FI82246B - Foerfarande foer framstaellning av ett farmakologiskt aktiva 6-purinyl-n-/2-kloretyl/karbamat eller tiokarbamat. - Google Patents

Description

1 82246

Menetelmä farmakologisesti aktiivisen 6-purinyyli-N-[2-kloo-rietyyli]karbamaatin ja -tiokarbamaatin valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää farmakologisesti aktiivisen 6-purinyyli-N-(2-kloorietyyli)karbamaattin tai -tiokarbamaatin valmistamiseksi, jolla on yleinen kaava X-CONHCHoCHoCl ö>

N N H

jossa X on happi- tai rikkiatomi.

Alan kirjallisuus tuntee tiettyjä karbamiinihapon 6-purinyy-lijohdannaisia, esimerkiksi N-(6-purinyyli)-N'-aryyli- ja -N'-alkyyliureoita (A.S. Jones et ai., Tetrahedron 26, 791 (1970); H. Griengl et ai., Arch. Pharm. 317 (3), 193 (1984)) ja N-(2-kloorietyyli)-6-aminopuriini-9-karboks-amidin, joka on valmistettu reagoittamalla 2-kloorietyyli-isosyanaatti adeniinin kanssa (Miyahara Michiko et ai.

Eisai Shikenako Hokoku 1980 (98), 123 - 5; Chem. Abstr.

94, 114381w (1981)). Nämä yhdisteet eivät omaa biologista aktiivisuutta lukuunottamatta joitakin adeniiniureajohdan-naisia, esimerkiksi N-(6-purinyyli) -N',N'-dietyyliureaa, joka osoitti heikkoa antineoplastista vaikutusta. Keksinnön mukaiset yhdisteet, N-(2-kloorietyyli)-karbamiinihapon 6-purinyyliesterit ovat uusi toistaiseksi kuvaamaton joukko yhdisteitä, jotka yllättäen osoittivat huomattavaa neoplastista vaikutusta sekä in vivo että in vitro.

Kaavan I mukaiset otsikon yhdisteet voidaan valmistaa reagoittamalla vastaava kaavan II mukainen 6-substituoitu purii-nijohdannainen (kaavassa II X tarkoittaa samaa kuin edellä) 2 82246

XH

Γ Y > ^»A/

H

kaavan III mukaisen 2-kloorietyyli-isosyanaatin

Cl-CH -CH -N=C=0 (III) 2 2 kanssa inertissä väliaineessa, jonka lämpötila on oleellises- o ti välillä 0 - 50 C, edullisesti alkalisen aineen ollessa läsnä.

Lähtöaineena käytettävät kaavan II mukaiset puriinijohdannaiset ts. hypoksantiini (X = O) ja 6-merkaptopuriini (X = S) ovat kaupallisesti saatavia materiaaleja. 2-kloorietyyli-isosyanaatin valmistusta kuvataan useissa kohtaa kirjallisuutta (ks. esim. Siefken W., Ann. Chem. 562, 103 (1949)).

Sopivia inerttejä väliaineita yllä mainittuun reaktioon ovat edullisesti dimetyyli formamidi, dimetyylisulfoksidi, fosfori-happo, heksametyylitriamidi tai tetrametyyliurea.

Hypoksantiinin tai 6-merkaptopuriinin reaktio 2-kloorietyyli-isosyanaatin kanssa etenee melko hitaasti; kuitenkin sitä voidaan yllättäen kiihdyttää yhdellä tai kahdella mooliekvi-valentilla alkalista ainetta, edullisesti tertiääristä orgaanista amiinia kuten trietyyliamiinia, di-isopropyylie-tyyliamiinia, 1-etyylipiperidiiniä, 4-metyylimorfoliinia tai vastaavaa, jolloin reaktionopeus lisääntyy noin yhdellä kertaluokalla ja myöskin halutun tuotteen saanto on oleellisesti korkeampi.

Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat joko heikosti liukoisia yllä mainittuihin liuottimiin ja eroavat välittömästi näistä väliaineista reaktion aikana, tai ne voidaan helposti eristää 3 82246 reaktioseoksesta laimentamalla vedellä ja sen jälkeen suodattamalla .

Yleisen kaavan I mukaiset yhdisteet, s.o. 6-/N-(2-kloorietyy-li)karbamoyyli7tiopuriini (yhdiste Ia, X = S) ja sen happi-analogi, 6-N-/j2-kloorietyyli)karbamoyyli7oksipuriini (yhdiste Ib, X = O), osoittivat farmakologisissa kokeissa merkittävää antineoplastista aktiivisuutta sekä in vitro, että in vivo koe-eläimillä ja tästä syystä niitä voidaan käyttää erityisesti n i r '·' '! ; 1 ;n pahanlaatuisten neoplastisten sairauksien hoitoon, joko annosteltuna yksinään tai yhdessä muiden anti-necnlastista a 1-. t i lvi. suutta omaavien aineiden kanssa.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden antineoplastinen aktiivisuus tutkittiin in vivo jyrsijöiden kokeellisia kasvaimia, kuten Crocker'in sarkoomaa (S180), solid-tyyppistä Ehrlich'in kar-sinoomaa (STE), Kreb'in askiittituumoria (Kr2), nämä kaikki olivat hiirellä H, Kardnerin lymfosarkoomaa (LsG, C3H-hii-ri), P388- ja L1210-leukemioita (DBA2-hiiri), Zajdela-askiit-tihepatoomaa (ZAH, Wistar-rotat), Yoshida-askiittiverkkokal-vosarkoomaa (Y, Wistar-rotat) ja B16-melanoomaa (C57B16-hiiri) vastaan V. Jelinekin mukaisilla kokeilla /Neoplasma 12, 469 (1969); 1_, 146 (196θ£7 ja in vitro kokeilla käyttäen nukleiinihappojen ja proteiinien radioaktiivisia prekursoreita Miko, M. et ai'in mukaisesti /Cancer Res. _39, 4242 (1979); Neoplasma 26, 449 (1979); 1<S, 161 (1969)_7 vähäisin modifikaatioin /Mattern J.: Studies on the Drug Sensitivity of Short Term Cultured Tumour Cell Suspensions. In "Human Tumours in Short Term Culture" (Dendy, P.P. ed.) s. 301, Academic Press 19767· Terapeuttista synergismiä on tutkittu Carter, W.H. et al'in menetelmällä /Cancer Res. 42, 2963 (1982)7·

Keksinnön mukaiset yhdisteet estävät tyypillisiä kasvainten aiheuttamia oireyhtymiä, kuten kasvaimen kasvua, jäljellä olevan elinajan lyhenemistä ja kasvainsolujen kasvun tai lukumäärän lisääntymistä. Kasvaimen kasvu voidaan havaita klii 4 82246 nisesti tai kokeellisesti in vivo, ts. koe-eläimillä, tai in vitro, esimerkiksi kasvaimista valmistetuissa kudosviljelmis-sä. Kasvaimen kasvu voidaan arvioida mittaamalla kasvaimen paino tai tehokkaammin mittaamalla radioaktiivisuus sen jälkeen kun kasvaimeen on lisätty tiettyjä luonnollista alkuperää olevia aineita, kuten aminohappoja (esimerkiksi valiinia), nukleiiniemäksiä tai vastaavia (tymidiiniä jne.), jotka on 14 3 merkitty radioaktiivisilla atomeilla, kuten C, H jne.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden terapeuttinen vaikutus on osoitettu kokeellisesti naaraspuolisella hiirellä H olevaan S180 ja/tai STE-kasvaimeen. Verrattaessa käsittelemättömiin kontrollieläimiin käsitellyillä eläimillä (esimerkit 3 ja 4) havaittiin olevan huomattavasti pienemmät kasvainten painot.

Tämän lisäksi keksinnön mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia lisättäessä sairastuneen eläimen, nimittäin STE-, ZAH-ja/tai Y-kasvaimia sairastavien hiirien ja rottien jäljellä olevaa elinaikaa; käytetyn koejärjestelmän tappavan luonteen johdosta yhdisteiden kasvaimenvastaista vaikutusta kuvataan vertaamalla käsiteltyjen eläinten jäljellä olevaa elinaikaa (elivät pitemmän ajan) käsittelemättömien kontrollieläinten (esimerkit 5, 6 ja 7) jäljellä olevaan elinaikaan. Näissä kokeissa käytettiin 10 eläimen koeryhmiä, ja käsiteltyjen eläinten ryhmät selvisivät hengissä pitemmän ajan kuin käsittelemättömät kontrolliryhmät.

Lisäksi joissakin tapauksissa osoitettiin keksinnön mukaisten yhdisteiden kasvaimen vastainen vaikutus koeolosuhteissa, joissa kliinisesti käyttökelpoinen ja rakenteeltaan läheinen yhdiste 6-merkaptopuriini oli inaktiivinen (esimerkki 8). Kokeen tulos tukee käsitystä, että yhdisteen Ia vaikutuksen mekanismi on erilainen kuin kliinisesti käytetyn 6-merkaptopu-riinin. Tämä vaikutus voi olla kliinisesti käyttökelpoinen kaikissa kasvain- tai leukemiaresistanssitapauksissa tämän luokan antimetaboliittia vastaan.

5 82246 Tämän lisäksi yleisen kaavan I mukaisten yhdisteiden terapeuttinen synergismi muiden sytostaattisten lääkeaineiden kanssa on osoitettu esimerkiksi yhdessä Benfluronin kanssa (5-/2-N,N-dimetyyliamiini)etoksi7-7-okso-7H-bentso(c)fluoree-nihydrokloridi, CAS 80427-58-3) - katso esimerkki 9. Ne eläinten ryhmät, joita käsiteltiin yhdistämällä yhdistettä Ia sytostaattisen lääkeaineen Benfluronin kanssa pysyivät hengissä merkittävästi pitemmän ajan (p = 0,01) kuin käsittelemättömien kontrol1ieläinten ryhmät tai yksinomaan Benfluro-nilla käsitellyt eläimet. Edellä mainitut esimerkit osoittavat, että yhdistettä Ia voidaan käyttää tehokkaasti yksinään tai yhdessä muiden sytostaattisten aineiden kanssa pahanlaatuisten neoplastisten tautien hoidossa.

In vivo-kokeissa Ehrlichin askiittikarsinoomasoluille ja/tai Yoshida-askiittisoluilie, yhdiste Ia oli huomattavasti tehokkaampi kuin jotkin kliinisesti käytetyt lääkeaineet, nimittäin tioguaniini (2-amino-6-merkaptopuriini, NSC 752) ja/tai 6-merkaptopuriini (NSC 755), katso esimerkit 10 ja 11.

Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää myös syöpäsolujen DNA- ja proteiinibiosynteesien estäjinä. Tämä johtopäätös seuraa esimerkistä 12. Yllä mainittujen vitaalien biosynteesien estyminen johtuu sytostaattien kasvainten vastaisesta aktiivisuudesta.

Tässä kuvatut yhdisteet voidaan annostella ihmiselle ja eläimelle, erityisesti nisäkkäille kasvaintenvastaisessa hoidossa perinteisellä tavalla sellaisenaan, mutta edullisesti aktiivisena ainesosana jonkin perinteisen sopivan myrkyttömän kan-toaineen avulla, liuotettuina tai suspendoituina, esimerkiksi veteen, suolaliuokseen, polyetyleeni- tai polypropyleenial-koholeihin jne. Annostus toteutetaan mielellään oraalisesti. Annostus riippuu kasvaimen tyypistä, saajan painosta, ruumiin pinta-alasta, kasvaimen sijainnista, sen morfologisesta tyypistä, käsittelyjen tiheydestä, yksilöllisestä toleranssista 6 82246 ja herkkyydestä jne; esimerkiksi rotat ja hiiret näyttivät kestävän hyvin pitkään jatketun oraalisen annostuksen 100, 200 mg/kg päivittäin. Biologisista kokeista voidaan päätellä, e^tä myös ihminen sietää 20 mg/kg annoksia (esim. n. 740 mg/ m ). Yhdisteet ovat lähes myrkyttömiä; eritysesti yhdiste

Ia on käytännöllisesti myrkytön (LD pienillä jyrsijöillä . . . . 50 arvioitiin olevan 3g/kg oraalisesti annettuna).

On oletettavaa, että terapeuttiset vaikutukset ilmenevät myöskin vastaavasti nisäkkäillä annettaessa tällaisia täysin myrkyttömiä annoksia.

Menetelmää kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi samoin kuin niiden valikoituja biologisia koetuloksia on valaistu seuraavilla ei-rajoittavilla esimerkeillä. Sulamispisteet määritettiin Kofler-blokilla ja ne ovat korjaamattomia, saannot on ilmoitettu stökiömetrisinä prosentteina teoreettisesta .

Esimerkki 1 6-/N-(2-kloorietyyli)karbamoyyli7 tiopuriini (Ia) 6-merkaptopuriinimonohydraatin (17,0 g, 0,1 moolia) dimetyy- 1iformamidisuspensiota (150 ml DMF) käsiteltiin trietyyli- amiinilla (10,1 g, 0,1 moolia) ja kiinteä aine liuotettiin o lämmittämällä seosta 50 - 60 C:een. Liuos jäähdytettiin o 15 C:een ja 2-kloorietyyli-isosyanaattia (11,6 g, 0,11 moolia) tiputettiin seokseen samalla jäähdyttäen vesijohtovedel-o lä 15 - 20 Creen. Reaktioseosta sekoitettiin tässä lämpötilassa 2 tuntia ja saostunut tuote koottiin suodattimelle, pestiin asetonilla ja kuivattiin alennetussa paineessa n. o 50 C lämpötilassa, jolloin saatiin 20,7 g (80 %) otsikon o yhdistettä la, jonka sulamispiste oli 221 - 223 C. T.JV- . v 326 absorptiospektri (dimetyylisulfoksidissa) λ nm log ε 4,33 ) . max 7 82246

Esimerkki 2 6-/N-(2-kloorietyyli)karbamoyyli7oksipuriini (Ib)

Hypoksantiinin (6,8 g, 50 mmoolia) dimetyyliformamidisuspen- sioon (DMF 200 ml) lisättiin trietyyliamiinia (5,05 g, 50 o mmoolia) ja sen jälkeen 15 - 20 C::;sa 2-Moorie tyyli-isosyanaattia (5,8 g, 55 mmoolia) tiputettiin seokseen. Reak-tioseokset sekoitettiin tässä lämpötilassa kunnes kiinteä aine oli liuennut (n. 2 tuntia), jonka jälkeen se kaadettiin jää-vesiseokseen (750 ml), otsikkoyhdisteen saostuma erotettiin imulla, pestiin asetonilla ja kuivattiin huoneen lämpötilassa. Saanto oli 8,2 g (67,8 " ) yiuu l1', sp. 320 - o 340 C (hajoaa), UV-absorptiospektri (dimetyylisulfoksidissa) λ 275 nm (log ε 3,76). max

Esimerkki 3

Aineen Ia kasvaimenvastainen vaikutus

Kuusikymmentä naaraspuolista hiirtä H, jotka painoivat noin 20 g jaettiin kolmeen ryhmään: yksi kontrolliryhmä ja kaksi koeryhmää, jossa kussakin oli 20 eläintä. Kaikille eläimille annettiin tappava annos Crocker'in kasvain(S180)homogenaattia subkutaanisesti. Koeryhmiä käsiteltiin aineen Ia vesisuspensiolla. Suspensio sisälsi ainetta Ia sellaisia määriä, että 0,4 tai 0,2 ml:n annos suspensiota p.o. vastasi annosta 200 tai 100 mg Ia/kg. Tämä annos annettiin koe-eläimille kerran päivässä, yhteensä kahdeksan kertaa alkaen implantaation jälkeen kahdeksantena päivänä. Neljäntenätoista päivänä implantaation jälkeen puolet kunkin ryhmän eläimistä tapettiin eet-terinukutuksessa, kasvaimet poistettiin ja punnittiin. Loput eläimet jätettiin jäljelle osoittamaan kuolinajankohdat. Kasvaimen painon keskimääräiset arvot olivat tilastollisesti merkittävästi alhaisempia käsitellyillä eläimillä kuin käsittelemättömällä kontrolliryhmällä.

8 82246

Esimerkki 4

Aineen Ib kasvaimenvastainen vaikutus

Analogisissa kokeissa, jotka suoritettiin eläimillä, joille oli istutettu Ehrlich-kasvain (STE) (naaraspuoliset hiiret H painoivat noin 20 g, 20 eläimen ryhmä) käsitellyillä eläimillä kasvaimen painon keskimääräiset arvot olivat tilastollisesti merkittävästi alhaisempia kuin käsittelemättömällä kontrolliryhmällä. Kokeiden tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon.

Aine Annostus Annos Kasvaimen paino _ (mg/kg)____(¾ kontrollista) 1)

Ia p.o. 8 x 200 70 1) 8 x 100 80 --

Ib p.o. 8 x 200 81 1) 8 x 100 76 ^Tilastollisesti merkittävä ero suhteessa kontrolliin (t-koe, p- 0,05)

Esimerkki 5

Aineen Ia terapeuttinen teho

Viisikymmentä nuorta naaraspuolista Wistar-rottaa, jotka painoivat keskimäärin 60 g jaettiin viiteen ryhmään: yksi kontrolli- ja viisi koeryhmää, kussakin 10 eläintä. Tappava annos Zajdel-askiittihepatoomasta peräisin olevia kasvainaskiitte-ja istutettiin intraperitoneaalisesti kaikkiin eläimiin. Koeryhmät käsiteltiin aineen Ia vesisuspensiolla. Suspensio sisälsi ainetta Ia sellaisia määriä, että 0,4 tai 0,2 ml:n annos suspensiota p.o. vastasi annosta 200 tai 100 mg Ia/kg.

II

9 82246 Tämä annos annettiin koe-eläimille kerran päivässä, viisi kertaa yhteensä alkaen ensimmäisenä päivänä implantaation jälkeen. Tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon.

Aine Annostus Aine Jäljellä oleva elinaika ____________(mg/kg)____(% kontrollista)__ 1)

Ia p.o. 5 x 200 126 1) 5 x 100 117 1)

Tilastollisesti merkittävä ero suhteessa kontrolliin (t-koe, p = 0,05)

Esimerkki 6

Aineiden Ia ja ib terapeuttinen teho verrattuna 6-merkaptopu-riiniin (NSC 755)

Analogisesti suoritetuissa kokeissa, joissa eläimille istutettiin Yoshida-kasvainta (nuoria naaraspuolisia Wistar-rottia, jotka painoivat keskimäärin 60 g, 10 eläintä ryhmässä), käsitellyillä eläimillä oli tilastollisesti merkittävästi pidemmät elinajat kuin käsittelemättömillä eläimillä. Tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon.

Aine Annostus Annos Jäljellä oleva elinaika ______(mg/kg)__(% kontrollista)_ 1) 6-merkap- p.o. 5 x 40 127 topuriini 5 x 20 109

Ia p.o. 5 x 200 127 5 x 100 134 1) 10 82246

Ib p.o. 5 x 200 83 ________5 x 100___100____ 1)

Tilastollisesti merkittävä ero suhteessa kontrolliin (t-koe, p = 0,05)

Esimerkki 7

Aineen Ia terapeuttinen teho verrattuna 6-merkaptopuriiniin (NSC 755)

Analogisesti suoritetuissa kokeissa, joissa eläimiin istutettiin Yoshida-kasvainta (nuoria naaraspuolisia Wistar-rottia, jotka painoivat keskimäärin 60 g, 10 eläintä ryhmässä) käsitellyillä eläimillä oli tilastollisesti merkittävästi pidemmät elinajat kuin käsittelemättömillä eläimillä. Tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon

Aine Annostus Annos Jäljellä oleva elinaika _____(mg/kg)_(% kontrollista) 1) 6-merkap- p.o. 5 x 40 156 topuriini 5 x 20 107 --

Ia p.o. 5 x 200 158 ____________5 x 100________124___ 1)

Tilastollisesti merkittävä ero suhteessa kontrolliin (t-koe, p = 0,05)

Esimerkki 8

Aineen Ia terapeuttinen teho osoitettuna kokeella, jossa jossain määrin samanlainen 6-merkaptopuriini osoittautui tehottomaksi

II

11 82246

Kokeessa, joka oli analoginen esimerkeille 5-7 ja joka suoritettiin eläimillä, joihin oli istutettu Zajdel-askittihepa-toomaa (nuoria naaraspuolisia Wistar-rottia, jotka painoivat keskimäärin 60 g, 10 eläintä ryhmässä), aineella Ia käsitellyillä eläimillä oli tilastollisesti merkittävästi pidentyneet keskimääräiset elinajat, kun taas 6-merkaptopuriinilla käsitellyillä eläimillä ei ollut, verrattuna käsittelemättömiin eläimiin. Kokeen tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon .

Aine Annostus Annos Jäljellä oleva elinaika ____________(mg/kg)_(% kontrollista)____ 6-merkap- p.o. 5 x 40 105 topuriini 5 x 20 101 __

Ia p.o. 5 x 200 128 1) 5 x 100 120 r)----------------------

Tilastollisesti merkittävä ero kontrollin suhteen (t-koe, p = 0,05 ) .

Esimerkki 9 127 nuorta naaraspuolista Wistar-rottaa, jotka painoivat 50 -60 g, jaettiin kuuteentoista ryhmään: yksi 25 eläimen kontrolliryhmä ja viisitoista 6-7 eläimen koeryhmää. Kuolettava annos Yoshida-askiittisarkoomasta peräisin olevia kasvainas-kiitteja istutettiin intraperitoneaalisesti kaikille eläimille. Koeryhmiä käsiteltiin aineen Ia vesisuspensiolla, syto-staattisen Benfluronin vesiliuoksella (CAS 80427-58-3) tai molempien aineiden kombinaatiolla. Suspensio tai liuos sisälsi aineita sellaisia pitoisuuksia, että annokset 0,4 tai 0,2 ja 0,1 ml suspensiota/liuosta p.o. vastasivat annoksia 200 tai 100 ja 50 mg Ia/kg tai annoksia 160, 80 tai 40 mg Benfluronia/ kg. Annokset ainetta Ia annosteltiin koe-eläimille kerran i2 82246 päivässä, neljä kertaa yhteensä alkaen ensimmäisenä päivänä kasvaimen implantaation jälkeen. Benfluronia annettiin ainoastaan kerran, neljäntenä päivänä kasvaimen istutuksen jälkeen, 7 tuntia aineen Ia viimeisen annoksen jälkeen. 29 päivän ajanjaksona havaittiin, että kaikki kontrolliryhmän eläimet kuolivat 5. - 15. päivänä implantaation jälkeen, kun taas aineella ia tai sen ja sytostaattisen Benfluronin kombinaatiolla käsitellyt eläimet säilyivät hengissä kauemmin keskimääräisellä tilastollisella merkittävyydellä (u = 0,05) tai suurella tilastollisella merkittävyydellä (a = 0,01). Kokeen tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon.

Annos (mg/kq p.o.) Keskimääräinen jäljellä Huomau-

Ia Benfluron oleva elinaika tus _______________päiviä (% kontrollista)___ 0 0 7,34 (6,8; 7,9) 100 4 x 200 0 8,86 (7,4;10,7) 121 4 x 100 0 10,94 ( 9,0; 13 ,3) 149 2)

4 x 50 0 9,20 (7,6;11,1) 125 S

0 160 7,79 (6,9; 8,8) 106 0 80 7,61 (6,5; 8,9) 104 0 40 7,67 (6,9; 8,6) 104 4 x 200 160 17,18 (10,9;26,9) 234 2) 4 x 200 80 13,09 (8,8;19,5 ) 178 1) 4 x 200 40 8,26 (6,3;10,9) 113 4 x 100 160 12,97 (8,9,-19,0) 177 1) 4 x 100 80 14,07 (9,7,-20,4) 192 2) 4 x 100 40 13,97 (9,5,-20,6) 190 2) 2 3 4 x 50 160 20,85 (14,5;29,9) 284 ) ) 4 ) 2 4 x 50 80 8,96 (8,1;10,0) 122 ) li i3 82246 1) .

Tilastollisesti merkittävä ero verrattuna kontrolliryhmään ( a = 0,05) 2) .

Tilastollisesti erittäin merkittävä ero verraattuna kontrolliryhmään ( a = 0,01) 3) .

Tilastollisesti erittäin merkittävä ero verrattuna ryhmään, jolla on optimaalinen monoterapia (4 x 100 mg Ia/kg p.o.

t-koe a = 0,01) 4)

Eläimet, jotka elivät 29. päivänä, ja jotka tapettiin ilman kasvainta

Geometrisen keskiarvon luotettavat rajat P = 1 - a = 0,95 on annetussa suluissa.

Esimerkki 10

Aineen Ia sytotoksisuus in vitro verrattuna 2-aminomerkapto-puriiniin (NSC 752) 14 14

Adeniini- C:stä ja valuni- C:stä peräisin olevan 14 C:n liittämisen vaikutusaste Ehrlich-karsinoomasoluihm, jotka ovat liukenemattomia trikloorietikkahappoon, toimi sy- totoksisuuden mittana. ID -arvo on se sytostaattipitoisuus, 14 50 joka alentaa C:n liittymisen 50 prosenttiin käsittelemättömillä kontrollisoluilla. Kokeen tulokset on koottu seuraa-vaan taulukkoon.

Aine Prekursori ID

50 , (^umol/1) -j-2j-

Ia adeniini- C 94 14 väliini- C 155 2-amino-6-mer- adeniini-*^ >600 14 kaptopuriini väliini- C >600 i4 82246

Esimerkki 11

Aineen Ia sytotoksisuus in vitro verrattuna 6-merkaptopurii-niin (NSC 755)

Analogisissa kokeissa vaikutusastetta 5-jodi-2'-deoksi-/6-3 . . 3 _ 14 _ H/-uridnnista peräisin olevan H: n tai L-£U- C/-ami- 14 nohappojen seoksesta peräisin olevan C:n alkuperäiseen liittymisnopeuteen Yoshida-askiittikasvainsolujen jakeeseen pidettiin sytotoksisuuden mittana. IC -arvo on se aineen 3 . 14 50 pitoisuus, joka alentaa H:n tai C:n alkuperäistä liit-tymisnopeutta 50 prosenttiin kontrollisoluilla. Tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon.

Aine Prekursori IC

50 _________(^umol/1) _ 3 __ 6-merkapto- 5-jodi-2'-deoksi/6- H/- puriini uridiini > 10 000 L-/U- c7aminohapot > 229

Ia 5-jodi-2'-deoksi^6-^H7- uridiini 25 14 L-/U- C/aminohapot 26

Esimerkki 12

Aineiden Ia ja Ib sytotoksisuuden vertailu in vitro

Analogisissa kokeissa määritettiin seuraavat IC -arvot 50

II

is 82246

Aine Prekursori IC50 Luotettavuusrajat (pmol (P = 0,95) /litra)

Ia 5-jodi-2'-deoksi[6-3H]- uridiini 39 (21; 106)

Ib 5-jodi-2'-deoksi[6-^H]- uridiini 55 (47; 65)

Ia L-[U-^-^C]aminohapot 62 (24; 8.10^)

Ib L-tU-^C] aminohapot 80 (66; 104)

Esimerkki 13

Aineen Ia, N-[delta-(6-purinyylitio)valeryyli]glysiini-etyyliesterin (Butocin, tunnettu FI-patenttijulkaisusta 48737) ja 6-merkaptopuriinin kasvaimenvastainen vaikutus Yoshida-retikulosarkoomaa vastaan.

70 nuorta naaraspuolista Wistar-rottaa, jotka painoivat 51,5 - 59,6 g, käytettiin kokeessa. Eläimille istutettiin Yoshida-retikulosarkoomaa intraperitoneaalisesti 0,2 ml 1/9 (til./til.)-askiittista nestettä (3 000 000 solua eläintä kohden) 0-päivänä. Kasvaimella istutetut rotat jaettiin seitsemään ryhmään, yksi kontrolliryhmä ja kuusi koeryhmää, jokaisen ryhmän sisältäessä 10 eläintä. Koeryhmien eläimille annettiin oraalisesti ainetta Ia tai Buto-cin'ia annoksina 200 ja 100 mg/kg/päivä. 6-merkaptopurilnia käytettiin vertailulääkkeenä annosten ollessa 40 ja 20 mg/kg/päivä. Kaikki aineet annettiin oraalisesti veteen suspendoituneina viitenä peräkkäisenä päivänä. Tarkkailtiin jokaisen eläimen elinaikaa. Terapeuttiset koetulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

16 82246

Aine Annos Jäljellä oleva % kont- Eloon (mg/kg/ elinaika (päivää) rollis- jää- päivä) keskiarvo/alue ta neet

Kontolli Ia 0 7,0 6,3 - 7,8 100 0/10 b) CLOTURIN 200 12,5 8,5 - 18,4 178 2/10 a) 100 11,6 7,5 - 17,9 165 1/10 BUTOCIN 200 7,2 6,9 - 7,5 102 0/10 100 8,3 6,5 - 10,5 118 0/10 a) 6-merkap- 40 9,4 7,2 - 12,2 133 0/10 topuriini 20 8,6 6,8 - 10,8 122 0/10 a) b) p < 0,05 p < 0,01 ti

Claims (2)

17 82246

1. Menetelmä farmakologisesti aktiivisen 6-purinyyli-N-(2-kloorietyyli)karbamaatin tai -tiokarbamaatin valmistamiseksi, jolla on yleinen kaava x-conhch2ch2ci H jossa kaavassa X on happi- tai rikkiatomi, tunnettu siitä, että 6-substituoitu puriinijohdannainen, jolla on yleinen kaava XH N T (II) H jossa kaavassa X tarkoittaa samaa kuin kaavassa I, saatetaan reagoimaan 2-kloorietyyli-isosyanaatin kanssa, jolla on kaava ci-ch2-ch2-n=c=o (III) inertissä väliaineessa lämpötilassa, joka on oleellisesti alueella 0 - 50°C, edullisesti alkalisen aineen läsnäollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkalisena aineena käytetään trietyyliamiinia. 18 82246