FI82074B - Foerfarande foer framstaellning av humant leukocytinterferon alfa-2. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av humant leukocytinterferon alfa-2. Download PDFInfo
- Publication number
- FI82074B FI82074B FI860099A FI860099A FI82074B FI 82074 B FI82074 B FI 82074B FI 860099 A FI860099 A FI 860099A FI 860099 A FI860099 A FI 860099A FI 82074 B FI82074 B FI 82074B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- interferon
- strain
- plasmid
- human leukocyte
- tetracycline
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 21
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims description 20
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 20
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 12
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 12
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 12
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 12
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 10
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 7
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 5
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 229930190887 Leptomycin Natural products 0.000 claims description 3
- YACHGFWEQXFSBS-RJXCBBHPSA-N leptomycin Chemical compound OC(=O)/C=C(C)/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)/C=C(\C)/C=C/C[C@@H](C)\C=C(/CC)\C=C\[C@@H]1OC(=O)C=C[C@@H]1C YACHGFWEQXFSBS-RJXCBBHPSA-N 0.000 claims description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 32
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 32
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 5
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 4
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 102100039350 Interferon alpha-7 Human genes 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000834102 Ailia Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000589344 Methylomonas Species 0.000 description 1
- 241000863393 Methylophilus methylotrophus Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
1 82074
Menetelmä ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistamiseksi
Keksinnön kohteena on mikrobiologinen teollisuus ja 5 erityisesti sen kohteena on virusten vastaisen vaikutuksen omaavan ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistus ja käyttö lääketieteessä virusetiologian joidenkin laajalti levinneiden tautien estämiseksi ja hoitamiseksi.
Interferonit ovat itse asiassa proteiineja, joita 10 spesifiset ihmissolut syntetisoivat vasteena virusinfek tiolle. Riippuen solutuottajan tyypistä ja interferonien spesifisistä rakenne- ja funktionaalisista piirteistä, ne voidaan jakaa kolmeen perustyyppiin, ts. alfa- eli leukosyytti-interferoniin, jota valkosolut tuottavat; beta- eli 15 fibroplasti-interferoniin, jota sidekudosemosolut tuotta vat; sekä gamma- eli immuuni-interferoniin, jota T-imuso-lut tuottavat.
Paitsi virusten vastaista vaikutustaan interferoneilla on myös lisäkasvua vastustava vaikutus sekä myös 20 vaikutus immuunivasteeseen. Tämä tekee mahdolliseksi pitää interferoniin perustuvia lääkkeitä potentiaalisesti tehokkaana apukeinona joidenkin pahanlaatuisten kasvainten hoitamiseksi .
Nyttemmin on valmistettu erittäin puhtaita ihmisen 25 interferonivalmisteita, jotka ovat itse asiassa 13 - 15 läheisesti samansukuisten proteiinien ryhmä, joita proteiineja kutakin koodaa oma rakennegeeninsä kromosomissa 9.
Eristämällä leukosyytti-interferoni luovuttajan verestä ei kuitenkaan onnistuta aikaansaamaan sen tuotan-30 toa riittävässä määrässä laajaa kliinistä käyttöä varten, koska 1 litran verta sisältämä interferonimäärä on yleensä 105 AU:n sisällä, kun taas interferonin yksinkertainen tehokas annos, joka on tarkoitettu laskimonsisäistä injektiota varten potilaalle, on vähintään 106 AU kokeellisten : : 35 kliinisten havaintojen perusteella.
2 82074
Tekniikan tasolla tunnetaan erilaisia menetelmiä ihmisen leukosyytti-interferonien valmistamiseksi, jotka menetelmät perustuvat lukuisten mikro-organismikantojen käyttämiseen tuottajakantoina, joihin ihmisen interferonin 5 yksittäisiä geenejä on siirretty vektorimolekyylien avul la. Erityisesti käytetään tuottajakantoina bakteerien Escherichia coli, Bacillus subtilis, Methylophilus methy-lotrophus jne. kantoja (vrt. EP-patenttijulkaisu 00062971-A2; julkaistu 1982; Int. Cl. C 12N 15/00).
10 Mikro-organismit, jotka sisältävät plasmidin, jossa on insertoituna ihmisen leukosyytti-interferonigeeni, tuottavat interferonia, kun niitä viljellään aerobisissa uppo-olosuhteissa ravintoväliaineissa, jotka sisältävät hiilen ja typen lähteitä, mineraalisuoloja ja kasvuteki-15 jöitä.
Tekniikan tasolla tunnetaan menetelmä ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistamiseksi (vrt. GB-patenttijulkaisu 2 079 291 A; julkaistu 1982; Cl. C 12N 15/00), jonka mukaisesti käytetään E. coli K-12 kantaa 20 294, joka on saatu insertoimalla yhdistelmäplasmidi pLeIFAtrp2,5, jolloin interferoni alfa-2-geeni on E. coli'n tryptofaanioperonin säätelyalueiden säätelyn alainen.
Edellä mainittua kantaa uppoviljellään ravintoväliaineissa, jotka sisältävät hiili- ja typpilähteitä, mine-25 raalisuoloja ja kasvua stimuloivia aineita antibiootin läsnäollessa.
Interferonisaanto edellä esitetylle tuottajalle on 2,5 x 108 AU/litra viljelynestettä.
E. coli'n käyttöön teollisena tuottajana liittyy 30 kuitenkin joitakin haittoja. E. coli'n katsotaan olevan tavanomaisesti patogeeninen mikro-organismi, samalla kun tämän bakteerin eri kantoja on pysyvästi läsnä ihmisten suoliston mikroflorassa. Tämä tosiasia asettaa erityisen ankarat vaatimukset E. coli'n pohjalta tuotettujen lääk-35 keiden puhdistukselle ja proteiiniepäpuhtauksien ja endo- toksiinien erottamiselle täydellisesti. Tämä puolestaan li 3 82074 tekee interferonin valmistusprosessin kalliimmaksi ja vaikuttaa haitallisesti puhtaan lopputuotteen saantoon. Lisäksi kaikki tähän saakka tunnetut E. coli'n laboratorio-kannat ovat herkkiä fagolyysille, jolloin E. coli'lle tun-5 nostettujen spesifisten fagien lukumäärä nousee moniin satoihin.
Lisäksi edellä esitettyä menetelmää rasittaa myös viljelyn suhteellisen alhainen tuottavuus, minkä johdosta interferonin eristäminen solubiomassasta ja sen myöhempi 10 puhdistaminen kunnes homogeeninen tila saavutetaan, on hyvin työläs prosessi.
Tämän keksinnön ensisijaisena tavoitteena on aikaansaada ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:ta suuremmin saannoin ja aikaansaada yksinkertaistettu menetel-15 mä tuotteen saamiseksi uutta tuottajakantaa käyttäen.
Edellä esitettyyn tavoitteeseen päästään keksinnön mukaisella menetelmällä ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistamiseksi uppoviljelemällä tuottajakantaa, joka sisältää plasmidin, johon on liitetty ihmisen leuko-20 syytti-interferoni alfa-2-geeni, ravintoväliaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä, mineraalisuoloja ja kasvutekijöitä, ilmastaen antibiootin läsnäollessa, mitä seuraa lopputuotteen eristäminen ja puhdistaminen.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, 25 että tuottajakantana käytetään Pseudomonas-lajin VG-84-kantaa, jossa on plasmidi pVG3, ja joka on talletettu talletuslaitoksen USSR Antibiotics Research Institute mikro-organismikokoelmaan talletusnumerolla 1742, ja että tuottajakantaa viljellään antibioottien, ts. streptomysiinin 30 tai tetrasykliinin tai näiden kummankin läsnäollessa. Me netelmässä on edullista, että tetrasykliiniä käytetään määrässä 30 - 50 mg/1 ja streptomysiiniä määrässä 50 - 150 mg/1.
Uuden, erittäin tuottavan kannan Pseudomonas-lajia 35 VG-84 käytöstä johtuen saadaan koneellistetulla ja yksin kertaisemmalla menetelmällä suurempi saanto lopputuotetta.
4 82074
Keksinnön mukaisesti käytetään siis uutta Pseudomo-nas-lajin VG-84-kantaa, johon ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2-geeni on kloonattu osaksi monikopioplasmidia pVG3 bakteriofagin 0X174:n geenin D säätelyalueiden sää-5 telyn alaisena.
Plasmidi pVG3 on laajan isäntäspektrin omaavan mo-nikopiovektoriplasmidin pAYC34 ja plasmidin pIFN-a2-P2 molekyylihybridi, joka sisältää replikonin pBR 322 ja interferoni alfa-2-geenin, ja vastaa soluresissenssistä tet-10 rasykliinille ja ampisilliinille. Plasmidin pIFN-a2-P2 interferoni alfa-2-geeni on bakteriofagin 0X174 geenin D säätelyalueiden säätelyn alaisena. 9,4 tuhannen emäsparin vektoriplasmidi pAYV34 on suhteessa yhteensopimattomuus-ryhmän Inc p-4/Q kanssa ja määrää soluresistenssin strep-15 tomysiinille.
Plasmidia pAYC34 ja pIFN-a2-p2-DNA:ta käsiteltiin Pst l:llä, minkä jälkeen E. coli-kannan C600 kompetentteja soluja transformoitiin tällä seoksella. Sitten transfor-mantit seulottiin täydellisellä ravintoalustalla, joka si-20 sälsi antibiootteja, ts. ampisilliiniä (50 μ/ml), strepto mysiiniä (100 μ/ml) ja tetrasykliiniä (25 μ/ml). Transfor-manttiklooneista löytyi plasmidi-DNA, jota nimitetään pVG3:ksi, ja joka kooltaan ja restriktiokartaltaan vastaa plasmidien pAC34 ja pIFN-a2-P2 hybridiä. Plasmidi pVG3 25 määrää soluresistenssin streptomysiinille, samoin kuin pAYC34 tekee, ja tetrasykliinille ja ampisilliinille kuten pIFN-a2-P2. Plasmidin pVG3 koko on 14,8 tuhatta emäsparia ja se koostuu plasmidien pIFN-2242-P2 (5,4 tuhatta emäsparia) ja pAYC34 (9,4 tuhatta emäsparia nukleotidia) summas-30 ta.
Konjugatiivinen laajan isäntäspektrin omaava plasmidi R 751 insertoitiin yhteen E. coli-kannoista C600, joka sisälsi hybridiplasmidin pVG3. Sarjan konjugatiivisia risteyttämisiä kautta plasmidi pVG3 siirrettiin Pseudomo-35 nas-suvun bakteereihin ja joihinkin muihin gram-negatiivi- κ 82074 siin bakteereihin. Sitten transkonjuganttibakteerit erotettiin selektiivisellä alustalla, joka sisälsi edellä mainitut antibiootit, ja testattiin kykynsä suhteen syntetisoida interferonia.
5 Edellä mainitulla menetelmällä saatuja viljelmiä viljeltiin sitten aerobisissa olosuhteissa 30 °C:ssa L-lie-messä 6-10 tunnin ajan, kunnes saavutettiin solutiheys 2 - 5 x 109 solua/ml. Sitten bakteerit kerättiin linkoamalla, hajotettiin ultraääntä käyttäen ja solu-uutteiden in-10 terferonipitoisuus määritettiin radioimmuunianalyysillä.
Testattiin yhteensä 18 gram-negatiivista bakteerikantaa, jotka kuuluivat sukuihin Escherichia, Salmonella, Methylomonas, Erwinia ja Rhizobium. Pääosan testatuista kannoista havaittiin tuottavan aktiivista interferonia. 15 Pseudomonas sp. VG-84-kanta antoi suurimman tuottavuuden.
Siten edellä määritellyissä olosuhteissa tämän kannan havaittiin tuottavan 5 x 109 - 1 x 1010 AU interferonia litraa kohti viljelynestettä.
Pseudomonas sp. VG-84-kanta on talletettu talletus-20 laitoksen USSR Antibiotics Research Institute mikro-orga- nismikokoelmaan talletusnumerolla 1742. Plasmidin pVG3 sisältävän Pseudomonas sp. VG-84-kannan ominaisuudet ovat seuraavat: 25 Mikroskopiamorfologia liikkuvia gram-negatiivisia sauvasoluja pituudeltaan 3 -5 pm
Morfologia eri välineissä: 30 lihauuteagar muodostaa läpimitaltaan 3-4 mm:n reunoiltaan epäsäännöllisiä pesäkkeitä, joilla on karkea pinta j a vaaleanvihreä väri 24 tunnin viljelyn jälkeen 25 -35 30 °C:ssa 6 82074 lihauuteliemi osoittaa kohtuullista kasvua iskuymppäyksen jälkeen, pääasiallisesti viljelyalustan (substraatin) pinnalla.
5 Kasvaa heikosti ilman ilmastus ta.
minimi ravintoväliaine, muodostaa läpimitaltaan 2-3
Ma, jossa on glukoosia mm:n pyöreitä, harmaan värisiä 10 pesäkkeitä viljelyn toisena päivänä
Fysiologiset ja bio- kasvaa 25 - 35 °C:ssa, optimaa- kemialliset ominaisuudet lisesti 30 °C:ssa pH-arvossa 15 7,0. Hiililähteet: käyttää glu koosia ja arabinoosia. Typpi-lähteet: yhteyttää hyvin. Tarvitsee adeiinia. Resistentti streptomysiinille ja tetrasyk-20 liinille.
Keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan seuraavasti:
Pseudomonas sp. VG-84-kantaa viljellään agarpitoi-25 sessa ravintoalustassa 28 - 30 °C:ssa 8-12 tuntia, minkä jälkeen se ympätään uudelleen nestemäiseen ravintoväliai-neeseen ja ymppiä viljellään voimakkaasti sekoittaen ja ilmastaen 3-6 tuntia 28 °C:ssa. Fermentointi suoritetaan fermentointilaitteessa jossakin nestemäisessä ravintoväli-30 aineessa, joka on tarkoitukseen sopiva ja sisältää hiili-ja typpilähteet, mineraalisuoloja ja kasvutekijöitä jne.; esim. ravintoväliaineessa, joka sisältää glukoosia, hiiva-uutetta tai autolysaattia tai tryptonia tai peptonia tai kaseiinin tai hiivan hydrolysaatteja, tai niiden seoksia. 35 Fermentointi suoritetaan antibioottien, ts. strep tomysiinin tai tetrasykliinin tai näiden kummankin seoksen li 7 82074 läsnäollessa. On edullista, että tetrasykliiniä on läsnä määrässä 30 - 50 mg/1 ja streptomysiiniä 50 - 150 mg/1. Fermentointiprosessin kestoaika on 6 - 10 tuntia 28 - 32 °C:ssa ja pH-arvo on välillä 6,7 - 7,1; voimakkaan ilmas-5 tuksen alaisena. Fermentoinnin kuluessa mitataan bakteeri- suspension optinen tiheys A550, jolloin optisen tiheyden arvo on 5 tai 7 optista yksikköä fermentointiprosessin päättyessä.
Edellä kuvatuissa viljelyolosuhteissa interferonin 10 saanto, osoitettuna radioimmunoanalyysillä tai määrittämällä virusten vastainen aktiivisuus ihmisen fibroblasti-soluviljelyllä, on välillä 5 x 109 - 1,5 x 1010 AU/litra viljelynestettä.
Fermentointiprosessin päättämisen ja edellä maini-15 tun optisen tiheyden saavuttamisen jälkeen bakteerisolut kerätään linkoamalla, suspendoidaan uudelleen sopivaan puskuriin ja hajotetaan ultraäänikäsittelyn tai jonkun muun menetelmän avulla, mistä on tuloksena solujen hajoaminen tai solumembraanin murtuminen, esim. käsittelyllä 20 lysotsyymillä käyttäen ballistisia menetelmiä, jotka käsittävät lasi- tai metallikuulien käytön, käyttäen French press-laitetta jne.
Sitten orgaaninen solujäte erotetaan linkoamalla, minkä jälkeen interferoni erotetaan päällä olevasta ja-25 keesta, joka itse asiassa on solu-uute, käyttäen tunnettuja proteiinin fraktiointi- ja puhdistusmenetelmiä. Homogeenisen interferonin saanto, kuten on osoitettu erilaisilla fysiko-kemiallisilla menetelmillä, on 20 - 60 %, jolloin puhdistussuhde on 200 - 500-kertainen ja näin puh-30 distetun lopputuotteen spesifinen aktiivisuus on 4 x 10® AU.
Puhdistamisen kulkua tarkkaillaan määrittämällä interferonin virusten vastainen vaikutus ihmisen fibroplas-tisoluviljelyllä käyttäen ärsyttimenä rakkula-stomatitis-35 virusta sekä RIA:lla tai ELISA:11a. Puhdistuksesta saatujen interferonivalmisteiden puhtaus testataan immunologi- β 82074 sin, elektroforeettisin, geelisuodatus- ja sedimentointi-menetelmin sekä myös määrittämällä eristetyn lopputuotteen aminohappokoostumus ja N-pääteaminohapposekvenssi.
Näin saaduilla homogeenisilla ihmisen leukosyytti-5 interferoni alfa-2-valmisteilla on kaikki tämäntyyppiselle interferonille spesifiset rakenteelliset ja funktionaaliset ominaisuudet.
Keksinnön mukainen menetelmä on edullinen tunnettuun menetelmään verrattuna sikäli, että korkea aktiivi-10 suustaso on saavutettavissa uuden erittäin tuottavan kannan käytön ansiosta. Siten voidaan saada sama määrä interferonia pienemmästä määrästä biomassaa, mikä myötävaikuttaa alentuneisiin kustannuksiin biomassan eristämiseksi ja hajottamiseksi, samoin koskien kaikkia jälkeentulevia työ-15 vaiheita, jotka liittyvät homogeenisen tuotteen valmistamiseen.
Automaattisesta Edman N-päätesekvenssimääritykses-tä saatujen tietojen mukaisesti Pseudomonas sp. VG-84 tuottajakannan biomassasta eristetyllä homogeenisella in-20 terferonilla on N-pääte-aminohapposekvenssi Cys-Asp-Leu-
Pro-Glu-Thr-His-Ser-, ja se ei sisällä N-pääte-metioniini-jäännöstä, ollen siten täysin samanlainen ihmisen leukosyyttien tuottaman interferonin alfa-2:n kanssa.
Keksinnön selventämiseksi esitetään seuraavat esi-25 merkit ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmista miseksi .
Esimerkki 1
Pseudomonas sp. VG-84-kantaa viljellään 28 °C:ssa 12 tuntia kiinteällä agar-alustalla, jolla on seuraava 30 koostumus: tryptoni 10 g/1; hiivauute 5 g/1; adeniini 80 mg/1; glukoosi 10 g/1; streptomysiini 150 mg/1; tetrasykliini 50 mg/1; tislattu vesi täydentämään 1 litraksi, sekä agar-agar 15 g/1.
35 Biomassaa, joka viljellään edellä mainitulla agar- alustalla, käytetään ympin valmistukseen. Tässä vaiheessa
II
9 82074 biomassasolut siirretään 750 ml:n Erlenmeyer-pulloihin, jotka sisältävät 100 ml edellä määriteltyä viljelyväliai-netta (agar-vapaata), ja viljellään ravistimella 6 tuntia voimakkaan sekoituksen (249 rpm) alaisena 28 °C:ssa. Ymppi-5 viljelyn optinen tiheys on 2 optista yksikköä.
Viljelyprosessl saatetaan tapahtumaan fermentointi-laitteistossa, joka on varustettu lämpötilan, pH:n, sekoi-tusnopeuden ja ilmastuksen säätösysteemeillä ja paineanturilla liuenneen hapen osittaispaineen mittaamiseksi.
10 Tämän tarkoituksen huomioon ottaen ymppiviljely pannaan 5-%:isessa suhteessa fermentointilaitteeseen, joka sisältää ravintosubstraatin, jolla on edellä mainittu koostumus (agar-vapaa), ja viljellään 6 tuntia 28 ± 0,5 °C:ssa pH-arvossa 6,7 - 6,9 voimakkaan ilmastuksen ja se-15 koituksen alaisena. Ilmastus- ja sekoitusolosuhteet vali taan niin, että liuenneen hapen pitoisuus ei rajoita kasvua, mitä tarkoitusta varten hapen osapaine pidetään tasolla 5 - 10 % kyllästymisestä. Nestemäistä ammoniakkia käytetään pH-arvon stabiloimiseen.
20 Biomassan kasvua tarkkaillaan mittaamalla viljely- nesteen optinen tiheys, joka määritetään niinkin tiheään kuin joka tunti. Fermentointi loppuu, kun optinen tiheys A550 saavuttaa 5 optista yksikköä.
Kun fermentointiprosessi on päättynyt, on ihmisen 25 leukosyytti-interferoni alfa-2-pitoisuus 1,5 x 1010 AU lit
raa kohti viljelynestettä. Näin saadun interferonin pitoisuuden määrittämiseksi käytetään RIA:n kiintofaasimuun-nosta, joka käsittää anti-interferoni-kaniinin polyklonaa-listen vasta-aineiden sekä monoklonaalisten hiiri-vasta-30 aineiden, jotka on merkitty 125I-isotoopilla, käytön. Lisäksi interferonin virusten vastainen aktiivisuus määritetään interferonin suojaavalla vaikutuksella rakkula-stomatitis-viruksen sytopaattista vaikutusta vastaan, joka on aikaansaatu ihmisen diploidisten fibroplastien viljelmillä. Ver-35 tailuvalmisteina käytetään interferoni-standardia MRC
B69/19 (Englanti).
10 82074
Solut, jotka kerättiin linkoamalla fermentoinnin jälkeen, käytetään interferonilähteenä. Ne suspendoidaan 0,1 M Tris-puskuriin, jonka pH-arvo on 7,5 (1 g soluja 5 -10 ml:aa kohti puskuria) ja hajotetaan ultraäänihajotti-5 messa. Sitten orgaaninen solujäte erotetaan linkoamalla 30 000 g:ssä ja homogeeninen ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2 eristetään päällä olevasta nesteestä (solu-uutteesta) .
Tuloksena jälkeentulevasta puhdistuksesta saadaan 10 41 %:n saannolla (aktiivisuutena laskettuna) elektrofo- reettisesti homogeeninen ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2-valmiste, jolla on puhdistumissuhde 210 ja sen spesifinen aktiivisuus on 4,0 x 10® AU.
Oheisessa piirroksessa on esitetty arvoja ihmisen 15 leukosyytti-interferoni alfa-2:n elektroforeettisesta ana lyysistä, jossa Ailia on esitetty interferonivalmiste ennen puhdistamista ja B:llä interferonivalmiste puhdistamisen jälkeen, samalla kun vertailuproteiinien molekyylipai-no on esitetty (kD:nä) numeroilla oikealla.
20 Elekroforeesi toteutetaan 12,5-%:isessa polyakryy- liamidigeelissä natriumdodekyylisulfaatin läsnäollessa. Mitä spesifiseen aktiivisuuteen, molekyylipainoon (18,4 kD), aminohappokoostumukseen ja muihin ominaisuuksiin tulee, näin eristetty ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-25 2 ei poikkea millään tavalla ihmisen leukosyytti-interfe roni alfa-2:sta, joka on eristetty muista bakteeri-tuotta-jakannoista.
Esimerkki 2
Menetelmä toteutetaan samalla tavalla kuin esimer-30 kissä 1. Tuottajaa kasvatetaan antibioottien, ts. streptomysiinin ollessa läsnä määrässä 50 mg/1 ja tetrasykliinin määrässä 30 mg/1. 6 tunnin fermentointiprosessin jälkeen bakteerisuspension optinen tiheys on 4,2 optista yksikköä, samalla kun litra viljelynestettä sisältää 7,5 x 109 AU 35 ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:ta.
11 82074
Esimerkki 3
Menetelmä toteutetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, jolloin tuottajaa viljellään antibiootin, ts. tet-rasykliinin ollessa läsnä määrässä 50 mg/1. 5,5 tunnin 5 fermentointiprosessin jälkeen bakteerisuspension optinen tiheys on 5,5 optista yksikköä, samalla kun interferonipi-toisuus litraa kohti viljelynestettä on 9,5 x 109 AU.
Claims (2)
1. Menetelmä ihmisen leukosyytti-interferoni alfa-2:n valmistamiseksi uppoviljelemällä tuottajakantaa, joka 5 sisältää plasmidin, johon on liitetty ihmisen leukosyytti- interferoni alfa-2-geeni, ravintovällaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä, mineraalisuoloja ja kasvutekijöitä, ilmastaen antibioottien läsnäollessa, mitä seuraa lopputuotteen eristäminen ja puhdistaminen, tunnet-10 t u siitä, että tuottajakantana käytetään Pseudomonas-lajia VG-84, jossa on plasmidi pVG3 ja joka on talletettu talletuslaitoksen USSR Antibiotics Research Insitute mik-ro-organismikokoelmaan talletusnumerolla 1742, ja että tuottajakantaa viljellään antibiootin, ts. streptomysiinin 15 tai tetrasykliinin tai näiden seoksen läsnäollessa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tetrasykliiniä käytetään määrässä 30 - 50 mg/1 ja streptomysiiniä määrässä 50 - 150 mg/1. Il ia 82074
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI860099A FI82074C (fi) | 1986-01-09 | 1986-01-09 | Foerfarande foer framstaellning av humant leukocytinterferon alfa-2. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI860099 | 1986-01-09 | ||
| FI860099A FI82074C (fi) | 1986-01-09 | 1986-01-09 | Foerfarande foer framstaellning av humant leukocytinterferon alfa-2. |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI860099A0 FI860099A0 (fi) | 1986-01-09 |
| FI860099A7 FI860099A7 (fi) | 1987-07-10 |
| FI82074B true FI82074B (fi) | 1990-09-28 |
| FI82074C FI82074C (fi) | 1991-01-10 |
Family
ID=8521939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI860099A FI82074C (fi) | 1986-01-09 | 1986-01-09 | Foerfarande foer framstaellning av humant leukocytinterferon alfa-2. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FI (1) | FI82074C (fi) |
-
1986
- 1986-01-09 FI FI860099A patent/FI82074C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI860099A7 (fi) | 1987-07-10 |
| FI860099A0 (fi) | 1986-01-09 |
| FI82074C (fi) | 1991-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7635466B1 (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human fibroblast interferon-like polypeptides | |
| US4680260A (en) | Method for producing human leukocyte interferon alpha-2 | |
| CA2162353A1 (en) | Interferon-.gamma. production inducing polypeptide, monoclonal antibody, and agent for interferon-.gamma. susceptive disease | |
| US4656131A (en) | Method for producing interferons | |
| Goldberg et al. | Molecular cloning of the hemolysin determinant from Vibrio cholerae El Tor | |
| CN118666961A (zh) | 人白蛋白特异结合多肽及其应用 | |
| EP0062971B1 (en) | Genetically modified microorganisms | |
| FI82074B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humant leukocytinterferon alfa-2. | |
| JPS6156199A (ja) | 新規ヒトインタ−フエロンα類 | |
| Atlan et al. | Optimized extracellular production of alkaline phosphatase by lky mutants of Escherichia coli K12 | |
| CN118146335A (zh) | 一种桃蛀螟抗菌肽Gloverin、其编码基因及其表达和应用 | |
| KR930002737B1 (ko) | 인터로이킨-2의 제조방법 | |
| CA1273591A (en) | Production of protein | |
| CN108840934B (zh) | 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| SU1703690A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека | |
| CN1746306B (zh) | 一种重组人干扰素α4编码cDNA序列及其制备方法和应用 | |
| EP0337430B1 (en) | Antitumor antibiotic kedarcidin | |
| CN1057564C (zh) | 能生产活性重组藻胆蛋白的微生物及其制备方法 | |
| RU2045575C1 (ru) | Рекомбинатная плазмидная днк ppr - tgatg - hil - 1 beta - tsr, обеспечивающая синтез рекомбинантного интерлейкина-1 и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека | |
| US4948735A (en) | System for release of proteins from microbe cells | |
| CN109517775A (zh) | 大黄鱼IFNc基因大肠杆菌表达产物的制备方法与应用 | |
| Bornstein-Forst et al. | In vivo D-serine deaminase transcription start sites in wild-type Escherichia coli and in dsdA promoter mutants | |
| CN1113964C (zh) | 人工合成的干扰素α－2b基因在大肠杆菌中的高效表达 | |
| RU2313576C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ ГЕН Ace VIBRIO CHOLERAE И ШТАММ ESCHERICHIA COLI-ПРОДУЦЕНТ ACCESSORY CHOLERAE ENTEROTOXIN VIBRIO CHOLERAE | |
| CN1326992A (zh) | 一种中国人白细胞介素－18亚型(53A rgIL－18)的基因克隆、产物的制备及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: SICOR BIOTECH UAB |
|
| MA | Patent expired |