FI82074B - Foerfarande foer framstaellning av humant leukocytinterferon alfa-2. - Google Patents

Description

1 82074

Menetelmä ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on mikrobiologinen teollisuus ja 5 erityisesti sen kohteena on virusten vastaisen vaikutuksen omaavan ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistus ja käyttö lääketieteessä virusetiologian joidenkin laajalti levinneiden tautien estämiseksi ja hoitamiseksi.

Interferonit ovat itse asiassa proteiineja, joita 10 spesifiset ihmissolut syntetisoivat vasteena virusinfek tiolle. Riippuen solutuottajan tyypistä ja interferonien spesifisistä rakenne- ja funktionaalisista piirteistä, ne voidaan jakaa kolmeen perustyyppiin, ts. alfa- eli leukosyytti-interferoniin, jota valkosolut tuottavat; beta- eli 15 fibroplasti-interferoniin, jota sidekudosemosolut tuotta vat; sekä gamma- eli immuuni-interferoniin, jota T-imuso-lut tuottavat.

Paitsi virusten vastaista vaikutustaan interferoneilla on myös lisäkasvua vastustava vaikutus sekä myös 20 vaikutus immuunivasteeseen. Tämä tekee mahdolliseksi pitää interferoniin perustuvia lääkkeitä potentiaalisesti tehokkaana apukeinona joidenkin pahanlaatuisten kasvainten hoitamiseksi .

Nyttemmin on valmistettu erittäin puhtaita ihmisen 25 interferonivalmisteita, jotka ovat itse asiassa 13 - 15 läheisesti samansukuisten proteiinien ryhmä, joita proteiineja kutakin koodaa oma rakennegeeninsä kromosomissa 9.

Eristämällä leukosyytti-interferoni luovuttajan verestä ei kuitenkaan onnistuta aikaansaamaan sen tuotan-30 toa riittävässä määrässä laajaa kliinistä käyttöä varten, koska 1 litran verta sisältämä interferonimäärä on yleensä 105 AU:n sisällä, kun taas interferonin yksinkertainen tehokas annos, joka on tarkoitettu laskimonsisäistä injektiota varten potilaalle, on vähintään 106 AU kokeellisten : : 35 kliinisten havaintojen perusteella.

2 82074

Tekniikan tasolla tunnetaan erilaisia menetelmiä ihmisen leukosyytti-interferonien valmistamiseksi, jotka menetelmät perustuvat lukuisten mikro-organismikantojen käyttämiseen tuottajakantoina, joihin ihmisen interferonin 5 yksittäisiä geenejä on siirretty vektorimolekyylien avul la. Erityisesti käytetään tuottajakantoina bakteerien Escherichia coli, Bacillus subtilis, Methylophilus methy-lotrophus jne. kantoja (vrt. EP-patenttijulkaisu 00062971-A2; julkaistu 1982; Int. Cl. C 12N 15/00).

10 Mikro-organismit, jotka sisältävät plasmidin, jossa on insertoituna ihmisen leukosyytti-interferonigeeni, tuottavat interferonia, kun niitä viljellään aerobisissa uppo-olosuhteissa ravintoväliaineissa, jotka sisältävät hiilen ja typen lähteitä, mineraalisuoloja ja kasvuteki-15 jöitä.

Tekniikan tasolla tunnetaan menetelmä ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistamiseksi (vrt. GB-patenttijulkaisu 2 079 291 A; julkaistu 1982; Cl. C 12N 15/00), jonka mukaisesti käytetään E. coli K-12 kantaa 20 294, joka on saatu insertoimalla yhdistelmäplasmidi pLeIFAtrp2,5, jolloin interferoni alfa-2-geeni on E. coli'n tryptofaanioperonin säätelyalueiden säätelyn alainen.

Edellä mainittua kantaa uppoviljellään ravintoväliaineissa, jotka sisältävät hiili- ja typpilähteitä, mine-25 raalisuoloja ja kasvua stimuloivia aineita antibiootin läsnäollessa.

Interferonisaanto edellä esitetylle tuottajalle on 2,5 x 108 AU/litra viljelynestettä.

E. coli'n käyttöön teollisena tuottajana liittyy 30 kuitenkin joitakin haittoja. E. coli'n katsotaan olevan tavanomaisesti patogeeninen mikro-organismi, samalla kun tämän bakteerin eri kantoja on pysyvästi läsnä ihmisten suoliston mikroflorassa. Tämä tosiasia asettaa erityisen ankarat vaatimukset E. coli'n pohjalta tuotettujen lääk-35 keiden puhdistukselle ja proteiiniepäpuhtauksien ja endo- toksiinien erottamiselle täydellisesti. Tämä puolestaan li 3 82074 tekee interferonin valmistusprosessin kalliimmaksi ja vaikuttaa haitallisesti puhtaan lopputuotteen saantoon. Lisäksi kaikki tähän saakka tunnetut E. coli'n laboratorio-kannat ovat herkkiä fagolyysille, jolloin E. coli'lle tun-5 nostettujen spesifisten fagien lukumäärä nousee moniin satoihin.

Lisäksi edellä esitettyä menetelmää rasittaa myös viljelyn suhteellisen alhainen tuottavuus, minkä johdosta interferonin eristäminen solubiomassasta ja sen myöhempi 10 puhdistaminen kunnes homogeeninen tila saavutetaan, on hyvin työläs prosessi.

Tämän keksinnön ensisijaisena tavoitteena on aikaansaada ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:ta suuremmin saannoin ja aikaansaada yksinkertaistettu menetel-15 mä tuotteen saamiseksi uutta tuottajakantaa käyttäen.

Edellä esitettyyn tavoitteeseen päästään keksinnön mukaisella menetelmällä ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistamiseksi uppoviljelemällä tuottajakantaa, joka sisältää plasmidin, johon on liitetty ihmisen leuko-20 syytti-interferoni alfa-2-geeni, ravintoväliaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä, mineraalisuoloja ja kasvutekijöitä, ilmastaen antibiootin läsnäollessa, mitä seuraa lopputuotteen eristäminen ja puhdistaminen.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, 25 että tuottajakantana käytetään Pseudomonas-lajin VG-84-kantaa, jossa on plasmidi pVG3, ja joka on talletettu talletuslaitoksen USSR Antibiotics Research Institute mikro-organismikokoelmaan talletusnumerolla 1742, ja että tuottajakantaa viljellään antibioottien, ts. streptomysiinin 30 tai tetrasykliinin tai näiden kummankin läsnäollessa. Me netelmässä on edullista, että tetrasykliiniä käytetään määrässä 30 - 50 mg/1 ja streptomysiiniä määrässä 50 - 150 mg/1.

Uuden, erittäin tuottavan kannan Pseudomonas-lajia 35 VG-84 käytöstä johtuen saadaan koneellistetulla ja yksin kertaisemmalla menetelmällä suurempi saanto lopputuotetta.

4 82074

Keksinnön mukaisesti käytetään siis uutta Pseudomo-nas-lajin VG-84-kantaa, johon ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2-geeni on kloonattu osaksi monikopioplasmidia pVG3 bakteriofagin 0X174:n geenin D säätelyalueiden sää-5 telyn alaisena.

Plasmidi pVG3 on laajan isäntäspektrin omaavan mo-nikopiovektoriplasmidin pAYC34 ja plasmidin pIFN-a2-P2 molekyylihybridi, joka sisältää replikonin pBR 322 ja interferoni alfa-2-geenin, ja vastaa soluresissenssistä tet-10 rasykliinille ja ampisilliinille. Plasmidin pIFN-a2-P2 interferoni alfa-2-geeni on bakteriofagin 0X174 geenin D säätelyalueiden säätelyn alaisena. 9,4 tuhannen emäsparin vektoriplasmidi pAYV34 on suhteessa yhteensopimattomuus-ryhmän Inc p-4/Q kanssa ja määrää soluresistenssin strep-15 tomysiinille.

Plasmidia pAYC34 ja pIFN-a2-p2-DNA:ta käsiteltiin Pst l:llä, minkä jälkeen E. coli-kannan C600 kompetentteja soluja transformoitiin tällä seoksella. Sitten transfor-mantit seulottiin täydellisellä ravintoalustalla, joka si-20 sälsi antibiootteja, ts. ampisilliiniä (50 μ/ml), strepto mysiiniä (100 μ/ml) ja tetrasykliiniä (25 μ/ml). Transfor-manttiklooneista löytyi plasmidi-DNA, jota nimitetään pVG3:ksi, ja joka kooltaan ja restriktiokartaltaan vastaa plasmidien pAC34 ja pIFN-a2-P2 hybridiä. Plasmidi pVG3 25 määrää soluresistenssin streptomysiinille, samoin kuin pAYC34 tekee, ja tetrasykliinille ja ampisilliinille kuten pIFN-a2-P2. Plasmidin pVG3 koko on 14,8 tuhatta emäsparia ja se koostuu plasmidien pIFN-2242-P2 (5,4 tuhatta emäsparia) ja pAYC34 (9,4 tuhatta emäsparia nukleotidia) summas-30 ta.

Konjugatiivinen laajan isäntäspektrin omaava plasmidi R 751 insertoitiin yhteen E. coli-kannoista C600, joka sisälsi hybridiplasmidin pVG3. Sarjan konjugatiivisia risteyttämisiä kautta plasmidi pVG3 siirrettiin Pseudomo-35 nas-suvun bakteereihin ja joihinkin muihin gram-negatiivi- κ 82074 siin bakteereihin. Sitten transkonjuganttibakteerit erotettiin selektiivisellä alustalla, joka sisälsi edellä mainitut antibiootit, ja testattiin kykynsä suhteen syntetisoida interferonia.

5 Edellä mainitulla menetelmällä saatuja viljelmiä viljeltiin sitten aerobisissa olosuhteissa 30 °C:ssa L-lie-messä 6-10 tunnin ajan, kunnes saavutettiin solutiheys 2 - 5 x 109 solua/ml. Sitten bakteerit kerättiin linkoamalla, hajotettiin ultraääntä käyttäen ja solu-uutteiden in-10 terferonipitoisuus määritettiin radioimmuunianalyysillä.

Testattiin yhteensä 18 gram-negatiivista bakteerikantaa, jotka kuuluivat sukuihin Escherichia, Salmonella, Methylomonas, Erwinia ja Rhizobium. Pääosan testatuista kannoista havaittiin tuottavan aktiivista interferonia. 15 Pseudomonas sp. VG-84-kanta antoi suurimman tuottavuuden.

Siten edellä määritellyissä olosuhteissa tämän kannan havaittiin tuottavan 5 x 109 - 1 x 1010 AU interferonia litraa kohti viljelynestettä.

Pseudomonas sp. VG-84-kanta on talletettu talletus-20 laitoksen USSR Antibiotics Research Institute mikro-orga- nismikokoelmaan talletusnumerolla 1742. Plasmidin pVG3 sisältävän Pseudomonas sp. VG-84-kannan ominaisuudet ovat seuraavat: 25 Mikroskopiamorfologia liikkuvia gram-negatiivisia sauvasoluja pituudeltaan 3 -5 pm

Morfologia eri välineissä: 30 lihauuteagar muodostaa läpimitaltaan 3-4 mm:n reunoiltaan epäsäännöllisiä pesäkkeitä, joilla on karkea pinta j a vaaleanvihreä väri 24 tunnin viljelyn jälkeen 25 -35 30 °C:ssa 6 82074 lihauuteliemi osoittaa kohtuullista kasvua iskuymppäyksen jälkeen, pääasiallisesti viljelyalustan (substraatin) pinnalla.

5 Kasvaa heikosti ilman ilmastus ta.

minimi ravintoväliaine, muodostaa läpimitaltaan 2-3

Ma, jossa on glukoosia mm:n pyöreitä, harmaan värisiä 10 pesäkkeitä viljelyn toisena päivänä

Fysiologiset ja bio- kasvaa 25 - 35 °C:ssa, optimaa- kemialliset ominaisuudet lisesti 30 °C:ssa pH-arvossa 15 7,0. Hiililähteet: käyttää glu koosia ja arabinoosia. Typpi-lähteet: yhteyttää hyvin. Tarvitsee adeiinia. Resistentti streptomysiinille ja tetrasyk-20 liinille.

Keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan seuraavasti:

Pseudomonas sp. VG-84-kantaa viljellään agarpitoi-25 sessa ravintoalustassa 28 - 30 °C:ssa 8-12 tuntia, minkä jälkeen se ympätään uudelleen nestemäiseen ravintoväliai-neeseen ja ymppiä viljellään voimakkaasti sekoittaen ja ilmastaen 3-6 tuntia 28 °C:ssa. Fermentointi suoritetaan fermentointilaitteessa jossakin nestemäisessä ravintoväli-30 aineessa, joka on tarkoitukseen sopiva ja sisältää hiili-ja typpilähteet, mineraalisuoloja ja kasvutekijöitä jne.; esim. ravintoväliaineessa, joka sisältää glukoosia, hiiva-uutetta tai autolysaattia tai tryptonia tai peptonia tai kaseiinin tai hiivan hydrolysaatteja, tai niiden seoksia. 35 Fermentointi suoritetaan antibioottien, ts. strep tomysiinin tai tetrasykliinin tai näiden kummankin seoksen li 7 82074 läsnäollessa. On edullista, että tetrasykliiniä on läsnä määrässä 30 - 50 mg/1 ja streptomysiiniä 50 - 150 mg/1. Fermentointiprosessin kestoaika on 6 - 10 tuntia 28 - 32 °C:ssa ja pH-arvo on välillä 6,7 - 7,1; voimakkaan ilmas-5 tuksen alaisena. Fermentoinnin kuluessa mitataan bakteeri- suspension optinen tiheys A550, jolloin optisen tiheyden arvo on 5 tai 7 optista yksikköä fermentointiprosessin päättyessä.

Edellä kuvatuissa viljelyolosuhteissa interferonin 10 saanto, osoitettuna radioimmunoanalyysillä tai määrittämällä virusten vastainen aktiivisuus ihmisen fibroblasti-soluviljelyllä, on välillä 5 x 109 - 1,5 x 1010 AU/litra viljelynestettä.

Fermentointiprosessin päättämisen ja edellä maini-15 tun optisen tiheyden saavuttamisen jälkeen bakteerisolut kerätään linkoamalla, suspendoidaan uudelleen sopivaan puskuriin ja hajotetaan ultraäänikäsittelyn tai jonkun muun menetelmän avulla, mistä on tuloksena solujen hajoaminen tai solumembraanin murtuminen, esim. käsittelyllä 20 lysotsyymillä käyttäen ballistisia menetelmiä, jotka käsittävät lasi- tai metallikuulien käytön, käyttäen French press-laitetta jne.

Sitten orgaaninen solujäte erotetaan linkoamalla, minkä jälkeen interferoni erotetaan päällä olevasta ja-25 keesta, joka itse asiassa on solu-uute, käyttäen tunnettuja proteiinin fraktiointi- ja puhdistusmenetelmiä. Homogeenisen interferonin saanto, kuten on osoitettu erilaisilla fysiko-kemiallisilla menetelmillä, on 20 - 60 %, jolloin puhdistussuhde on 200 - 500-kertainen ja näin puh-30 distetun lopputuotteen spesifinen aktiivisuus on 4 x 10® AU.

Puhdistamisen kulkua tarkkaillaan määrittämällä interferonin virusten vastainen vaikutus ihmisen fibroplas-tisoluviljelyllä käyttäen ärsyttimenä rakkula-stomatitis-35 virusta sekä RIA:lla tai ELISA:11a. Puhdistuksesta saatujen interferonivalmisteiden puhtaus testataan immunologi- β 82074 sin, elektroforeettisin, geelisuodatus- ja sedimentointi-menetelmin sekä myös määrittämällä eristetyn lopputuotteen aminohappokoostumus ja N-pääteaminohapposekvenssi.

Näin saaduilla homogeenisilla ihmisen leukosyytti-5 interferoni alfa-2-valmisteilla on kaikki tämäntyyppiselle interferonille spesifiset rakenteelliset ja funktionaaliset ominaisuudet.

Keksinnön mukainen menetelmä on edullinen tunnettuun menetelmään verrattuna sikäli, että korkea aktiivi-10 suustaso on saavutettavissa uuden erittäin tuottavan kannan käytön ansiosta. Siten voidaan saada sama määrä interferonia pienemmästä määrästä biomassaa, mikä myötävaikuttaa alentuneisiin kustannuksiin biomassan eristämiseksi ja hajottamiseksi, samoin koskien kaikkia jälkeentulevia työ-15 vaiheita, jotka liittyvät homogeenisen tuotteen valmistamiseen.

Automaattisesta Edman N-päätesekvenssimääritykses-tä saatujen tietojen mukaisesti Pseudomonas sp. VG-84 tuottajakannan biomassasta eristetyllä homogeenisella in-20 terferonilla on N-pääte-aminohapposekvenssi Cys-Asp-Leu-

Pro-Glu-Thr-His-Ser-, ja se ei sisällä N-pääte-metioniini-jäännöstä, ollen siten täysin samanlainen ihmisen leukosyyttien tuottaman interferonin alfa-2:n kanssa.

Keksinnön selventämiseksi esitetään seuraavat esi-25 merkit ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmista miseksi .

Esimerkki 1

Pseudomonas sp. VG-84-kantaa viljellään 28 °C:ssa 12 tuntia kiinteällä agar-alustalla, jolla on seuraava 30 koostumus: tryptoni 10 g/1; hiivauute 5 g/1; adeniini 80 mg/1; glukoosi 10 g/1; streptomysiini 150 mg/1; tetrasykliini 50 mg/1; tislattu vesi täydentämään 1 litraksi, sekä agar-agar 15 g/1.

35 Biomassaa, joka viljellään edellä mainitulla agar- alustalla, käytetään ympin valmistukseen. Tässä vaiheessa

II

9 82074 biomassasolut siirretään 750 ml:n Erlenmeyer-pulloihin, jotka sisältävät 100 ml edellä määriteltyä viljelyväliai-netta (agar-vapaata), ja viljellään ravistimella 6 tuntia voimakkaan sekoituksen (249 rpm) alaisena 28 °C:ssa. Ymppi-5 viljelyn optinen tiheys on 2 optista yksikköä.

Viljelyprosessl saatetaan tapahtumaan fermentointi-laitteistossa, joka on varustettu lämpötilan, pH:n, sekoi-tusnopeuden ja ilmastuksen säätösysteemeillä ja paineanturilla liuenneen hapen osittaispaineen mittaamiseksi.

10 Tämän tarkoituksen huomioon ottaen ymppiviljely pannaan 5-%:isessa suhteessa fermentointilaitteeseen, joka sisältää ravintosubstraatin, jolla on edellä mainittu koostumus (agar-vapaa), ja viljellään 6 tuntia 28 ± 0,5 °C:ssa pH-arvossa 6,7 - 6,9 voimakkaan ilmastuksen ja se-15 koituksen alaisena. Ilmastus- ja sekoitusolosuhteet vali taan niin, että liuenneen hapen pitoisuus ei rajoita kasvua, mitä tarkoitusta varten hapen osapaine pidetään tasolla 5 - 10 % kyllästymisestä. Nestemäistä ammoniakkia käytetään pH-arvon stabiloimiseen.

20 Biomassan kasvua tarkkaillaan mittaamalla viljely- nesteen optinen tiheys, joka määritetään niinkin tiheään kuin joka tunti. Fermentointi loppuu, kun optinen tiheys A550 saavuttaa 5 optista yksikköä.

Kun fermentointiprosessi on päättynyt, on ihmisen 25 leukosyytti-interferoni alfa-2-pitoisuus 1,5 x 1010 AU lit

raa kohti viljelynestettä. Näin saadun interferonin pitoisuuden määrittämiseksi käytetään RIA:n kiintofaasimuun-nosta, joka käsittää anti-interferoni-kaniinin polyklonaa-listen vasta-aineiden sekä monoklonaalisten hiiri-vasta-30 aineiden, jotka on merkitty 125I-isotoopilla, käytön. Lisäksi interferonin virusten vastainen aktiivisuus määritetään interferonin suojaavalla vaikutuksella rakkula-stomatitis-viruksen sytopaattista vaikutusta vastaan, joka on aikaansaatu ihmisen diploidisten fibroplastien viljelmillä. Ver-35 tailuvalmisteina käytetään interferoni-standardia MRC

B69/19 (Englanti).

10 82074

Solut, jotka kerättiin linkoamalla fermentoinnin jälkeen, käytetään interferonilähteenä. Ne suspendoidaan 0,1 M Tris-puskuriin, jonka pH-arvo on 7,5 (1 g soluja 5 -10 ml:aa kohti puskuria) ja hajotetaan ultraäänihajotti-5 messa. Sitten orgaaninen solujäte erotetaan linkoamalla 30 000 g:ssä ja homogeeninen ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2 eristetään päällä olevasta nesteestä (solu-uutteesta) .

Tuloksena jälkeentulevasta puhdistuksesta saadaan 10 41 %:n saannolla (aktiivisuutena laskettuna) elektrofo- reettisesti homogeeninen ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2-valmiste, jolla on puhdistumissuhde 210 ja sen spesifinen aktiivisuus on 4,0 x 10® AU.

Oheisessa piirroksessa on esitetty arvoja ihmisen 15 leukosyytti-interferoni alfa-2:n elektroforeettisesta ana lyysistä, jossa Ailia on esitetty interferonivalmiste ennen puhdistamista ja B:llä interferonivalmiste puhdistamisen jälkeen, samalla kun vertailuproteiinien molekyylipai-no on esitetty (kD:nä) numeroilla oikealla.

20 Elekroforeesi toteutetaan 12,5-%:isessa polyakryy- liamidigeelissä natriumdodekyylisulfaatin läsnäollessa. Mitä spesifiseen aktiivisuuteen, molekyylipainoon (18,4 kD), aminohappokoostumukseen ja muihin ominaisuuksiin tulee, näin eristetty ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-25 2 ei poikkea millään tavalla ihmisen leukosyytti-interfe roni alfa-2:sta, joka on eristetty muista bakteeri-tuotta-jakannoista.

Esimerkki 2

Menetelmä toteutetaan samalla tavalla kuin esimer-30 kissä 1. Tuottajaa kasvatetaan antibioottien, ts. streptomysiinin ollessa läsnä määrässä 50 mg/1 ja tetrasykliinin määrässä 30 mg/1. 6 tunnin fermentointiprosessin jälkeen bakteerisuspension optinen tiheys on 4,2 optista yksikköä, samalla kun litra viljelynestettä sisältää 7,5 x 109 AU 35 ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:ta.

11 82074

Esimerkki 3

Menetelmä toteutetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, jolloin tuottajaa viljellään antibiootin, ts. tet-rasykliinin ollessa läsnä määrässä 50 mg/1. 5,5 tunnin 5 fermentointiprosessin jälkeen bakteerisuspension optinen tiheys on 5,5 optista yksikköä, samalla kun interferonipi-toisuus litraa kohti viljelynestettä on 9,5 x 109 AU.

Claims (2)

12 82074

1. Menetelmä ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistamiseksi uppoviljelemällä tuottajakantaa, joka 5 sisältää plasmidin, johon on liitetty ihmisen leukosyytti- interferoni alfa-2-geeni, ravintovällaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä, mineraalisuoloja ja kasvutekijöitä, ilmastaen antibioottien läsnäollessa, mitä seuraa lopputuotteen eristäminen ja puhdistaminen, tunnet-10 t u siitä, että tuottajakantana käytetään Pseudomonas-lajia VG-84, jossa on plasmidi pVG3 ja joka on talletettu talletuslaitoksen USSR Antibiotics Research Insitute mik-ro-organismikokoelmaan talletusnumerolla 1742, ja että tuottajakantaa viljellään antibiootin, ts. streptomysiinin 15 tai tetrasykliinin tai näiden seoksen läsnäollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tetrasykliiniä käytetään määrässä 30 - 50 mg/1 ja streptomysiiniä määrässä 50 - 150 mg/1. Il ia 82074