FI77045C - Foergrenade amider av l-aspartyl-d-aminosyrapeptider. - Google Patents

Description

1 77045 L-aspartyyli-D-aminohappo-dipeptidien sivuketjuisia amideja

Keksintö koskee uusia L-aspartyyli-D-aminohappo-dipeptidiamideja, joilla on kaava I

5 O

NH2 ,|

Ac^nyc\

f II f NHR I

COOH 0 R

10 ja niiden suoloja. Nämä L-aspartyyli-D-seriinin ja L-as-partyyli-D-O-metyyliseriinin amidit ovat erityisen käyttökelpoisia voimakkaiden makeutusominaisuuksiensa vuoksi ja niitä voidaan käyttää elintarvikkeissa ja komponentteina 15 syötäviksi kelpaavissa yhdistelmissä.

US-patenttijulkaisussa 3 492 131 L-aspartyyli-L-fenyylialaniinin tiettyjen alempi alkyyliesterien todettiin olevan jopa 200 kertaa makeampia kuin sakkaroosi ja niiltä puuttui oleellisilta osiltaan katkerat makuvivah-20 teet, jotka olivat aikaisempien keinotekoisten makeutusai-neiden, kuten sakkariinin heikkouksia. Näiden yhdisteiden stabilisuuden todettiin myöhemmin olevan vain rajoitettua vesiseoksissa, johtuen diketopiperatsiinin muodostumisesta erityisesti neutraaleissa - happamissa pH-olosuhteissa, 25 jotka ovat yleisiä useimmissa elintarvikeseoksissa.

Mazur et al.f J. Med. Chem. 16 (1973), s. 1284 ovat esittäneet, että L-aspartyyli-D-alaniinin alempi alkyyliesterien ja eräiden niiden homologien, erityisesti L-aspartyyli-D-alaniini-isopropyyliesterin, makeutustehot 30 ovat enintään 125-kertaiset sakkaroosiin verrattuna.

Sukehiro et ai., Seikatsu Kagaku, 11 (1977), ss.

9 - 16; Chem. Abstr. 87 (1977), s. 16840h, ovat esittäneet tiettyjä L-aspartyyli-D-alaniinin amideja, joilla on kaava

35 ?H2 B

f ^ p ^ NHR1 I II CH-

COOH O J

2 77045 jossa R1 on metyyli, etyyli, n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, isobutyyli, sekundäärinen butyyli, sykloheksyyli tai glysiinin, D-alaniinin tai L-alaniinin metyyliesterin hiilitähde. Voimakkaimpia yhdisteitä olivat yhdisteet, 5 joissa R·*" on jokin edellä mainituista butyyliryhmistä tai sykloheksyyli, ja joiden makeus on vastaavasti 100 - 125-ja 100-kertainen sakkaroosiin verrattuna. Koska n-butyyli-amidin todettiin olevan 125 kertaa makeampi kuin sakkaroosi ja isobutyyliamidi ja sekundäärinen butyyliamidiovat 10 100 kertaa sakkaroosia makeampia, pääteltiin, että näiden amidien tehokkuuteen vaikuttaa pääasiallisesti alkyyliryh-mässä R*· olevien hiiliatomien lukumäärä, ja että alkyyli-ryhmän rakenneisomerismillä on vähäinen vaikutus makeutus-tehoon.

15 Ariyoshi et ai., Bull. Chem. Soc. Japan 47 (1974), s. 326 ovat todenneet L-aspartyyli-D-seriinin ja L-aspar-tyyli-D-treoniinin esterien olevan makeampia kuin vastaavat L-aspartyyli-D-alaniinin ja vastaavasti L-aspartyyli-D-2-aminovoihapon esterit. Voimakkain näistä estereistä, 20 L-aspartyyli-D-seriini-N-propyyliesteri, oli 320 kertaa makeampi kuin 5 %:n sakkaroosistandardi.

US-patenttijulkaisussa 3 971 822 esitetään L-aspar-tyyli-D-alaninolin ja karboksyylihappojen estereitä, mukaan luettuina 2-metyylivoihapon, syklopropaanikarboksyy-25 lihapon, syklobutaanikarboksyylihapon ja 2-metyylisyklo-butaanikarboksyylihapon estereitä. Nämä syklopropaani- ja syklobutaanikarboksyylihappojen esterit olivat vastaavasti 200 ja 220 kertaa sakkaroosia makeampia. 2-metyylisyklobu-taanikarboksyylihapon esteri oli ainoastaan 160 kertaa sak-30 karoosia makeampi. Lisäksi esitetään vastaavat L-aspartyy-li-D-serinoliesterit, joista makein, propionihapon esteri, on 160 kertaa sakkaroosia makeampi.

US-patenttijulkaisuissa 3 959 245 ja 3 907 766 esitetään, vastaavasti, L-aspartyyliaminomalonihappometyy-35 li-2-metyylisykloheksyyli-diesteri ja vastaava alkyyli- fenkyyli-diesteri. Edellisen ilmoitetaan olevan 6600 kertaa sakkaroosia makeamman, jälkimmäisen 4200 - 33000 kertaa sakkaroosia makeamman. Tähän liittyvässä keksijän jul- 3 77045 kaisussa, Chem. Pharm. Bull. 24 (1976), s. 2112 esitetään sarja L-aspartyyliaminomalonihappo-diestereitä, toisen es-teriryhmistä ollessa metyyli tai etyyli ja toisen ollessa jokin erilaisista sivuketjuisista alkyyli- ja sykloalkyy-5 liryhmistä.

Vireillä olevassa FI-patenttihakemuksessamme 810148 on todettu, että ei ainoastaan amidi-substituentin koolla ole ratkaisevaa merkitystä L-aspartyyli-D-alaniini-amidien korkealle makeutusasteelle, vaan päinvastoin ratio kaiseva merkitys on amidi-substituentin R täsmällisellä avaruudellisella sijoittumisella. Tietyillä L-aspartyyli-D-alaniini-amideilla, joissa on sivuketju Qi-hiiliatomin kohdalla (hiiliatomi, jossa on amidi-typpiatomi) ja sivu-ketju myös uudelleen toisen tai kummankin /4- ja /iV-hii-15 liatomin kohdalla, todettiin olevan merkittäviä etuja.

Tämä keksintö kohdistuu uusiin kaavan I mukaisiin sivuketjuisiin L-aspartyyli-D-seriini- ja L-aspartyy-li-D-O-metyyliseriini-dipeptidien amideihin, joilla on odottamattoman korkea makeutusteho ja joilta puuttuvat ei-20 toivottavat makuvivahteet tavanomaisin määrin käytettäes sä. Niiden stabilisuuden on todettu olevan yllättävän hyvän sekä kiinteässä muodossa että vesiseoksissa pH-rajois-sa, jotka vallitsevat useimmissa elintarvikeseoksissa normaalia korkeammissakin lämpötiloissa, joita käytetään lei-25 vonnassa ja tavanomaisessa elintarvikkeiden jatkokäsitte lyssä.

Keksinnön mukaiset uudet yhdisteet ovat L-aspar-tyyli-D-aminohappo-dipeptidiamideja, joilla on kaava I

30 MH O

Γ2 il

I li I NHR

COOH Q Ra ja niiden fysiologisesti hyväksyttäviä kationi- ja happo-additiosuoloja, jossa kaavassa Ra on CI^OH tai Ct^OCH^, 35 4 77045 R on di-isopropyylikarbinyyli, disyklopropyylikarbinyyli tai ryhmä, jolla on kaava (a) tai (b) ^ 3 R H C CH3 ,ί> '> 10 H3C CH3 (a) (b) 3 6 joissa ryhmät R ja R merkitsevät alkyyliä, jossa on 15 1-4 hiiliatomia, ja X on S tai SO-, jolloin hiiliato- 3 6 ^ mien summa ryhmissä R ja R ei ole suurempi kuin 6.

Keksinnön piiriin sisällytetään myös seokset, jotka sisältävät kaavan I mukaisia L-aspartyyli-D-amino-happoamideja, joissa toinen tai kumpikin aspartyyli- tai 20 toinen aminohappo (s.o. seriini tai O-metyyliseriini)-ryhmistä on raseeminen.

Kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa aspartyyli-osa on pelkästään D-konfiguraatiota vastaava tai toinen aminohappo-osa on pelkästään L-konfiguraatiota vastaava, 25 ovat vain hiukan makeita tai eivät ole lainkaan makeita.

Erityisen ensisijaisen kaavan I mukaisten L-as-partyyli-D-aminohappoamidien ryhmän muodostavat yhdisteet, joissa R on asyklinen ryhmä, joka on di-isopropyylikarbinyyli.

30 Toisen erityisen ensisijaisen kaavan I mukaisten L-aspartyyli-D-aminohappoamidien ryhmän muodostavat yhdisteet, joissa R on ryhmä, jolla on kaava (a) tai (b).

Erityisen ensisijaisia kaavan I mukaisia amideja ovat L-aspartyyli-D-seriini-amidit, s.o. yhdisteet, jois-35 sa Ra on Cl^OH.

5 77045

Erityisen ensisijaisia ovat kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa:

Ra on CH2OH ja R on disyklopropyylikarbinyyli, 2,2,4,4-tetrametyyliti-5 etan-3-yyli, 2,2,4,4-tetrametyyli-l,l-dioksoetan-3-yyli; ja yhdisteet, joissa:

Ra on CH2OCH3 ja R on 2,2,4,4-tetrametyylitietan-3-yyli tai 2,2,4,4-tetra-metyyli-1,l-dioksoetan-3-yyli; 10 joiden makeutustehot ovat 200 - 1200 kertaiset sakkaroosiin nähden.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää seoksissa, jotka on tarkoitettu syötäväksi kelpaavien aineiden makeuttamiseen, jotka seokset sisältävät makeuttavan mää-15 rän kaavan I mukaista yhdistettä ja myrkytöntä kantajaa. Erityisen ensisijaisia ovat seokset, jotka sisältävät L-aspartyyli-D-seriini-N-(disyklopropyylikarbinyyli)amidia, L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyylitietan-3-yyli)amidia, jälkimmäisen 1,1-dioksojohdannaista.

20 Lisäksi kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyt tää seoksissa, jotka on tarkoitettu syötäviksi kelpaavien aineiden makeuttamiseen ja jotka sisältävät makeuttavan määrän kaavan I mukaisen yhdisteen ja sakkariinin tai sen fysiologisesti hyväksyttävän suolan seosta.

25 Erityisen edullisia sellaisia seoksia ovat seok set, joiden mainitussa kaavan I mukaisessa yhdisteessä Ra on CH2OH ja R on disyklopropyylikarbinyyli, 2,2,4,4-tetra-metyylitietan-3-yyli tai 2,2,4,4-tetrametyyli-l,1-diokso-tietan-3-yyli. Erityisen ensisijaisia ovat L-aspartyyli-D-30 seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyylitietan-3-yyli)amidin ja mainitun sakkariinin seokset, erityisesti sellaiset, joissa mainittua yhdistettä ja mainittua sakkariinia on läsnä painosuhteessa 1:1 - 1:8.

Fysiologisesti hyväksyttävillä sakkariinin suo-35 loilla tarkoitetaan sakkariinin suoloja fysiologisesti hyväksyttävien kationien kanssa, kuten esim. natrium-, kalium-, kalsium- tai ammoniumsuoloja.

6 77045

Keksinnön mukaisten yhdisteiden fysiologisesti hyväksyttävillä kationisuoloilla tarkoitetaan suoloja, jotka on muodostettu neutraloimalla kaavan I mukaisten yhdisteiden vapaa karboksyylihapporyhmä fysiologisesti hyväk-5 syttävillä metalli-, ammonium ja amiiniemäksillä. Esimerkkejä sellaisista metalleista ovat N-metyyliglukamiini ja etanoliamiini.

Termillä fysiologisesti hyväksyttävät happoaddi-tiosuolat tarkoitetaan suoloja, jotka on muodostettu kaa-10 van I mukaisen yhdisteen vapaan aminoryhmän ja fysiologisesti hyväksyttävän hapon kesken. Esimerkkejä sellaisista hapoista ovat etikkahapoo, bentsoehappo, bromivetyhappo, kloorivetyhappo, sitruunahappo, fumaarihappo, glukonihap-po, maitohappo, maleiinihappo, maliinihappo, typpihappo, 15 fosforihappo, sokerihappo, roeripihkahappo ja viinihappo.

Termi "karbinyyli" tarkoittaa tässä käytettynä ryhmää -CH-. Täten esimerkiksi di-isopropyylikarbinyyli on ryhmä (i-C^H.^ 2-CH- ja disyklopropyylikarbinyyliamiini on (Δ)2chnh2.

20 Uusia kaavan I mukaisia dipeptidiamideja valmis tetaan mukavasti menetelmin, jotka soveltuvat aminohappojen kytkemiseen. Ensisijainen menetelmä kaavan I mukaisten peptidiamidien valmistamiseksi on hahmoteltu seuraa-vassa: NHQ Ra _/ , »* (1) kondensointi L' f\ * b-nh2c«coor11 πro—►

C00RiU COOH

tai karboksyyli-aktivoitu johdannainen

.-^NH0 Ra /—<-NHQ

4θ \ /k RNH? \ X

COOR COHN ^ ^COOH-► COOR10 C0HN^>«C0NHR

(11) y'' (III) / suojauksen poisto (I) 7 77045

Edellä esitetyissä L-aspartiinihappojohdannaisissa Q on jokin hyvin tunnetuista aminosuojaryhmistä, jotka voidaan poistaa selektiviisesti, kuten ryhmistä, joita on selostettu artikkelissa Boissonnas, Advances in Or-5 ganic Chem., 3 (1963), ss. 159 - 190. Erityisen ensisijaisia amino-suojaryhmiä ovat bentsyylioksikarbonyyli ja tert-butyylioksikarbonyyli. R^ on edullisesti alkyyliryhmä, jossa on 1 - 4 hiiliatomia tai bentsyyli. Käytettävä D-se-riini tai D-O-metyyliseriini voi olla vapaan aminohapon 10 muodossa, jossa on vety, mutta lähinnä se on karboksyy- lisuojattu johdannainen, jossa R^ voi olla esteriryhmän tähde, kuten metyyli tai etyyli, mutta on suositeltavimmin silyyliryhmä, kuten trialkyylisilyyli, jossa on 3 - 12 hiiliatomia. Erityisen ensisijainen sellainen ryhmä on tri-15 metyylisilyyli, taloudellisuutensa ja tehokkuutensa vuoksi.

Edellä esitetyn reaktiosarjän ensimmäisessä vaiheessa di-suojattu L-aspartiinihappo kondensoidaan sopivan D-aminohapon tai karboksisuojatun johdannaisen kanssa, jolloin saadaan kaavan II mukaista di-suojattua dipeptidiä.

20 Joskin tämä vaihe voidaan suorittaa di-suojattua aspartii-nihappoa käyttäen kondensointiaineiden, kuten esim. disyk-loheksyylikarbodi-imidin läsnäollessa, suositeltavampaa on käyttää di-suojatun aspartiinihapon <2-karboksyyli-akti-voitua johdannaista. Ensisijaisia sellaisia karboksyyli-25 aktivoituja johdannaisia ovat kloridi, bromidi, anhydridi tai seka-anhydridi. Tehokkuuden kannalta erityisen ensisijaisia ovat edellä mainittujen di-suojattujen L-aspartiinihappo jen seka-anhydridit kloorikarboksyylihapon esterien, erityisesti alkyyliesterien kanssa, joiden mainitussa al-30 kyylissä on 1 - 4 hiiliatomia. Ensisijaisimpia seka-anhyd-ridejä ovat taloudellisista syistä anhydridit, jotka on valmistettu kloorikarboksyylihapon metyyli- ja etyylieste-reistä.

Eräässä ensisijaisessa menetelmässä kaavan I mu-35 kaisten yhdisteiden valmistamiseksi yiS-bentsyyli-N-bents-yylioksikarbonyyli-L-aspartiinihapon annetaan reagoida etyylikloorikarbonaatin kanssa vastaavan seka-anhydridin muodostamiseksi alalla tunnetuin menetelmin. D-aminohappo, 8 77045

RaCH(Nt^JCOOH, jota saadaan kaupallisista lähteistä tai hajottamalla raseeminen aminohappo tunnetuin menetelmin i(ks. esim. Yamada et ai., J. Org. Chem. 38 (1973), s. 4408?, muutetaan erillisessä astiassa trimetyylisilyyliesteriksi 5 saattamalla aminohappo kosketukseen ekvimolaarimäärän kanssa trimetyylisilyylikloridia reaktion suhteen neutraalin orgaanisen liuottimen läsnäollessa; Ra:n ollessa CH20H käytetään tavallisesti 2 mooliekvivalenttia silyloin-tiainetta. Tähän tarkoitukseen sopivia liuottimia ovat 10 esim. pyridiini, dimetyyliformamidi tai dimetyyliasetami- di, erityisen edullinen on dimetyyliformamidi.

Tyypillisessä tämän menetelmän mukaisessa reaktiossa D-aminohappo, esim. D-O-metyyliseriini, liuotetaan dimetyyliformamidiin ja ekvimolaarimäärä trimetyylikloori-15 silaania lisätään huoneen lämpötilassa. Erillisessä astiassa /3-bentsyyli-N-bentsyylioksikarbonyyli-L-aspartiinihap-po ja mooliylimäärin happoa sitovaa ainetta, lähinnä tri-etyyliamiinia liuotetaan seokseen, jossa on dimetyyliform-amidia ja tetrahydrofuraania ja huoneen lämpötilassa tai 20 sitä alemmassa lämpötilassa, lähinnä noin -24 - +25°C:ssa ja erityisesti noin -10 - 0°C:ssa lisätään ekvimoolimäärä etyylikloorikarbonaattia, jolloin muodostuu seka-anhydri-diä. Tähän lisätään esim. D-O-metyyliseriini-trimetyyli-silyyliesterin liuos, lämpötilan ollessa lähinnä samoissa 25 rajoissa. Reaktio on tavallisesti päättynyt 1-2 tunnin kuluessa, minkä jälkeen reaktioseos kaadetaan veteen tai hapon vesiliuokseen, esimerkiksi suolahappoon, ja kaavan IE mukainen tuote uutetaan veden kanssa sekoittamattomalla liuottimena, tyypillisesti kloroformilla, metyleeniklori-30 dilla tai etyylieetterillä ja eristetään standardin mukaisin menetelmin. Di-suojattu dipeptidi (II) on tavallisesti riittävän puhdasta käytettäväksi seuraavassa vaiheessa, mutta sitä voidaan haluttaessa puhdistaa edelleen, esim. kroamtografoimalla kolonnissa.

9 77045 Tämän menetelmän toisessa vaiheessa disuojatun dipeptidin (II) annetaan reagoida ekvimoolimäärän kanssa primääristä amiinia, jonka kaava on RNH2, jolloin saadaan vastaavaa disuojattua dipeptidiamidi-väliyhdis-5 tettä, joka on kaavan (III) mukainen, jossa Ra, R, R10 ja Q ovat aikaisemmin määriteltyjä. Kuten ensimmäisessä vaiheessa reagenssin (II) karboksyylihappomuotoa voidaan käyttää menestyksellisesti käytettäessä kondensointi-aineita, esim. disykloheksyylikarbodi-imidiä, jolloin 10 saadaan kaavan (III) mukaisia väliyhdisteitä. Suositeltavaa on kuitenkin muuttaa kaavan (II) mukainen yhdiste karboksyyli-aktivoiduksi johdannaiseksi, esim. kloridiksi, bromidiksi tai seka-anhydridiksi, jälkimmäisen ollessa ensisijainen. Täten seka-anhydridejä valmistetaan 15 käyttämällä erityisen ensisijaista kaavan (II) mukaista yhdistettä, jossa R10 on bentsyyli ja Q on bentsyyliok-sikarbonyyli. Kuten edellä on mainittu ensisijaisia ovat anhydridit, joita on saatu kloorikarboksyylihapon estereistä ja erityisen ensisijaisia ovat sen metyyli-20 tai etyyliesterit. Yhdisteen (II) seka-anhydridejä valmistetaan käyttämällä reagensseja ja olosuhteita, joita on selostettu edellä tämän reaktiosarjan ensimmäisessä vaiheessa. Tyypillisessä reaktiossa kaavan (II) mukaista yhdistettä ja trietyyliamiinia yhdistetään 25 suunnilleen ekvimoolimäärin reaktion suhteen neutraalissa orgaanisessa liuottimessa, esim. tetrahydrofuraanissa, seos jäähdytetään noin -10°C:seen ja lisätään etyyli-kloorikarbonaattia, jolloin saadaan seka-anhydridiä.

Tähän lisätään sitten ekvimoolimäärä kaavan RNH2 mu-30 kaista amiinia tai sen liuosta, esim. samassa reaktion suhteen neutraalissa liuottimessa ja lämpötilan ollessa rajoissa noin -50 - +25°C, ja lähinnä välillä -35 --5°C. Amiinin lisäyksen päätyttyä reaktioseoksen annetaan lämmetä suunnilleen huoneen lämpötilaan ja sitä 35 pidetään tässä lämpötilassa kunnes reaktio on pääasiallisesti tapahtunut täydellisesti, tavallisesti noin 1-20 10 7 7045 tuntia. Haluttu kaavan (II) mukainen väliyhdiste eristetään sen jälkeen ja puhdistetaan, mikäli halutaan, edellä yhdisteen (II) yhteydessä selostetuin menetelmin.

Tämän menetelmän viimeisessä vaiheessa poistetaan 5 karboksyyli-suojaryhmä, R10 ja amino-suojaryhmä, Q, jolloin saadaan haluttuja kaavan (I) mukaisia makeutusai-neita.

Suojaryhmien poistamiseen kaavan (III) mukaisesta dipeptidiamidista valittava menetelmä vaihtelee riip-10 puen joukosta tekijöitä, jotka ovat alan asiantuntijoille ilmeisiä. Kaksi tärkeätä tekijää tällaisen valinnan suorittamiseksi ovat suojaryhmien R^ ja Q luonne, ja amidi-substituentin R luonne. Esimerkiksi kun R"^ ja Q ovat, vastaavasti, erityisen ensisijaisia bentsyyli- ja 15 bentsyylioksikarbonyyli-ryhmiä eikä R:ssä ole rikkiä, ensisijaisena menetelmänä mainittujen suojaryhmien poistamiseksi on tavallisesti hydrogenolyysi. Kuitenkin kun R^ on bentsyyli tai edellä määritelty alkyyli ja Q on tert-butyylioksikarbonyyli ja R:llä on mikä tahan-20 sa edellä mainituista merkityksistä, tavallisesti on suositeltavaa poistaa suojaryhmät hydrolysoimalla. Hydro-lyysin ja hydrogenolyysin yhdistelmä on suositeltava tapauksissa, jolloin R1^* on alkyyli, Q on bentsyylioksi-karbonyyli eikä R:ssä ole rikkiä.

25 Kun suojaryhmien poistamiseksi kaavan (III) mu kaisesta väliyhdisteestä valitaan hydrogenolyysi, suositeltavaa on, että reaktio suoritetaan katalyyttisen jalometalli-katalyyttimäärän läsnäollessa, palladiumin ollessa erityisen ensisijainen, ja reaktion suhteen 30 neutraalin liuottimen läsnäollessa. Esimerkkejä sellaisista liuottimista ovat pienimolekyyliset alkanolit, kuten metanoli, etanoli, isopropanoli ja n-butanoli; eetterit, kuten tetrahydrofuraani, etyylieetteri, 1,2-dimetoksietaani ja dietyleeniglykoli-dimetyylieetteri; 35 esterit^kuten etyyliasetaatti, metyylipropionaatti ja dimetyylisukkinaatti; ja dimetyyliformamidi. Erityisen ensisijaisia sellaisia liuottimia ovat metanoli ja eta- 11 77045 noli taloudellisista syistä ja tehokkuudesta johtuen. Joskin hydrogenolyysi voidaan suorittaa menestyksellisesti korkeammissa paineissa ja lämpötiloissa, taloudellisuuden ja mukavuuden kannalta suositeltavaa on 5 käyttää noin 1-10 ilmakehän painetta ja huoneen lämpötilaa. Ensisijaisessa lämpötilassa ja paineessa reaktio on tavallisesti päättynyt noin 30 minuutin - noin 6 tunnin kuluttua, minkä jälkeen katalyytti poistetaan tyypillisesti suodattamalla, liuotin haihdutetaan pois 10 ja saatu tuote puhdistetaan haluttaessa standardin mukaisin menetelmin, esimerkiksi kiteyttämällä uudelleen tai kromatografoimalla kolonnissa.

Kun toisen tai kummankin suojaryhmän R10 ja Q poistamiseksi valitaan hydrolyysi, melkoisella menes-15 tyksellä voidaan käyttää mitä tahansa hyvin tunnetuista esterien alkalilla tai hapolla suoritettavista hydro-lysointimenetelmistä ja näiden kaltaisia menetelmiä. Kuitenkin kun suojaryhmät R"^ on poistettava hydrolysoimalla, alkalinen hydrolyysi on ensisijainen, ja eri-20 tyisen ensisijaisia ovat olosuhteet käytettäessä ainakin yhden ekvivalentin verran vahvaa emästä, esim. nat-riumhydroksidia tai kaliumhydroksidia veden ja pienimolekyylisen alkanolin, erityisesti metanolin tai etanolin läsnäollessa huoneen lämpötilassa tai suunnilleen 25 huoneen lämpötilassa. Näissä ensisijaisissa olosuhteissa R^-ryhmän poistuminen hydrolyyttisesti on tavallisesti tapahtunut täydellisesti muutamassa tunnissa tai lyhyemmässä ajassa.

Kun amino-suojaryhmä Q on tert-butyylioksikarbo-30 nyyli , sen poistamiseen on suositeltavaa käyttää hapolla hydrolysointia. Erityisen suositeltava on laimea kloorivetyhapon vesiliuos metanolin tai etanolin läsnäollessa, ja seoksen lämmittäminen kiehuttaen. Näissä olosuhteissa hydrolyysi on tavallisesti tapahtunut 35 täydellisesti muutamassa tunnissa tai lyhyemmässä ajassa.

12 77045

Millä tahansa edellä mainituista hydrolyysime-netelmistä suoritetun suojaryhmien poistamisen jälkeen kaavan (I) mukaisten tuotteiden eristämiseen käytetään standardin mukaisia alalla tunnettuja menetelmiä.

5 Esimerkiksi hapolla hydrolysoinnin jälkeen reaktioseos haihdutetaan kuiviin liuottimen poistamiseksi, vesipitoinen jäännös pestään veden kanssa sekoittumattomalla polaarittomalla liuottimena, esimerkiksi etyylieette-rillä tai kloroformilla, minkä jälkeen vesikerros teh- 10 dään alkaliseksi ja tuote uutetaan veden kanssa sekoittumattomalla liuottimella, kuten esim. etyyliasetaatilla, ja tuote saadaan talteen haihduttamalla liuotin. Haluttaessa tuote voidaan puhdistaa edelleen, esim. kiteyttämällä uudelleen tai kromatografoimalla kolonnissa. Kun 15 suojaryhmän poistamista alkalilla hydrolysoimalla seuraa hydrogenolyysi aminosuojaryhmän Q poistamiseksi, alkalisen hydrolyysin jälkeinen reaktioseos on suositeltavaa neutraloida lisäämällä happoa, esim. suolahappoa, ja neutraloitu reaktioseos hydrogenolysoidaan edel- 20 lä selostetulla tavalla.

Toinen ensisijainen menetelmä tämän keksinnön kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi on esitetty alla.

25

D-QNHCHCOOH + RNH, QNHCHCONHR

- —► tai karboksyyli-aktivoitu (IV) johdannainen

NHQ

30 L /-(

. . . , Ra COOR10 COOH

suoiauksen poisto -►NH2CHCONHR -► (III)—XI) (V) 35 jossa Ra, R, R^ ja Q ovat edellä määriteltyjä.

77045 13

Amino-suojätun D-aminohapon tai sen karboksyy-li-aktivoidun johdannaisen annetaan reagoida ekvimoo-limäärän kanssa amiinia RNHj käyttämällä menetelmiä ja olosuhteita, joita on selostettu edellä väliyhdis-5 teiden (II) ja (III) valmistamiseksi, jolloin saadaan kaavan (IV) mukaista aminosuojattua D-aminohappoamidia. Suojaryhmä Q poistetaan hydrogenolysoimalla tai hydrolysoimalla edellä selostetulla tavalla ja saatu vapaa aminoamidi (V) kondensoidaan disuojatun L-aspartiini-10 happo-johdannaisen tai sen karboksyyli-aktivoidun joh dannaisen kanssa, kuten edellä on selostettu kaavan (II) mukaisten väliyhdisteiden valmistuksen yhteydessä, jolloin saadaan kaavan (III) mukaista disuojattua dipeptidiamidia, josta haluttua kaavan (I) mukaista 15 makeutusainetta saadaan aikaisemmin selostetulla tavalla .

Tämän menetelmän muunnelmassa kaavan (IV) mukainen väliyhdiste, jonka R:ssä on syklinen sulfidi-ryhmä (—S—), voidaan hapettaa vastaavaksi sulfoniksi ennen sen 20 muuttamista väliyhdisteeksi (V) ja myöhempiä edellä selostettuja reaktioita, jolloin saadaan kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R:ssä on sulfoniryhmä.

Kolmannessa ensisijaisessa menetelmässä keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi kaavan (V) mu-25 kaisen D-aminohappoamidin, selostettu edellä, annetaan reagoida L-aspartiinihappo-N-tiokarboksianhydridin kanssa, jolloin saadaan suoraan kaavan (I) mukaisia yhdisteitä. Tätä menetelmää suoritettaessa sopivassa liuottimessa oleva väliyhdiste (V) saatetaan kosketuk-30 siin ekvimoolimäärän kanssa L-aspartiinihappo-N-tiokarbok-sianhydridiä pH:n ollessa lievästi alkalinen ja lämpötilan ollessa välillä noin -25 - +10°C, jolloin saadaan kaavan (I) mukaista yhdistettä. Tätä reaktiota varten pH saadaan alkaliseksi vahvan emäksen, esim. natrium-35 hydroksidin tai kaliumkarbonaatin avulla. Tähän reaktioon sopivia liuottimia ovat liuottimet, jotka liuottavat ainakin osan reagensseista käytettävissä reaktio-olosuhteissa reagoimatta kummankaan reagenssin kanssa 14 77045 olennaisessa määrässä ja mahdollistavat reaktiossa muodostuneiden tuotteiden eristämisen suhteellisen helposti. Esimerkkejä tähän reaktioon soveltuvista sellaisista liuottimista ovat vesi, tetrahydrofuraani, 1,2-dime-5 toksietaani, dietyleeniglykoli-dimetyylieetteri, dime-tyylisulfoksidi, dimetyyliformamidi ja niiden yhdistelmät; ensisijaisia liuottimia ovat vesi ja sen seokset tetrahydrofuraanin kanssa. Ensisijainen alkalinen pH-alue tämän reaktion kannalta on noin 8-10, ja eri-10 tyisen ensisijainen pH on noin 9. Erityisen ensisijainen lämpötila on rajoissa noin -10 - 0°C.

Edellä mainituissa ensisijaisissa olosuhteissa reaktio on tavallisesti tapahtunut loppuun yhden - kahden tunnin kuluessa. Kaavan (I) mukainen tuote eris-15 tetään sitten standardin mukaisin menetelmin, esim., reaktioseoksen pH säädetään tuotteen isoelektriseen pH-arvoon, tavallisesti välille noin 5,0-5,6 kaavan (I) mukaisen tuotteen saostamiseksi, pääosa liuottimesta poistetaan haihduttamalla tai suodattamalla ja raaka 20 aine lietetään orgaaniseen liuottimeen, esim. metano- liin, etanoliin, etyylieetteriin, etyyliasetaattiin tai niiden seoksiin. Kaavan (I) mukainen tuote eristetään sitten, esimerkiksi suodattamalla. Haluttaessa sitä voidaan puhdistaa edelleen, esim. kiteyttämällä uudel-25 leen tai kromatografroimalla kolonnissa.

Tämän keksinnön yhdisteiden makeutusteho määritettiin vertaamalla niiden maun makeutta sakkaroosin makeuteen. Kaavan (I) mukaisen yhdisteen vesiliuoksia, laimennettuina sopiviin konsentraatioalueisiin, verta-30 si sakkaroosi-standardiin asiantuntijoista koottu maku-paneeli. Vertailut suoritettiin yleensä käyttämällä sakkaroosin 7-9-prosenttisia vesiliuoksia, so. liuoksia, joissa oli 7-9 g sakkaroosia/100 ml liuosta. Suuremmilla sakkaroosikonsentraatioilla on selvä makuvaikutelma 35 suussa, joka voi vaikuttaa tuloksiin ja pienemmät sak- karoosikonsentraatiot eivät viittaa normaaleihin käyttötilanteisiin. Jos esimerkiksi 0,014-prosenttinen kaavan (I) mukaisen yhdisteen liuos arvioidaan yhtä makeaksi 15 77045 kuin 7 %:inen sakkaroosi liuos, silloin tuon yhdisteen makeutusteho on 7/0,014 = 500 x sakkaroosin makeutusteho. Kaikki tässä mainitut makeutusteho-arvot, jotka on saatu tämän keksinnön yhdisteillä, määritettiin tällä 5 menetelmällä. Kynnyskonsentraatioiden kohdalla (so.

pienin konsentraatio, jolloin makeus ensin havaittiin, joka sakkaroosin osalta on tavallisesti konsentraatio-alueessa 2-3 %) makeutusaineen, kuten keksinnön yhdisteiden, teho on yleensä kaksi kertaa suurempi kuin se, 10 mikä havaitaan verrattaessa sen maun makeutta 7-9%:isiin sakkaroosiliuoksiin.

Tarvittavat amiinit, jotka ovat kaavan RNH2 mukaisia, jossa R on aikaisemmin määritelty, ovat joko kaupan olevia tai niitä voidaan saada helposti saatavista 15 lähtöyhdisteistä. Esimerkiksi 2-alkyylisykloheksyyli- amiineja ja 2,6-dialkyylisykloheksyyliamiineja voidaan saada hydraamalla katalyyttisesti vastaavia alkyyli-subs-tituoituja aniliineja. Monia amiineista saadaan pelkisty s aminoima 11a vastaavasta ketonista käyttämällä eri-20 laisia alalla tunnettuja olosuhteita. Esimerkiksi voi daan käyttää pelkistysaminointia hyvin tunnetun Leuckhart-reaktion yhteydessä käyttämällä pelkistysaineina muurahaishappoa ja formamidia, katso esimerkiksi selostusta Organic Reactions, Wiley and Sons, New York, Vol. 5, 25 s. 301, 1949. Vaihtoehtoisesti sopiva ketoni voidaan pelkistysaminoida käyttämällä natriumsyaaniboorihydri-diä ja ammoniumasetaattia, katso esim. J.Amer. Chem.

Soc., 93, 2897 (1971), tai ammoniakin etanoliliuoksen avulla hydrauskatalyytin kuten Raney-nikkelin, platinan 30 tai palladiumin läsnäollessa, katso, esim. Organic

Reactions, 4, 174 (1948). Monia kaavan RNH2 mukaisia amiineja saadaan vastaavista ketoneista muodostamalla oksii-mi-väliyhdiste, joka muodostetaan antamalla ketonin reagoida hydroksyyliamiinin tai sen suolojen kanssa alalla 35 hyvin tunnetuissa olosuhteissa. Oksiimi-väliyhdiste pelkistetään sitten hydraamalla katalyyttisesti tai natriumin avulla pienimolekyylisen alkanolin läsnäollessa normaalia 16 77C45 korkeammassa lämpötilassa. Erityisen ensisijaisessa menetelmässä, joka on erityisen käyttökelpoinen pelkistettäessä rikkipitoisten ketonien oksiimeja, oksiimi pelkistetään etanolissa ja käyttämällä mooliylimäärin 5 natriumia seoksen kiehumislämpötilassa.

Tarvittavat amiinien RNF^ ketoni-lähtöyhdisteet ovat joko kaupan olevia alalla tunnettuja tai niitä valmistetaan tunnetuin menetelmin.

Kaavan RNHj mukaisia amiineja, joissa R on ai-10 kaisemmin määritelty, saadaan myös hyvin tunnetun

Hofmann'in reaktion avulla suorittamalla sopivan karboksi-amidin konversio alkalimetallihypohalitin kanssa.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä tai niiden amidiväli-yhdisteitä, joissa R on ryhmä, jolla on kaava (b), jossa 15 X on SO2, saadaan vastaavista yhdisteistä, joissa X on hapettamalla ja käyttämällä reagensseja ja olosuhteita, joissa sulfideista tiedetään muodostuvan sulfoneja.

Kaavan I mukaisen yhdisteet ja niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat tarjoavat etuja makeutusaineina suu-20 ren tehokkuutensa, fysikaalisen muotonsa ja stabilisuuten-sa vuoksi. Ne ovat tavallisesti kiteisiä, eivät ole hygroskooppisia, ovat veteen liukenevia kiinteitä aineita. Niiden ainutlaatuisena tyypillisenä ominaisuutena on, että ne ovat makean makuisia, vailla ei-toivottavia kitke-25 riä tai karvaita makuvivahteita tavanomaisilla käyttömäärillä. Niitä voidaan edullisesti käyttää syötäväksi kel-paavien aineiden makeuttamiseen.

Termi "syötäväksi kelpaavat aineet" tarkoittaa tässä käytettynä kaikkia myrkyttömiä aineita, joita ihmi-30 set tai muut elolliset olennot voivat käyttää kulutukseen kiinteässä tai nestemäisessä muodossa. Kuvaavia sellaisia aineita ovat elintarvikkeet, mukaan lukien ravintoaineista valmistetut ruokavalmisteet, purukumi ja virvoitusjuomat; elintarvikkeiden lisäaineet, mukaan lukien mauste- ja 35 väriaineet, samoin kuin makua korostavat aineet; ja farmaseuttiset valmisteet.

Seuraavassa on esitetty eräitä valmistusesimerk-kejä tällaisista syötäviksi kelpaavista aineista.

i7 7 / C 4 b

Valmiste-esimerkki 1

Hyytelöjälkiruokaa valmistetaan seuraavan yhdistelmän ja menetelmän mukaisesti: aineosat grammaa 5 Gelatin 225 Bloom 7,522

Sitruunahappo 1,848

Natriumsitraatti 1,296

Mansikkamauste 0,298 L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetra-10 metyylitietan-3-yyli)amidi 0,036

Kiehuva vesi 240,000

Kylmä vesi 240,000 491,000

Sekoita ensin viisi ensimmäistä aineosaa, lisää 15 kiehuvaan veteen ja sekoita täydelliseen liukenemiseen asti. Lisää kylmä vesi ja sekoita vilkkaasti. Siirrä seos annoskulhoihin ja jäähdytä kunnes seos on hyytynyt .

Valmiste-esimerkki 2 20 Leivinkakku

Erittäin miellyttävä vaniljakakku valmistettiin käyttämällä seuraavaa reseptiä:

Aineosat grammaa

Emulgoitu rasva 16,09 25 Vesi 20,83

Munat 23,00

Natriumvetykarbonaatti 1,10

Vaniljauute, yksinkertainen 0,28

Glukono-delta-laktoni 1,75 30 Polydekstroosi , 70 %:inen vesiliuos 80,00 ö . . . .. (U.S. 3 766 165) ,

Rasvaton kuivamaxto 2,50

Kakkujauho 56,20

Kokomaitoj auhe 0,80

Vehnätärkkelys 1,40 35 L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetra- metyylitietan-3-yyli)amidi 0,05 204,00 77045 18

Yhdistä rasvaton kuivamaito, kokomaitojauhe, polydekstroosiliuos ja emulgoitu rasva. Sekoita alhaisella nopeudella kunnes seos on kermamainen ja tasalaatuinen (noin 3 minuuttia), lisää munat ja vatkaa kunnes 5 seos on saatu homogeeniseksi kermamaiseksi seokseksi. Liuota makeutusaine veteen, lisää liuos kermamaiseen homogeni saatti in ja sekoita 2-3 minuuttia. Lisää jäljellä olevat aineosat ja sekoita kunnes seos on kermamainen ja tasalaatuinen (3-5 minuuttia). Pane 120 g taiki-10 naa pieneen esivoideltuun pannuun ja paista 350°F:ssa (176°C) 30 minuuttia.

Valmiste-esimerkki 3 Säilykepäärynät

Tuoreet päärynät pestään, kuoritaan, poistetaan 15 siemenkodat, leikataan viipaleiksi ja upotetaan vesi-liuokseen, jossa on 0,05 paino-% askorbiinihappoa. Leikattu hedelmä pakataan kierrekansitölkkeihin ja tölkit täytetään siirapilla, joka sisältää seuraavat aineosat: Paino-% 20 Sorbitoli 25,000 L-aspartyyli-D-seriini-N-(2 ,2,4,4-tetrame- tyyli-tietan-3-yyli)amidi 0,025

Sitruunahappo 0,125

Vesi g.s, 25 100,000 Tölkkien kannet kierretään löysästi kiinni ja tölkit sijoitetaan autoklaaviin, jossa on kuumaa vettä ja käsitellään siinä 100°C:ssa 45 minuutin ajan. Tölkit otetaan pois, suljetaan heti kiristämällä kannet 30 kiinni ja annetaan jäähtyä.

19 77045

Valmiste-esimerkki 4

Virvoitus j uomaj auhekonsentraatti Aineosat Paino-%

Sitruunahappo 31,78 5 Natriumsitraatti 5,08

Mansikkamauste 57,72

Strawberry FD- ja C-väri Q,54 L-aspartyyli-D-O-metyyliseriini-N-(2,2,4,4- tetrametyylitietan-3-yyli)amidi 2,44 10 Karboksimetyyliselluloosa 2,44 100,00

Yhdistä kaikki aineosat sekoittimessa ja sekoita kunnes seos on homogeeninen. Käyttöä varten 1,73 g virvoitus juomaj auhekonsentraattia liuotetaan 4 nesteuns-15 siin (118 ml) vettä.

Valmiste-esimerkki 5 Ruokavalio-opillinen kovamakeinen Kovamakeisia valmistetaan seuraavan yhdistelmän ja menetelmän mukaisesti: 20 Aineosat grammaa L-aspartyyli-D-seriini-N-(disyklopropyyli-karbinyyli)amidi 0,59

Vesi 4,00 FD ja C Red 40 (10 % vesiliuos) 0,30 25 Kirsikkamauste 0,60

Sitruunahappo 6,00

Polydekstroosi (U.S. 3 766 165) 420,00

Vesi 180,00

Makeutusaine liuotetaan pienessä dekanterilasis-30 sa veteen, lisätään väriaine, mauste ja sitruunahappo ja sekoitetaan hyvin liukenemiseen asti. Polydekstroosi ja vesi yhdistetään erillisessä dekanterilasissa. Sekoitetaan lämmitettäessä 140°C:seen, sitten annetaan jäähtyä 120 - 125°C:seen. Pienestä dekanterilaisista 35 lisätään muut aineosat ja sekoitetaan tai vatkataan perusteellisesti. Massa siirretään öljypinnoitteisel-le marmorilevylle ja annetaan jäähtyä 75-80°C:seen. Massa ajetaan öljy pinnoitteisen painotelan läpi.

77045 20 Käytettäessä 0,49 g L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli-l,l-dioksotietan-3-yyli)amidia tai 2,33 g L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrame-tyyli-3-pentyyli)amidia makeutusaineena L-aspartyyli-5 D-seriini-N-(disyklopropyylikarbinyyli)amidin asemesta, saadaan samanlaisia tuloksia.

Valmiste-esimerkki 6

Hiilihappopitoinen Cola-juoma Hiilihappopitoista cola-juomaa valmistettiin 10 alla esitetyn koostumuksen mukaisesti. Saadun juoman arvosteltiin omaavan makeusintensiteetin, joka oli verrattavissa 11 % sakkaroosia sisältävän kontrolli-juoman makeusintensiteettiin.

Aineosa Paino-% 15 Kofeiini (1-prosenttinen vesiliuos) 0,700 L-aspartyyli-D-seriini-N-(cis,trans-2,6- dimetyylisykloheksyyli)amidi (10 % vesi- liuos) 0,540

Cola-maustekonsentraatti 0,080 20 Fosforihappo (50 % vesiliuos) 0,040

Sitruunahappo (50 % vesiliuos) 0,066

Natriumsitraatti (25 % vesiliuos) 0,210

Karamelliväri (25 % vesiliuos) 0,370

Sitruunaöljyuute 0,012 25 Citrus limetta-kuoriöljyuute 0,021

Hiilihappopitoinen vesi (3,5 til-% hiilidioksidia) g »s.

100,000

Korvaamalla edellä esitetyssä reseptissä L-aspar-30 tyyli-D-seriini-N-(cis,trans-2,6-dimetyylisykloheksyy- li)amidi 0,090 %:lla 10-%:ista L-aspartyyli-D-seriini-happo-N-(disyklopropyylikarbinyyli)amidin vesiliuosta tai 1,35 %:lla 10-%:ista L-aspartyyli-D-O-metyyliserii-ni-N-(disyklopropyylikarbinyyli)amidin vesiliuosta, 35 saadaan laadultaan samanlaisia hiilihappopitoisia cola-juomia.

21 77045

Valmiste-esimerkki 7 Jähmetetty jälkiruoka Vähäsokerista vanilja-jähme-jälkiruokaa valmistetaan seuraavan yhdistelmän ja tavanomaisen käytännön 5 mukaisesti.

Aineosa Paino-%

Kuohukerma (35 % voirasva) 23,00

Rasvaton kiinteä maitoaine 10,50

Mono- ja diglyseridi-emulgaattori 0,25 10 Polydekstroosi (U.S. 3 766 165) 11,20

Vesi 54,49 L-aspartyyli-D-O-metyyliseriini-N-(2,2,4,4- tetrametyyli-1,l-dioksotietan-3-yyli)amidi 0,06

Gelatiini (225 Bloom) 0,50 15 100,00

Keksinnön yhdisteistä voidaan valmistaa erilaisia muotoja, jotka soveltuvat käytettäviksi makeutus-20 aineina. Tyypillisiä käyttökelpoisia muotoja ovat kiinteät muodot, kuten jauheet, tabletit, rakeet ja pastillit; ja nestemäiset muodot, kuten liuokset, suspensiot, siirapit, emulsiot samoin kuin muut yleisesti käytettävät muodot, jotka erityisesti soveltuvat syötäväksi kel-25 paavien aineiden yhteyteen. Näitä muotoja voivat olla kaavan I mukaiset yhdisteet tai niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat joko sellaisinaan tai myrkyttömien makeutusainekantajien yhteydessä, so. myrkyttömien aineiden kanssa, joita yleisesti käytetään makeu-30 tusaineiden yhteydessä. Sellaisia sopivia kantajia ovat nesteet, kuten vesi, etanoli, sorbitoli, glyseroli, sitruunahappo, maissiöljy, maapähkinäöljy, soijapapuöl-jy, seesamöljy, propyleeniglykoli, maissisiirappi, vaah-terasiirappi ja nestemäinen parafiini, ja kiinteät ai-35 neet, kuten laktoosi, selluloosa, tärkkelys, dekstriini, 77045 22 modifioidut tärkkelykset, polysakkariditt kuten poly-dekstroosi (kts. esim. US-patenttijulkaisut 3 766 165 ja 3 876 794), kalsiumfosfaatti (mono-, di- tai kolmiemäk-siset) ja kalsiumsulfaatti.

5 Samalla tavalla käyttökelpoisia ja sekoittuvia ovat seokset, jotka sisältävät keksinnön yhdistettä tunnetun makeutusaineen yhteydessä, kuten esim. sakkaroosin, sakkariinin, syklamaatin, L-aspartyyli-L-fe-nyylialaniini-metyyliesterin ja näiden kaltaisten ainei-10 den yhteydessä, jotka soveltuvat syötäväksi kelpaavien aineiden makeuttamiseen. Erityisen käyttökelpoisia ovat kaavan (I) mukaisten yhdisteiden ja sakkariinin tai sen fysiologisesti hyväksyttävän suolan, esim. sakkariinin natrium-, kalium-, kalsium- tai ammoniumsuolan 15 seokset. Mainituissa seoksissa sakkariinin kanssa kaa van (I) mukaiset yhdisteet vähentävät tai peittävät täysin sakkariinin hyvin tunnetun katkeran, ei-toivottavan jälkimaun.

Erityisen käyttökelpoisia sellaisia makeutusai-20 neseoksia ovat seokset, jotka sisältävät sakkariinia seoksena kaavan (I) mukaisten yhdisteiden kanssa, jotka ovat makeudeltaan ainakin 400 kertaa sakkaroosia makeampia, erityisesti yhdisteiden kanssa, joissa Ra on CH20H ja R on disyklopropyylikarbinyyli, 2,2,4,4-tetra-25 metyylitietan-3-yyli tai 2,2,4 ,4-tetrametyyli-l,1- dioksotietan-3-yyli. Erityisen ensisijaisia ovat sellaiset sakkariinin ja L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,- 4,4-tetrametyylitietan-3-yyli)-amidin seokset, erityisesti sellaiset seokset, jotka sisältävät jälkimmäistä 30 kaavan (I) mukaista yhdistettä ja sakkariinia painosuh-derajoissa 1:1 - 1:8. Nämä seokset eivät ainoastaan ole maultaan miellyttävän makeita katkeran jälkimaun olennaisesti puuttuessa, vaan ne ovat yllättäen merkittävästi makeampia kuin seoksen yksittäisten aineosien 35 makeuksien summa. Toisin sanoen niillä on synergistinen 23 7 7 0 4 5 vaikutus, makeuden ollessa jopa 50 % laskettua suurempi. Sakkariinin tai sen suolojen ja L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyylitietan-3-yyli)amidin seoksissa, joissa niiden suhteet eivät ole edellä mainituissa rajoissa, 5 synergistinen vaikutus on huomattavasti heikompi.

Seuraavat valmiste-esimerkit kuvaavat kaavan I mukaista yhdistettä sisältäviä makeutusaineita. Valmiste-esimerkki 8 Vähäkalorisia pöytämakeutusaineita valmistetaan 10 seuraavien yhdistelmien mukaisesti: A. Makeutusaineen jauhemuotoa valmistetaan sekoittamalla keskenään seuraavat aineosat.

Aineosat Paino-% L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetra-15 metyyli-l,l-dioksotietan-3-yyli)amidi 0,42

Kiteinen sorbitoli 49,52

Dekstriini (dekstroosi-ekvivalentti 10) 50,00

Mononatriumglutamaatti 0,02

Glukono-delta-laktoni 0,02 20 Natriums!traatti 0,02 100,00

Yksi gramma saatua seosta vastaa makeudeltaan kolmea grammaa sakkaroosia.

25 B. Pöytämakeutusaineen nestemuotoa valmistetaan seuraavasti.

Aineosat Paino-% L-aspartyyli-D-seriini-N-(disyklopropyyli- karbinyyli)amidi 0,17 30 Vesi 99,73

Natriumbensoaatti 0,10 100,00

Yksi gramma saatua liuosta vastaa makeudeltaan noin 1,2 grammaa kiteistä sakkaroosia.

24 77045

Kun edellä osassa A käytettävänä kaavan (I) mukaisena makeutusaineena on 0,83 g L-aspartyyli-D-se-riini-N-(2,2 ,4,4-tetrametyylitietan-3-yyli)amidin ja natriumsakkariinin l:4-seosta, saadaan vastaavia 5 tuloksia. Samalla tavalla kun edellä osassa B käytetty L-aspartyyli-D-seriini-N-(disyklopropyylikarbinyyli)-amidi korvataan 0,34 grammalla saman yhdisteen ja natriumsakkariinin 1:6 (paino-%) seosta, saadaan vastaavaa nestemäistä pöytä-makeutusainetta.

10 Valmiste-esimerkki 9 L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli-tietan-3-yyli)amidin, CH, CH-</ 3 15 ^(1) , Ra = CH20H, R = —) ja sakkariinin synergistisiä CH^ CHj seoksia

Valmistettiin L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyylitietan-3-yyli)amidin ja natriumsakkariinin 20 seoksia ja arvioitiin maun hyväksyttävyyttä ja makeus-intensiteettiä vertaamalla sakkaroosi-standardi-vesi-liuoksiin. Seosten teoreettisen makeuden laskemiseksi natriumsakkariinin ja keksinnön mukaisen yhdisteen (I, Ra = CH20H, (CH3>2 25 J.

R = _ζ S ) makeutustehotekijöinä

V

(CH3)2 käytettiin tekijöitä 300 ja vastaavasti 1200 x sakka-30 roosin makeus. Suoritettiin joukko makupaneelin arviointeja vertaamalla koesekoitusten vesiliuoksia sakkaroosin vesiliuoksiin alueella 6-12 % (paino/til.) ja 0,033 %:n natriumsakkariiniliuokseen. Tulokset on koottu seu-raavaan taulukkoon.

25 770 4 5

Seos, paino-% lί, rSo^OH, ^3 *2 Makeus c R = —<Γ 7 Natrium- Teto x sakkaroosi Syner- Maun sakka- (T)Teor. (A) Todell. gia-% laatu «”3)2 riinl _ 1 : 1 750 1125 50 puhdas, makea, ei katkera 1Q 1 : 2 600 900 50 sama 1 : 4 480 720 50 sama 1:6 430 580 35 sama 1 ; 8 400 520 30 makea, juuri havaittava metallinen 1 _ maku

Ib 1 : 9 390 makea, lievästi metallinen maku 1 : 10 381 makea, lievä - kohtalainen metallinen 20 maku

Synergia-% laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti:

Synergia-% = — x 100

T

25 jossa A on todellinen makeus määritettynä laskemalla makupaneelin tulosten keskiarvo ja T on teoreettinen makeus, joka on määritetty seosten koostumuksesta painon perusteella, esim. seoksen 1:4 teoreettinen makeus on (1/5 x 1200) + (4/5 x 300) = 480.

3q Tuloksista nähdään, että seoksien 1:1 - 1:8 osalta makeusteho lisääntyy odottamattoman paljon, 30-50%. Vaikkakin suhteiden ollessa suurempia näytti esiintyvän synergiaa, sakkariinista johtuva metallinen maku häiritsi tarkkaa määritystä. Lisäksi sakkariinin hyvin 25 tunnettu katkera jälkimaku peittyi täysin seoksissa 1:1-1:6 ja katkeruus peittyi tehokkaasti seoksiin 26 7 7 0 4 5 saakka, joissa oli yksi osa L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyylitietan-3-yyli)amidia ja 8 osaa natriumsakkariinia.

L-aspartyyli-D-seriini-N- (2,2,4 ,4-tetrametyyli-5 tietan-3-yyli)amidi/natriumsakkariini-seoksen 1:8, konsentraation ollessa 0,0192 % (paino/til.), todettiin vastaavan makeudeltaan 10-%:ista (paino/til.) sak-karoosiliuosta ja sakkariini/syklamaatti-seosta 1:10, konsentraation ollessa 0,117 % (paino/til.).

10 Lisäksi suoritetussa aistiarvioinnissa trian- gelikokeessa, jossa harjaantuneille koepaneelin jäsenille tarjottiin kolme näytettä, joina olivat edellä mainitut vesiliuokset, joissa oli seoksena 1:8 keksinnön yhdiste/natriumsakkariini, konsentraation olles-15 sa 0,0192 % ja seoksena 1:10 sakkariini/syklamaatti, konsentraation ollessa 0,1177 %. Paneelin jäseniä pyydettiin löytämään kaksi samanlaista näytettä ja ilmaisemaan mahdollinen paremmuus. Seitsemän kymmenestä koepaneelin jäsenestä ei kyennyt moitteettomasti erot-20 tamaan toisistaan kahta makeampaa seosta.

Heistä ne, jotka moitteettomasti löysivät kaksi samanlaista näytettä, arvioivat noiden kahden seoksen välisen eroavuuden olevan "hyvin lievän" tai "juuri havaittavan".

25 Nämä tulokset osoittavat, että mitään merkittä vää eroa ei ole seoksen 1:8 keksinnön yhdiste/sakkarii-ni ja seoksen 1:10 sakkariini/syklamaatti välillä.

Toistettaessa edellä esitetty menettely käytetyn keksinnön yhdisteen ollessa kuitenkin kaavan (I) 30 mukainen, jossa Ra on C^OCH^ ja R on (CH3>2 Whh -<> tai <^>2 (CH3)2 (ch3)2 27 77045 tai jossa Ra on CH20H ja R on (ch3)2 -<C^S02 tai -CH-(/\>2 (CH3,2 saadaan samanlaisia tuloksia.

Makeuttava määrä kaavan I mukaista yhdistettä tai sen fysiologisesti hyväksyttävää suolaa pelkkänä tai yhdistelmänä myrkyttömän kantajan tai tunnetun makeutusai-10 neen kanssa voidaan lisätä esimerkiksi seuraaviin syötäväksi kelpaaviin yhdistelmiin: hedelmät, vihannekset, mehut, lihatuotteet, kuten kinkku, pekoni ja makkara; mu-natuotteet, hedelmäkonsentraatit, gelatiinit ja gelatiini-maiset tuotteet, kuten hillot, hyytelöt, säilykkeet jne.; 15 maitotuotteet, kuten jäätelö, hapan kermajäätelö ja sorbetti jäätelö; sokerikuorrutukset, siirapit, melassit mukaan luettuina; maissi-, vehnä-, ruis-, soijapapu-, karua-, riisi- ja ohra-tuotteet kuten leipä, hiutaleet, tahtaat, kakku ja kakkuseokset; kala, juusto ja juusto-20 tuotteet, pähkinät ja pähkinätuotteet, virvoitusjuomat kuten kahvi, tee, hiilihappoiset ja hiilihapottomat alkoholittomat juomat, oluet, viinit ja muut nesteet; sokeroidut valmisteet kuten makeiset ja hedelmänmakui-set pastillit; mausteet kuten yrtit, aromiaineet ja 25 höysteet, makua korostavat aineet kuten mononatriumglu-tamaatti ja purukumi. Pikamakeutusaineilla on käyttöä myös valmispakkaustuotteissa kuten ruokavalio-makeutus-aineissa, neste-makeutusaineissa, rakeistetuissa maku-aineseoksissa, jotka vedessä hajotessaan muodostavat 30 hiilihapottomia juomia, pikavanukasseoksissa, pikakahvissa ja teessä, kahvin vaalennusaineissa, imelletyissä maitoseoksissa, kotieläinten elintarvikkeissa, karjan rehussa, tupakka- ja kulutustoalettitarvikkeissa, kuten suuvesissä ja hammastahnoissa samoin kuin paten-35 toiduissa ja patentoimattomissa farmaseuttisissa valmisteissa ja muissa elintarvike-, lääke- ja sekalaisia valmisteita valmistavien teollisuuksien tuotteissa.

77045 28

Erityisen ensisijaisia makeutettuja nautittaviksi kelpaavia seoksia ovat hiilihappoiset virvoitusjuomat, jotka sisältävät yhtä tai useampaa tämän keksinnön mukaista pikamakeutusainetta.

Kaavan I mukaiset L-aspartyyli-S-aminohappo-di-peptidiamidit ovat käyttökelpoisia myös samoihin tarkoituksiin, joita on esitetty seuraavissa L-aspartyyli-L-fenyylialaniini-metyyliestereihin liittyvissä patenteissa ja patenttihakemuksissa. Näissä käyttötarkoituksissa niillä on ne edut, jotka on esitetty valmistettaessa dipeptidi-esteriä samoin kuin niiden aikaisemmin mainitut edut sta-bilisuus ja tehokkuus huomioiden.

BE-patentit n:o 830 020 838 938 863 138 882 672 GB-patentti n:o 1 464 571 JP-Kokai-julkaisu n:o 77-04 176 FR-patentti n;o 2 338 651 CH-patentti n:o 590 615 US-patentit n:o 3 642 491 3 971 857 3 865 957 3 761 288 3 982 023 3 800 046 4 001 456 3 818 077 4 004 039 3 829 588 4 007 288 3 875 311 4 031 258 3 875 312 4 036 992 3 886 295 4 051 268 3 922 369 4 059 706 3 934 048 4 122 195 3 947 600 4 139 636 3 955 000 4 143 170 3 956 507 4 153 737 29 77045 CA-patentit n:o 1 026 987 1 027 113 1 028 197 5 1 043 158 1 046 840 NL-patenttihakemukset n:o 73-04 314 73-11 307 10 75-14 921 76-05 390 76-08 963 DE-patenttihakeraukset n:o 2 438 317 15 2 456 926 2 509 257 2 518 302 2 609 999 2 646 224 20 2 713 951

Esimerkki 1 L-aspartyyli-D-seriini-N-(disyklopropyylikarbi-nyyli) amidi

25 A

I, Ra = CH20H, R =

A.) D-H0CH-CHC00H V

2\ NHCbz 30 Liuos, jossa oli 4,41 g (0,042 moolia) D-serii- niä 21 ml:ssa 2-norm, natriumhydroksidia, jäähdytettiin 5-10°C:seen, pH säädettiin väkevällä suolahapolla välille 10,0-11,5 ja 1,5 tunnin kuluessa lisättiin annoksittain 6,9 ml (0,048 moolia) bentsyyliklooriformi-35 aattia samanaikaisesti, kun lisättiin 2-norm, natriumhydroksidia seoksen pH:n pitämiseksi edellä mainituissa rajoissa. Seosta sekoitettiin yön ajan huoneen 30 77045 lämpötilassa, pestiin etyylieetterillä ja vesifaasi tehtiin happameksi (pH 2,5-3,0) 6-norm. suolahapolla. Uuttamalla etyyliasetaatilla, pesemällä uutteet suolaliuoksella ja kuivaamalla (MgSO^) saatiin 3,14 g tuo-5 tetta värittömänä kiinteänä aineena, joka kiteytettiin uudelleen 20 mlrsta etyyliasetaattia, jolloin saatiin 2,64 g tuotetta, 0,43 ^ohutkerroskromatografi-ointi (TLC), etyyliasetaatti/heksaani/etikkahappo, 9:9:2, til.suhde^.

10 b.) d-hoch2chconh-<q^ NHCbz

Lietteeseen, jossa oli 2,4 g (0,01 moolia) osassa A saatua N-Cbz-D-seriiniä 75 ml:ssa kloroformia, lisättiin 1,1 ml (0,01 moolia) N-metyylimorfoliinia.

15 Saatiin liuos, joka jäähdytettiin -12°C:seen. Tähän lisättiin 0,96 ml (0,01 moolia) etyyliklooriformiaat-tia, seosta sekoitettiin -10°C:ssa viisi minuuttia, lisättiin liuos, jossa oli 1,11 g (0,01 moolia) disyk-propyyliamiinia 5 ml:ssa kloroformia ja sekoittamista 20 jatkettiin viisi minuuttia -15°C:ssa. Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan, pestiin peräkkäin 0,5-norm. suolahapolla, 5 %:isella natriumvety-karbonaattiliuoksella ja vedellä. Kloroformi haihdutettiin pois vakuumissa, Vesipesunesteet yhdistettiin ja 25 uutettiin etyyliasetaatilla. Etyyliasetaattiuutteet yhdistettiin jäännöksen kanssa, joka oli saatu haihduttamalla kloroformi pois ja etyyliasetaattiosa kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin valkeata kiinteätä ainetta, jota kuivat-30 tiin vakuumissa yön ajan, jolloin saatiin 3,2 g haluttua tuotetta (Rj 0,54) jota käytettiin seuraavassa vaiheessa.

31 77045 C.) D-H0CHoCHC0NH-2 I NH2 3,2 g (9,6 mmoolia) osassa B saatua N-Cbz-ami-dia liuotettiin 70 ml:aan metanolia, lisättiin 1,0 g 5 5 %:ista Pd/C-katalyyttiä ja seosta hydrattiin 60 psi:n 2 paineessa (4,2 kg/cm ) 30 minuuttia. Katalyytti poistettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin kuiviin va-kuumissa, jolloin saatiin 1,93 g tuotetta saippuamaise-na kiinteänä aineena.

io d.) c6h5ch2ococh2chconhch(ch2oh)conhch(A)2 NHCbz

Seosta, jossa oli 3,4 g (9,5 mmoolia) /3-bentsyyli-N-bentsyylioksikarbonyyli-L-aspartaattia, 1,0 ml (9,5 mmoolia) N-metyylimorfoliinia ja 0,9 ml (9,5 mmoo-15 lia) etyyliklooriformiaattia, sekoitettiin -15...-10°C:ssa viisi minuuttia ja -15°C:ssa lisättiin liuos, jossa oli 1,9 g (9,5 mmoolia) osassa C saatua D-seriini-N-di-syklopropyylikarbinyyliamidia 10 ml:ssa kloroformia.

Saatua seosta sekoitettiin -10°C:ssa viisi minuuttia, 20 annettiin lämmetä ympäristön lämpötilaan ja sekoitettiin tunnin ajan. Liuottimen poistamiseksi reaktio-seos haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin (250 ml), pestiin vuorollaan 1-norm. suolahapolla, 5-%:isella natriumvetykarbonaat-25 tiliuoksella ja suolaliuoksella, ja kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla. Liuotin haihdutettiin pois vakuumissa, jolloin saatiin hyytelömäistä kiinteätä ainetta. Tämä liuotettiin 75 ml:aan kuumaa etyyliasetaattia. Jäähdytettäessä saatiin kiteistä kiinteätä 30 ainetta, joka kuivattiin vakuumissa 40°C:ssa, jolloin saatiin 2,75 g haluttua disuojattua dipeptidiamidia hienojakoisena valkeana kiinteänä aineena; 0,30.

E.) Seosta, jossa oli 2,75 g osassa D saatua disuojattua dipeptidiamidia, 200 ml metanolia ja 1,0 g 35 5-%:ista Pd/C-katalyyttiä, hydrattiin 60 psi:n painees- 2 sa (4,2 kg/cm ) tunnin ajan, jolloin tuote saostui. Katalyytti/tuote-seos suodatettiin erilleen, suodatin-kakku lietettiin 100 ml:aan kuumaa vettä ja suodatet- 77045 32 20 tiin uudelleen. Yhdistetyt suodokset haihdutettiin kuiviin, trituroitiin veden kanssa, suodatettiin ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 260 mg tuotetta hienojakoisena valkeana, höytymäisenä kiinteänä aineena; sp. 252-54°c; 0,58 (TLC, n-butanoli/vesi/- 25 etikkahappo 4:1:1, ninhydriini-suihke).

Hydrauksessa saatu suodatinkakku lietettiin 50 ml: aan 0,1-norm. suolahappoa, seos suodatettiin piimään läpi (Supercel), suodoksen pH (pH 1,6) säädettiin arvoon pH 5,9 natriumhydroksidiliuoksella, ja saostunut 30 tuote koottiin talteen suodattamalla ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin vielä 800 mg tuotetta. Vaiheen kokonaissaanto 68 %.

Massaspektri (m/e) 313 (M+).

Esimerkki 2 L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,4-dimetyyli-3-pen-tyyli)amidi 5 I, Ra = CH-0H, R = V- A.) D-H0CHoCHC0NH—( 2i

NHCbz S

10 Seka-anhydridiä valmistettiin seuraavasti: 1,0 g (4,3 mmoolia) N-bentsyylioksikarbohyyli-D-seriiniä liuotettiin 50 ml:aan tetrahydrofuraania, jäähdytettiin -10°C:seen typpiatmosfäärin suojämänä ja lisättiin 0,47 ml (4,3 mmoolia) N-metyylimorfoliinia 15 ja 0,41 ml (4,3 mmoolia) etyyliklooriformiaattia.

Seosta sekoitettiin 30 minuuttia -10°C:ssa.

Seka-anhydridiliuokseen lisättiin 495 mg (4,3 mmoolia) 2,4-dimetyyli-3-aminopentaania liuotettuna pieneen määrään kloroformia, seosta sekoitettiin -10°C:ssa 20 15 minuuttia ja sen annettiin lämmetä huoneen lämpöti laan. Lisättiin etyyliasetaattia (40 ml) ja seos pestiin 1-norm. suolahapolla, natriumvetykarbonaattiliuoksella ja suolaliuoksella, ja orgaaninen kerros kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla. Haihduttamalla liuotin pois 33

7704S

vakuumissa saatiin 1,27 g väritöntä kiinteätä ainetta jota trituroitiin etyylieetterin kanssa, suodatettiin ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin 1,0 g väritöntä tuotetta, R^ 0,77 (TLC, etyyliasetaatti/heksaani, til.

5 suhde 7:3, vanilliinisuihke).

B.) D-H0CH-CHC0NH —/ k V- 1,0 g edellä saatua tuotetta liuotettiin 50 ml:aan 10 metanolia, lisättiin 0,5 g 5 %:ista Pd/C-katalyyttiä 2 ja seosta hydrattiin 50 psi:n paineessa (3,52 kg/cm ) kunnes vedyn sitoutuminen lakkasi. Suodattamalla ja haihduttamalla suodos saatiin 700 mg haluttua tuotetta.

15 - c.) C6H5CH20C0CH2CHC0NHCH(CH20H)C0NH_/ K I—

Liuos, jossa oli 1,36 g (3,8 mmoolia) /^-bentsyy-li-N-bentsyylioksikarbonyyli-L-aspartaattia 10 ml:ssa 20 tetrahydrofuraania, jäähdytettiin -10°C:seen ja lisättiin 0,42 ml (3,8 mmoolia) N-metyylimorfoliinia. Tähän lisättiin tiputtamalla 0,36 ml (3,8 mmoolia) etyyli-klooriformiaattia ja saatua seosta sekoitettiin -10°C:ssa 5 minuuttia. Sitten lisättiin tiputtamalla 566 mg (2,8 25 mmoolia) D-seriini-N-(2,4-dimetyyli-3-pentyyli)amidia (osasta B edellä) muutamassa millilitrassa tetrahydro-furaania ja sekoittamista jatkettiin 15 minuuttia. Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 30 kiinteätä jäännöstä. Tätä sekoitettiin etyyliasetaatin kanssa, pestiin 1-normaalisella suolahapolla ja orgaaninen faasi pestiin 5-%:isella natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella ja suolaliuoksella, kuivattiin (MgSC>4) ja liuotin haihdutettiin pois, jolloin saatiin 1,6 g tuo-35 tetta amorfisena kiinteänä aineena, jota käytettiin seu-raavassa vaiheessa.

34 7 7 0 4 5 D.) Liuokseen, jossa oli 2,7 g disuojattua dipep- tidiamidia (valmistettu edellä osassa C selostetulla tavalla) metanolissa, lisättiin 1,5 g 5-%:ista Pd/C-ka- talyyttiä ja seosta hydrattiin 50 psi:n paineessa 2 5 (3,52 kg/cm ) kunnes vedyn sitoutuminen oli lakannut.

Katalyytti poistettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin vakuumissa pienitilavuiseksi ja annettiin olla paikoillaan huoneen lämpötilassa. Saostunut tuote koottiin talteen suodattamalla ja kuivattiin vakuumissa, 10 jolloin saatiin 342 mg väritöntä kiinteätä ainetta, sp.

90°C. Rf 0,65 ^ohutkerroskromatografia, n-butanoli:etik-kahapposvesi (tilavuussuhde 4:1:1)^?.

Makeus: 180 x sakkaroosin makeus.

Esimerkki 3 15 L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli- tietan-3-yyli)amidi CH, en., X/

I , Ra = CH-0H, R = -/ X

20

/N

CH3 CH3 A.) d-hoch2chcooh NHt-Boc

Menetelmänä oli menetelmä, jota ovat selosta-25 neet Moroder ym., Z. Physiol. Chem. 357, 1651 (1976) t-Boc-aminohappojen valmistamiseksi. Liuokseen, jossa oli 10 ml dioksaania ja 10 ml vettä, lisättiin 2,18 g (10 mmoolia) di-t-butyylidikarbonaattia, 1,6 ml (11,5 mmoolia) trietyyliamiinia ja 1,05 g (10 mmoolia) D-30 seriiniä. Seosta sekoitettiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja dioksaani haihdutettiin pois vakuumissa. Vesipitoinen jäännös jäähdytettiin jäissä, lisättiin etyyliasetaattia ja seosta sekoitettiin lisäten laimeata kaliumvetysulfaattiliuosta kunnes pH oli 2-3.

35 Vesikerros erotettiin, uutettiin kahdesti etyyliasetaatilla ja yhdistetyt uutteet pestiin vedellä, kuivattiin (Na2S04) ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa, jolloin saatiin 1,7 g tuotetta viskoosisena tahnana.

35 7 7 0 4 5 CH3 ch3

B.) D-H0CHoCHC0NH--A X

A X

CH3 CH3 5 Seka-anhydridiä valmistettiin 2,85 g:sta (14 mmoo- lia) N-t-butoksikarbonyyli-D-seriiniä, 1,55 ml:sta N-me-tyylimorfoliinia, 1,34 ml:sta etyyliklooriformiaat-tia 75 ml:ssa metyleenikloridia -12...-10°C:ssa esimerkin 1 osan B menetelmällä. Tähän seokseen lisättiin 2,01 g 10 (14 mmoolia) 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitietaania ja sekoittamista jatkettiin viisi minuuttia -12°C:ssa.

Tuote eristettiin esimerkissä 1 osassa B selostetulla tavalla, jolloin saatiin 4 g viskoosista nestemäistä jäännöstä. Jäännös liuotettiin 40 ml:aan metyleeniklo-15 ridia, lisättiin 12 ml trifluorietikkahappoa (d = 1,480) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa kolme tuntia. Reaktioseos tehtiin alkaliseksi 40-%:isella nat-riumhydroksidiliuoksella, orgaaninen kerros erotettiin, vesikerros kyllästettiin natriumkloridilla ja uutettiin 20 metyleenikloridilla. Yhdistetyt uutteet kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 2,21 g amorfista, harmahtavaa kiinteätä ainetta. Kiteyttämällä etyylieetteri/heksaani-seoksesta saatiin 1,92 g tuotetta hienojakoisena, valkeana kiinteänä 25 aineena. (CH-,)^

A

C.) t-butyyli0C0CH2CHC0NHCHC0NH—X X

| CH20H \A

NH-t-Boc (CH3)2 30 Seosta, jossa oli 2,3 g (,0 mmoolia) y^-t-butyy- li-N-t-butoksikarbonyyli-L-asparaattia, 0,88 ml (8,0 mmoolia) N-metyylimorfoliinia ja 0,77 ml (8,0 mmoolia) etyyliklooriformiaattia 40 ml:ssa metyleenikloridia, sekoitettiin -12°C:ssa viisi minuuttia. Lisättiin liuos, 35 jossa oli 1,85 g (8,0 mmoolia) D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyylitietan-3-yyli)amidia 5 ml:ssa samaa liuotinta ja sekoittamista jatkettiin -12 .. .-10°C:ssa kymmenen minuuttia. Seoksen annettiin lämmetä huoneen « 77045 ό Ο lämpötilaan, sekoitettiin tunnin ajan tässä lämpötilassa ja liuotin haihdutettiin pois. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, pestiin laimealla suolahapolla, natriumvetykarbonaattiliuoksella ja suolaliuoksella, kui-5 vattiin (MgSO^) ja etyyliasetaatti haihdutettiin pois, jolloin saatiin 3,34 g amorfista kiinteätä ainetta. Kiteyttämällä etyylieetteri/häksaani-seoksesta saatiin 2,91 g väritöntä kiinteätä tuotetta, 0,70 (etyyli-asetaatti/heksaani-seos, 7:3).

10 D.) Liuokseen, jossa oli 2,4 g (4,78 mmoolia) edellä osassa C saatua tuotetta 60 ml:ssa kloroformia, sijoitettiin kaasun sisäänjohtoputki ja liuoksen läpi johdettiin kuplina kuivaa kloorivetyä. Viiden minuutin kuluttua havaittiin kiinteän aineen saostumista. Kloo-15 rivedyn lisäämistä jatkettiin kymmenen minuuttia, sen jälkeen seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa tunnin ajan ja sitten haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäännös liuotettiin veteen, pestiin kloroformilla ja pH säädettiin arvoon 5,6, pestiin uudelleen kloroformilla, 20 ja vesifaasi haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäännökseen lisättiin etanolia ja seos haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 25 ml:aan kuumaa vettä ja annettiin jäähtyä. Saostunut tuote koottiin talteen suodattamalla ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saa-25 tiin 1,12 g (67 %) tuotetta, sp. 193-196°C.

R^ 0,32 (n-butanoli/vesi/etikkahappo 4:1:1).

Analyysi yhdisteelle C14H25N3°5S

laskettu: C 48,39; H 7,25; N 12,09; S 9,23.

saatu: C 46,77; H 7,48; N 11,91; S 8,82.

30 Makeutusteho, 1200 x sakkaroosin makeutusteho.

Esimerkki 4 L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli- 1,l-dioksotietan-3-yyli)amidi CH^CHa 35 I, Ra = CH-OH, R = —ς SO,

X

CH3 CH3 37 77045 A.) 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitetaani-1,1-dioksidi Liuosta, jossa oli 14,53 g (0,1 moolia) 3-ami-no-2,2,4,4-tetrametyylitietaania ja 64,17 g (0,3 moolia) natrium-m-perjodaattia 500 ml:ssa vettä sekoitettiin yön 5 ajan huoneen lämpötilassa. Reaktioseoksen pH säädettiin natriumhydroksidiliuoksella arvoon 13 ja saostunut nat-riumjodaatti poistettiin suodattamalla. Suodos pestiin 100 mlslla etyylieetteriä, vesifaasia uutettiin jatkuvasti 18 tuntia metyleenikloridilla, uute kuivattiin 10 (MgSO^) ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa. Jäljelle jäänyt kiinteä aine kiteytettiin uudelleen etyyliasetaatista, jolloin saatiin 8,5 g tuotetta, sp. 104-106,5°C. Saatiin myös toinen erä kiteitä, 2,7 g,* sp. 103-106°C. Kokonaissaanto 63 %.

15 B.) D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli-l,1-diokso- tietan-3-yyli)amidi

Esimerkin 1 osan B menetelmällä 1,33 g:sta (6,5 moolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-D-seriiniä, 0,715 ml:sta N-metyylimorfoliinia, 0,62 ml:sta etyyliklooriformiaat-20 tia ja 1,15 g:sta (6,5 mmoolia) 3-amino-2,2,4,4-tetra-metyylitietaani-1,1-dioksidia saatiin 2,3 g N-bentsyy-lioksikarbonyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli- 1,l-dioksotietan-3-yyli)amidia viskoosisena nesteenä, R^ 0,37 (etyyliasetaatti/heksaani-seos, 7:3). Tämä 25 neste liuotettiin metanoliin, lisättiin 750 mg 5-%:ista Pd/C-katalyyttiä ja seosta hydrattiin esimerkin 1 osan C mukaisella menetelmällä. Katalyytin poistamiseksi suoritetun suodatuksen jälkeen metanoli haihdutettiin vakuumissa, jäännös liuotettiin 1-norm. suolahappoon 30 ja uutettiin kloroformilla. Vesikerros tehtiin alkali-seksi natriumkloridilla kyllästetyllä natriumhydroksi-dilla ja uutettiin jatkuvasti yön ajan kloroformilla. Haihduttamalla liuotin pois saatiin 1,54 g tuotetta viskoosisena nesteenä, joka muuttui kiinteäksi ollessa pai-35 koillaan, Rf 0,32 (m-butanoli/vesi/etikkahappo, 4:1:1).

38 7 70 4 5 CH, CH0

X

C.) CcHc0C0CHoCHC0NHCHC0NH—< S0o 6 5 2, | 2

NHCbz CH OH

CH3 ^ch3 5 Edellä esitetyn kaavan mukaista disuojattua dipeptidiamidia valmistettiin 4,7 mmooli-mittakaavas-sa käyttämällä esimerkin 1 osan D menetelmää ja 1,7 g /3-bentsyyli-N-bentsyylioksikarbonyyli-L-aspartaattoa, 0,51 ml N-metyylimorfolinia, 0,45 ml etyylikloori-10 formiaattia ja 1,24 g D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrame-tyyli-1,l-dioksotietan-3-yyli)amidia. Tuote, 2,45 g, saatiin värittömänä amorfisena, kiinteänä aineena. Kaksi grammaa tätä ainetta puhdistettiin kromatografises-ti 60 g:11a silikageeliä eluoimalla etyyliasetaatilla, 15 jolloin saatiin 1,2 g amorfista kiinteätä tuotetta,

Rf 0,30 (etyyliasetaatti/heksaani, 7:3).

D.) Seosta, jossa oli 1,2 g edellä osassa C saatua pudistettua tuotetta, 75 ml metanolia ja 0,6 g 5-%:ista

Pd/C-katalyyttiä, hydrattiin 80 psi:n paineessa (5,6 kg/ 2 20 cm ). Vedyn sitoutumisen päätyttyä katalyytti poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin väritöntä kiinteätä jäännöstä. Jäännös liuotettiin veteen, pestiin kloroformilla ja vesikerros haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäljelle jäänyt kiin-25 teä aine kiteytettiin etanolista, jolloin saatiin 255 mg haluttua dipeptidiamidia hienojakoisena, valkeana kiinteänä aineena; sp. 170-173°C; R^0,20. Käsittelemällä uudelleen hydrauksessa saatua suodatinkakkua saatiin vielä 180 mg tuotetta.

30 Makeutusteho: 850 x sakkaroosin makeutusteho.

39 77045

Esimerkki 5 A. ) N-klooriasetyyli-dl-O-metyyliseriini 125 ml:aan vettä lisättiin 59,55 g (0,5 moolia) dl-O-metyyliseriiniä, seosta sekoitettiin ja lisät-5 tiin 20 g (0,5 moolia) natriumhydroksidia. Saatua liuosta jäähdytettiin jäissä ja kahdesta tiputussuppilosta lisättiin samanaikaisesti tunnin kuluessa liuos, jossa oli 20 g natriumhydroksidia 125 ml:ssa vettä ja 47,8 ml (0,6 moolia) klooriasetyylikloridia. Lisäysmäärät sää-10 dettiin siten, että reaktioseoksen pH saatiin pidetyksi rajoissa 9,0-9,5. Lisäyksen päätyttyä saatua seosta sekoitettiin tunnin ajan pH-arvon ollessa välillä 9,0-9,5. Seos pestiin kahdesti metyleenikloridilla, vesifaasi tehtiin happameksi pH-arvoon 1,5 väkevällä suolahapolla 15 jäillä jäähdyttäen, kyllästettiin natriumkloridilla ja uutettiin useaan kertaan kloroformilla. Yhdistetyt uutteet kuivattiin (MgSO^) ja liuotin haihdutettiin vakuu-missa. Jäännöstä sekoitettiin etyylieetterin kanssa keltaisen kiinteän tuotteen saostamiseksi, joka koottiin 20 talteen suodattamalla ja kuivattiin,' 69,38 g (71 %) .

Sp. 104-107°C, Rf 0,23 (etyy.liasetaatti/heksaani/etik-kahappo, 9:9:2, fosforimolybdaattisuihke). Toinen erä saatiin vesifaasista lisäämällä enemmän natriumklori-dia ja uuttamalla kloroformilla. Haihduttamalla kloro-25 formi pois saatiin 3,65 g tuotetta. Kokonaissaanto 75 %.

B. ) N-klooriasetyyli-D-O-metyyliseriini 3000 ml:aan vettä, jonka lämpötila oli 35-37°C, lisättiin 73,03 g (0,37 moolia) N-klooriasetyyli-dl-O-metyyliseriiniä ja seoksen pH säädettiin arvoon 7,18 30 lisäämällä väkevää ammoniumhydroksidia. Lisättiin vettä siten, että kokonaistilavuudeksi tuli 3700 ml. Tähän lisättiin 17 mg kaupan olevaa sianmunuais-aminoasylaa-sia /N-asyyliaminohappo-amidohydrolaasia; EC 3.5.1.14 (Acylase Ijj, jossa oli 1845 yksikköä/mg (1 yksikkö mää-35 ritetään määräksi, joka tarvitaan hydrolysoimaan 1 mik-romooli N-asetyyli-L-metioniinia tuntia kohden pH:n oi- 40 77045 lessa 7,0 ja lämpötilan 25°C). Lisätyn entsyymin määrä oli määrä, jonka laskettiin hydrolysoivan herkän isomeerin kuudessa tunnissa. Saatua liuosta pidettiin 37-38°C:ssa 28 tuntia lisäämällä silloin tällöin ammonium-5 hydroksidia siten, että pH pysyi välillä 7,1 - 7,2. 24 tunnin kuluttua lisättiin vielä 5 mg entsyymiä. Hydro-lyysiseos tehtiin happameksi pH-arvoon 4,5 jääetikka-hapolla, suodatettiin 0,6 pm:n millipore-suotimen (tyyppiä BD) läpi ja suodosta haihdutettiin vakuumis-10 sa 35°C:n alapuolella kokonaistilavuuden pienentämiseksi välille 100-150 ml. Jäljellejäänyt seos tehtiin happameksi pH-arvoon 2,00 suolahapolla ja uutettiin useaan kertaan etyyliasetaatilla ja uutettiin edelleen kloroformilla. Erilliset orgaaniset uutteet pestiin 15 kukin vedellä, kuivattiin (MgSO^) ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa, jolloin saatiin keltaista nestemäistä jäännöstä. Kiteytyminen käynnistettiin lisäämällä heksaania ja haihduttamalla vakuumissa. Etyyliase-taattiuutteista saatiin 16,67 g (46 %) N-klooriasetyyli-20 D-O-metyyliseriiniä ,* sp. 95-96°C,‘ - 15,5 (C = 1, 1-norm. NaOH). Kloroformiuutteista saatiin 4,61 g (31 %) samaa tuotetta! sp. 90-94°C (kloorietikkahapon tuoksua). Molemmat tuote-erät antoivat yhden ainoan täplän ohutker-roskromatografiakäsittelyssä silikageelilevyillä,' 25 0,35 (etyyliasetaatti/heksaani/etikkahappo, 9:9:2, fosforimolybdaatti-suihke).

C. 16,67 g:aan (0,085 moolia) N-klooriasetyyli-D-O-metyyliseriiniä lisättiin 25 ml 2-norm, suolahappoa ja seosta lämmitettiin kiehuttaen kolme tuntia. Seos 30 konsentroitiin vakuumissa, karkoittamalla jäljelle jäänyt kloorietikkahappo lisätyllä vedellä. Kiinteä jäännös pestiin etyylieetterillä ja koottiin talteen suodattamalla, jolloin saatiin 12,31 g (93 %) D-O-metyyliseriini-hydrokloridia,' sp. 188-190°C; “16,7° (C = 0,7, 35 CH30H).

41 77045

Esimerkki 6 L-aspartyyli-D-O-metyyliseriini-N-disyklopropyy- likarbinyyli) amidi .Λ 5 I, R = CH20CH3, R = A.) D-CH0 —OCH-nCHCO OH 3 2{ NHCbz

Liuos, jossa oli 12,31 g (0,079 moolia) D-0-10 metyyliseriiniä 40 ml:ssa vettä, jossa oli 6,32 g (0,158 moolia) natriumhydroksidia, jäähdytettiin 5-10°C:seen ja samanaikaisesti lisättiin (pH:n ollessa 8-9) 11,74 ml (0,0806 moolia) bentsyyliklooriformiaattia ja 4-mol. natriumhydroksidia. Saatua seosta sekoitettiin kunnes 15 pH pysyi arvossa 8 lisäämättä enempää emästä. Metylee-nikloridilla pesemisen jälkeen vesifaasi tehtiin happa-meksi väkevällä suolahapolla, uutettiin neljä kertaa metyleenikloridilla, uutteet kuivattiin (MgSO^) ja liuotin haihdutettiin vakuumissa. Viskoosista nestemäistä 20 jäännöstä sekoitettiin heksaanin kanssa ja saostunut kiinteä aine koottiin talteen suodattamalla, jolloin saatiin 18,6 g tuotetta (93 %) , /9^-2,7° (C = 1, 1-norm. NaOH), Rf 0,43.

A

25 B.) D-CH..0CH-CHC0NH

3 2i V

NHCbz

Liuokseen, jossa oli 3,80 g (0,015 moolia) N-bents-yylioksikarbonyyli-D-O-metyyliseriiniä 75 ml:ssa mety-leenikloridia, lisättiin 1,68 ml (0,015 moolia) N-me-30 tyylimorfoliinia ja seos jäähdytettiin -15°C:seen. Tähän lisättiin 1,43 ml (0,015 moolia) etyyliklooriformiaat-tia, seosta sekoitettiin -20...15°C:ssa kymmenen minuuttia ja lisättiin 1,68 g (0,015 moolia) disyklopropyyli-karbinyyliamiinia. Seoksen annettiin lämmetä huoneen läm- 42 ' 77045 potilaan ja sekoitettiin kaksi tuntia. Saatu seos pestiin kaksi kertaa 1-norm. natriumhydroksidilla, kahdesti 1-norm. suolahapolla ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Haihduttamalla liuotin pois vakuumissa saatiin 5,1 g 5 (98 %) haluttua tuotetta, 0,59 (silikageeli-TLC:n jälkeen, etyyliasetaatti/heksaani-seoksella 1:1; fosfo-rimolybdaatti-suihke^.

Tuotteen struktuuri varmennettiin 1H-NMR-spektro-skooppisesti.

10 /Λ c.) D-CH30CH2CH (ΟΗ2)α0ΝΗ-\

V

5,1 g edellä osassa B saatua N-bentsyylioksikarbo-nyyli-D-O-metyyliseriini-N-(disyklopropyylikarbinyyli)ami-15 dia hydrattiin esimerkin 1 osan C menetelmällä, jolloin saatiin 2,96 g (95 %) D-O-metyyliseriini-N-(disyklopropyylikarbinyyli ) amidia nesteenä, Rf 0,39; -23,2 (C = 0,7, 1-norm. HC1). Struktuurin varmensi 1H-NMR-spektroskooppinen määritys.

20 D.) C6H5CH2OCOCH2CH(NHCbz)CONHCH(CH2OCH3)CONHCH(A)2

Seoksen, jossa oli 4,97 g (13,9 mmoolia) /^-bents-yyli-N-bent^ylioksikarbonyyli-L-aspartaattia, 1,55 ml (13,9 mmoolia) N-metyylimorfoliinia ja 1,33 ml (13,9 mmoolia) etyyliklooriformiaattia, annettiin reagoida 25 esimerkissä 1 osassa D selostetulla tavalla, jolloin saatiin 7,43 g (97 %) disuojattua dipeptidiamidia, joka kiteytettiin uudelleen kaksi kertaa etyyliasetaatista, jolloin saatiin 4,25 g väritöntä tuotetta, R^ 0,45 (etyyliasetaatti/heksaani-seos, 7:3). Rakenne varmennet-30 tiin 1H-NMR:n avulla.

E.) Hydrattaessa 4,25 g edellä osassa D saatua puhdistettua disuojattua dipeptidiamidia esimerkin 1 osan E menetelmällä, saatiin 2,4 g (95 %) haluttua dipeptidiamidia, sp. 215-217°C (hajosi); +37,6° 35 (C = 0,8, 1,2-norm. HC1); R^ 0,41.

43 77045

Makeutusteho, 85 x sakkaroosin makeutusteho.

Esimerkki 7 L-aspartyyli-D-O-metyyliseriini-N-^ ,2,4,4-tetra- metyylitietan-3-yyli)amidi 5 CH, CH- K/ I, Ra = CH20CH3, R = ch/ch3

10 A.) D-CH30CH2CHC00H

NHt-Boc

Liuokseen, jossa oli 2,89 g {18,6 mmoolia) D-0-metyyliseriini-hydrokloridia 11 ml:ssa vettä, lisättiin 6,48 ml (46,5 mmoolia) trietyyliamiinia, 5,10 g 15 (20,7 mmoolia) 2-(t-butoksikarbonyylioksi-imino)-2-fe- nyyliasetonitriiliä ("B0C-0N") ja 11 ml tetrahydrofu-raania. Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa yön ajan, laimennettiin 25 ml:11a vettä ja pestiin etyyliasetaatilla. Vesikerros tehtiin happameksi pH-arvoon 1,8 20 1-mol. suolahapolla, uutettiin etyyliasetaatilla (3 x 75 ml), kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 4,2 g tuotetta viskoosisena nesteenä, R^ 0,65 (etyyliasetaatti/heksaani/etikkahappo, 9:9:2, fosforimolybdaatti-suihke).

25 B. N-t-Boc-D-O-metyyliseriini-N-(2,2,4,4-tetra- metyylitietan-3-yyli)amidi

Liuokseen, jossa oli 4,2 g (18,6 mmoolia) N-t-Boc-D-O-metyyliseriiniä 90 ml:ssa metyleenikloridia, lisättiin 2,08 ml N-metyylimorfoliinia, seos jäähdytet-30 tiin -15°C:seen ja lisättiin 1,78 ml etyylikloorifor- miaattia. Kun oli sekoitettu 8 minuuttia -20 ...-15°C:ssa, samassa lämpötilassa lisättiin 2,70 g (18,6 mmoolia 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitietaania liuotettuna 10 ml: aan metyleenikloridia ja seoksen annettiin lämmetä huoneen 35 lämpötilaan. Kahden tunnin sekoittamisen jälkeen seos pes- 4« 77045 tiin laimealla natriumhydroksidilla ja laimealla suolahapolla, kuivattiin vedettömällä magnesiumsulfaatilla ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa, jolloin saatiin 6,04 g (94 %) väritöntä kiinteätä ainetta, 0,35 5 (etyyliasetaatti/heksaani-seos 3:7, fosforimolybdaatti- suihke). Rakenne varmennettiin ^H-NMR:n avulla.

C. D-O-metyyliseriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli-tietan-3-yyli)amidi

Liuokseen, jossa oli 6,04 g (17,4 mmoolia) N-t-10 Boc-D-0-metyyliseriini-N-(2,2,4,4-tetrametyylietan-3- yyli)amidia 13,4 ml:ssa metyleenikloridia, lisättiin 6,7 ml (87 mmoolia) trifluorietikkahappoa (om.p. 1,480) ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa kolme tuntia; sitä lisättiin vielä 1,0 ml 2 ml:ssa 15 metyleenikloridia ja sekoittamista jatkettiin tunnin ajan. Reaktioseos tehtiin alkaliseksi 40-%:isella (pai-no-%) natriumhydroksidiliuoksella, orgaaninen kerros erotettiin ja vesikerros uutettiin useaan kertaan tuoreella metyleenikloridilla. Yhdistetyt uutteet kuivat-20 tiin (MgSO^) ja liuotin haihdutettiin pois vakuumissa, jolloin saatiin 4,29 g raakaa nestemäistä tuotetta.

Tämä liuotettiin 20 ml:aan 1-norm. suolahappoa, pestiin etyylieetterillä, vesikerros tehtiin alkaliseksi natriumhydroksidilla (40 paino-%), kyllästettiin natrium-25 kloridilla ja uutettiin metyleenikloridilla. Haihdut tamalla uutteet kuiviin saatiin 3,21 g (75 %) haluttua tuotetta; Rf 0,41; - 19,8° (C = 0,8, 1-norm. HC1) .

Tämän tuotteen struktuurin osoitti oikeaksi sen 1H-NMR-spektri.

45 77045 CH0 CH,

D.) t-butyyli 0C0CH„CH CONH CH CONH_/ XS

I =H20CH3 'Vf 5 NH-t-Boc CH3 CH3 Käyttämällä 3,76 g edellä osan C menetelmällä saatua tuotetta toistettiin esimerkin 3 osan C menetelmä 13 millimoolin mittakaavassa käyttämällä liuottimena 50 ml metyleenikloridia, jolloin saatiin 5,0 g (74 %) 10 haluttua disuojattua dipeptidiamidia hauraana vaahtona,

Rf 0,40 (etyyliasetaatti/heksaani-seos, 1:1; fosfori-molybdaatti-suihke). Rakenne osoitettiin oikeaksi tuotteen ^H-NMR-spektrin avulla.

E. Kuivaa bromivetyä johdettiin kuplina liuoksen 15 läpi, jossa oli 5,0 g (9,7 mmoolia) edellä osassa D saatua disuojattua dipeptidiamidia sekoittamalla huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Saatu seos haihdutettiin kuiviin vakuumissa ja saatu keltainen kiinteä jäännös liuotettiin veteen. Liuos pestiin kahdesti etyylieette- 20 rillä ja kerran metyleenikloridilla. Vesifaasin pH säädettiin arvoon 5,8 natriumhydroksidiliuoksella ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäljelle jäänyt kiinteä aine liuotettiin 10 ml:aan 95-%:ista etanolia ja lisättiin etyylieetteriä otsikon yhdisteen saostamiseksi, kahte-25 na eränä: 1,66 g, + 13,4° (C = 0,9, 1,2-norm. HCl), sp. 85-90°C; 1»20 g, {°0O + 13,9° (C = 0,8, 1,2 -norm. HCl).

Kummankin erän TLC:ssä oli täplä kohdalla Rf 0,51 30 sekä pieni ainemäärä kohdalla 0,44.

F. Puhdistus p-tolueenisulfonaattisuolana 10 ml:aan vettä lisättiin 1,39 g (3,85 mmoolia) yhdistettyjä edellä saadun tuotteen eriä ja 0,66 g (3,83 mmoolia) p-tolueenisulfonihappoa. Saatua liuosta 35 sekoitettiin huoneen lämpötilassa kaksi tuntia. Saostunut 77045 46 kiinteä aine koottiin talteen suodattamalla ja pestiin pienellä määrällä vettä, jolloin saatiin 0,94 g p-tolueeni-sulfonaatti-suolaa. Suola yhdistettiin 3 ml:n kanssa nestemäistä anioinivaihtajahartsia ^Amberlite LA-1® (Rohm 5 and Haas Co.: n rekisteröity tavaramerkki )^} , 6 ml: an kanssa heksaania ja 2 ml:n kanssa vettä ja seosta sekoitettiin 2 tuntia. Vesifaasi erotettiin, pestiin heksaanilla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 0,72 g harmaan valkeata kiinteätä ainetta; (pjD +22,43° (C = 0,8, 10 1,2-norm. HC1); Rf 0,48.

Makeutusteho: 320 x sakkaroosin makeutusteho.

Makean maun arveltiin olevan epätavallisen puhtaan, vapaan sivumakuvivahteista ja makeutusvaikutuksen nopean.

15 Esimerkki 8 L-aspartyyli-D-O-metyyliseriini-N-(2,2,4,4-tetra-metyyli-l,l-dioksotietan-3-yyli)amidi CH, CH-3 20 A.) D-CH30CH2CHC0NH_/ .s NHCbz ch3 ch3 75 ml:aan metyleenikloridia liuotettiin 3,8 g (15 mmoolia) N-bentsyylioksikarbonyyli-D-O-metyylise-25 riiniä. Lisättiin N-metyylimorfoliinia (1,68 ml), liuos jäähdytettiin -15°C:seen ja lisättiin 1,43 ml etyyli-klooriformiaattia. Saatua seosta sekoitettiin 8 minuuttia -15°C:ssa, sitten lisättiin 2,18 g (15 mmoolia) 3-amino-2,2,4,4-tetrametyylitietaania ja seoksen annet-30 tiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Sekoittamista jatkettiin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa, reaktioseos pestiin laimealla natriumhydroksidilla, laimealla suolahapolla, kuivattiin (MgSO^) ja liuotin haihdutettiin vakuumissa, jolloin saatiin 6,11 g nestemäistä tuotet-35 ta, Rf 0,58 (etyyliasetaatti/heksaani-seos, 1:1; fosfo-rimolybdaattisuihke).

47 7 7 0 4 5 B.) Hapetus 1,1-dioksidiksi

Edellä osassa A saatu tuote, 6,11 g, liuotettiin 75 ml:aan kloroformia ja jäähdytettiin jäissä lisäten annoksittain 7,12 g m-klooriperbentsoehappoa.

5 Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja sekoitettiin kolme tuntia. Lisättiin vielä kloroformia (75 ml) ja liuos pestiin kahdesti 5-%:isella (pai-no/til.) natriumkarbonaattiliuoksella, 2 x 0,5-norm, natriumsulfaatilla ja 2 x 1-norm. suolahapolla. Orgaa-10 nisen faasin kuivaamisen (MgS04) ja liuottimen haihduttamisen jälkeen saatiin 6,24 g tuotetta viskoosisena nesteenä, Rf 0,22 (etyyliasetaatti/heksaani-seos, 1:1; fosforimolybdaatti-suihke) sekä jälkiä lähtöaineesta ja sulfoksidista. ^H-NMR-spektri oli halutun sulfonin 15 struktuurin mukainen pienen kloroformimäärän yhteydessä.

ch3 ch3 c.) d-ch3och2chconh 20 CHf CH3

Seosta, jossa oli 6,11 g N-bentsyylioksikarbo-nyyli-D-O-metyyliseriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli-l,1-dioksotietan-3-yyli)amidia, 250 ml metanolia ja 3,0 g 25 3—%:ista palladium/hiili-katalyyttiä, hydrattiin 50 ps:n paineessa (3,52 kg/cm ) kaksi tuntia. Katalyytti poistettiin suodattamalla, suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa ja jäännös liuotettiin 35 ml:aan 1-norm. suolahappoa. Hapan liuos pestiin kolme kertaa klorofor-30 millä, tehtiin alkaliseksi kiinteällä natriumhydroksi-dilla, kyllästettiin natriumkloridilla ja uutettiin 3 kertaa 50 ml:11a kloroformia. Yhdistetyt uutteet kuivattiin (MgSO^) ja liuotin haihdutettiin vakuumissa, jolloin saatiin 3,37 g (80 %) ^-aminoamidi-tuotetta vä-35 rittömänä nesteenä, R^ 0,29; ^?D - 15,7° (C = 0,8, 48 7 7 0 4 5 l-norm. HC1). Struktuuri varmennettiin ^H-NMR-spektrosko-pian avulla.

CH, CH,

D.) /X

5 C6H5CH2OCOCH2CH (NHCbz) CONHCH (CH2OCH3) C0NH-<^^ S02 ch3^^^ch3

10 Käyttämällä 3,37 g (12 mmoolia) edellä osassa C

saatua tuotetta lähtöaineena esimerkin 1 osan D menetelmässä, haluttua disuojattua dipeptidiamidia saatiin kirkkaana lasimaisena aineena, 6,73 g (91 %); 0,28 (etyyliasetaatti/heksaani-seos, 70:30). ^H-NMR-15 spektri oli tämän yhdisteen struktuurin mukainen.

E.) Seosta, jossa oli 6,75 g -bentsyyli-N-Cbz-L-aspartyyli-D-O-metyyliseriini-N-(2,2,4,4-tetrame-tyyli-1,l-dioksotietan-3-yyli)amidia, 250 ml metano-lia ja 2,0 g 5-%:ista Pd/C-katalyyttiä, hydrattiin 20 edellä esitetyn osan C menetelmällä. Liuottimen haihduttamisen jälkeen jäljelle jäänyttä jäännöstä sekoitettiin yön ajan etyylieetterissä ja kiinteä tuote koottiin talteen suodattamalla ja kuivattiin vakuumiuunis-sa, jolloin saatiin 3,3 g (77 %) haluttua dipeptidi-25 amidia/ Rf 0,23; sp. 140-150°C (haj .); (V)^ + 20,3° (C = 1, 1,2-norm. HC1).

Makeutusteho: 200 x sakkaroosin makeutusteho.

Esimerkki 9 L-aspartyyli-D-seriini-N-(dl-cis,trans-2,6-di-30 metyylisykloheksyyli)amidi CH-, \3 I, Ra = CHjOH, R = —^ ^ 35 CH3 49 7 7 0 4 5 A.) dl-cis,trans-2,6-dimetyylisykloheksyyliamiini Liuos, jossa oli 2,1 g trans-2,6-dimetyylisyklo-heksanonioksiimia 30 mlrssa kuivaa etanolia, lämmitettiin kiehuvaksi. Tähän lisättiin annoksittain 3,1 g 5 metanolista natriumia. Lisäyksen päätyttyä seosta pidettiin kiehuvana 30 minuuttia ja annettiin jäähtyä huoneen lämpötilaan. Saatu geeli liuotettiin veteen, pH säädettiin arvoon 2,0 suolahapolla ja pestiin etyyli-eetterillä. Vesifaasi tehtiin alkaliseksi. natriumhydrok-10 sidilla, uutettiin eetterillä ja uutteet kuivattiin (MgSO^) ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin haluttua amiinia värittömänä nesteenä.

B.) D-seriini-N-(dl-cis,trans-2,6-dimetyylisyklo- heksyyli)amidi 15 Käyttämällä 1,47 g (6,17 mmoolia) N-Cbz-D-serii- niä, 775 mg (6,15 mmoolia) dl-cis,trans-2,6-dimetyyli-sykloheksyyliamiinia ja ekvimoolimäärin N-metyylimorfo-liinia ja etyyliklooriformiaattia ja poistamalla sen jälkeen amino-suojaryhmä hydraamalla katalyyttisesti 20 esimerkin 1 osien B ja C menetelmin, saatiin 0,70 g haluttua D-seriini-amidia valkeana kiinteänä aineena, 0,64 (etyyliasetaatti/heksaani, 7:3).

C.) Disuojattu dipeptidiamidi Käyttämällä esimerkin 1 osassa D 600 mg (2,8 mmoo-25 lia) D-seriini-N-(dl-cis,trans-2,6-dimetyylisyklohek- syyli)amidia, vastaavaa yi-bentsyyli-N-bentsyylioksi-karbonyyli-L-aspartyyli-D-seriiniamidia (l,2 g) saatiin värittömänä kiinteänä aineena. Kiteyttämällä uudelleen isopropyylieetteristä saatiin 1,0 g tuotetta, 30 R^ 0,35 (etyyliasetaatti/heksaani, 7:3).

D.) Hydraamalla katalyyttisesti edellä osassa C saatua disuojattua dipeptidiamidia (1,0 g) metanolissa siten, että läsnä oli 0,6 g 5—%:ista palladium/hiili-katalyyttiä, esimerkin 1 osan E menetelmällä, saatiin 435 35 mg otsikon yhdistettä harmaanvalkeana, kiteisenä kiin- tenä aineena; sp. 206 - 210°C (haj.); 0,67 ^ohutkerros- kromatografia, n-butanoli:etikkahappo:vesi (tilavuussuhde 4:1:1)].

Makeusteho: 200 x sakkaroosin makeusteho.

bo 77045

Esimerkki 10 L-aspartyyli-D-seriini-N-(disyklopropyylikarbi-nyyli)amidin natriumsuola

Liuokseen, jossa on 3,12 g (0,01 moolia) L-aspar-5 tyyli-D-seriini-N-(disyklopropyylikarbinyyli)ami dia 100 ml;ssa etanolia, lisätään 2 ml 2-norm, natrium-hydroksidia. Saatua seosta sekoitetaan kymmenen minuuttia huoneen lämpötilassa ja sitten haihdutetaan kuiviin vakuumissa. Jäännöstä trituroidaan kuivan etanolin 10 kanssa, suodatetaan ja kuivataan ilmassa.

Kun edellä käytetty natriumhydroksidi korvataan ekvivalenttimäärällä kaliumhydroksidia, kalsiumhydrok-sidia, magnesiumhydroksidia tai ammoniumhydroksidia, samalla tavalla muodostuu vastaavia kalium-, kalsium-, 15 magnesium- ja ammoniumsuoloja.

Myös muut kaavan (I) mukaiset L-aspartyyli-aminohappo-dipeptidiamidit muutetaan edellä selostetulla tavalla karboksylaattisuoiksi.

Esimerkki 11 20 Happoadditiosuolat

Kaavan (I) mukainen L-aspartyyli-D-aminohappo-dipeptidiamidi lietetään pieneen määrään vettä ja lisätään ekvivalenttimäärä happoa kuten suolahappoa, fosfo-rihappoa, rikkihappoa, etikkahappoa, maleiinihappoa, 25 fumaarihappoa, maitohappoa, viinihappoa, sitruunahappoa, glukonihappoa tai sokerihappoa. Saatua seosta sekoitetaan 15 - 30 minuuttia ja haihdutetaan sitten kuviin tai saos-tetaan lisäämällä lisäliuotinta, kuten metanolia tai etanolia.

Claims (4)

1. L-aspartyyli-D-aminohappo-dipeptidiamidi, jolla on kaava (I) 5 72 » /\c/NH>/C^NhR (I) ( Il 'a COOH O R 10 ja sen fysiologisesti hyväksyttävät kationi- ja happoaddi-tiosuolat, tunnettu siitä, että Ra on CH2OH tai CH2OCH3; ja R on di-isopropyylikarbinyyli, disyklopropyylikarbinyyli 15 tai ryhmä, jolla on kaava (a) tai (b) n 3 CH -J

20 Rb H,C CH (a) (b) 3 6 joissa ryhmät R ja R merkitsevät alkyyliä, jossa on 1-4 hiiliatomia, ja X on S tai SO_, jolloin hiiliato- 3 6 ^ mien summa ryhmissä R ja R ei ole suurempi kuin 6.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on L-aspartyyli-D-seriini-N-(disyklopropyylikarbinyyli)-amidi, L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyylitietan-3-30 yyli)amidi, L-aspartyyli-D-seriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli-l,1-diokso-tietan-3-yyli)amidi, L-aspartyyli-D-O-metyyliseriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli-tietan-3-yyli)amidi tai

35 L-aspartyyli-D-O-metyyliseriini-N-(2,2,4,4-tetrametyyli- 1,l-dioksotietan-3-yyli)amidi.