DK149272B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af lhrh-analoge nona- eller decapeptider eller farmaceutisk anvendelige syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

149272

Den foreliggende opfindelse angår en aha'logf remgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte LHRH-analoge nona- eller decapeptider, som har luliberin-agonistegenskaber, idet luliberin er det internationale anerkendte trivialnavn for LH-RF (frigørende faktor for luteiniserende honnon) (J. Biol. Chem., 1975, 250,. 3215), eller farmaceutisk anvendelige, syreadditionssalte deraf.

Det er kendt (Dutta, Furr, Giles og Morley, Clinical Endocrinology, 1976, 5, Supplement, side 291s-298s), at substitution af cc-aza-amino= syrer i stillingerne 6 eller 10 i luliberin frembringer forbindelser, som er mindre kraftige end stammolekylet i deres evne til at frigøre Luteiniserende hormon (LH) fra hypofysen, og fra Biochem. Biophys.

tes. Commun., 49 (1972) 863-869, og 67 (1975) 576-581, at ombytning if Gly10 med ethylamino i LHRH og i visse af dens analoge, hvori

C

;ly også er blevet erstattet med andre aminosyrer, kan resultere . enten større eller mindre evne til at frigøre LH sammenlignet med 2 149272 den tilsvarende Gly^ stamforbindelse. Det har nu vist sig, at substitution af azaglycin i stilling 10 kombineret med substitution af forskellige D-a-aminosyrer i stilling 6 i luliberin eller substitution af azaglycin eller azalanin i stilling 6 kombineret med erstatning af 5 det endestillede glycinamid med et ethylaminoradikal i luliberin frembringer forbindelser, som er mere aktive end luliberin og til dels også end lulibe- g rin, hvori Gly er udskiftet med forskellige D-a-aminosyrer, i deres evne til at frigøre luteiniserende hormon.

^ Ifølge opfindelsen angives en analogifremgangsmåde til fremstilling af LHRH-analoge nona- eller decapeptider med den almene formel:

^-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F I

hvor A er D-Tyr, D-Tyr(Me), D-Ser (Bu**) eller D-Phe, B er Leu eller 15 Meleu, E er Azgly,-og F er et aminoradikal, eller A er Azgly eller

Azala, B er Leu, E ef'en direkte binding, og F er et ethylaminoradikal, eller farmaceutisk anvendelige syreadditionssalte deraf.

I ovenstående formel I og i hele den foreliggende beskrivelse er amino-20 syreresterne betegnet ved deres standardforkortelser (Pure and Applied Chemistry, 1974, 40, 317-331). En α-aza-aminosyrerest er en , hvori a-CH i en aminosyre er blevet erstattet med nitrogen. Forkortelsen for en α-aza-aminosyre er afledt af forkortelsen for den tilsvarende aminosyre ved at indsætte forstavelsen "Az". Azgly er således aza-glycin, 25 og Azala er azalanin. Hvor konfigurationen af en given aminosyre ikke er angivet, har denne aminosyre (bortset fra α-aza-aminosyrerne, som ikke indeholder noget asymmetrisk centrum ved siden af carboxygryppen) den naturlige L-konfiguration.

30 En foretrukken gruppe forbindelser, der kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er de, hvori A er D-Tyr(Me), D-Ser(But) eller D-Phe, B er Leu eller MeLeu, E er Azgly, og F er et aminorakikal.

De tre foretrukne forbindelser, der kan fremstilles ved fremgangsmåden 35 ifølge opfindelsen, har følgende strukturer:

Qnu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 3 149272

Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr(Me)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 Et særligt farmaceutisk anvendeligt syreadditionssalt fremstillet 5 ifølge opfindelsen er f.eks. et hydrochlorid, phosphat, citrat eller acetat.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, 10 (a) Fjernelse af beskyttelsesgruppen eller -grupperne fra en forbin delse med formlen I, hvori en eller flere aminosyrerester er beskyttet på sædvanlig måde, eller (b). omsætning af Cfilu-OHj .Elu -His-OH, Glu-His-Trp-OH, 15 i-Glu-His-Trp-Ser-OH. ·—Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OH, L-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-OH, «—Glu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-OH, Qsiu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-OH henholdsvis CJlu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-OH eller et egnet aktiveret derivat heraf med henholdsvis 2 o H-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, H-A-B-Arg-Pro-E-F, H-B-Arg-Pro-E-F, H-Arg-Pro-E-F, H-Pro-E-F eller H-Azgly-NH2 25 eller et egnet aktiveret derivat heraf ved en inden for peptidkemien sædvanligt anvendt peptiddannende kondensationsreaktion, hvorefter de fremkomne forbindelser om ønsket omdannes til farmaceutisk anvendelige syreadditionssalte.

30

Ved fremgangsmåden (a) kan der være lige så mange beskyttende grupper i udgangsmaterialet som der er radikaler, der kan kræve beskyttelse, f.eks. nogle eller alle de radikaler, der eksisterer i produktet som frie OH-radikaler eller basiske NH radikaler.

Ved fremgangsmåden (a) kan den eller de beskyttende grupper være de, der er beskrevet i standardlærebøger om peptidkemi, f.eks. M. Bodansky og M.A. Ondetti, "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966, 35 4 149272 kapital IV, F.M. Finn og K. Hofmann, "The Proteins", bind II, redigeret • af H. Neurath og R.L. Hill, Academic Press Inc., New York, 1976, side 106, "Amino-acids, Peptides and Proteins" (Specialist Periodical Reports) , The Chemical Society, London, bind 1 til 8. Forskellige frem-5 gangsmåder til fjernelse af de beskyttende grupper er også beskrevet i disse bøger.

Ved fremgangsmåden (a) er en særlig nyttig NH beskyttende gruppe benzyloxycarbonylradikalet og en særlig nyttig OH-beskyttende gruppe 10 er benzylradikalet. Begge disse grupper kan let fjernes ved hydrogeno= lyse, f.eks. i nærværelse af en katalysator af palladium på trækul.

Ved fremgangsmåden (a) er en anden særligt nyttig NH-beskyttende gruppe t-butoxycarbonylradikalet, og en anden særlig nyttig OH-beskyttende 15 gruppe er t-butylradikalet. Begge disse grupper kan let fjernes ved behandling med en syre, såsom saltsyre eller trifluoreddikesyre.

Ved fremgangsmåden (a) er en anden særligt nyttig NH-beskyttende gruppe benzyloxycarbonyl eller t-butoxycarbonylradikalet, og en særlig nyttig 2o OH-beskyttende gruppe er t-butylradikalet. Disse beskyttende grupper kan let fjernes ved behandling med HBr i eddikesyre.

Til fremgangsmåden (b) kan anvendes enhver standardpeptiddannende kcnden-saticnsreaktion, f. éks. de, der er beskrevet i en standardlærebog om pep= 25 tidkemi, f.eks. ovennævnte lærebog af Bodansly og Ondetti, kapitel V, og ovennævnte bind 1 til 8 af Specialist Periodical Reports of the Chemical Society.

Ved fremgangsmåden (b) er en speciel koblingsreaktion en azidkobling, 30 en aktiv esterkobling eller en kobling, der indebærer N,N'-dicyklo= hexylcarbodiimid og 1-hydroxybenzotriazol. En foretrukken koblingsreaktion er en azidkobling, og især en sådan kobling, som danner His-Trp eller Ser-Tyr peptidbindingen. 1 40

Udgangsmaterialerne til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan fremstilles ud fra kendte forbindelser ved standardpeptidkoblings-reaktioner, standardpeptidbeskyttelsesreaktioner og standardreaktioner til fjernelse af beskyttelse fra peptid, der er velkendt for fagfolk, 5 149272 f.eks. som vist i eksemplerne 1 til 10.

Som ovenfor nævnt har forbindelserne, der kan fremstilles ved freirrv gangsmåden ifølge opfindelsen, luliberinagonistegenskaber, dvs. de 5 efterligner virkningerne af luliberin, et naturligt hormon, der udskilles af hypothalamus, som virker på hypofysen og bringer denne til at frigøre luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH). Disse to hypofysehormoner indgår i regulering af reproduktive processer, idet sidstnævnte FSH virker på ovarierne til fremme af modning af fol-10 likler, og førstnævnte LH til inducering af ovulation. Forbindelserne af formlen I er uventet kraftigere end luliberin i sin evne til at frigøre LH og er derfor nyttig til regulering og/eller forbedring af rer produktion hos mennesker. Den kan også være nyttig til forbedring af ufrugtbarhedstilstande hos mænd og kvinder.

15

Luliberinagonistvirkningen af forbindelserne kan påvises, f.eks. ved deres evne til at inducere ovulation hos androgensteriliserede rotter i konstant østrus eller ved deres evne til at frigøre LH og FSH målt ved dobbelt antistofradioimmunobestemmelse i blodplasma hos umodne 20 hanrotter eller i blodplasma af anøstrus eller diøstrus hunfår.

Ovennævnte prøve på androgensteriliserede rotter udføres som følger:

Androgensteriliserede hunrotter fremstillet ved behandling af 3, 4 og 25 5 dage gamle rotter med 100 yg testosteronpropionat udviser et udstrø get vaginalpræparat med vedvarende østrus og talrige præovulatoriske follikler i ovarierne. Administration af luliberin og aktive analoge bevirker frigørelse af en ovulatorisk bølge af LH og FSH, som kan bedømmes ved tilstedeværelsen af æg i æggelederne og frisk corpora i 30 lutea i ovarierne.

Alle forbindelserne, der er eksemplificeret i den foreliggende beskrivelse, er mere aktive end luliberin i deres evne til at inducere ovulation i rotter med konstant østrus og udviser desuden ingen gif-35 tige virkninger, når de doseres i mindst fire gange deres minimale aktive dosis. Specielt er de foretrukne forbindelser fremstillet ifølge opfindelsen, de der er beskrevet i eksemplerne 4, 6 og 7, ca. ethundrede gange så aktive som luliberin, og de udviser ingen giftvirkninger, når de doseres i hundrede gange deres minimalt effektive dosis. Aktivitetsniveauet for de ifølge opfindel-40 sen fremstillede forbindelser er vist i følgende B.

6 U9272 -p--- — — 1 C § g § § ·| 3 * »T'i'iV'it •Η δ I J, Λ ο ο ο ° > ^ - q ο oo m ιη '.S3 -®-- ' ' Ό

S

U

0) 'd οιηοοΓ-θΓ-ooooom οοοο ·> ο> OVDOVDO ο ο ΓΟ Ο ο

Ο Η ι—! «—1 ·—I —i ρ—ί Η ι—I

<& ? ~Τϊ ο s e

Pj β 'ρ co ro ¢, .Η U Λ^ιηοίο^ίοΝ rOo'wJOPlM (Ο Ο Π Ο

^ Γ—ί rH

ΐ 3 ι I

¥ S S S

CQ <ί ------—-- H i 45 s

: m CL +> in . o in o in in H

o IV P in cm o m m cm m cm io m m m

la I IQ'S. OinOCMlOtnfMOOOOOOHOHO

Eh μ -H · in CM Η H O CM ri O O O O O O O O O O

w O §* ooooooo oo O o o o o o o o 1 Q — ft u------ 1 m in in ,· K K !

5 CM CM

£ CM OU CM CM CM CM CM

*? Puffi KfflWWWWg i, s szsszas V ““ >5 ”>1 {S >| >i

1—1 Η Η Η Η H

>1 Cn dn Cn &1 tn

Η N N N N N

pq O 1 I I< C < <c fiC

-.------3-3-* (Ud) d Pdsns^^ Q) <D Φ 0) <D Q) 0) 0) CQl·^ 1-3 (G t-ί S* Si

— +P

0) d o) se s

>1 ιβ <1) Μ Μ Φ M

rH »C Q) »G

>iCnnJCii&i«lAEH i H N N I I I I I s rtJO<ri;QQQQQ j ___ - -j

G G

i-M f4 ; Q) (1) .

Ρ, Λ 1 g -H ! <D i-l w d ,y q i-i cm m s1 in ιο r~ __H - ___i_ 7 149272

Det er kendt, at luliberin-agonister har virkning mod dimethylbenz= anthren-inducerede tumorer i rotter og derfor er nyttige til behandling af visse hormonafhengige tumorer hos mennesker. (Cancer Research, 1976, 36, 3830-3833). Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen 5 er aktive på samme dyremodel og har derfor samme anvendelighed til mennesker.

Forbindelserne, der kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan anvendes i form af et farmaceutisk prsparat, der som aktiv be-10 standdel omfatter forbindelserne sammen med en farmaceutisk anvendelig bsrer eller fortyndingsmiddel.

Midlet kan f.eks. vsre i en form egnet til oral administration eller administration i kindhulen, f.eks. en tablet, kapsel, opløsning eller 15 suspension til nasal administration, f.eks. snus, nssesprøjtevsske eller nssedråberrtil vaginal eller rektal administration, f.eks. et suppositorium, eller parenteral administration, f.eks. en steril injicerbar opløsning eller suspension.

2Q Midlet administreres normalt således, at en daglig oral dosis er fra 50 ug pr. kg til 20 mg pr. kg, og en daglig parenteral dosis, f.eks. ved intravenøs subkutan eller intramuskuler injektion eller infusion, er fra 0,2 ug pr. kg til 100 ug pr. kg.

For mennesker er disse doser ækvivalent ned en samlet daglig dosis på 3,5 mg til 1,4 g administreret oralt og en samlet daglig dosis på 14 ug til 7 mg administreret parenteralt. Ved administration via slimhinderne 25 vil doserne ligge imellem de, der er anført ovenfor for oral og parenteral administration.

Opfindelsen illustreres af følgende eksempler.

30 I eksemplerne refererer Rf til opstigende tyndtlagskromatografi (t.l.c.) på silicagelplader (kiselgel G). Opløsningsmiddelsystemerne anvendt til denne kromatografi var butan-1-ol/eddikesyre/vand (4:1:5 v/v) (R^A), butan-1-ol/eddikesyre/vand/pyridin (15:3:12:10 v/v) (RfB), butan-2-ol/ 3% w/v vandig ammoniak (3:1 v/v) (RfC), acetonitril/vand (3:1 v/v) 3 3 (R|.D), acetone/qhlorof orm (1:1 v/v) (RfE), chlorof orm/ethanol (1:4 v/v) (RjF), cyklohexan/ethylacetat (1:1 v/v) (R^G), cyklohexan/ethylacetat/ methanol (1:1:1 v/v) (R^H), chloroform/methanol/vand' (11:8:2 v/v) (R^K), chloroform/methanol' (19:1 v/v) (R^P) og chloroform/methanol (9:1 v/v) 40 (R|,Q) . X alle tilfælde blev plader undersøgt under U,V, lys og behandlet 149272 δ med fluorescamin, ninhydrin og chlor/stivelse/iodidr'reagenser. Medmindre andet er anført, indebærer nævnelse af en Rf, at der blev afsløret en enkelt plet ved disse metoder.

5 Syrehydrolysater af alle produkterne beskrevet i den foreliggende beskrivelse blev fremstillet ved at opvarme peptidet eller det beskyttede peptid med 6N saltsyre indeholdende 1$ w/v phenol i et tillukket evakueret rør i 16 timer til 100°C. Aminosyresammensætningen af hvert hydrolysat blev bestemt med LoCarte aminosyreanalysator, og i hvert 10 tilfælde var den i overensstemmelse med den forventede sammensætning. Udtrykket "oparbejdet på sædvanlig måde" anvendt i eksemplerne indebærer, at efter reaktionen blev en eventuel fast rest fjernet ved filtrering, filtratet inddampet til tørhed under Μ3°0, remanensen i ethyl= 15 acetat blev vasket med en 20$ citronsyreopløsning, vand, mættet natrium= bicarbonatopløsning og vand, tørret over vandfri natriumsulfat og ethylacetaten afdampet i vakuum, således at forbindelsen blev tilbage.

Eksempel 1 til .7 .

20

Syntese af L·-PVΓoglutamvl-L·-histidvl-L·-trvptophvl-L·-servl-l·-tvΓOsyl-A-L-leucvl-L-arginvl-L-prolvl-E-F. Almen fremgangsmåde (m) (skema_1_ og 11. 1 2 3 4 5 en afkølet (0°C) og omrørt suspension af L-pyroglutamyl-L-histidin= 2 hydrazid (0,2 mmol) i 0,9 ml dime thyIformamid og 0,7 ml dimethylsulf= oxid blev der sat 5,?U chlorbrinte i dioxan (0,8 mmol). Der fremkom en klar opløsning efter 5 minutters kraftig omrøring. Opløsningen blev afkølet til -20°C, 0,22 mmol t-butylnitrit blev tilsat, og omrøringen 3 3q blev fortsat i 2? minutter. Temperaturen blev så nedsat til -30°C, og opløsningen blev neutraliseret ved tilsætning af 0,8 mmol triethyl= amin. En forud afkølet (-20°C) blanding af L-tryptophyl-L-seryl-L-tryrosyl-A-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-E-F dihydrochlorid (0,1 mmol, fremkommet ved hydrogenolyse af N-benzyloxycarbonylderivatet i 80$ 4 35 v/v vandig methanol indeholdende to ækvivalenter chlorbrinte over 5% w/w palladium på trækul i 16 timer), og 0,1 mmol triethylamin i 1 ml ' dimethyIformamid blev tilsat, og reaktionsblandingen blev omrørt i 2b-timer ved ^°0. Dimethylformamid blev afdampet i vakuum, og remanensen blev kromatograferet på Sephadex LH-20 under anvendelse af dimethyl= 5 - formamid som eluant. Peptidhydrochloridet blev yderligere renset ved adskille3ses kromatografi på Sephadex G-25 under anvendelse af opløsningsmiddelsystemet n-butanol/eddikesyre/vand/pyridin (5:1:5:1 v/v).

9 149272

Syntese af L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-Å-B-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamid. Almen fremgangsmåde (n) (skema 3, 4 og 5).

5 0,2 mmol L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-serinhydrazid blev opløst i dimethylformamid (4 ml) og blev omdannet til azidet som beskrevet i fremgangsmåde (m). Det blev koblet, som beskrevet i fremgangsmåde (m), med L-tyrosyl-A-B-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamidhy-drochlorid (0,15 mmol), fremstillet ved katalytisk reduktion af N-ben-10 zyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-A-L-leucyl-N^-nitro-L-arginyl-L-prolylazaglycinamid i 80% v/v vandig methanol i 20 timer over 5% w/w palladium på trækul, og slutproduktet, som hydrochloridet, blev renset som ovenfor.

15 Syntese af L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-A-B-L-arginyl-L-prolyl-azaglycinamid. Almen fremgangsmåde (o) (skema 4 og 6).

En opløsning af det beskyttede decapeptidderivat (med D-Ser(Bu^) i 20 stilling 6) (50 mg) blev opløst i 90% v/v vandig trifluoreddikesyre (5 ml). Tre dråber β-mercaptoethanol blev tilsat, og opløsningen blev henstillet ved stuetemperatur i 45 minutter. Opløsningsmidlet blev fjernet i vakuum, og remanensen blev frysetørret én gang af vand og to gange af t-butanol.

25

Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen ved en af disse tre almene fremgangsmåder er anført i eksemplerne 1 til 7 i følgende tabel. 1 10 149272 OO O Un Un U\ J- cj CM ΓΟ CM CM CM ro m η j r·* c» es r o »v r* aj ooooooo d •ri d © fo

fo U

r-1 rO i-i Cm vO CN. O

3 VC O O Dn CO On CO On P_j »n r> *> η n rv © æ HHO o o o o 03 r—1 di © fo d -P o tf-) Ό 0 fo--—........— ,...., - — . - . —

d O

-P ,d Μ d © O r—i cm © foI .

^ fo ·* CO Ifo N i J N

CM On ON O O ON CO CO

p>t r r r> r* r» *s cv

© ft K O O fo O O O O

ft (¾ ft © +3

-P

U\ CM O U\ ft NO O fo^S. w J- J- H m J- <M

Ό !=> 1 1 ©

txG

d ©

• IxQ

r-i ε© SSdddQd © © Ό fo d O©

© fo S

fo____

Un Un Ή P3

ft CM CM CM CM CM CM CM

i o o κ fd w k w ft fo ft ft s S S S3 S3 1 S S3 0 __L I__.

M fo fo

ft fo fo fo fo H

1 t—\ j—! r-J ^JO b0 ω ft i i ω ud ω n n

r. K! N N © <J

pq © © i d d 3 d d m3 ft <H rø ©©©©©©©

I ft ft ft ft ft S S

d______

fo - jT

£-| ^N -P mn I © d ©

. d S PQ S

© flj ^ N-' CQ fo © © d d Od I fo fo ^d fo © vd fo ft bD © ft fo CQ ft fo

Μ N N 1 I 1 I I

<tJ^OQQQQ

i___—-------- CO fo fo © id ft · I S d d ©d fo cm co cf in , io > fo ra ΓΟ ft LJ ft 11 149272

Udgangsmaterialerne til brug i ovenstående fremgangsmåder kan fås som anført i følgende skemaer 1 og 2 (fremgangsmåde (m)) , skema 3, 2 4 og 5 (fremgangsmåde (n)) og skema 4 og 6 (fremgangsmåde (o)).

. I disse skemaer anvendes følgende forkortelser: OCp = 2,4,5trichlorphenylester, 10 Bzl = benzyl, Z = benzyloxycarbonyl,

Boc = t.-butoxycarbonyl, og DMF = dimethylformamid.

Tallene i cirkler refererer til det særlige trin, der er tale om.

12 149272 in in in in in in in in in ^ ^ ^ ^

K B B g £g g B s B E

2_?-^ ^ %~Ά—I—^ H

n @ n @ æ © © gB o & 0~ *, ^ * +Kv faO _Zv.1 2v 2y Z»J B-J au. g\ ci J >£ o o -- m « (Wl ^

v&J

nj f~\L·^ V£y s i i 1 ar s ® © a-i-1--+-H---- o

II

O

O O

o o O .

CQ CQ „ O >5 « «-φ «-φ K“t $ S’ 3---- s~© s© §® *©“©*© r-ι ο (ίΗ)1-1 Q'-i (pi ri rj f-ι μ h ^

Cj N J=( O' N Viy S! VJ S3 N i? N N

m ° cay, flK tSsy UK CQ-J a - M tsJ N3 N ISI Μ N N a "T “ __ P l /¾ t cn ™ S) ^ ål S m (Ci\ w 6 g 2 c1 hi . c

co---—------— ,H

c * 5 © © @ 5- e a - *-:-M—I—I I =5

N SI N N! N W K

Xs C

É S M m O

- 0 0 2 2 >« ® I 2 -—- O' I ® a 5 @ © :

_3 I

jo_-*- 14927*2 13

CM CM CM CM CM ^V1 CM OJ ^M CM

ν' ^

< X

s © © a__]... -1________ ^ n n a /^v ® © CVJX OJX OJ , O O O O Q + + + + + + .. 53 23 X S3 X X 53. 53. 53«.

I»_\| x_\_\_\_\_\ \_ , <.· " QJ-:-1--------- N N KJ 53 a a f « © © λ dogs

Η I

t-j-------- ® © ©

N^1 ti N N N

t «V mx| «x «x|___

Csl JK1 NJ tsi CSJ EG

CM

af (¾ ' ε £ £ I cn ^ . “ _g, °, η η___

w—:-: I

53 * © © @ s---1—^^^—H— N! N N tO NJ 53

CM

•H_____^ ^ ___- —-

53 P

X

© @ §

.3 I

L·?--- 14 1S3272 s if if i1. € if sf if if ω , «-+-----— = © © o o ^ k_i-- :-- N " w © © - &* S g™ g™ %. ta

g ^5 Ζχ| sN| sN

O o K O o 03 O

gf © 3 i i g § i - ® a i - j____— --

K

___ .s.« ® d) ® d

i—I o, r-1 t—i (—i rH

N (Y « N N N - - u ao n> å b. «χ 3-3!—ή—N| -]—

N N N N N K

' ΓΛ ’ CM a g å M £ 1 « i O O O O Z S v (1) I m CO---------

W

£__J]_^_____

N N tC

, f Λ © i å_I |.-..|..-J----! •T* ** 0 i? 0. ® © © “ 3 8 β-1-^^-1-1-1— 15 149272

CM CM CM CM

K K w K

>, 3 3 3 3

H

to N —..................... " -1111...............' " ...........1 --------- ——— < © f-t---:-

CM CM

O O + +

to \ \ \ X

jh-- CM ® ffi <D a) <u 3

Jss-skj^· . § O O O 3 3 S \ I I I [ I _ (D ©

S © © © © ® ©___ · I

<_1 1 r© © ® © ’s t n rH Η Η £ 8 5 «. mv «v δ_M-A_^_\_Λ__ g—ί^]3 N SI to N jjh

(CM

S ΓΛ g 3 u .-¾ ttJ---

CO

•P

3

CQ

Q)

Q. W

----I

^ Q

© ,. I

co U

•rl >> K---£h a

II

<s 3 iH - -_ - I - _

Cf 16 1-49272

OJ (M CM CM

a a a a .-. a a a a ?ϊ

H

fcO-__---—--:--- © O.-__-------—-- o.

CM CM

O O + + » ’ N N K\ K\ u —----1 - < a

CM

oj ω . j $ £ . * § §·. §, § I _ __________ (Λ OJ-------

' s *© © ® © © © I

a u o >1 __________

Eh------ p ώ n a

H a t-i H ι-f H

SgS £ S3 & \| \ \_\_\__ E-< ώ tS3 tO Csl ^ Β a a a k\ r a a

H

O ------——---- co a U........—— -r--- &< © to •rl ---------- a 3 _;___ r-f —

DP

17 1A9272

CM CM CM CM CM

a a a a a ^ ss a s s s

rH

to_:_—-----

N

< O .____—------— (14

— CM

§ *x *x V

to__\_ < S3

CM

a <D <D 0) ® g _ 3 s g a s a »a (D Ο Ο Ο O ^ ^

Il I Ί M----:--— “© © <D © © ©

ο a . I

a o · = CU _______® _____——— ..... ....

CM CM

4i +) 43 43 -P +> 4> 3 a 3 3 3 3 3 3 in o a a a a a a , \i \ \ \ \ \ \ >»-

^ cl K

tM CM CM CM

CM

a K\ § a --- u_ -------- .

e> a . ft ----—-—----- E4 © co •H -- - " ·™·—-· —— .......

a D° 3 ___________ 149272 18

Trin(l) . N-benzyloxycarbonyl-L-prolin <19,94 g, 80 mmol)og N-methyl- 0 morpholin (8,8 ml, 80 mmol) blev opløst i tør tetrahydrofuran (200 ml) og opløsningen blev afkølet til -20°C. Ethylchlorformiat (7,15 ml, 76 mmol) blev tilsat dråbevis, og efter 2 minutters omrøring blev en forud afkølet (-20°C) 70% vandig opløsning af ethylamin (20 ml, 300

mmol) tilsat, og omrøringen blev fortsat i 18 timer ved 4°C. Reak-S

tionsblandingen blev oparbejdet på sædvanlig måde, og remanensen blev krystalliseret af ethylacetat/petroleumsether (kogepunkt 60-80°C). Udbytte 12,97 g (58,7%), smeltepunkt 107-108°C, ZT<xJ^5'5-43,88° (c = 1 i methanol), R^D 0,69, R^E 0,53, R^P 0,67, R^H 0,62, R^P 0,57, 10 RfQ 0,66.

Trin (2t Katalytisk reduktion over 5% Pd/C i vandig ethanol indeholdende et ækvivalent chlorbrinte i 5 timer ved stuetemperatur.

15 Trin Q. En opløsning af Na-t-butoxycarbonyl-Ne*i-nitro-L-arbinin (13,5 g, 42,3 mmol), L-prolinethylamidhydrochlorid (7,15 g, 47 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (11,5 g 85 mmol) og triethylamin (6,58 ml, 47 mmol) i DMF blev afkølet til 0°C, og der blev tilsat dicyklohexyl-carbodiimid (9,13 g, 44,4 mmol). Reaktionsblandingen blev omrørt nat-20 ten over ved 4°C, filtreret for at fjerne det faste materiale, og filtratet blev inddampet til tørhed i vakuum. Remanensen blev skilt mellem ethylacetat og vand ved en modstrømsfordeling (4 overføringer). De vandige faser blev forenet, inddampet til tørhed, og remanensen blev skilt mellem n-butanol og 5% v/v vandig eddikesyre ved modstrøms-25 fordeling (12 overførseler). Det rå peptid fremkommet ved inddampning af de forenede n-butanolfaser blev renset ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af 5% v/v methanol i chloroform og 10% v/v methanol i chloroform som elueringsmidler. De produktholdige fraktioner blev forenet, inddampet til tørhed, og en vandig opløsning af remanen-30 sen blev ledet gennem en anionbytter (AG 1-X2) søjle til fjernelse af Na-t-butoxycarbonyl-N‘*'-nitroarginin. Søjlen blev så vasket med vand, og de forenede vandige faser og vaskevæskerne blev frysetørret til dannelse af azapeptidderivatet, udbytte 16,67 g (89%), smeltepunkt 109-111°C under dekomponering, r«Jls -39,0° (c = 1 i methanol), 35 RfA 0,62, RfB 0,74, RfC 0,59, RfD 0,70, RfE 0,20, RfF 0,60, RfH 0,61, RfK 0,85, RfQ 0,13.

Trin (Γ). N-t-butoxycarbonylderivat blev opløst i ethylacetat og behandlet med 3N HC1 i ethylacetatopløsning (4 ækvivalenter) i 1 time 19 149272 ved stuetemperatur.

Trin © (R=H). En opløsning af t-butoxycarbonylhydrazid (2,90 g, ^ 22 mmol) og N-benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin-2,4,5-trichlor= phenylester (11,71 g, 20 mmol) i dimethylformamid (40 ml) blev holdt natten over ved stuetemperatur. Oparbejdning på sædvanlig måde efterfulgt af omkrystallisation af remanensen af ether/petroleumsether (kogepunkt 60-80°C) gav det beskyttede hydrazid som et hvidt pulver 3,46 g (67%) , smeltepunkt 126-127°C,^a_^^ -13,2° (c = 1 i methanol) , RfD 0,82, RfE 0,65, RfF 0,63, RfH 0,70.

Trin (D (R=H). 1-(N-benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl)-2-t-but= oxycarbonylhydrazid (5,19 g, 10 mmol) blev opløst i ethylacatat (50 ^ ml), og blev behandlet med 5N chlorbrinte i ethylacetat (8 ml, 40 mmol) i en time ved stuetemperatur. Ethylacetat blev fjernet i vakuum, og hydrochloridet blev filtreret med ether og tørret.

Trin få) (R=H). Ovennævnte hydrochlorid blev optaget i tetrahydrofuran 2Q (75 ml), og der blev tilsat triethylamin (1,15 g, 8mmol) efterfulgt af N-carbonyl-L-leucinmethylester (1,36 g, 8 mmol). Efter 16 timer ved stuetemperatur blev reaktionsblandingen oparbejdet på sædvanlig måde, og remanensen blev omkrystalliseret af ethylacetat/petroleums= ether (kogepunkt 60-80°C) til dannelse af azatripeptidderivatet, 25 4,57 g (77,7%), smeltepunkt 156-157^,^(1^7^4 -10,3° (c = 1 i metha= nol), RfD 0,81, RfE 0,45, RfP 0,26, RfQ 0,47.

Trin (|) . Hydrazinhydrat (5 ml, 100 mmol) blev sat til en opløsning af N-benzyloxycarbonyl-0-benzyl~L-tyrosylazaglycyl-L-leucinmethyl= · 3Q ester (2,95 g, 5 mmol) i methanol (50 ml). Efter 2 timer ved stuetemperatur blev hydrazidet fældet med vand og omkrystalliseret af methanol/ether, udbytte 2,74 g (92,8%), smeltepunkt 169-170°C,/^a^D^ -9,05° (c = 1 i dimethylformamid), R^A 0,76, R^B 0,75, R^C 0,73, R^D 0,63, RfF 0,60, RfH 0,55.

35 Trin ® og (Π) (R=H). N-benzyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-aza= glycyl-L-leucinhydrazid (1,18 g, 2,0 mmol) blev opløst i dimethylform= amid (10 ml), og efter afkøling af opløsningen til -20°C blev der tilsat en 5,49M opløsning af chlorbrinte i dioxan (1,46 ml, 8 mmol) efterfulgt af t-butylnitrit (0,25 ml, 2,2 mmol). Efter 5 minutter blev op-40 løsningen afkølet til -30°C, og en forud afkølet blanding af N^nitro- 149272 20 L-arginyl-L-prolinethylamidhydrochlorid (0,836 g, 2,2 mmol) og tri= ethylamin (1,43 ml, 10,2 mmol) i dimethylformamid (10 ml) blev tilsat. Reaktionsblandingen blev omrørt ved -10°C i 1 time og ved 4°C i 48 timer. Den blev oparbejdet på sædvanlig måde,'og pentapeptid= derivatet blev renset ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af chloroform, og 3% v/v methanol i chloroform som eluerings-. midler, udbytte o,695 g (38,5%), RfA 0,71, RfB 0,72, RfC 0,84.

10 Λ

Trin fl.4 (R=H). Katalytisk reduktion med 5% w/w palladium på trækul i 80% v/v vandig eddikesyre indeholdende to ækvivalenter chlor= brinte.

Trin få _. Til en kraftigt omrørt og afkølet (-20°C) opløsning af N-benzyloxycarbonyl-L-tryptophan (33,84 g, 100 mmol) og N-methyl= morpholin (11,0 ml, 100 mmol) i tetrahydrofuran (200 ml), blev der sat ethylchlorformiat (9,0 ml, 95 mmol). Efter 2 minutter blev der tilsat en forud afkølet (-20°C) opløsning af L-serinmethylesterhydro= chlorid (17,10 g, 110 mmol) og N-methylmorpholin (12,1 ml, 110' mmol) i dimethylformamid (150 ml), og omrøringen blev fortsat ved -20°C i 30 minutter og ved stuetemperatur i 3 timer. Sædvanlig oparbejdning gav en olie. To krystallisationer af ethylacetat/petroleumsether (kogepunkt 60-80°C) gav dipeptidderivatet (30,53 g, 69,5%), smeltepunkt 140,5-141°C,/7a27^ -22,13° (c = 1,4 i dimethylformamid).

25 D

Trin Θ . Foregående ester (30,53 g, 69,5 mmol) blev opløst i metha= nol (1 liter), og der blev tilsat en 62% w/v opløsning af hydrazin= hydrat (15 ml). Efter 16 timer blev hydrazidet opsamlet, vasket med methanol og ether og omkrystalliseret af varm ethanol (23,18 g, 75,8%) smeltepunkt 178-179°C,/^α_7ρ -25,27° (c = 1 i dimethylformamid)

RfD 0,65, RfE 0,20, RfF 0,43, RfH 0,50.

Trin jQL og ¢5) . 6,02N chlorbrinte i dioxan (0,77 ml, 4,64 mmol) blev sat til en afkølet (-20°C) og omrørt opløsning af N-benzyloxy= carbonyl-L-tryptophyl-L-serinhydrazid (0,502 g, 1,16 mmol) i dimethyl= formamid (5 ml) efterfulgt af t-butylnitrit (0,14 ml, 1,22 mmol). Efter 30 minutter blev opløsningen afkølet til -30°C og blev neutraliseret ved tilsætning af triethylamin (0,65 ml, 4,65 mmol). En forud afkølet (-20°C) blanding af L-tyrosylazaglycyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin= 40 ethylamiddihydrochlorid (0,547 g, 0,77 mmol), og triethylamin (0,108 ml, 0,77 mmol) i dimethylformamid (5 ml) blev tilsat, og omrøringen 21 149272 blev fortsat i 1 time ved -20 C og i 48 timer ved 4°C, Reaktionsblandingen blev filtreret, og filtratet inddampet til tørhed i vakuum.

Det rå peptid blev renset ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af chloroform, 10% v/v methanol i chloroform, og en blanding af chloroform, methanol og vand (11:8:2 v/v) som elueringsmidler, 5 udbytte o, 424 g (52,9%) J~ α 7 25 -i c. qa° /„ η c .

jr ' y ' i- aj D -16,84 (c = 1,5 i methanol), R A

0,61, RfC 0,36, RfD 0,67 RfK 0,90. f

Trin Q (R=Me) . Som trin©, udbytte 66%, smeltepunkt 102-104°C,

rmm 24 O

a_/D -15,5 (c = 1 i methanol), RfD 0,76, RfE 0,68, RfP 0,76,

RfH 0,74.

Trin @ (R=Me) . Som trin © .

15 Trin (gg) (R=Me) . Som trin © , udbytte 93%, smeltepunkt 145-146°C, 27 a^/]Q5 +8,7° (c = 1,2 i methanol), RfA 0,88, RfB 0,88, RfC 0,83,

RfD 0,80, RfE 0,59, RfF 0,78, RfH 0,73.

Trin . IN natriumhydroxid (12 ml, 12 mmo]) blev sat til en omrørt 2Q opløsning af N-benzyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-azalanyl-L-leucin= methylester (2,41 g, 4 mmol) i methanol (36 ml) ved stuetemperatur, og omrøringen blev fortsat i 3 timer. Methanol blev fjernet i vakuum, og en vandig opløsning (40 ml) af remanensen blev syrnet med citron= syre (pH3) og ekstraheret med ethylacetat. Efter vask af ethylacetat= 25 ekstrakten med vand og tørring (Na2S04), blev opløsningsmidlet afdampet og remanensen i en blanding af dimethylformamid og vand (3:2 v/v, 200 ml) blev ført på en søjle af AG 1X-2 harpiks (100 ml). Søjlen blev vasket med ovennævnte opløsningsmiddel (50 ml), og tripeptidet blev elueret med 0,2M eddikesyre i dimethylformamid-vand (3:2 v/v).

30 tripeptidholdige fraktioner blev forenet, inddampet i vakuum, og remanensen tritureret med ether og opsamlet, 1,22 g (51,7%), smeltepunkt 195°C under dekomponering^ oTJ^ -25,4° (c = 1 i dimethyl= formamid). 1

Trin (Q) (R=Me) . Som trin , udbytte 43%£" α 2^ -25,9° (c = 1 i methanol), RfA 0,72, RfB 0,76, RfC 0,85.

Trin Θ _(R=Me) . Som trin . I

40 Trin (24) (R=Me) . Sårerne · som trin med undtagelse af, at slutpro- 149272 22 duktet også blev renset ved gelfiltrering på Sephadex LH-20 i di= methylformamid efter søjlekromatografi på silicagel, udbytte 63%, 0. a_J^ -24,76° (c = 0,8 i methanol), R^A o,58, R^-C 0,42, R^D 0,65,

Rj-K 0,95.

5 f

Trin (gj) . Til en omrørt og afkølet (0°C) suspension af N-benzyloxy= carbonyl-L-prolin (24,9 g, 100 mmol), semicarbazidhydrochlorid (11,2 gi 100 mmol) og triethylamin (14,5 ml, 100 mmol) i dimethylformamid (200 ml), blev der sat dicyklohexylcarbodiimid (20,6 g, 100 mmol), og omrøringen blev fortsat i 16 timer ved 4°C. Dicyklohexylurinstof blev fjernet ved filtrering, og filtratet blev inddampet til et lille rumfang. 200 ml vand blev tilsat, og opløsningen blev ekstraheret med ethylacetat (3 x 50 ml). Produktet udfældede af den vandige opløsning på ca. 1 time. Omkrystallisation af vandig methanol gav dipeptid= ^ amidet (16,5 g, 53,9%), smeltepunkt 189-190°C,77ot 17^ -43,6° (c = 1,4 i dimethylformamid), R^D 0,54, RfF 0,52, RfH 0,38, R^K 0,78.

Trin JSL . Katalytisk reduktion over 5% w/w palladium på trækul i 80% v/v vandig dimethylformamid i seks timer ved stuetemperatur i 20 nærværelse af to ækvivalenter chlorbrinte.

Trin (27) . Ethylchlorformiat (2,83 ml, 29,5 mmol) blev sat til en opløsning af N-benzyloxycarbonyl-L-leucin (8,24 g, 31 mmol) og tri= ethylamin (4,55 ml, 32,5 mmol) i tetrahydrofuran (100 ml) ved -10 til 25 o

-15 C. Reaktionsblandingen blev omrørt i 3 minutter ved denne temperatur og blev så hældt i en kraftigt omrørt opløsning af N^-nitro-L-arginin (5,79 g, 31 mmol) i 2N natriumhydroxid (15,5 ml, 31 mmol) og dimethylformamid (50 ml) ved -10°C. Omrøring blev fortsat ved -10°C

i 30 minutter og derpå ved stuetemperatur i 1 time. Opløsningsmidler-30 ne blev fjernet i vakuum, og remanensen blev fordelt mellem ethyl= acetat (50 ml) og vand (50 ml). Den vandige fase blev fraskilt og ekstraheret med yderligere to portioner ethylacetat. De forenede organiske faser blev vasket én gang til med vand (25 ml) og kasseret.

De forenede vandige faser blev syrnet med mættet citronsyreopløsning 35 og ekstraheret med ethylacetat (3 x 100 ml). Ethylacetatekstrakterne blev forenet, vasket med vand, tørret (Na2SO^) og inddampet til tørhed. Omkrystallisation af remanensen af ethylacetat/petroleumsether (kogepunkt 60-80°C) gav dipeptidet (8,98 g, 62%), smeltepunkt 150- 165°C under dekomponering.

40

Trin (£δ) . En opløsning af N-benzyloxycarbony 1-L-leucyl-N^nitro) - „ 149272 23 L-arginin (9,2 g, 20 mmol), L-prolylazaglycinamidhydrochlorid (4,2 g, 20 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (5,4 g, 40 mmol) og triethylamin (3 ml, 20 mmol) i dimethylformamid (200 ml) blev afkølet til 0°C, og der blev tilsat dicyklohexylcarbodiimid (8,2 g, 40 mmol). Reaktionsblandingen blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Dicyklohexylurin= 5 stof blev fjernet ved filtrering, og filtratet blev inddampet til tørhed. Omkrystallisation af remanensen af methanol-ether gav tetrapep= tidderivatet (12,2 g, 98,3%), smeltepunkt 88-90°ς£7α -30,2° (c = 1,6 i dimethylformamid), RfD 0,57, RfF 0,40, RfH 0,26, R^K 0,63.

10 Trin (2§) . Hydrogenering over 5% w/w palladium på trækul i vandig ethanol i 16 timer i nærværelse af to ækvivalenter hydrogenchlorid.

Trin . N-benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin-2,4,5-trichlorphe= nylester (6,484 g, 11,0 mmol) og D-alaninmethylesterhydrochlorid 15 (1,396 g, 10 mmol) blev opløst i dimethylformamid (50 ml), og der blev sat triethylamin (1,4 ml, 10,0 mmol) til opløsningen, som blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev oparbejdet på sædvanlig måde, og remanensen blev omkrystalliseret af varm ethyl= acetat og gav 3,782 g, 77,2% af den beskyttede dipeptidmethylester, ^ smeltepunkt 163°C,/J α ® -12,84° (c = 1,1 i .dimethylfarmamid) .

Trin JiL . N-benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alaninmethylester I

(3,435 g, 7,0 mmol) blev opløst i varm methanol (400 ml), og opløsningen blev behandlet med 62% w/v hydrazinhydrat (10 ml, 120 mmol), og blandingen blev henstillet ved 25°C natten over. Hydrazidet blev frafiltreret, vasket med methanol og ether og krystalliseret to gange af kogende methanol, udbytte 3,068 g, 89,2%, smeltepunkt 217°C, -20,44° (c = 1,1 i dimethylformamid) R^A 0,73, R^B 0,75, R„C 0,67 R,D 0,70, R Ξ 0,50, R.F 0,54, R.H 0,67, R_K 0,85, R.Q 0,25.

30 1 1 f t 1 1 t

Trin @ og 5¾) . Til et afkølet (-20°C) og omrørt opløsning af N- benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alaninhydrazid (1,18 g, 2,4 mmol) blev der sat en 6,02 M opløsning af hydrogenchlorid i dioxan (1,6 ml, 9,6 mmol) efterfulgt af t-butylnitrit (o,29 ml, 2,52 mmol).

35 o

Efter 15 minutter blev der tilsat en forud afkølet (-20 C) opløsning af L-leucyl-L-arginyl-L-prolylazaglycinamiddihydrochlorid (1,03 g, 2,0 mmol) og triethylamin (1,62 ml, 11,6 mmol) i dimethylformamid 115 ml). Omrøringen blev fortsat ved 4°C i 24 timer. Triethylamin= hydrochlorid blev fjernet ved filtrering, og filtratet blev inddampet 40 149272 24 til tørhed i vakuum. Remanensen blev fyldt på en silicagelsøjle, og søjlen blev elueret med 5% v/v methanol i chloroform, 10% v/v metha= nol i chloroform og en blanding af chloroform, methanol og vand (11:8:2 v/v). De produktholdige fraktioner blev forenet og inddampet, og peptidet blev kromatograferet igen på en silicagelsøjle under anvendelse af acetonitril/vand (3:1 v/v) som elueringsmiddel, udbytte 890 mg (46,4%) ,ΖΓ α -45,7° (c = 1,1 i methanol), R^A 0,54, RfB 0,69, RfC 0,41.

Trin 61) . Som trin .

Trin 65) . Som trin (Q), udbytte 43%£ α*Γρ5 -41,4° (c = 1,3 i methanol), RfA 0,80, RfC 0,47, RfD 0,65, RfK 0,95.

Trin (3^ . Som trin (3), udbytte 69%, smeltepunkt 135°C, RfA 0,49,

RfB 0,65, RfC 0,46, RfD 0,64, RfF 0,35, RfH 0,19, RfK 0,86. .

Trin fåj) . Som trin Φ 20 ^

Trin (4Q) (A=D-Phe) . En opløsning af N-benzyloxycarbonyl-D-phenyl= alanin (7,41 g, 24,8 mmol) og L-leucinmethylester (3,62 g, 25 mmol) i 100 ml ethylacetat blev afkølet til 0°C, og der blev tilsat dicyk= lohexylcarbodiimid (5,15 g, 25 mmol). Reaktionsblandingen blev omrørt ^ natten over ved 4°C. Den sædvanlige oparbejdning efterfulgt af omkrystallisation af remanensen af ethylacetat/petroleumsether (kogepunkt 60-80°C) gav dipeptidet (9,1 g, 86%), smeltepunkt 123-124°C, Γ_ aJ7p6 -18/7° (c = 2,1 i methanol), RfD 0,76, RfE 0,65, RfF 0,74,

RfH 0,73.

Trin (jl) (A=D-Phe) . Katalytisk reduktion over 5% w/w palladium på trækul i ethanol indeholdende et ækvivalent hydrogenchlorid i 5 timer.

Trin (få (A=D-Phe). Til en omrørt opløsning af N-benzyloxycarbonyl- 0-benzyl-L-tyrosin-2,4,5-trichlorphenylester (4,89 g, 8,36 mmol) og 35 . D-phenylalanyl-L-leucinmethylesterhydrochlorid (2,5 g, 7,6 mmol) i dimethylformamid, blev der sat triethylamin (1,1 ml, 7,6 mmol), og omrøringen blev fortsat natten over ved stuetemperatur. Triethylamin= hydrochlorid blev frafiltretet, og filtratet blev inddampet til tør-^ hed. Omkrystallisation af remanensen af vandig methanol gav tripep= tidderivatet, 3,6 g (69,7%), smeltepunkt 183-184°C, R^D 0,82, R^E 0,69, RfH 0,78, RfP 0,71, RfQ 0,82.

25 149272

Trin (Q) (A=D-Phe). En opløsning af foregående methylester (3,42 g, 5,04 mmol) og hydrazinhydrat (60 mmol) i dimethylformamid (30 ml) blev omrørt ved stuetemperatur i 4 timer, koncentreret’til et lille rumfang, og hydrazidet blev udfældet ved tilsætning af vand (500 ml).

5

Det blev opsamlet, vasket med vand, raethanol/ether (1:4 v/v) og ether og tørret. Udbytte 2,94 g (85,9%), smeltepunkt 179-180°C, R^A 0,81, RfB 0,79, RfC 0,88, RfD 0,69,RfE 0,49, RfF 0,65, RfH 0,67,

RfP 0,25, RfQ 0,57.

10 Trin j2L og ^5) (A=D-Phe). En opløsning af 6,02 M hydrogenchlorid i dioxan (1,83 ml, 11 mmol) blev sat til en opløsning af N-benzyloxy= carbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucinhydrazid (1,86 g, 2,75 mmol) i dimethylformamid (5 ml) ved -20°C efterfulgt af t-butyl= nitrit (0,33 ml, 2,89 mmol). Efter 2 minutter blev tilsat en forud 15 afkølet (-20°C) opløsning af triethylamin (1,89 ml, 13,5 mmol) og N^nitro-L-arginyl-L-prolylazaglycinamidhydrochlorid (1,02 g, 2,5 mmol) i dimethylformamid (10 ml), og reaktionsblandingen blev omrørt natten over ved 4°C, og sædvanlig oparbejdning gav hexapeptidderiva-tet, som blev yderligere renset ved søjlekromatografi på silicagel 20 (120 g) under anvendelse af 5% v/v methanol i chloroform, 10% v/v methanol i chloroform og en blanding af chloroform/methanol/vand (11:8:2 v/v ) som elueringsmidler, udbytte 0,74 g (29,3%), smeltepunkt

137-139°C, RfA 0,68, RfB 0,72, RfC 0,58, RfD 0,62, RfH 0,39, RfK

0,95.

25

Trin , ^7) og Cg) . L-pyroglutamyl-L-histidinhydrazid (10 mmol ) blev omdannet til azidet som beskrevet i den almene fremgangsmåde (m) og blev koblet med L-tryptophyl-L-serinmethylester (11 mmol fremstillet ved hydrogenering af N-benzyloxycarbonylderivatet over 5% w/w 3 0 palladium på trækul i dimethylformamid) ved -10°C i 30 minutter og ved 4 C i 24 timer. Triethylaminhydrochloridet blev fjernet ved filtrering, og filtratet blev inddampet til tørhed. Det rå peptid blev renset ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af 10% v/v methanol i chloroform, 20% v/v methanol i chloroform og en blanding af chloro= form/methanol/vand (11:8:2 v/v) som elueringsmidler, udbytte 70%, smeltepunkt 142-145°C under dekomponering, R^A 0,39,R^B 0,72, R^C 0,45, RfD 0,48, RfK 0,61.

Trin C§) · L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-serinmethylester (5,4 mmol) blev opløst i dimethylformamid (70 ml) og blev "behandlet 26 1Λ9272 med hydrazinhydrat (100 mmol)i 4 timer. Dimethylformamid blev fjernet i vakuum, og remanensen blev tritureret med ethanol, opsamlet, 5 vasket med ethanol og ether og tørret (88,2%), smeltepunkt 184 -189°C, RfA 0,18, RfB 0,55, RfC 0,39, RfD 0,27, RfK 0,58.

Trin (go) (A=D-Trp). Dicyklohexylcarbodiimid (4,87 g, 23,6 mmol) blev sat til en opløsning af N-benzyloxycarbonyl-D-tryptophan (7,27 lø g, 21,5 mmol), leucinmethylester (3,12 g, 21,5 mmol) og l-hydroxy= benzotriazol (5,8 g, 43 mmol) i dimethylformamid (50 ml) ved 0°C. Reaktionsblandingen blev omrørt natten over ved stuetemperatur og blev oparbejdet på sædvanlig måde. Omkrystallisation af ethylacetat/ petroleumsether (kogepunkt 60-80°C) gav dipeptidderivatet (9,55 g), 15 som udviste spor af urenheder ved tyndtlagskromatografi. Det blev renset ved søjlekromatografi på silicagel (300 g) ved anvendelse af chloroform og 5% v/v methanol i chloroform som elueringsmidler. Udbytte 9,18 g (91,7%), smeltepunkt 151-153°C, R^A 0,84, R^B 0,80,

RfC 0,86, RfD 0,78, RfE 0,61,RfF 0,68, RfH 0,73, RfP o,55, RfQ 0,73.

20 r\

Trin (A=D-Trp). Katalytisk reduktion i 80% v/v vandig dimethyl= formamid over 5% w/w palladium på trækul i 5 timer.

Trin (52) (A=D-Trp). En opløsning af N-benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-25 tyrosin-2,4,5-trichlorphenylester (11,69 g, 20 mmol),D-tryptophyl-L-leucinmethylester (6,28 g, 19 mmol) i dimethylformamid (100 ml) blev omrørt ved stuetemperatur i 60 timer. Reaktionsblandingen blev oparbejdet på sædvanlig måde, og remanensen blev krystalliseret af ethyl= acetat/petroleumsether (kogepunkt 60-80°C) til dannelse af tripep= 50 tidderivatet, 8,52 g (62,5%), smeltepunkt 165-166°C, R^A 0,78, R^B 0,73, RfC 0,84, RfD 0,80, RfE 0,62, RfF 0,70, RfH 0,76, RfP 0,58,

RfQ 0,68.

Trin Θ (A=D-Trp). En opløsning af N-benzyloxycarbonyl-O-benzyl-35 L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucinmethylester (7,26 g, 10,1 mmol) i en blanding af methanol (200 ml) og dimethylformamid (50 ml) blev behandlet med hydrazinhydrat (100 mmol) ved stuetemperatur. Efter 24 timer blev opløsningen koncentreret (ca. 30 ml), og der blev tilsat 500 ml vand. Tripeptidhydrazidet blev opsamlet, vasket med vand, 40 methanol/ether (1:4 v/v) og ether og tørret, 6,86 g (94,6%), smeltepunkt 200-202°C, RfA 0,90, RfB 0,95, RfC 0,90, RfD 0,74, RfQ 0,59.

27 149272

Trin él) og (A=D-Trp). En oinrørt og afkølet (-20°c) opløsning af N-benzyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucin= hydrazid (1,97 g, 2,75 mmol) i dimethylformamid (10 ml) blev behandlet med en 6,02M opløsning af hydrogenchlorid i dioxan (1,83 ml, 2 11 mmol) efterfulgt af t-butylnitrit (0,33 ml, 2,89 mmol). Efter 2 minutter blev der tilsat en forud afkølet (-20°C) opløsning af N^ nitro-L-arginyl-L-prolylazaglycinamidhydrochlorid (1,02 g, 2,5 mmol) og triethylamin (1,89 ml, 13,5 mmol) i dimethylformamid (10 ml), og reaktionsblandingen blev omrørt natten over ved 4°C. Den blev opar-j^q bejdet på sædvanlig måde, og remanensen (1,27 g) blev påført på en søjle af silicagel (230 g), og søjlen blev elueret med chloroform, og 5% v/v methanol i chloroform. Udbytte o,91 g (34,4%), smeltepunkt 139-140°C under dekomponering, RfA 0,67, RfB 0,72, RfC 0,58, RfD 0,62, RfH 0,34, RfK 0,95.

Trin (s6^ (A=D-Tyr(Me)). En opløsning af Z-D-Tyr(Me)-OH (3,17 g, 9,64 mmol), H-Leu-QMe,HCl (1,92 g, 10,6 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (2,6 g, 19,2 mmol) og triethylamin (1,6 ml, 11 mmol) i dimethylform= amid (30 ml) blev afkølet til 0°C, og der blev tilsat N,N'-dicyklo= 20 hexylcarbodiimid (2,29 g, 11,1 mmol). Reaktionsblandingen blev omrørt natten over ved 4°C og derefter oparbejdet på sædvanlig måde. Omkry-stallisation af varm cyklohexan gav det beskyttede dipeptidderivat. Udbytte 1,41 g (95,2%), RfD 0,83, RfE 0,69, RfP 0,72, RfQ 0,76.

25 Trin C?) (A=D-Tyr(Me)). Katalytisk reduktion over 5% w/w palladium på trækul i methanol/dimethylformamid/vand (8:1:1) indeholdende 1,2 ækvivalenter hydrogenchlorid i tre timer.

Trin (^8) (A=D-Tyr(Me)). En opløsning af Z-Tyr(Bzl)-OCp (8,2 mmol), 3q H-D-Tyr (Me)-Leu-QMe, HC1 (8,2 mmol) og triethylamin (8,2 irrrol) i dimethyl= formamid (60 ml) blev omrørt natten over ved stuetemperatur, og reaktionsblandingen blev så oparbejdet på sædvanlig måde. Produktet blev filtreret med ether, vasket med ether og tørret. Udbytte 81,2%, smeltepunkt 191-192°C, RfD 0,85, RfE 0,73, RfF 0,72, RfQ 0,78.

35 ZT\

Trin ^9) (A=D-Tyr(Me)). Hydrazinhydrat (12,9 mmol) blev sat til en opløsning af Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-Leu-OMe (4,59 g, 6,4 mmol) i di= methylformamid (25 ml) og methanol (50 ml), og reaktionsblandingen blev henstillet natten over ved stuetemperatur. Methanol blev fjernet 40 i vakuum, og produktet blev fældet med vand, opsamlet, vasket med vand og tørret, smeltepunkt 212-213°C, R^e 0,49, RfF 0,66, R^H 0,69, R^Q 0,70.

28 149272

Trin (βθ) og (βΐ) (A=D-Tyr(Me)). Hydrazidet fra trin (5^) (3,5^, 5,0 mmol) blev opløst i EMF (10 ml), og den omrørte opløsning blev afkølet til -20°C. 5,92M HC1 i dioxan (3 »38 ml, 20 mmol) blev tilsat efterfulgt af t-butylnitrit (0,6 ml, 5,25 mmol). Efter 2 minutter 5 blev der tilsat en forud afkølet opløsning af H-Arg(N02)-Pro-Azgly- NH2,HCl (2,0^ g, 5 mmol) og triethylamin (3,55 ml, 25 mmol) i DMF (10 ml), og omrøringen blev fortsat natten over ved 1*°C. Reaktionsblandingen blev oparbejdet på sædvanlig måde, og det rå produkt blev renset ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af cbloro= ]_q form, 5% v/v methanol i chloroform og 10% v/v methanol i chloroform som elueringsmidler, Udbytte 3,72 g (70,9%), R^A 0,6*+, RfB 0,72,

BfC 0,55, RfD 0,66, RfF 0,1*0, RfH 0,52.

Trin (ό2) (A=D-Ser(Bu^)). Som trin (^β) . Produktet blev krystalliseret 15 af vandig methanol. Udbytte 9°Λ%, smeltepunkt 107-108°C, R^D 0,80,

RfE 0,68, RfF 0,73, RfH 0,72, RfP 0,72, RfQ 0,7*K

Trin (63) (A=D-Ser(Bu^)). Katalytisk reduktion over 5% w/w palladium på trækul i DMF-vand (8:2) i fem timer.

20 _

Trin @ (A=D-Ser(Bu^)). En opløsning af Z-Tyr(Bzl)-OCp (19,17 g, 32,7 mmol) og H-D-Ser(But)-Leu-Ofe (32,7 mmol) i DMF (100 ml) blev henstillet ved stuetemperatur i 72 timer. Sædvanlig oparbejdning gav et fast stof, der blev opsamlet, vasket med ether og tørret. Udbytte 25 17,6 g (79>%), smeltepunkt 135-137°C, RfD 0,80, RfH 0,77, RfQ 0,8l.

Trin (5¾) (A=D-Ser(Bu^)). Som trin (^). Omkrystalliseret af vandig methanol. Udbytte 56,2%, smeltepunkt 13^136^, RfD 0,66, RfH 0,6^,

RfQ 0,6¼.

Trin ^6) og (A=D-Ser(Bu^)). Som trin (60) og (6^. Produktet blev renset ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af chloroform og 5% v/v methanol i chloroform som elueringsmidier. Udbytte 38,5%, smeltepunkt ltø-l^C, RfA 0,6**, RfB 0,71, RfC 0,55, 35 RfD 0,65, RfF 0,lt6, RfH-0,lf3, RfQ 0,16.

Trin @ (A=D-Tyr(Me)). Dicyklohexylcarbodiimid (5,13 g, 2l*,9 mmol) blev sat til en afkølet (0°C) og omrørt opløsning af Z-D-Tyr(Me)-OH (22,6 mmol), H-MeLeu-OMe,HBr (5,98 g, 2^,9 mmol), triethylamin (3,5 ml, 2lf,9 mmol) og 1-hydroxybenzotriazol (6,12 g, !f5,2 mmol) i DMF (50 ml), og omrøringen blev fortsat natten over ved k-°C. Reaktions- 29 149272

blandingen blev oparbejdet på sædvanlig måde, og produktet blev renset ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af chloroform som opløsningsmiddel. Udbytte 55,2%, olie, RfD 0,83, R^E 0,78, R^H

5 0,79, RfP 0,80, RfQ 0,79.

Trin (A=D-Tyr Me)) . Katalytisk reduktion over 5% w/w palladium på trækul i methanol/vand (8:2 v/v) indeholdende et ækvivalent hydro= genchlorid i seks timer.

10 ~ _

Trin (tq) (A=D-Tyr (Me)) . Som trin . Produktet blev renset ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af ether som opløsningsmiddel .

15 Trin (A=D-Tyr(Me)) . En opløsning af Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)-MeLeu-

OMe (4,85 g, 6,69 mmol) og hydrazinhydrat (120,7 mmol) i methanol (150 ml) blev henstillet natten over ved stuetemperatur. Hydrazidet blev fældet ved tilsætning af vand, opsamlet og krystalliseret af methanol/vand. Udbytte 91,1%, smeltepunkt 129-131°C, R^D 0,79, R^E

2o 0,60, RfF 0,68, RfH 0,73, RfQ 0,77.

Trin (S) og (A=D-Tyr(Me)). Som trin ^o) og . Omkrystalli seret af methanol/ether, udbytte 23,8%, smeltepunkt 152-154°C, R^A 0,67, RfB 0,68, RfC 0,58, RfD 0,59, RfH 0,50, RfK 0,94, RfQ 0,35.

25

Trin (74) » Ethylchlorformiat (1,8 ml, 18 mmol) blev sat til en afkølet (-15°C) og omrørt opløsning af Z-D-Phe-OH (5,99 g, 20 irmol) og N-méthyl= morpholin (2,2 ml, 20 mmol) i DMF (60 ml). Efter 2 minutter blev tilsat en forud afkølet (-15°C) opløsning af H-MeLeu-OMe,HBr (4,8 g, 30 20 mmol) og triethylamin (2,8 ml, 20 mmol) i DMF (20 ml), og reaktionsblandingen blev omrørt i 30 minutter ved 0°C og natten over ved stuetemperatur. Den blev oparbejdet på sædvanlig måde. Udbytte 7,54 (90%) , olie.

35 Trin (75) . Katalytisk reduktion over 5% w/w palladium på trækul i methanol indeholdende et ækvivalent hydrogenchlorid i tre timer.

Trin ,(76) . Fremstillet ved kobling af Z-Tyr (But)-OH (16,02 g, 43,2 mmol) og H-D-Phe-MeLeu-OMe, HC1 (13,15 g, 40,0 mmol) som i trin 74.

40 Produktet blev renset ved søjlekromatografi på silicagel under anvendelse af chloroform og 5% v/v methanol i chloroform som opløsningsmiddel. Udbytte 60%, olie, R^G 0,48, R^P o,71, R^Q 0,73.

149272 30

Trin » En opløsning af Z-Tyr(Bu*")-D-Phe-MeLeu-OMe (6,52 g, 9,76 mmol) og hydrazinhydrat (97,6 mmol) i methanol (50 ml) blev henstillet natten over ved stuetemperatur. Methanol blev fjernet i vakuum, 5 og hydrazidet blev krystalliseret af methanol/ether, vasket med metha= nol/vand (1:1 v/v) og ether og tørret. Udbytte 5,2 g (80%), smeltepunkt 135°C, RfD 0,75, RfE 0,69, RfF 0,66, RfH o,79, RfQ o,73.

Trin og JzL . Som trin ^o) og (6^ . Under oparbejdningen ud- j^q fældede produktet af ethylacetat. Det blev frafiltreret, vasket med ethylacetat og ether og tørret. Udbytte 58,5%, smeltepunkt 145-148°C,

RfD 0,72, RfF 0,40, RfH 0,53, RfQ 0,18.

Eksempel 8.

15 t

Forbindelsen af formlen I, hvori A er D-Ser(Bu ), B er Leu, E

er Azgly, og F er NI^/ blev fremstillet som vist i skema 7 under anvendelse af reaktionsbetingelser og oparbejdningsmetoder analoge med de, der er beskrevet for de tilsvarende koblingsreaktioner i de foregående eksempler. Produktet havde samme analytiske egen- 20 skaber som det i eks. 5. Udbytte 42,6%.

31 149272

CM CM

a a

Si a >1 rH —__________ _ t7> ----

N

* a

CM

a

<U Φ (D Q) Q) (U S

s S s S g g a ίο O O O O S co a ________ ----- CM CM CM CM - oao oo + + + + + sos. SvS\ a. a a a. a\ ?_ \| \ \ \ \ \ \ \ \ ο υ a o o a a co s 3 i Π) _______: a ;--- «—»s 3 a U ! Φ

Ui -.——-........ ........ I .....

P Γ" id e H rH a Q)

N N M

ffl fflv : W

£-α_Λ------

Eh n n a

CO

s

M

0)................. ------ ' —.......- — -1 ω a u -------

EH

m _ H ———— -1 ·« 1 ffi 0 a