FI75579B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar polypeptid. - Google Patents

Description

1 75579

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen polypeptidin valmistamiseksi

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 771480 5

Keksinnön kohteena on menetelmä polypeptidin, valmistamiseksi jolla on luliberiiniagonistisia ominaisuuksia. Luliberiini on kansainvälisesti hyväksytty LH-RF:n (luteinizing hormone releasing factor) triviaali-10 nimi (J.Biol.Chem., 1975, 250, 3215).

On tunnettua (Dutta, Furr, Giles ja Morley, Clinical Endocrinology, 1976, 5, Supplement, 291s-298s), että substituoimalla luliberiini °(-atsa-aminohapoilla 6- tai 10-asemassa saadaan yhdisteitä, joiden vaikutus 15 kertarauhasmuodostusta ohjaavan hormonin (LH) erittymiseen aivolisäkkeestä on heikompi kuin alkuperäisellä yhdisteellä. Nyt on keksitty, että substituoimalla luli-beriinin 10-asema atsaglysiinillä ja samalla 6-asema erilaisilla D-^-aminohapoilla tai substituoimalla luli-20 beriinin 6-asema atsaglysiinillä tai atsa-alaniinilla ja korvaamalla luliberiinin pääteasemassa oleva glysii-niamidi etyyliaminoradikaalilla saadaan yhdisteitä, joiden vaikutus keltarauhasmuodostusta ohjaavan hormonin erittymiseen on voimakkaampi kuin luliberiinilla.

25 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan polypeptidi, jolla on kaava:

Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F I

jossa A on D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser(But), D-Phe, D-Ala tai D-Trp, B on Leu tai MeLeu, E on Azgly, ja F 30 on aminoryhmä, tai A on Azgly tai Azala, B on Leu, E on suora sidos, ja F on etyyliaminoradikaali, ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät happoadditiosuolat.

Yllä olevassa kaavassa ja koko patenttitekstissä aminohappotähteistä käytetään niiden standardilyhennyk-35 siä (Pure and Applied Chemistry, 1974, 40, 317-331).

2 75579 °^-atsa-aminohappotähde on aminohappotähde, jossa aminohapon °C-CH on korvattu typellä. ^-atsa-aminohapon lyhennys on johdettu vastaavasta aminohapon lyhennyksestä liittämällä siihen etutavu Az. Azgly tarkoittaa azagly-5 siiniä ja Azala atsa-alaniinia. Milloin määrätyn amiini-hapon konfiguraatiota ei ole ilmoitettu, aminohapolla on luonnollinen L-konfiguraatio (paitsi ®<f-atsa-amino-hapoilla, joissa ei ole asymmetriakeskusta karboksiryh-män vieressä).

10 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettujen yhdisteiden erityisiä ryhmiä ovat seuraavat:

Sellaiset, joissa A on D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser, D-Ser(But), D-Phe, D-Ala tai D-Trp, B on Leu tai MeLeu, E on Azgly, ja F on aminoryhmä.

15 Sellaiset, joissa A Azgly tai Azala, B on Leu, E on suora sidos, F on etyyliaminoryhmä.

Sellaiset, joissa A on D-Tyr(Me), D-Ser, D-Ser (Bufc),D-Phe, D-Al tai D-Trp, B on Leu tai MeLeu, E on azgly, ja F on aminoryhmä.

20 Edullisia keksinnön mukaisella menetelmällä val mistettuja yhdisteitä ovat sellaiset, joissa A on D-Tyr (Me), D-Ser (Bu*") tai D-Phe, B on Leu tai Meleu, E on Azgly, ja F on aminoryhmä.

Kolmella edullisella keksinnön mukaisella mene- 25 telmällä valmistetulla yhdisteellä on seuraavat kaavat:

Qlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-'iH2 □

Glu-His-Trp-Ser^Tyr-D-Tyr (Me) -Leu-Arg-Pro-Azgly-rJH2 30 ^lu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (But) -Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditiosuola on esimerkiksi hydrokloridi, fosfaatti, sitraatti tai asetaatti.

Il 3 75579

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) poistetaan suojaryhmät kaavan I mukaista polypeptidiä vastaavasta suojatusta polypeptidistä, jossa yksi tai use- 5 ampi amino- ja/tai hydroksiryhmä on suojattu tavanomaisilla peptidisuojaryhmillä, tai b) kaavan □ D □ '“Glu-OH, *-Glu-His-OH, ^Glu-His-Trp-OH, 10 Hsiu-His-Trp-Ser-OH, ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, □ . □

Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-OH, Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-OH, ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-OH tai

15 Qsiu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-OH

mukainen yhdiste tai tällaisen sopiva aktivoitu johdannainen saatetaan reagoimaan vastaavasti kaavan H-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, 20 H-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-A-B-Arg-Pro-E-F, H-B-Arg-Pro-E-F, H-Arg-Pro-E-F, H-Pro-E-F tai H-Azgly-Nl·^ mukaisen yhdisteen tai tällaisen sopivan aktivoidun johdannaisen kanssa peptidien liittämisessä käytetyllä standardi-25 menetelmällä.

Menetelmässä (a) suojaryhmiä voi olla lähtöaineessa yhtä monta kuin yhdisteessä on suojausta tarvitsevia radikaaleja, joita ovat esim. kaikki yhdisteessä olevat vapaat OH-ryhmät ja emäksiset NH-ryhmät.

30 Menetelmässä (a) suojaryhmä tai -ryhmät voivat ol la peptidikemian standarditeoksissa kuvattuja ryhmiä. Tällaisista teoksista voidaan mainita: M. Bodansky ja M.A. Ondetti, "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966, luku IV; F.M. Finn ja K. Hofmann, "The Proteins", Voi. II, 35 toimittanut H. Neurath ja R.L. Hill, Academic Press Inc.,

New York, 1976, p. 106; "Amino-acids, Peptides and Proteins" (Specialist Periodical Reports), The Chemical So- 4 75579 ciety, London, voi. 1-8. Näissä kirjoissa on myös esitetty erilaisia menetelmiä näiden suojaryhmien poistamiseksi.

Menetelmässä (a) erityisen sopiva NH-suojaryhmä on bentsyylioksikarbonyyliradikaali ja erityisen sopiva 0H-5 suojaryhmä on bentsyyliradikaali. Kumpikin näistä ryhmistä voidaan helposti poistaa hydraamalla, esim. käyttäen pal-ladium-hiilikatalysaattoria.

Menetelmässä (a) erityisen sopiva NH-suojaryhmä on lisäksi t-butoksikarbonyyliradikaali ja erityisen sopiva 10 OH -suojaryhmä on lisäksi t-butyyliradikaali. Kumpikin näistä ryhmistä voidaan helposti poistaa käsittelemällä hapolla, kuten kloorivetyhapolla tai trifluorietikkahapolla.

Menetelmässä (a) vielä eräs erityisen sopiva NH-suo-jaryhmä on bentsyylioksikarbonyyli- tai t-butoksikarbonyy-15 liradikaali ja erityisen sopiva OH-suojaryhmä on t-butyyli-radikaali. Nämä suojaryhmät voidaan helposti poistaa käsittelemällä HBr:llä etikkahapossa.

Menetelmässä (b) voidaan käyttää mitä tahansa pepti-dikemiassa käytettyä standardiliittämismenetelmää, esimer-20 kiksi sellaisia, joita on kuvattu peptidikemian standardi-teoksissa, kuten yllä mainitussa Bodansky'n ja Ondetti'n teoksessa, luku V, ja yllä mainituissa Specialist Periodical Reports of the Chemical Society, voi. 1-8.

Menetelmässä (b) sopiva liittämisreaktio on atsidi-25 liittäminen, aktiivisen esterin liittäminen tai liittäminen käyttäen N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidiä 1-hydroksi-bentsotriatsolia. Edullinen liittämisreaktio on atsidiliit-täminen, ja varsinkin sellainen, jossa muodostuu His-Trp-tai Ser-Tyr-peptidisidos.

30 Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyt lähtöai neet voidaan valmistaa tunnetuista yhdisteistä peptidien liittämisessä käytetyillä standardimenetelmillä, peptidien suojauksen standardimenetelmillä ja peptidien suojauksen poiston standardimenetelmillä, jotka kaikki ovat alan asi-35 antuntevalle hyvin tunnettuja, ja joita on lähemmin kuvattu esimerkeissä 1 - 10.

Kuten yllä mainittiin keksinnön mukaisella menetel-

II

5 75579 mällä valmistetuilla yhdisteillä on luliberiiniagonistiomi-naisuuksia, so. niiden vaikutus muistuttaa luliberiinin vaikutusta, joka on luonnollinen alanäkökukkulan (hypotalamus) erittämä hormoni, joka vaikuttaa aivolisäkkeeseen saaden 5 sen erittämään keltarauhasmuodostusta ohjaavaa hormonia (LH) ja munarakkulaa stimuloivaa hormonia (FSH). Nämä kaksi ai-volisäkehormonia säätelevät lisääntymistapahtumaa, viimeksimainitun (FSH) vaikuttaessa munasarjoihin edistäen munarakkulan kypsymistä ja edellisen (LH) saadessa aikaan muna-10 solun irtoamisen. Kaavan I mukaisen yhdisteen vaikutus LH-eritykseen on odottamattomasti vahvempi kuin luliberiinin, ja sillä on siten käyttöä ihmisen hedelmättömyystilojen parantamisessa.

Yhdisteiden luliberiini-vaikutus voidaan osoittaa 15 esimerkiksi sen kyvyllä saada aikaan munasolun irtoaminen androgeeni-steriloiduilla, jatkuvassa kiimassa olevilla rotilla tai sen kyvyllä saada aikaan LH- ja FSH-eritys kypsy-mättömien urosrottien veriplasmaan tai hedelmöittymisväli-vaiheessa olevilla tai hedelmättömillä emälampailla, jol-20 loin LH- ja FSH-eritys mitataan kaksinkertaisella vasta-aine-radioimmuunikokeella.

Yllä mainittu koe androgeeni-steriloiduilla rotilla suoritetaan seuraavasti:

Androgeeni-steriloiduilla naarasrotilla, joita on 25 käsitelty 3, 4 ja 5 vrk ikäisin 100 |jg:lla testosteroni-propionaattia, on pysyvä kiimainen emätinlima ja lukuisia munasolun irtoamista edeltäviä munarakkuloita munasarjoissa. Antamalla luliberiiniä tai sen aktiivisia analogeja saadaan aikaan LH:n ja FSH:n vahva vaikutus munasarjoihin, 30 mikä voidaan kokeellisesti osoittaa munasolujen esiintymisestä Fallopiaputkissa ja tuoreesta keltarauhasesta munasarjoissa .

Kaikki keksinnössä esitetyt yhdisteet ovat aktiivisempia kuin luliberiini ovulaation aikaansaamisessa jatku-35 vakiimaisilla rotilla, eikä niillä ole osoittautunut olevan myrkkyvaikutusta niitä annettaessa vähintään 4-kertai-sena minimiaktiiviannoksena. Varsinkin keksinnön esimer- 6 75579 keissä 4, 6 ja 7 kuvatuilla edullisilla yhdisteillä on noin 100-kertainen aktiviteetti luliberiiniin verrattuna, eikä niillä ole saatu myrkkyvaikutusta, kun niitä on annettu 100-kertainen minimiaktiiviannos.

5 Tulokset on esitetty taulukossa 1.

Il 7 75579 -jpj S2 ·Η -Μ 3 fj pj o oo o o 3 Φ S o o o to o o o

Vh CO if at- «N iH OI i—ItOrHr-l

•H *H 0) I I I I I I I I I I

> i—f > JtCMOlOCOOOOOO

,rj 3 ^ O O 00 t-l LO LO

ti 03 ^_____________*m

•S

+J O LO o O O r- oo o o o o o o o ro O O- oo oo rfl o o- O o o LO o o o o o oo o o o o

fU ^ r—i r~IrHiHfHr-tfHrHrHrHrH

_ .15 w “2 ab :(3 Ä E OO LO 00 00 OO OO OO OO OO OO lO ro ΓΟΟ 00 00 0000 0000 ---- V N V. \ X S S NN N N N N N N N — — N N N \ , O _y* ί «O (O a 00 OI 00 O 00 O 00 O LO O 00 CM 00 CM OOO 00 o

tn -H -S

I +J " ω jo ή i t__ s

C ^ LO UO CM

I (ti LO ΟΙΛ ΛΝ Oifl MH

CO -P LOOM OlO OlO UN OJ OI «H |Λ cm loco LO LO

I +-> OlOO CM ω LO CM LO OI OO OOOO .O O OO LOi—I rHO HO

«C MO IOCMjH i—IO OI iH Oi iH OO OO OO OO OO O O OO

L C N* OOO OO OO OO OO OO OO OQ OO oo QO

«h >> e bo 1 k —--

L LO LO

2 r r a: s:

(ti >J t*-l OI CM

H EH ^ O ^Nl ^Nl ^pi rä „

I I W >, bObObODObObObObO

^ ö ..33333333 3 3 “H 3 33333333®“

^N

/N 4-» ✓“> £ S £ < * § | 3 H £ I I H £ £

•H

4j -s ^ H Λ iHoirojTLOtor^cDcno

Ja 1 a a -L----—_ 8 75579

•H I

säE

•H «τΗ <V lO

> H > I

Ss-ag_ •s

H

TO o co oo

Hae o co oo

P i—I

_ H —

I TO :TO

w ti H

1 w:(ö 0 csjioco

CU _ 3 tN ld H

tr .9 3

M ij *—I

f |~ cq g < <5 i--- — μ 3 >i 3 H ^ M I nj

•PM 4J O LO

(0 QJ ra -P oho -rn “ SS ^ L Ι'ώ 000 HM 3

Eh ^ O l-- M ra

M -H (N

3 K f*-> S

H I S

3 3

flö rH

En ,_O---—-- □ w ^

H

<s> ω jj < i * ώ

S

ΰ

II

9 75579

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetun yhdisteen farmaseuttinen koostumus sisältää aktiiviaineena yhdistettä yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän laimennus- tai kantaja-aineen kanssa.

5 Koostumus voi olla esimerkiksi sopiva suun kautta tai poskesta tapahtuvaan lääkeantoon, esimerkiksi tabletteina tai kapseleina, nenän kautta tapahtuvaan lääkeantoon, esimerkiksi nuuskana, nenäsuihkeena tai nenätippoina, emätin-tai peräsuoliantoon, esimeriksi suppositoreina, tai paren-10 teraaliin antoon, esimerkiksi steriileinä injektioliuoksina tai suspensioina.

Koostumukset voidaan yleensä valmistaa tavallisella tavalla käyttäen tavanomaisia täyteaineita. Oraalisesti annettaviksi tarkoitetut koostumukset voidaan kuitenkin sopi-15 vasti päällystää suojapäällysteellä aktiivisen polypeptidi-aineosan suojaamiseksi mahalaukun entsyymien vaikutusta vastaan .

Koostumus saattaa myös sisältää keksinnön mukaisen polypeptidin lisäksi yhtä tai useampaa muuta tunnettua aktii-20 viainetta, esim. prostaglandiinijohdannaista, kuten prostag-landiini-F2<*, kloprostenolia tai fluprostenolia, tai esim. klomifeenia tai tamoksifeenia.

Edullinen koostumus on oraaliseen käyttöön sopiva yk-sikköannos, esim. tabletti tai kapseli, joka sisältää annos-25 ta kohti 2,5-500 mg, edullisesti 10-100 mg polypeptidiä, tai parenteraalisesti annettava sopiva valmiste, joka sisältää 5 /ug-1 mg, edullisesti 10-100 yug polypeptidiä liuoksen ml:aa kohti.

Parenteraalinen koostumus on edullisesti isotoniseen 30 suolaliuokseen tai isotoniseen dekstroosiin valmistettu liuos, joka tarvittaessa on puskuroitu pH 5-9:ään. Vaihtoehtoisesti parenteraalinen koostumus voi olla hitaasti aktii-viainetta vapauttava, missä tapauksessa polypeptidimäärä yk-sikköannosta kohti on yleensä suurempi kuin tavallisessa 35 injisoitavassa koostumuksessa. Edullinen hidasvaikutteinen parenteraalikoostumus sisältää 100yug-l,0 mg polypeptidiä yksikköannosta kohti.

10 75579

Koostumusta annetaan normaalisti siten, että päivittäinen oraaliannos on 50 yug/kg ja päivittäinen parenteraali-annos esimerkiksi intravenöösinä, subkutaanina tai intramus-kulaarina injektiona tai infuusiona on 0,2-100 yug/kg. Ihmi-5 sellä nämä annokset ovat kaikkiaan 3,5 mg - 1,4 g päivässä oraalisti annettuna tai 14 ^g - 7 mg kokonaisannos päivässä parenteraalisti. Annettaessa limakalvojen kautta päiväannos vaihtelee yllä mainittujen oraali- ja parenteraaliannosten välillä.

10 Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä:

Esimerkeissä Rf viittaa nousevaan ohutkerroskromato-grafiaan (t.l.c.) piihappogeelilevyillä (Kieselgel G). Kro-matografiassa käytettiin seuraavia liuotinsysteemejä: butan-l-oli/etikkahappo/vesi (4:1:5 v/v) (R^A), buta-l-oli/-15 etikkahappo/vesi/pyridiini (15:3:12:10 v/v) (R^B), butan-2-oli/3-%:inen , w/v, ammoniumhydroksidin vesiliuos (3:1 v/v) (RfC), asetonitriili/vesi (3:1 v/v) (R^D), asetoni/klorofor-mi (1:1 v/v) (RfE), kloroformi/etanoli (1:4 v/v) (RfF), syk-loheksaani/etyyliasetaatti (1:1 v/v (RfG), sykloheksaani/-20 etyyliasetaatti/metanoli (1:1:1 v/v) (RfH), kloroformi/meta-noli/vesi (11:8:2 v/v) (RfK), kloroformi/metanoli (19:1 v/v) (RfP) ja kloroformi/metanoli (9:1 v/v) (RfQ). Levyt tutkittiin aina UV-valossa, ja niitä käsiteltiin fluoreskamiinil-la, ninhydriinillä ja klooritärkkelys-jodidilla. Jollei muu-25 ta ilmoiteta, niin R^-arvo tarkoittaa, että näillä menetelmillä saatiin yksi ainoa täplä.

Kaikkien tässä kuvattujen tuotteiden happohydrolysaa-tit valmistettiin kuumentamalla peptidiä tai suojattua peptidiä 6-n kloorivetyhapossa, joka sisälsi 1 % w/v fenolia, 30 suitetussa tyhjiöputkessa 16 tuntia 100°C:ssa. Kunkin hydro-lysaatin aminohappokoostumus määritettiin LoCarte-aminohap-poanalysaattorilla, ja kaikissa tapauksissa se täsmäsi odotetun koostumuksen kanssa. Esimerkeissä käytetyllä ilmaisulla "jatkokäsiteltiin tavallisella tavalla" tarkoitetaan että 35 reaktion jälkeen mahdollinen kiinteä jäännös poistettiin suodattamalla, suodos haihdutettiin kuiviin alle 40°C:n

II

11 75579 lämpötilassa, etyyli-, asetaattiin liuotettu jäännös pestiin 20-%:isella sitruunahapolla, vedellä, kyllästetyllä natriumvetykarbonaattiliuoksella ja vedellä, kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla, ja etyyli-5 asetaatti haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin haluttu yhdiste.

Esimerkit 1-10 L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L- seryyli-L-tyrosyyli-A-L-leusyyli-L-arginyyli-L-prolyyli- 10 E-F:n synteesi Yleinen menetelmä (m) (kaaviot 1 ja 2)_ Jäähdytettyyn (0°C) ja sekoitettuun L-pyrogluta-myyli-L-histidiinihydratsidin (0,2 mmoolia) suspensioon dimetyyliformamidissa (0,9 ml) ja dimetyylisulfoksidissa (0,7 ml) lisättiin 5,7-n kloorivedyn dioksaaniliuosta 15 (0,8 mmoolia). 5 minuutin voimakkaan sekoituksen jälkeen saatiin kirkas liuos. Liuos jäähdytettiin -20°C:seen, siihen lisättiin t-butyylinitriittiä (0,22 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin 25 minuuttia. Sitten lämpötila alennettiin -30°C:seen, ja liuos neutraloitiin lisäämäl-20 lä trietyyliamiinia (0,8 mmoolia). Lisättiin jäähdytetty (-20°C) L-tryptofyyli-L-seryyli-L-tyrosyyli-A-L-leusyyli-L-arginyyli-L-prolyyli-E-F-dihydrokloridin (0,1 mmoolia, saatu hydraamalla N-bentsyylioksikarbonyy-lijohdannainen 80-%:sessa vesi/metanoliliuoksessa (v/v), 25 joka sisälsi 2 ekvivalenttia kloorivetyä Pd/C-katalysaat-torin, 5 % w/w, läsnäollessa 16 tuntia) ja trietyyli-amiinin (0,1 mmoolia) seos dimetyyliformamidissa (1 ml), ja reaktioseosta sekoitettiin 24 tuntia 4°C:ssa. Dimetyylif ormamidi haihdutettiin tyhjiössä, ja jäännös kroma-30 tografoitiin Sephadex LH-20-pylväällä käyttäen eluenttina dimetyyliformamidia. Peptidihydrokloridi lisäpuhdistet-tiin partitiokromatografiällä Sephadex G-25:llä käyttäen liuotinsysteemiä n-butanoli/etikkahappo/vesi/butanoli (5:1:5:1 v/v).

12 75579 L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L-seryyli-L-tyrosyyli-A-B-L-arginyyli-L-prolyyli-atsa-glysiiniamidi. Yleinen menetelmä (n) (Kaaviot 3, 4 ja 5) L-pyrOglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L-5 seriini-hydratsidi (0,2 mmoolia) liuotettiin dimetyyli-formamidiin (4 ml) ja muutettiin atsidiksi menetelmässä (m) kuvatulla tavalla. Se liitettiin menetelmässä (m) kuvatulla tavalla L-tyrosyyli-A-B-L-arginyyli-L-prolyyli-atsaglysiini-amidihydrokloridiin (0,15 mmoolia), joka 10 oli valmistettu pelkistämällä katalyyttisesti N-bentsyy-lioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-A-L-leusyyli-(N ω-nitro)-L-arginyyli-L-prolyyli-atsaglysiini-amidi 80-%:isessa (v/v) vesipitoisessa metanolissa 20 tuntia Pd/C-katalysaattorin (5 % w/w) läsnäollessa, ja hydroklo-15 ridina saatu hydrokloridi puhdistettiin yllä kuvatulla tavalla.

L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L-seryyli-L-tyrosyyli-A-B-L-arginyyli-L-prolyyli-atsa-glysiini-amidin synteesi.

20 _Yleinen menetelmä (o) (kaaviot 4 ja 6)_

Suojatun dekapeptidijohdannisen (jossa on Ser (Bufc) 6-asemassa tai Tyr(But) 5-asemassa) (50 mg) liuos valmistettiin 90-%:iseen (v/v) trifluorietikkahapon vesiliuokseen (5 ml). Lisättiin 3 tippaa /0 -merkaptoetano-25 lia, ja liuos sai seistä huoneen lämpötilassa 45 minuuttia. Liuotin poistettiin tyhjössä, ja jäännös kylmäkui-vattiin kerran vedestä ja 2 kertaa t-butanolissa. Saanto 90 - 100 %.

Seuraavassa taulukossa 2 on lueteltu näillä ylei-30 sillä menetelmillä valmistetut esimerkkien 1-10 yhdisteet: 11 13 75579 oo O O t— m ιγν ιΛ lT' -^γ < cvj ιπ m «v m f\j oi (M »n CC O O O O O O θ' θ' θ' o" IT.

O „ <—i t— c~- '.o no t— o ® O O b- KN OO On On CO On f i . ( r i o ο ο ο ο ο o

4 J

•H -S

S » δ C-----

,0 'H

*<Η C O *r* fj *H

p f4 ®{ ^ KN r\J ^ ^

φ r-K'* On On On O LfN ON ON On CO CO

•h r ~ ^ ^ _

fed* OOOrMOOOOOO

S* IM

S. <T

<*>

. O ^WOJOUNtnHLTNNONO

0 «3 .* c2 λ: ___ 1 g Ά o

E- V

O) S EE^c'cccooc 2u ~ ; ~

Ui IV. , CM r\j *» CNJ r\j cnj r\j r\j pj r\j I ** V V 5: 5 5 S K tu a: a: M 5 5 2 2 ‘-2 ΪΠ i _ 11 M ----- Λ O' ri *-· Ή rH t-l ,H ,-) ( tj 1-0 LO LO bO bO li) ()0 u I ω 1 1 L1 ” 22 N N >·» f

i---—-----L

.f 3 3 . _ - m m

Ui

>1 ω πί ^ α> <u α>.<υ (\J ö» 0> <D

γ ___·~’ -1 -1 .-1 o .1 u s s M ——-— 0) Λ 4J Ä W Q) 3 Q) ft < >ιΐβ(βα>04^·^·φ^^

W < < Q Q Q I I I

£----- Q Q Q

I . " " “ 1 ^

jjj HO

□° £== M cm --r to vo «>. co on 2 14 75579

Yllä mainituissa menetelmissä käytetyt lähtöaineet voidaan valmistaa seuraavien kaavioiden 1 ja 2 (menetelmä (m)), kaavioiden 3, 4 ja 5 (menetelmä (n)) ja kaavioiden 4 ja 6 (menetelmä (o)) mukaan.

5 Näissä kaavioissa käytetään seuraavia lyhennyk siä: OCp * 2,4,5-trikloorifenyyliesteri Bzl = bentsyyli Z = bentsyylioksikarbonyyli 10 BOc = t-butoksikarbonyyli DMF = dimetyyliformamidi

Ympyröidyt numerot viittaavat kulloinkin käytettyyn reaktiovaiheeseen.

Il 15 75579 u"t mm m mmm mm

K ffi® ffi K K K K K

<N (N (N (N (N <N <N (N (N

u υυ UUOCJUU

0 o Z z z zzzzzz £-h-- I „ I-----f_ Θ @ f= 2.Ί S £ a" * * < * k-=-(-^^ ^ JE\_ o o o o ^

® CD /-X

© M

. Ε~ W

1 _ S £ I ar S ® © 0

Il -H

u > II <o

O «J

υ υ ^ '? ? , V Λ =? ” < tC-Z te—2 χ_«5 n- J, -H. 7^ '—t I T f “'“l* ™ ho o)----- r\j x i Λ n m to

S (S) ^ (m) ^ ^ r\ ^ s-T

aU (J ® ® © (§)

t* h8®n 6¾ h y h aT

“L-A.JLj2>^___S

Mnm " . B- © : <u aj z ^ e

fc-« jj 2J <"Ό f'fn'i »H

.%_ O o a a -H

(Tj

rH

X (Ti © © 0 5 G· = " (->__ O,

" 1 K

N M M M N x x

(N

<U <1) § -H

•λ E S E m' C

a. _ o o g 2" .h --- tn >1

rH

n en (rs © © * r-3 D?-----1 I I I I < 16 75579

CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM

B ® ® ® B B B KK® Γ^ΖΖΖΒΒΖΖ Ζ Ζ Ζ

*“ί I

hfl_J__ t) 1 -------

< X

s © © £______

Cl, I i------------ CJ CM £TJ /-> © ©

CM CM CM

oao®o + + + + + + zozoz a ® a a a a S-^^1_\, a B ©

3 Q

Λ----|-------- M M N 3* „ I s I © © 3 0 0 2 2 c*r._ Λ -------- a ® © (§) H & m ., H ^

» N O N N 7j m O

£-____3 1 T~ (0 M M N tsj N J. *g s' (ίλ\ III vö 5 ----° °. *. ___ a

x © © (D

6 -4_|_^_I_|_1_ M Μ N) cs) Μ χ

CM

0) <U 2 a a a m in o o z 2 •H .

- --1—-^-1- a s· © © o cl----1_

II

17 75579 r—( X X X X £ ffi 33 33 N-----1__J_L___ ^ x

0 g (§) (D

b-1-h—^----- IM to X (&\ ί^λ

Vnj IPij PJ f\j r\j c\j

¢0 kci 9 9 § % X

<_Nl N| \ \ \

O 8 K

cq en «υ Χ™ ©

$ £1 ,<U Λ) g X

3 0¾ 6 6 1 a I 1 1 I 1 ^__ 33 x © © S~\ .f ®| Q © ® ©___

N N = © © (I

Ο» Ή rH rH rH

. M O N N fj fg C COOCQaXCQCQ ^ f}-_\ _\ \__” Ν N N tSJ M X > (0 (0 C\J ^ u i i i § 1 ^ -1—^—1—^^—f- x * © © g ] I_____

to Nl X

p" (¾ (¾ £

4* .« I vä' ^ A

m Ö Ö * a Q

P I

---------- 1 x X 0* S® © ® :

3 O

[5-1-1—1—I—^—L

18 75579

(N (N (N CM

^ td tC td 93

£ S 9! Z K

bO

f) *-—-—------ < o_ © l·.-——-—---. ___ dl

rvj C\J

O O + + ?-*x •at

c\j PC

X

(U Φ 0) OJ X

g- 51 5Γ 5; X r^v 3 Ο ° ° Ο 2: χ 3Η—I—^—a-^^--- * © © s © © © © ® © < —1--------- ti « X © © © © ο Ι-Η Ι-l f-H Ή N Ο « N CJ Μ cq o to. cq ων ω ο e--Ν—^^^—1\]__> Μ 5 N N N (Μ »

X

OJ

φ-------- οο ~------ +© d

S

m φ a w

u - I

H Q

'φ _ © t

K -—-—---I

Q

II

< 3 (—I ___ cy ' --

II

19 755 79

OJ ΓΜ t\J CM

χ x x x

>> 2 X X X

rH

hO______

N

< © o____ c.

PU

OJ OJ

O O + + X 2 X x Ϊ—:_^^_Ns_Ns <

X

c\j

& (u a> <u X

g s ε ε z 3 0 0 o o x

<D <2 X

•J

<υ--------- ε ΰ x® © © © © ©

V-' X

5-i O u-> >1 ___ E|< o O tsi to X ’>

(O

(H Q. <H r-t <—( r-t s5

tJ O tJ tJ N N

CQ O CO X X X

&--N >] N \ \|__ N „

to ts) to to X

OJ

X

S

tj . XX

(D ____________ c/i a

Cl _ .___

Ei © t/) *<H - - - ---------- - - - - - ----. I . .. I. . — .

X

3 rH 1 "" 1 '1 1 ‘ 1 "

Ci 20 75579 OJ _ OJ C\J cvj oj 31 x 2: χ χ 2 <c, 2 2

rH

60 ___ N :-- < ® o ________ u CL·

r\J

o + + + 2 31 X sc if__\^\ < ' 31 ru 31 Q) OI 0) Q) 21 3 ε ε ε ε 3i κλ <u o o o o s 2 QJ------->---- ε © © ® © © © <U 21

2 O

Cu <*> I---------- o 2

x -H

N M > 03 +>+>+> 42> +>+>+> v3 3X33333 3 *

XOCQCQ X CQ CQ X

S;_ N \.\ \ N \ \_

H

N 3-i

N N N N

fro 2 ti

OJ

tn a

Sh_:____ E-i © 10 •rH - — ___ -- _________ ________ __

X

d H — - " _. _ — D°

II

2i 75579

Vaihe 1 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-proliinia (1994 g, 80 mmoolia) ja N-metyylimorfoliinia (8,8 ml, 80 nunoolia) liuotettiin kuivaan tetrahydrofuraaniin (200 ml), ja 5 liuos jäähdytettiin -20°C:seen. Lisättiin tipoittain etyyliklooriformiaattia (7,15 ml, 76 mmoolia), ja 2 minuutin sekoituksen jälkeen jäähdytettyä (-20°C) etyyli-amiinin vesiliuosta (20 ml, 300 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin 18 tuntia 4°C:ssa. Reaktioseosta jatkokäsitel-10 tiin tavallisella tavalla, ja jäännös kiteytettiin etyyli-asetaatti/petrolieetteristä (kp. 60 - 80°C). Saanto 12,97 g (58,7 %), sp. 107 - 108°C. 43,88° (c, 1 metano- lissa), RfD 0,69, RfE 0,53, RfF 0,67, FfH 0,62, RfP 0,57, FfQ 0,66.

15 Vaihe 2

Katalyyttinen pelkistys Pd/C-katalysaattorin (5 %) läsnäollessa vesipitoisessa etanolissa, jossa on 1 ekvivalentti kloorivetyä, 5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa .

20 Vaihe 3 N «('-t-butoksikarbonyyli-N c(-nitro-L-arginiinin (13,5 g, 42,3 mmoolia), L-proliini-etyyliamidihydroklori-din (7,15 g, 47 mmoolia), 1-hydroksibentsotriatsolin (11,5 g 85 mmoolia) ja trietyyliamiinin (6,58 ml, 25 47 mmoolia) liuos DMFrssä jäähdytettiin 0°C:seen, ja liuokseen lisättiin disykloheksyylikarbodi-imidiä (9,13 g, 44,4 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin 4°C:ssa yön yli, se suodatettiin kiinteän aineksen poistamiseksi, ja suodos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Jäännös jaettiin 30 etyyliasetaatin ja veden kesken vastavirtajakomenetelmällä (4 siirtoa). Vesifaasit yhdistettiin, haihdutettiin kuiviin ja jäännös jaettiin n-butanolin ja 5-%risen (v/v) etikkahapon vesiliuoksen kesken vastavirtajakomene-telmällä (12 siirtoa). Yhdistetyistä n-butanolifaaseista 35 haihduttamalla saatu raakapeptidi puhdistettiin kromatog-rafoimalla piihappogeelipylväällä käyttäen eluointiin 22 7 557 9 5-%:ista (v/v) metanoli/kloroforraia ja 10-%:ista (v/v) metanoli/kloroformia. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin kuiviin, ja jäännöksen vesi-liuos laskettiin anioninvaihtohartsipylvään (AG 1-X2) 5 lävitse n Qf-t-butoksikarbonyyli-Nm -nitroarginiinin poistamiseksi. Pylväs pestiin sitten vedellä, ja yhdistetyt vesifaasit ja pesunesteet kylmäkuivattiin, jolloin saatiin atsapeptidi johdannainen, saanto 16,67 g (89 %), sp. 109 - 111°C (hajoaa), - 39,0° (c, 1 metano- 10 lissa), RfA 0,62, RfB 0,74, RfC 0,59, RfD 0,70, RfH 0,20, RfF 0,60, FfH 0,61, RfK 0,85, RfQ 0,13

Valhe 4 N-t-butoksikarbonyylijohdannainen liuotettiin etyyliasetaattiin, ja liuosta käsiteltiin 3-n HCl-etyyli-15 asetaattiliuoksella (4 ekvivalenttia) tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Vaihe 5 (R =H) t-butoksikarbonyylihydratsidin (2,90 g, 22 mmoolia) ja N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-20 tyrosiini-2,4,5-trikloorifenyyliesterin (11,71 g, 20 mmoolia) liuosta dimetyyliformamidissa (40 ml) pidettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, ja jäännös kiteytettiin eetteri/ petrolieetteristä (kp. 60 - 80°C), jolloin suojattu hyd-25 ratsidi saatiin valkeana jauheena, 3,46 g (67 %), sp.

126 - 127°C, = -13,2° (c, 1 metanolissa) , R^D

0,82, RfE 0,65, RfF 0,63, FfH 0,70.

Vaihe 6 (R = H) 1-(N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-30 L-tyrosyyli)-2-t-butoksikarbonyylihydratsidi (5,19 g, 10 mmoolia) liuotettiin etyyliasetaattiin (50 ml), ja liuosta käsiteltiin 5-n kloorivedyllä etyyliasetaatissa (8 ml, 40 mmoolia) tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Etyyliasetaatti haihdutettiin tyhjössä, jäännökseen li-35 sätiin eetteriä, hydrokloridi suodatettiin ja kuivattiin.

Il 23 7 5 5 7 9

Vaihe 7 (R = H). Yllä saatu hydrokloridi liuotettiin tetrahydrofuraaniin (75 ml), ja liuokseen lisättiin trietyyliamiinia (1/15 g 8 mmoolia) ja sitten N-karbo-5 nyyli-L-leusiinimetyyliesteriä (1/36 g, 8 mmoolia).

16 tunnin seisotuksen jälkeen huoneen lämpötilassa reak-tioseosta jatkokäsiteltiin tavallisella tavalla, ja jäännös kiteytettiin etyyliasetaatti/petrolieetteristä (kp.

60 - 80°C), jolloin saatiin atsatripeptidijohdannainen, 10 4,57 g (77,7 %) , sp. 156 - 157°C, ^ = -10,3° (c, 1 metanolissa), RfD 0,81, R^E 0,45, RfP 0,26, R^Q 0,47.

Vaihe 8 N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyro-syyliatsaglysyyli-L-leusiinimetyyliesterin (2,95 g, 5 15 mmoolia) liuokseen metanolissa (50 ml) lisättiin hydrat-siinihydraattia (5 ml, 100 mmoolia). 2 tunnin seisotuksen jälkeen huoneen lämpötilassa hydratsidi saostettiin vedellä ja kiteytettiin uudelleen metanoli/eetteristä, jolloin saatiin 2,74 g. (92,8 %) , sp. 169-170°C., 20 - 9,05° (c, 1 dimetyyliformamidissa), R^A 0,76, R^B 0,75,

RfC 0,73, RfD 0,63, RfF 0,60, RfH 0,55.

Vaiheet 9 ja 10 (R = H). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyliatsaglysyyli-L-leusiinihydratsidia (1,18 g, 25 2,0 mmoolia) liuotettiin dimetyyliformamidiin (10 ml), liuos jäähdytettiin -20°C:seen, ja siihen lisättiin 5,49-molaarinen kloorivedyn dioksaaniliuos (1,46 ml, 8 mmoolia) ja sitten t-butyylinitriittiä (0,25 ml, 2,2 mmoolia).

5-minuutin kuluttua liuos jäähdytettiin -30°C:seen, ja 30 siihen lisättiin jäähdytetty N^-nitro-L-arginyyli-L- proliini-etyyliamidihydrokloridin (0,836 g, 2,2 mmoolia) ja trietyyliamiinin (1,43 ml, 10,2 mmoolia) seos dimetyyliformamidissa (10 ml). Reaktioseosta sekoitettiin tunnin ajan -10°C:ssa ja 48 tuntia 4°C:ssa. Jatkokäsit-35 tely suoritettiin tavallisella tavalla ja pentapeptidi puhdistettiin piihappogeelipylväällä kromatografoimalla 24 755 7 9 käyttäen eluointiin kloroformia ja 3 % (v/v) metanolia sisältävää kloroformia, saanto 0,695 g (38,5 %), R^A 0,71, RfB 0,72, RfC 0,84.

Vaihe 11 5 (R = H). Katalyyttinen pelkistys käyttäen kata lysaattorina Pd/C (5 % w/w) 80-%:isessa (v/v) vesipitoisessa etikkahapossa, joka sisälsi 2 ekvivalenttia HC1.

Vaihe 12 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-tryptofäänin (33,84 g, 10 100 mmoolia) ja N-metyylimorfoliinin (11,0 ml, 100 mmoolia) voimakkaasti sekoitettuun, jäähdytettyyn (-20°C) liuokseen tetrahydrofuraanissa (200 ml) lisättiin etyylikloo-riformiaattia (9,0 ml, 95 mmoolia). 2 minuutin kuluttua lisättiin L-seriini-metyyliesterihydrokloridin (17,10 g 15 110 mmoolia) ja N-metyylimorfoliinin (12,1 ml, 110 mmoo- lia) esijäähdytetty (-20°C) liuos dimetyyliformamidissa (150 ml), ja sekoitusta jatkettiin -20°C:ssa 30 minuuttia ja huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Tavallisella tavalla suoritetulla jatkokäsittelyllä saatiin öljy. Kiteyttämällä 20 2 kertaa etyyliasetaatti/petrolieetteristä (kp. 60 - 80°C) saatiin dipeptidijohdannainen (30,53 g, 69,5 %), sp.

140,5 - 141°C, = “22,13° (c, 1,4 dimetyyliformami- dissa).

Vaihe 13 25 Edellä saatu esteri (30,53 g, 69,5 mmoolia) liu- tettiin metanoliin (1 litra), ja liuokseen lisättiin 62-%:isa (w/v) hydratsiinihydraatin liuosta (15 ml). 16 tunnin kuluttua hydratsidi koottiin, pestiin metanolilla ja eetterillä ja kiteytettiin kuumasta etanolista (23,18 g, 30 75,8 %) , sp. 178 - 179°C, = “25,27° (c, 1 dimetyy lif ormamidissa), R^D 0,65, RfE 0,20, RfF 0,43, R^H 0,50.

Vaiheet 14 ja 15 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-tryptofyyli-L-serii-nihydratsidin (0,502 g, 1,16 mmoolia) jäähdytettyyn 35 (-20°C) ja sekoitettuun liuokseen dimetyyliformamidissa (5 ml) lisättiin 6,02-n kloorivedyn dioksaaniliuosta

II

25 7 5 5 7 9 (0,77 ml, 4,64 mmoolia) ja sen jälkeen t-butyylinitriit-tiä (0,14 ml, 1,22 mmoolia). 30 minuutin kuluttua liuos jäähdytettiin -30°C:seen ja neutraloitiin lisäämällä trietyyliamiinia (0,65 ml, 4,65 mmoolia). Lisättiin L-5 tyrosyyliatsaglysyyli-L-leusyyli-L-arginyyli-L-proliini- etyyliamididihydrokloridin (0,547 g, 0,77 mmoolia) ja treietyyliamiinin (0,108 ml, 0,77 mmoolia) esijäähdytetty (-20°C) seos dimetyyliformamidissa (5 ml), ja sekoitusta jatkettiin tunnin ajan -20°C:ssa ja 48 tuntia 4°C:ssa.

10 Reaktioseos suodatettiin, ja suodos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Raakapeptidi puhdistettiin pylväskromatografi-alla piihappogeelillä käyttämällä eluointiin kloroformia, 10-%:ista (v/v) metanoli/kloroformia ja kloroformi/me-tanoli/vesiseosta (11:8:2 v/v), saanto 0,424 g (52,9 %), 15 /c£7q5=“16/84° (c, 1,5 metanolissa), R^A 0,61, R^C 0,36,

RfD 0,67, RfK 0,90.

Vaihe 18 (R = Me). Samoin kuin vaihe 5, saanto 66 %, sp.

102 - 104°C, = -15,5° (c, 1 metanolissa), RfD 0,76, 20 RfE 0,68, RfF 0,76, RfH 0,74.

Vaihe 19 (R = Me) . Samoin kuin vaihe 6.

Vaihe 20 (R = Me). Samoin kuin vaihe 7, saanto 93 %, sp.

25 145 - 146°C, = +8,7° (c, 1,2 metanolissa), RfA

0,88, RfB 0,88, RfC 0,83, RfD 0,80, RfE 0,59, RfF 0,78,

RfH 0,73.

Vaihe 21 N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-30 atsa-alanyyli-L-leusiini-metyyliesterin (2,41 g, 4 mmoolia) sekoitettuun liuokseen metanolissa (36 ml) lisättiin 1-n natriumhydroksidia (12 ml), 12 mmoolia) huoneen lämpötilassa, ja sekoitusta jatkettiin 3 tuntia. Metanoli poistettiin tyhjössä, ja jäännöksen vesiliuos (40 ml) tehtiin 35 happameksi sitruunahapolla (pH 3) ja uutettiin etyyliasetaatilla. Etyyliasetaatti pestiin vedellä ja kuivattiin 26 75579 (Na2S04), liuotin poistettiin, ja jäännös liuotettiin dimetyyliformamidi/vesiseokseen (3:2 v/v, 200 ml) ja vietiin AG 1 x-2-hartsipylväälle (100 ml). Pylväs pestiin yllä mainitulla liuottimena (50 ml) , ja tripeptidi eluoi-5 tiin 0,2-m etikkahapolla dimetyyliformamidi/vesiseoksessa (3:2 v/v). Tripeptidiä sisältävät fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin tyhjössä, ja jäännöstä trituroitiin eetterin kanssa. Tuotetta saatiin 1,22 g (51,7 %), sp. 195°C (hajoaa), = -25,4° (c, 1 dimetyyliformamidissa) .

10 Vaihe 22 (R = Me). Samoin kuin vaihe 10, saanto 43 %, = -25,9° (c, 1 metanolissa) , R^A 0,72, RfB 0,76,

RfC 0,85.

Vaihe 23 ^ (R = Me). Samoin kuin vaihe 11.

Vaihe 24 (R = Me). Samoin kuin vaihe 15 paitsi, että lopputuote puhdistettiin piihappogeeli-pylväskromatografoin-nin jälkeen lisäksi geelisuodatuksella Sephadex LH-20:llä ^ dimetyyliformamidissa. Saanto 63 %, - -24,76° (c, 0,8 metanolissa), R^A 0,58, R^C 0,42, R^D 0,65, RfK 0,95.

Vaihe 25 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-proliinin (24,9 g, 100 mmoolia), semikarbatsidihydrokloridin (11,2 g, 100 25 mmoolia) ja trietyyliamiinin (14,5 ml, 100 mmoolia) sekoitettuun ja jäähdytettyyn (0°C) suspensioon dimetyyliformamidissa (200 ml) lisättiin disykloheksyylikarbodi-imidiä (20,6 g, 100 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin 16 tuntia 4°C:ssa. Disykloheksyyliurea poistettiin suo-30 dattamalla, ja suodos haihdutettiin pieneen tilavuuteen. Lisättiin vettä (200 ml), ja liuos uutettiin etyyliasetaatilla (3 x 50 ml). Tuote saostui vesiliuoksesta noin tunnin kuluessa. Uudelleenkiteyttämällä vesipitoisesta metanolista saatiin dipeptidiamidi (16,5 g, 53,9 %) sp.

35 189 - 190°C, /o= -43,6° (c, 1,4 dimetyyliformamidis sa), RfD 0,54, RfF 0,52, RfH 0,38, RfK 0,78.

Il 27 75579

Vaihe 26

Katalyyttinen pelkistys 80-%:isessa (v/v) vesipitoisessa dimetyyliformamidissa 5-%:isen (w/w) Pd/C-katalysaattorin avulla 6 tunnin ajan huoneen lämpötilas-5 sa HCl:n läsnäollessa (2 ekvivalenttia).

Vaihe 27 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-leusiinin (8,24 g, 31 mmoolia) ja trietyyliamiinin (4,55 ml, 32,5 mmoolia) liuokseen tetrahydrofuraanissa (100 ml) lisättiin - 10 -10 -15°C:ssa etyyliklooriformiaattia (2,83 ml, 29,5 mmoolia).

Reaktioseosta sekoitettiin 3 minuuttia tässä lämpötilassa, ja sitten se kaadettiin Νω-nitro-L-arginiinin (5,79 g, 31 mmoolia) voimakkaasti sekoitetuun liuokseen 2-n nat-riumhydroksidissa (15,5 ml, 31 mmoolia) ja dimetyylifor-15 mamidissa (50 ml) -10°C:ssa. Sekoitusta jatkettiin -10° C:ssa. Sekoitusta jatkettiin -10°C:ssa 30 minuuttia ja sitten huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Liuottimet poistettiin tyhjössä, ja jäännös jaettiin etyyliasetaatin (50 ml) ja veden (50 ml) kesken. Vesifaasi erotettiin ja 20 uutettiin vielä kehdella etyyliasetaattiannoksella. Yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin vielä kerran vedellä (25 ml) ja hyljättiin.

Yhdistetyt vesifaasit tehtiin happameksi sitruu-nahappoliuoksella ja uutettiin etyyliasetaatilla (3 x 25 100 ml). Etyyliasetaattiuutteet yhdistettiin, pestiin vedellä, kuivattiin (Na2SO^) ja haihdutettiin kuiviin. Kiteyttämällä jäännös etyyliasetaatti/petrolieetteristä (kp. 60 - 80°C) saatiin dipeptidi (8,98 g, 62 %), sp.

150 - 165°C (hajoaa).

30 Vaihe 28 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-leusyyli- (N·*>-nitro) -L-arginiinin (9,2 g, 20 mmoolia), L-propyyliatsaglysiini-amidihydrokloridin (4,2 g, 20 mmoolia), 1-hydroksibentso-triatsolin (5,4 g, 40 mmoolia) ja trietyyliamiinin (3 ml, 35 20 mmoolia) liuos dimetyyliformamidissa (200 ml) jäähdy tettiin 0°C:seen, ja liuokseen lisättiin disykloheksyyli- 28 75579 karbodi-imidiä (8,2 g, 40 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötiloissa. Disykloheksyyli-urea poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin kuiviin. Uudelleenkiteyttämällä jäännös metanoli/eette-5 ristä saatiin tetrapeptidijohdannainen (12,2 g, 98 %), sp. 88 - 90°C, = “30,2° (c, 1,6 dimetyyliformami- dissa), RfD 0,57, RfF 0,40, RfH 0,26, RfK 0,63.

Vaihe 29

Hydraus 5 % sisen (w/w) Pd/C-katalysaattorin 10 avulla vesipitoisessa etanolissa kloorivedyn (2 ekvivalenttia) läsnäollessa 16 tunnin ajan.

Vaihe 30 N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosii-ni-2,4,5-triklorifenyyliesteriä (6,484 g, 11,0 mmoolia) 15 ja D-alaniinimetyyliesterihydrokloridia (1,396 g, 10 mmoolia) liuotettiin dimetyyliformamidiin (50 ml) ja liuokseen lisättiin trietyyliamiinia (1,4 ml, 10,0 mmoolia), ja liuosta sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa. Reaktioseoksen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella 20 tavalla, ja jäännös kiteytettiin kuumasta etyyliasetaatista, jolloin saatiin 3,782 g, 77,2 % suojattua dipepti-dimetyyliesteriä, sp. 163°C, = -12,84° (c, 1,1 dimetyyliformamidissa).

Vaihe 31 25 N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyy- li-D-alaniinimetyyliesteriä (3,453 g, 7,0 mmoolia) liuotettiin lämpimään metanoliin (400 ml), ja liuosta käsiteltiin 62 %:isella (w/w) hydratsiinihydraatilla (10 ml, 120 mmoolia) , ja seos jätettiin yöksi 25°C.:seen. Hydrat-30 sidi suodatettiin, pestiin metanolilla ja eetterillä ja kiteytettiin 2 kertaa kiehuvasta metanolista, saanto 3,068 g, 89,2 % sp. 217°C, -20,44° (c, 1,1 dimetyy liformamidissa) R^A 0,73 R^B 0,75, R^C 0,67, R^D 0,70,

RfE 0,50, RfF 0,54, RfH 0,67, RfK 0,85, RfQ 0,25.

Il 75579 29

Vaiheet 32 ja 33 Jäähdytettyyn (-20°C) ja sekoitettuun N-bentsyy-lioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-alaniinihyd-ratsidin (1,18 g, 2,4 mmoolia) liuokseen lisättiin 6,02-5 m kloorivetyliuos dioksaanissa (1,6 ml, 9,6 mmoolia) ja sitten t-butyylinitriittiä (0,29 ml, 2,52 mmoolia). 15 minuutin kuluttua lisättiin esijäähdytetty (-20°C) L-leusyyli-L-arginyyli-L-prolyyliatsaglysiiniamididihydrok-kloridin (1,03 g, 2,0 mmoolia) ja trietyyliamiinin (1,62 10 ml, 11,6 mmoolia) liuos dimetyyliformamidissa (15 mm).

Sekoitusta jatkettiin 4°C:ssa 24 tuntia. Trietyyliamiini-hydrokloridi poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Jäännös vietiin piihappo-geelipylväälle, ja pylväs eluoitiin 5-%:isella (v/v) me-15 tanoli/kloroformiseoksella, 10-%:isella metanoli/kloro-formiseoksella ja kloroformiiftetanoli/vesiseoksella (11:8:2 v/v). Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin ja kromatografoitiin uudelleen piihappogee-lipylväällä käyttäen eluointiliuottimena asetonitriili/ 20 vesiseosta (3:1 v/v), jolloin saatiin 890 mg ^ = “45,7° (c, 1,1 metanolissä). R^A 0,54, R^B 0,69, R^C 0,41.

Vaihe 34

Samoin kuin vaihe 11.

Vaihe 35 25 Samoin kuin vaihe 15, saanto 43 %, = -41,4° (c, 1,3 metanolissa), RfA 0,80, RfC 0,47, RfD 0,65, RfK 0,95.

Vaihe 38

Samoin kuin vaihe 3, saanto 69 %, sp. 135 C,

RfA 0,49, RfB 0,65, RfC 0,46, RfD 0,64, RfF 0,35, RfH 0,19, 30 RfK 0,86.

Vaihe 39

Samoin kuin vaihe 4.

Vaihe 40 (A = D-Phe). N-bentsyylioksikarbonyyli-D-fenyyli-35 alaniinin (7,41 g, 24,8 mmoolia) ja L-leusiinimetyylies- terin (3,62 g, 25 mmoolia) liuos etyyliasetaatissa (100 ml) 30 7 5 5 7 9 jäähdytettiin 0°C:seen, ja liuokseen lisättiin disyklo-heksyylikarbodi-imidiä (5,15 g, 25 mmoolia). Reaktio-seosta sekoitettiin yön yli 4°C:ssa. Tavallisella jatkokäsittelyllä ja kiteyttämällä jäännös etyyliasetaatti/ 5 petrolieetteristä (kp. 60 - 80°C) saatiin dipeptidi (9,1 g, 86 %), sp. 123 - 124°C, = -18,7° (c, 2,1 metanolissa), R^D 0,76, RfE 0,65, R^F 0,74, RfH 0,73.

Vaihe 41 (A = D-Phe) Katalyyttinen pelkistys 5 tunnin 10 aikana käyttäen 5 %:ista (w/w) Pd/hiiltä etanolissa, joka sisälsi 1 ekvivalentin kloorivetyä.

Vaihe 42 (A = D-Phe). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bent-syyli-L-tyrosiini-2,4,5-trikloorifenyyliesterin (4,89 g, 15 8,36 mmoolia) ja D-fenyylialanyyli-L-leusiinimetyylies- terihydrokloridin (2,5 g 7,6 mmoolia) sekoitettuun liuokseen dimetyyliformamidissa lisättiin trietyyliamiinia (1,1 ml, 7,6 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin huoneen lämpötilassa yön yli. Trietyyliamiinihydrokloridi suo-20 datettiin, ja suodos haihdutettiin kuiviin. Uudelleen-kiteyttämällä jäännös vesipitoisesta metanolista saatiin tripeptidijohdannainen (3,6 g, 69,7 %), sp. 183 -184°C, RfD 0,82, RfE 0,69, RfH 0,78, RfP 0,71, RfQ 0,82.

Vaihe 43 25 (A = D-Phe). Edellä saadun metyyliesterin (3,42 g, 5,04 mmoolia ja hydratsiinihydraatin (60 mmoolia) liuosta dimetyyliformamidissa (30 ml) sekoitettiin huoneen lämpötilassa 4 tuntia, sitten liuos haihdutettiin pienempään tilavuuteen ja hydratsidi saostettiin lisäämällä 30 vettä (500 ml). Se koottiin, pestiin vedellä metanoli/ eetterillä (1:4 v/v) ja eetterillä ja kuivattiin. Saanto 2,94 g (85,9 %), sp. 179 - 180°C, RfA 0,81, RfB 0,79, RfC 0,88, RfD 0,69, RfE 0,49, RfF 0,65, RfH 0,67, RfP 0,25, RfQ 0,57.

35 Vaiheet 44 ja 45 (A = D-Phe). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bent- li 31 75579 syyli-L-tyrosyyli-D-fenyylialanyyli-L-leusiinihydratsi-din (1,86 g, 2,75 mmoolia) liuokseen dimetyyliformamidis-sa (5 ml) lisättiin -20°C:ssa 6,02-molaarinen kloorivedyn dioksaaniliuos (1,83 ml, 11 mmoolia) ja sen jälkeen t-bu-5 tyylinitriittiä (0,33 ml, 2,89 mmoolia). 2 minuutin kuluttua lisättiin esijäähdytetty (-20°C) trietyyliamiinin (1,89 ml, 13,5 mmoolia) ja NW-nitro-L-arginyyli-L-prolyy-liatsaglysiiniamidihydrokloridin (1,02 g, 2,5 mmoolia) liuos dimetyyliformamidissa (10 ml), ja reaktioseosta se-10 koitettiin yön yli 4°C:ssa. Jatkokäsittelemällä tavallisella tavalla saatiin heksapeptidijohdannainen, joka puhdistettiin edelleen piihappogeelillä (120 g) pylväskromatografiällä käyttämällä eluointiliuottimina 5-%:ista (v/v) metanoli/ kloroformiseosta, 10-%:ista (v/v) metanoli/kloroformiseos-15 ta ja kloroformi/metanoli/vesiseosta (11:8:2 v/v). Saanto 0,74 g (29,3 %), sp. 137 - 139°C, RfA 0,68, RfB 0,72,

RfC 0,58, RfD 0,62, RfH 0,39, RfK 0,95.

Vaiheet 46, 47 ja 48 L-pyroglutamyyli-L-histidiinihydratsidi (10 20 mmoolia) muutettiin atsidiksi yleisessä menetelmässä (m) kuvatulla tavalla ja liitettiin L-tryptofyyli-L-seriini-metyyliesteriin (11 mmoolia, valmistettu hydraamalla N-bentsyylioksikarbonyylijohdannainen dimetyyliformamidissa 5-%:isen Pd/C:n, w/w, läsnäollessa reaktion tapahtuessa 25 -10°C:ssa 30 minuutin ajan ja 4°C:ssa 24 tuntia. Trie- tyyliamiinihydrokloridi poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin kuiviin. Raaka peptidi puhdistettiin piihappogeeliä sisältävällä pylväällä käyttäen eluointiin 10-%:ista (v/v) metanoli/kloroformiseosta, 20-%:ista 30 (v/v) metanoli/kloroformiseosta ja kloroformi/metanoli/ vesiseosta (11:8:2 v/v), saanto 70 %, sp. 142 - 145°C (hajoaa), RfA 0,39, RfB 0,72, RfC 0,45, RfD 0,48, RfK 0,61.

Vaihe 49 L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-L-tryptofyyli-L-35 seriinimetyyliesteriä (5,4 mmoolia) liuotettiin dimetyyli-formamidiin (70 ml) ja käsiteltiin hydratsiinihydraatilla 32 75579 (100 mmoolia) 4 tuntia. Dimetyyliformamidi poistettiin tyhjössä, ja jäännöstä trituroitiin etanolissa, suodatettiin, pestiin etanolilla ja eetterillä ja kuivattiin (88,2 %), sp. 184 - 189°C, RfA 0,18, RfB 0,55, RfC 0,39, 5 RfD 0,27, RfK 0,58.

Vaihe 50 (A = D-Trp). N-bentsyylioksikarbonyyli-D-trypto-faanin (7,27 g, 21,5 ramoolia), leusiiniraetyyliesterin (3,12 g, 21,5 mmoolia) ja 1-hydroksibentsotriatsolin 10 (5,8 g, 43 mmoolia) liuokseen dimetyyliformamidissa (50 ml) lisättiin 0°C:ssa disykloheksyylikarbodi-imidiä (4,87 g, 23,6 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa yön yli, sitten sitä jatkokäsiteltiin tavallisella tavalla. Kiteyttämällä etyyliasetaatti/pet-15 rolieetteristä (kp. 60 - 80°C) saatiin dipeptidijohdannainen (9,55 g), jossa ohutkerroskromatografiän mukaan oli hieman epäpuhtauksia. Se puhdistettiin kromatografoi-malla piihappogeeliä (300 g) sisältävällä pylväällä käyttäen eluointiin kloroformia ja 5-%:ista (v/v) metanoli/ 20 kloroformiseosta. Saanto 9,18 g (91,7 %), sp. 151 - 153°C,

RfA 0,84, RfB 0,80, RfC 0,86, RfD 0,78, RfE 0,61, RfF 0,68, RfF 0,68, RfH 0,73, RfP 0,55, RfQ 0,73.

Vaihe 51 (A = D-Trp). Katalyyttinen pelkistys 80-%:isessa 25 (v/v) vesipitoisessa dimetyyliformamidissa 5-%:isen (w/w)

Pd/C:n avulla 5 tunnin aikana.

Vaihe 52 (A = D-Trp). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyy-li-L-tyrosiini-2,4,5-trikloorifenyyliesterin (11,69 g, 30 20 mmoolia), D-tryptofyyli-L-leusiinimetyyliesterin (6,28 g, 19 mmoolia) liuosta dimetyyliformamidissa (100 ml) sekoitettiin huoneen lämpötilassa 60 tuntia. Reaktioseoksen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla ja jäännös kiteytettiin etyyliasetaatti/petrolieetteristä (kp.

35 60 - 80°C), jolloin saatiin 8,52 g tripeptidijohdannaista (62,5%), sp. 165 - 166°C, RfA 0,78, RfB 0,73, RfC 0,84, 11 33 7 5 5 7 9

RfD 0,80, RfE 0,62, RfF 0,70, RfH 0,76, RfP 0,58, RfQ 0,68.

Vaihe 53 (A = D-Trp). N-bentsyylioksikarbonyyli-O-bentsyyli-L-tyrosyyli-D-tryptofyyli-L-leusiinimetyyliesterin (7,26 g, 5 10,1 mmoolia) liuosta metanolin (200 ml) ja dimetyylifor- mamidin (50 ml) seoksessa käsiteltiin hydratsiinihydraatilla (100 mmoolia) huoneen lämpötilassa. 24 tunnin kuluttua liuos väkevöitiin (noin 30 ml :ksi) ja -siihen lisättiin vettä (500 ml). Tripeptidihydratsidi koottiin, pestiin vedellä, 10 metanoli/eetterillä (1:4 v/v) ja eetterillä ja kuivattiin, jolloin saatiin 6,86 g (94,6 %), sp. 200 - 202°C, R^A 0,90, RfB 0,95, RfC 0,90 RfD 0,74, RfQ 0,59.

Vaiheet 54 - 55 (A = D-Trp). N-bentsyylioksikarbonyyli-0-bentsyy-15 li-L-tyrosyyli-D-tryptofyyli-L-leusiinihydratsidin (1,97 g, 2,75 mmoolia) sekoitettua ja jäähdytettyä (-20°C) liuosta dimetyyliformamidissa (10 ml) käsiteltiin 6,0-molaarisella kloorivedyn dioksaaniliuoksella (1,83 ml, 11 mmoolia) ja sen jälkeen t-butyylinitriitillä (0,33 ml, 2,89 mmoolia).

20 2-minuutin kuluttua lisättiin esijäähdytetty (-20°C) N40 -nitro-L-arginyyli-L-propyyliatsaglysiiniamidihydroklori-din (1,02 g, 2,5 mmoolia) ja trietyyliamiinin (1,89 ml, 13,5 mmoolia) jäähdytetty (-20°C) liuos dimetyyliformamidissa (10 ml), ja reaktioseosta sekoitettiin yön yli 4° 25 C:ssa. Sen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, ja jäännös vietiin piihappogeeliä (230 g) sisältävälle pylväälle, joka eluoitiin kloroformilla ja 5-%:isella (v/v) metanoli/kloroformiseoksella. Saanto 0,91 g (34,4 %), sp. 139 - 140°C (hajoaa), RfA 0,67, RfB 0,72, RfC 0,58, 30 RfD 0,62, RfH 0,34, RfK 0,95.

Vaihe 56 (A = D-Tyr((Me)). Z-D-Tyr(Me)-OH:n (3,17 g, 9,64 mmoolia), H-Leu-OMe.HCL:n (1,92 g, 10,6 mmoolia), 1-hydrok-sibentsotriatsolin (2,6 g, 19,2 mmoolia) ja trietyyliamii-35 nin (1,6 ml , 11 mmoolia) liuos dimetyyliformamidissa (30 ml) jäähdytettiin 0°C:seen, ja siihen lisättiin N,N- 34 75579 disykloheksyylikarbodi-imidiä (2,29 g, 11,1 mmoolia). Rektioseosta sekoitettiin yön yli 4°C:ssa, jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla. Uudelleenkiteyttä-mällä kuumasta sykloheksaanista saatiin suojattu dipep-5 tijohdannainen. Saanto 1,41 g (95,2 %),R^D 0,83, R^E 0,69, RfP 0,72, RfQ 0,76.

Vaihe 57 (A = D-Tyr(Me)). Katalyyttinen pelkistys 3 tunnin ajän.metanoli/dimetyyliformamidi/vesiseoksessa (8:1:1), 10 joka sisältää 1,2 ekvivalenttia kloorivetyä. Katalysaat torina Pd/C (5 % w/w).

Vaihe 58 (A = D-Tyr(Me)). Z-Tyr(Bzl)-OCp:n (8,2 mmoolia), H-D-Tyr(Me)-Leu-OMe. HCl:n (8,2 mmoolia) ja trietyyliamii-15 nin (8,2 mmoolia) liuosta dimetyyliformamidissa (60 ml) sekoitettiin yön yli huoneen lämpötilassa, sitten reaktio-seosta jatkokäsiteltiin tavallisella tavalla. Tuote suodatettiin eetterin kanssa, pestiin eetterillä ja kuivattiin. Saanto 81,2 %, sp. 191 - 192°C, RfD 0,85, RfE 0,73, RfF 20 0,72, RfQ 0,78.

Vaihe 59 (A = D-Tyr(Me)). Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-Leu-OMe:n (4,59 g, 6,4 mmoolia) liuokseen dimetyyliformamidissa (25 ml) ja metanolissa (50 ml)lisättiin hydratsiinihydraat-25 tia (12,9 mmoolia), ja reaktioseos sai seistä huoneen lämpötilassa yön yli. Metanoli poistettiin tyhjössä, ja tuote saostettiin vedellä, koottiin, pestiin vedellä ja kuivattiin, sp. 212 - 213°C, RfE 0,49, RfF 0,66, RfH 0,69,

RfH 0,69, RfQ 0,70.

30 Vaiheet 60 ja 61 (A = D-Tyr(Me)). Vaiheesta 59 saatu hydratsidi (3,54 g, 5,0 mmoolia) liuotettiin DMF:ään (10 ml), ja sekoitettu liuos jäähdytettiin -20°C:seen. Siihen lisättiin 5,92-m HCl dioksaanissa (3,38 ml, 20 mmoolia) ja sit-35 ten t-butyylinitriittiä (0,6 ml, 5,25 mmoolia). 2 minuutin kuluttua lisättiin H-Arg (NC>2) -Per-Azgly-NH2.HCl:n (2,04 g,

II

35 75579 5 mmoolia) ja trietyyliamiinin (3,55 mmoolia) jäähdytetty liuos DMF:ssä (10 ml), ja sekoitusta jatkettiin yön yli 4°C:ssa. Reaktioseoksen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, ja raakatuote puhdistettiin kromatogra-5 foimalla piihappogeelipylväällä käyttäen eluointiin kloroformia, 5-%:ista (v/v) metanoli/kloroformiseosta ja 10-% sta (v/v) metanoli/kloroformiseosta. Saanto 3,72 g (70,9 %) , RfA 0,64, RfB 0,72, RfC 0,55, FfD 0,66, RfF 0,40, RfH 0,52.

Vaihe 62 10 (A = D-Ser (Bu1") ) . Samoin kuin vaihe 56. Tuote ki teytettiin vesipitoisesta metanolista. Saanto 90,4 %, sp.

107 - 108°C, RfD 0,80, RfE 0,68, RfF 0,73, RfH 0,73, RfH 0,72, RfP 0,72, RfQ 0,74.

Vaihe 63 15 (A = D-Ser(Bufc)). Katalyyttinen pelkistys 5 tun nin aikana DMF/vesiseoksessa (8:2), katalysaattorina Pd/C, 5 % (w/w).

Vaihe 64 (A = D-Ser(But)). Z-Tyr(Bzl)-OCp:n (19,17 g, 20 32,7 mmoolia) ja H-D-Ser(Bu^j-Leu-OMe:n (32,7 mmoolia) liuos DMF:ssa (100 ml) jätettiin huoneen lämpötilaan 72 tunniksi. Jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, saatu kiinteä aine pestiin eetterillä ja kuivattiin. Saanto 17,6 g (79,4 %), sp. 135 - 137°C, RfD 0,80, RfH 25 0,77, RfQ 0,81.

Valhe 65 (A = D-Ser(But)). Samoin kuin vaihe 59. Uudelleen-kiteytys vesipitoisesta metanolista. Saanto 56,2 %, sp.

134 - 136°C, RfD 0,66, RfH 0,64, RfQ 0,64.

30 Vaiheet 66 ja 67 (A = D-SerfBu^·)). Samoin kuin vaiheet 60 ja 61. Tuote puhdistettiin kromatogragoimalla piihappopylväällä käyttäen eluointiin kloroformia, 5-%:ista (v/v) metanoli kloroformiseosta. Saanto 38,5 %, sp. 142 - 145°C, RfA 35 0,64, RfB 0,71, RfC 0,55, RfD 0,65, RfF 0,46, RfH 0,43,

RfQ 0,16.

36 7 5 5 7 9

Vaihe 68 (A = D-Tyr(me)-OH:n (22,6 mmoolia), H-MeLeu-OMe). HBr:n (5,98 g, 24,9 mmoolia), trietyyliamiinin (3,5 ml, 24,9 mmoolia) ja 1-hydroksibentsotriatsolin (6,12 g 45,2 5 mmoolia) jäähdytettyyn (0°C) ja sekoitettuun liuokseen DMF:ssä (50 ml) lisättiin disykloheksyylikarbodi-imidiä (5,13 g, 24,9 mmoolia), ja sekoitusta jatkettiin yön yli 4°C:ssa. Reaktioseoksen jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla, ja tuote puhdistettiin kromatografoimal-10 la piihappogeelipylväällä käyttäen eluenttina kloroformia. Saanto 55,2, öljy, RfD 0,83, RfE 0,78, RfH 0,79, RfP 0,80, RfQ 0,79.

Vaihe 69 (A = D-Tyr(me)). Katalyyttinen pelkistys 6 tunnin 15 aikana metanoli/vesiseoksessa (8:2 v/v), joka sisältää 1 ekvivalentin kloorivetyä, katalysaattorina Pd/C, 5 % (w/w).

Vaihe 70 (A = D-Tyr(Me)). Samoin kuin vaihe 58. Tuote puhdistettiin kromatografoimalla piihappogeelipylväällä 20 käyttäen eetteriliuotinta.

Vaihe 71 (A = D-Tyr(Me)). Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-MeLeu-OM:n (4,85 g, 6,69 mmoolia) ja hydratsiinihydraatin (120,7 mmoolia) liuos metanolissa (150 ml) jätettiin huoneen 25 lämpötilaan yön yli. Hydratsidi seostettiin lisäämällä vettä, se koottiin ja kiteytettiin metanoli/vesiseoksesta. Saanto 91,1 %, sp. 129 - 131°C, RfD 0,79, RfE 0,60, RfF 0,68, RfH 0,73, RfQ 0,77.

Vaiheet 72 ja 73 30 (A = D-Tyr (Me)). Samoin kuin vaiheet 60 ja 61.

Uudelleenkiteytys metanoli/eetteristä, saanto 23,8 %, sp. 152 - 154°C, RfA 0,67, RfB 0,68, RfC 0,58, RfD 0,59, RfH 0,50, RfK 0,94, RfQ 0,35.

Vaihe 74 35 Z-D-Phe-OH:n (5,99 g, 20 mmoolia) ja N-metyyli- morfoliinin (2,2 ml 20 mmoolia) jäähdytettyyn (-15°C) ja

II

37 7 5 5 7 9 sekoitettuun liuokseen DMFrssä (60 ml) lisättiin etyyli-klooriformiaattia (1,8 ml, 18 mmoolia). 2 minuutin kuluttua lisättiin H-MeLeu-OMe.HBr:n (4,8 g, 20 mmoolia) ja trietyyliamiinin (2,8 ml, 20 mmoolia) jäähdytetty (-15°C) 5 liuos DMF:ssä (20 ml), ja reaktioseosta sekoitettiin 30 minuuttia 0 C:ssa ja yön yli huoneen lämpötilassa. Jatkokäsittely suoritettiin tavallisella tavalla. Saanto 7,54 g (90 %) öljyä.

Vaihe 75 10 Katalyyttinen pelkistys 3 tunnin aikana metano- lissa, joka sisälsi 1 ekvivalentin kloorivetyä, katalysaattorina Pd/C, 5 %, w/w.

Vaihe 76

Valmistus liittämällä Z-Tyr(Bufc)-OH (16,02 g, 15 43,2 mmoolia) ja H-D-Phe-MeLeu-OMe.HCl (13,15 g, 40,0 mmoolia) yhteen samoin kuin vaiheessa 74. Tuote puhdistettiin kromatografoimalla piihappogeelipylväällä käyttäen eluointiin kloroformia ja 5-%:ista (v/v) metanoli/kloro-formiseosta. Saanto 60 %, öljy, R^G 0,48, R^P 0,71, R^Q 20 0,73.

Vaihe 77 Z-Tyr(BuS-DPhe-MeLeu-OMe:n (6,52 g, 9,76 mmoolia) ja hydratsiinihydraatin (97,6 mmoolia) liuos metanolissa (50 ml) jätettiin yöksi huoneen lämpötilaan. Metanoli 25 poistettiin tyhjössä, ja hydratsidi kiteytettiin metanoli/ eetteriseoksesta, pestiin metanoli/vesiseoksella (l:lv/v) ja eetterillä ja kuivattiin. Saanto 5,2 g (80 %), sp.

135°C, RfD 0,75, RfE 0,69, RfF 0,66, RfH 0,79, RfQ 0,73.

Vaiheet 78 ja 79 30 Selmoin kuin vaiheet 60 ja 61. Jatkokäsittelyssä tuote saostui etyyliasetaatista. Se suodatettiin, pestiin etyyliasetaatilla ja eetterillä ja kuivattiin. Saanto 58,5 %, sp. 145 - 148°C, RfD 0,72, RfF 0,40, RfH 0,53,

RfQ 0,18.

Claims (4)

38 755 79

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen poly-peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava 5 H *“ Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F I jossa A on D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser, D-SeriBu^), D-Phe, D-Ala tai D-Trp, B on Leu tai MeLeu, E on Azgly ja F on aminora-10 dikaali, tai A on Azgly tai Azala, B on Leu, E on suora sidos ja F on etyyliaminoradikaali, ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) poistetaan suojaryhmät kaavan I mukaista polypep-15 tidiä vastaavasta suojatusta polypeptidistä, jossa yksi tai useampi amino- ja/tai hydroksiryhmä on suojattu tavanomaisilla peptidisuojaryhmillä, tai b) kaavan Hilu-OH, ^Glu-His-OH, ^Glu-His-Trp-OH, 20 n n L Glu-His-Trp-Ser-OH, L Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, n Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-OH, Π Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-OH, 25 Π ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-OH tai n ‘-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-OH mukainen yhdiste tai tällaisen sopiva aktivoitu johdannai-30 nen saatetaan reagoimaan vastaavasti kaavan H-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-A-B-Arg-Pro-E-F, H-B-Arg-Pro-E-F, H-Arg-Pro-E-F, 35 H-Pro-E-F tai H-Azgly-NH2 mukaisen yhdisteen tai tällaisen sopivan aktivoidun johdan- II 39 7 5 5 7 9 naisen kanssa peptidien liittämisessä käytetyllä standardi-menetelmällä .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen poly- 5 peptidi, joka on Π Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -10 n e t t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen poly- peptidi, joka on Π Glu-His-Trp-Ser-D-Tyr(Me)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -15 n e t t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen poly- peptidi, joka on Π t ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu )-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2. 40 75579