läsnä paikallisissa haavavaurioissa sellaisissa määrissä, että ne steerisesti estävät infektoivan bakteerikannan pintareseptoreita sitoutumasta esillä olevaan fibronektiiniin utarekudoksessa.

Koe 2

Avoimen ihohaavan tulehduksen estäminen haavakäsittelyn avulla käyttäen fibronektiiniin sitoutuvaa solun pintaproteiinia S. au-reuksesta.

Sikojen (20-25 kg) selkään tehtiin standardoituja haavavaurioita (2x2 cm) käyttäen niin kutsuttua dermatomia. Nämä haavat, jotka oli asetettu kahteen riviin 8 haavaa selkärangan kummallakin puo- o lella, altistettiin termiselle vioittamiselle (250 C, 3 min.) Termisen käsittelyn jälkeen haavat peitettiin steriilillä siteellä 1,5 tunnin ajaksi, minkä jälkeen haavat infektoitiin S. aureus -kannalla (SA 113 (83A)). Ennen bakteeri-infektiota haavoja toisella puolella selkärankaa käsiteltiin fibronektiiniä sitovalla solun pintaproteiinilla, yllä olevan esimerkin mukaisesti, liuotettuun steriiliin isotoniseen suolaliuokseen (100^ug/ml NaCl-liuosta). Tällälailla esikäsittelyissä haavoissa infektion kehittyminen estyi, kun samalla haavoja pestiin kahdesti päivässä käyttäen steriiliä isotonista suolaliuosta. Käsittelemättömissä haavoissa esiintyi vaurioissa pahoja infektioita 2-4 päivän sisällä, vaikka pestiin kahdesti päivässä käyttäen NaCl-liuosta; infektiot, jotka eivät parantuneet antibiooteilla käsittelemättä yhden viikon tarkkailuajänjaksona.

Tämän kokeen tulokset osoittivat, että esikäsittellyissä vaurioissa käyttäen 100^ug/ml NaClsssa pinnalla esillä oleva fibro-nektiini sitoutuu, siten että infektiot estyvät. Kiinnittyneet bakteerit voidaan helposti poistaa huuhtelemalla, mikä on mahdotonta haavoissa, joita ei ole käsitelty solun pintaproteiinilla.

9 84431

Fibronektiinin lisäksi on löydetty muita sidekudoksen sitovia proteiineja eri mikro-organismeissa, jotka sitoutuvat niihin si-dekudosrakenteisiin, joita on läsnä ihmisessä ja eläimissä, nimittäin kollageeniin ja laminiiniin alla olevan taulukon mukaisesti :

Taulukko

Fibronektiini Kollageeni Laminiini 1)

Stafylokokit + + - (eri tyyppiset)

Streptokokit + + + (Ryhmä A, C, G, H, valinn.B)

Escherichia coli + - + 1) ei vielä kokeiltu + merkitsee läsnäoloa

Koe 3

Stafylokokkien sitominen immobilisoituun fibronektiiniin - malli traumaattiseen kudokseen sitoutumisen simuloimiseksi (kirurgiset haavat ja utaretulehdus).

Polymeerin pintaa käsiteltiin erilaisilla seerumin proteiineilla, kuten albumiinilla ja fibronektiinilla. Sitten polymeerin pintaa inkuboitiin vastaavalla proteiinilla dispergoituna natriumfos-faattipuskuroituun suolaliuokseen (0,2 M natriumfosfaatti, pH 7,4 ja 0,145 M NaCl) 2 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Sitten polymeerin pinta kuivattiin puhaltamalla ilmaa käyttäen puhallin-ta. Sitten käsitelty pinta altistettiin stafylokokeille (SA 113(83A)-kanta) puskuriliuoksessa ja dispergoitiin naudan maidon läsnäollessa, vastaavasti. Jo parin minuutin jälkeen bakteerien kiinnittyminen määritettiin näissä molemmissa koesystee-meissä, jolloin samalla tavoin käsitelty pinta käyttäen albumii- 10 84431 nia samassa ja 10 kertaa suuremmassa pitoisuudessa proteiini-liuosta, ei osoita aktiivista bakteerien sitoutumista (käsittelemätön pinta on kuitenkin hydrofobinen ja sitoo stafylokokkeja epäspesifisesti). Kannan SA 113(83A) sitoutuminen voidaan inhiboida ensin inkuboimalla bakteereja vasta-aineella, joka on saatu puhdistetulla reseptoriproteiinilla rokotetusta kanista.

Koe 4

Samalla tavoin on pintaa käsitelty laminiinilla ja sitten kuten yllä on lisätty bakteereja, tässä tapauksessa ryhmän A streptokokki-kantaa. Tällöin on osoittautunut, että sreptokokki sitoutuu pintaan.

Koe 5

Polymeerin pintaa käsiteltiin fibronektiinilla (immobilisoitu) yllä olevan kokeen 3 mukaisesti. Sitten pintaa käsiteltiin solun pintaproteiinilla (Mp 87 000) esimerkistä 1 yllä liuotettuna fysiologiseen suolaliuokseen, 100 ug/ml. Sitten pintaa käsiteltiin stafylokokeilla (SA 113(83A)-kanta) dispergoituna puskuri-liuokseen (fosfaattipuskuri, 0,2 M Na-fosfaatti, pH 7,4 ja 0,145 NaCl). Stafylokokeilla käsittelemisen jälkeen polymeerin pinta huudeltiin fysiologisella suolaliuoksella löyhästi kiinnittyneiden bakteerien poistamiseksi. Tätä seuraavassa analyysissa havaittiin, että aktiivista stafylokokkien sitoutumista ei ollut tapahtunut. Analyysi suoritettiin määrittämällä bakteerisolumassan ATP (adenosiinitrifosfaatti) bioluminesenssitekniikalla. Lyhyesti ana lyysi suoritetaan inkuboimalla polymeerin pintaa 50^ul:lla.

1,25N trikloroetikkahappoa solujen ATP:n uuttamiseksi. ATP:n määrä määritettiin ja sitä verrattiin ATP:n standardikäyrään Lu-minometer 1250 avulla (LKB-Produkter, Bromma, Ruotsi).

Claims (1)

11 84431 Patenttivaatimus Menetelmä sellaisen fibronektiiniä sitovan solun pintaproteiinin valmistamiseksi, jonka molekyylipaino on 40 000 - 165 000 ja joka on käyttökelpoinen profylaktisesti ja/tai terapeuttisesti aktiivisten valmisteiden valmistuksessa, tunnettu siitä, että viljellään fibronektiiniä sitovaa bakteerikantaa, joka on Staphylococcus aureus, kiinteällä tai nestemäisellä väliaineella, eristetään näin saatu bakteerikanta, pestään eristetty bakteerikanta suolaliuoksella, hajotetaan pesty bakteerikanta, puhdistetaan fibronektiiniä sitova komponentti affiniteettikromatogra-fialla käyttäen kromatografiageeliin sidottua immobilisoitua fibronektiiniä ja eluoidaan fibronektiiniä sitova solun pintaproteiini . Förfarande för framställning av ett fibronektinbindande cellyte-protein som har en molekylvikt av 40 000 - 165 000 och som är användbar vid framställning av profylaktiskt och/eller terapeu-tiskt aktiva beredningar, kännetecknat av att man odlar en fibronektinbindande bakteriestam, som utgörs av Staphylococcus aureus, pä ett fast eller flytande medium, isolerar den s& er-hällna bakteriestammen, tvättar den isolerade bakteriestammen med en saltlösning, sönderdelar den tvättade bakteriestammen, renar fibronektinbindande komponent genom affinitetskromatografi p& immobiliserat fibronektin bundet tili en kromatografigel och eluerar det fibronektinbindande cellyteproteinet.