FI74818B - Foerfarande foer detektering eller bestaemning av histamin i histaminhaltiga kroppsvaetskor och analytisk anordning foer dylikt foerfarande. - Google Patents

Description

7481 8

Menetelmä histamiinin toteamiseksi tai määrittämiseksi histamiinia sisältävissä ruumiinnesteissä sekä analyysi-laite tällaista menetelmää varten 5 Esillä olevan keksinnön kohteena on patenttivaati muksen 1 johdannon mukainen menetelmä histamiinin toteamiseksi tai määrittämiseksi histamiinia sisältävissä aineissa, etenkin veressä tai veren osissa. Keksinnön kohteena on myös patenttivaatimuksen 6 johdannon mukainen analyysilaite 10 tällaisen menetelmän suorittamiseksi.

Eräs ongelma hoidettaessa allergisia tauteja on sellaisten diagnostiikkatekniikkojen puuttuminen, jotka ovat riittävän spesifisiä ja herkkiä ja jotka eivät muodosta vaaraa potilaalle. Edelleen tarvitaan nopeaa, yksinkertaista 15 ja halpaa diagnostista tekniikkaa, joka varmistaa sopivaa hoitoa odottavien potilaiden määrän vähenemisen.

Ihmisen veressä ja kudoksissa on erityisiä soluja (basofiilis ia leukosyyttejä ja syöttösoluja), jotka osallistuvat allergiseen reaktioon. Näiden solujen pinnalla 20 on määrättyyn luokkaan kuuluvia vasta-aineita (igE-vasta- aineet). Esim. kun potilas on allerginen kissalle, tämän allergisen reaktion aiheuttavat niiden solujen pinnalla olevat vasta-aineet, jotka tuntevat erityisesti kissan hilseen proteiinin rakenteen. Sisäänhengittäessä kissan 25 proteiini tulee kosketuksiin keuhkokudoksen syöttösolujen ja basofiilisten leukosyyttien kanssa. Solun pinnalla olevat vasta-aineet reagoivat kissan proteiinin kanssa, jolloin ne laukaisevat solussa reaktion, joka puolestaan saa aikaan useiden aineiden (allergisten välittäjien) vavautu-30 misen. Nämä allergiset välittäjät ovat vastuussa potilaan oireista.

Useita vuosia on ollut mahdollista imitoida allerginen reaktion (in vitro). Tämä tehdään ottamalla verinäyte allergisesta potilaasta. Asettamalla verinäyte alttiiksi 35 esim. kissan proteiinille, allergiset välittäjät vapautu vat verinäytteen basofiilisista leukosyyteistä. Näistä 7481 8 välittäjistä on ollut mahdollista määrittää jokin aine, esim. histamiini. Tästä syystä potilaan ollessa allerginen kissalle on ollut mahdollista määrittää histamiinin vapautuminen soluista. Tähän periaatteeseen perustuvat 5 menetelmät edustavat parhainta analyysiä oikean diagnoo sin saamiseksi ja niitä selitetään seuraavassa yksityiskohtaisemmin .

Tämän tekniikan avulla on mahdollista diagnostisoida vastuussa olevat antigeenit (esim. heinän siitepöly, eläin-10 hilse, lääkkeet, ruoka-aineet, homesienet ja bakteerit) potilaissa, joilla on allerginen sairaus (astma, urtikaria j a heinänuha).

Tämän testin yleisenä ongelmana on, että se on vaikea suorittaa laboratoriossa. Vain muutamia testejä voi-15 daan suorittaa päivittäin ja teknillisen henkilökunnan tarve on suuri. Tästä syystä testin yksinkertaistamista kaivataan kovasti, niin että se voitaisiin ottaa käyttöön klinikoiden päivittäisissä diagnostiikkarutiineissa.

On, kuten mainittiin, useita menetelmiä histamiinin 20 toteamiseksi nesteissä. Siten alkuperäinen histamiinin määritys on esitetty Shore'n et ai'in toimesta ja se perustuu fluorometrianalyysiin (viite 1).

Tämän menetelmän periaatteena on histamiinin yhdistäminen fluoroforiin (o-ftaalialdehydiin ) , jolloin muo-25 dostuu rengasrakenne. Tämän rengasrakenteen määrä, joka voidaan määrittää spektrofotometriseksi , riippuu histamiinin määrästä. Menetelmää on myöhemmin muunnettu spesifisyyden ja herkkyyden lisäämiseksi. Stahl Skov & Norn (viite 2) ovat siten yksinkertaistaneet analyysiä aller-30 geeniärsyttämällä koko veren sijasta Ficoll-Hypaque-eris- tettyjä solususpensioita, jotka sisältävät 1/2-2$ basofii-lisia leukosyyttejä. Fraktioimalla veri poistetaan häiritsevät aineet, niin että basofiilisten leukosyyttien his-tamiinipitoisuus voidaan määrittää suoraan, jolloin väl-35 tetään pitkä uuttamismenettely. Kuitenkin fraktiontimenet - telyt (gradienttisentrifugointi ) , jotka tarvitaan häiritsevien aineisen poistamiseksi, ovat aikuavieviä ja vaikei- 3 7481 8 ta suorittaa, ja Siraganian on tästä syystä kehittänyt autoanalyyttisen fluorometrimenetelmän (viite 3). Tätä menetelmää käytetään sairaaloissa, mutta vain rajoitetussa mittakaavassa, koska sen käyttö edellyttää teknillis-5 tä kokemusta, jatkuvaa valvontaa ja kalliita laitteita.

Taylor et ai. (viite t) ovat kehittäneet toisen menetelmän histamiinin määrittämiseksi biologisessa aineessa. Tämä hyvin herkkä ja spesifinen menetelmä on entsymaat-tinen isotooppitekniikka, joka perustuu histamiinin mety-10 lointiin N-metyylitransferaasin avulla. Siten on ollut mahdollista määrittää histamiinin pieniä määriä kudoksessa, veressä ja virtsassa. Kuitenkin klinikoilla käytettävän rutiinimenetelmän tarvetta ei ole tyydytetty tällä menetelmällä, koska analyysien määrä päivää kohden on 15 alhainen (n.30) ja analyysia£ka on pitkä.

Stahl Skov et ai (viite 5) ovat kehittäneet toisen menetelmän, joka perustuu radioaktiivisesti merkityn histamiinin yhdistämiseen potilaan basofiilisiin soluihin in vitro, missä merkityn histamiinin vapautuminen määri-20 tetään oletettujen allergeenien kanssa tapahtuvan ärsytyk sen jälkeen.

Kuitenkin, kuten alla on esitetty, tällä menetelmällä on saatu aikaan heikko korrelaatio fluorometrisesti määritetyn histamiinin vapautumisen kanssa.

25 Esillä olevan keksinnön tehtävänä on aikaan saada menetelmä histamiinin toteamiseksi tai määrittämiseksi, johon ei liity tunnettujen menetelmien epäkohtia, kuten laitevaatimuksia, ajan kulutusta ja verinäytteiden esikäsittelyä.

30 Keksinnön tehtävänä on etenkin saada aikaan yksin kertainen ja spesifinen menetelmä histamiinin toteamisek-• si ja määrittämiseksi histamiinia sisältävissä aineissa, joka menetelmä on nopea ja helppo suorittaa, joka vaatii vain pienen määrän ainetta ja joka ei aseta korkeita 35 vaatimuksia henkilökunnan koulutukselle.

U 74818 Tämä saadaan aikaan keksinnön mukaisella menetelmällä, jossa aineen näyte saatetaan kosketuksiin lasimikro-kuitujen kanssa sellaisissa lasimikrokuitujen ja aineen välisissä määräosuuksissa, että se mahdollistaa todetta-5 van tai määriteltävän histamiinimäärän sitoutumisen mikro kuituihin, ja rekisteröidään tai mitataan histamiinin sitoutunut määrä. Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

10 Kuten mainittiin, keksinnön kohteena on myös laite, joka on tarkoitettu käytettäväksi menetelmän suorittamiseen ja jolle laitteelle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 6 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnön menetelmässä käytetään hyväksi havaintoa, 15 että histamiini sitoutuu lujasti ja melko selektiivisesti lasimikrokuituihin jopa toistettujen pesujen jälkeen. Lasi-mikrokuituja (eli mikro lasikuituja) käytetään laajalti suodattamina ja niitä on selitetty yksityiskohtaisesti esim. esittelylehtisessä "Glass Microfiber Filters", Publication 20 no. 630, Whatman, Springfield Mill, Maidstone, Kent, England.

' Tässä esittelylehtisessä painotetaan, että ne osoittavat erittäin alhaista adsorptiokykyä, mutta niitä on muutamissa tapauksissa käytetty välineenä suurimolekyylisten aineiden, ".· etenkin proteiininen, kuten albumiinin ja poly-U:n adscr- 25 boimiseksi RNA-analyyseissä. Mitään viitettä histamiiniad- soptiosta ei ole esitetty.

Histamiinin adsorptiota lasipinnoille ovat tutkineet Bosse & Wassermann (viite 6). Todettuaan määrättyjä epä-. tarkkuuksia tunnetuissa vaivalloisissa histamiinin tctea- 30 misissa mittaamalla marsun sykkyräsuolen supistumisreaktio he tutkivat, voisivatko epätarkkuudet johtua histamiinin ;; osittaisesta sitoutumisesta testivarusteiden lasipinnoille.

Tätä varten he lisäsivät eri lasilaatujen karkeaa jauhetta histamiiniliuoksiin, joissa oli erilaisia tun-35 nettuja konsentraatioita. Ravistelemisen jälkeen liuos ten vapaa jäämähistamiinipitoisuus mitattiin marsun syk-kyräsuolitestillä ja verrattiin testiliuoksiin, joissa 5 74818 ei ollut lasijauhetta. Sidotun histamiinin mahdollista vapautumista lasipinnasta ei tutkittu.

Bosse & Wassermann totesivat, että alhaisissa hista-miinikonsentraatioissa (10 ^ m) n. 75? läsnäolevasta his-5 tamiinista sitoutui lasijauheeseen. Tähän tulokseen pe rustuen he tulivat siihen lopputulokseen, että kvantitatiivisissa tutkimuksissa histamiinilla (konsentraation herkkyyskäyrä) on otettava huomioon, että alhaisemmissa konsentraatioissa (< 10 ^ m) suuri osuus histamiinista 10 menetetään sen adsorboituessa lasipinnoille.

Epäilemättä tällainen negatiivinen toteamus ei hou-kuttele histamiinin toteamistekniikan tuntevaa henkilöä käyttämään tunnettuja ja ei-toivottuja sitoutumisominai-suuksia kvantitatiivisessa ja toistokelpoisessa menetel-15 mässä histamiinin toteamiseksi tai määrittämiseksi. Päin vastoin tunnettu ennakkokäsitys neuvoo tekniikan tason tuntevaa henkilöä välttämään kosketusta lasipinnan kanssa etenkin alhaisissa histamiinikonsentraatioissa kuten allergisista reaktioista peräisin olevissa.

20 Tavallaan tämän väitteen vahvistavat Murray & McGill (viite 7) 1982. Todetessaan yllä mainitut Bosse et al.'in löydöt oikeiksi Murray & McGill tulevat siihen lopputulokseen, että histamiinin erittäin herkät analyyttiset tekniikat, kuten OPT-menetelmä tuottaisi potentiaalises-25 ti suuren erehtymisvaaran , jos adsorptiovaikutus toimisi.

Murray & McGill suosittelevat tästä syystä polyeteenisäi-liöiden käyttöä ja jos käytetään lasia, hapottamista , koska tämä estää adsorption.

Mikrolasikuitujen käyttö on edullista, koska pienimo-30 lekyyliset yhdisteet, kuten serotoniini ja histidiini sa moin kuin histamiinimetaboliitit 1,k- ja 1,5-metyyli-imi-datsoli-etikkahappo eivät sitoudu kuituihin, mikä on esitetty alla.

Mikrolasikuituja on kaupallisesti saatavilla eivät-35 kä ne ole toksisia eivätkä vaarallisia käyttää. Mikrolasi- k > 6 74818 kuitusuodattimen, jota markkinoidaan tavaramerkillä "Whatman GF/B", on todettu olevan hyvin sopiva esillä

olevan menetelmän suorittamiseksi. Myös tyyppiä "Whatman R

GF/C" voidaan käyttää, mutta sillä on vaihtelevammat 5 sitomisominaisuudet.

Yllä mainitusta esittelylehdestä nähdään, että mainitut kuidut ovat boorisilikaattikuituja, joilla on seu-raava tyypillinen oksidipitoisuus: % % 10 Si02 57,9 CaO 2,6 B203 10,7 MgO 0,1*

Fe2°3 5,9 Ba0 5,0 A12 ° 3*1 10,1 Zn0 3,9

Na^O J F 0,6 15 K^O 2,9

Keksintöä ei ole tietenkään rajoitettu yllä mainitun tyyppisten mikrolasikuitujen käyttöön, ja tekniikan tason tunteva pystyy löytämään optimaaliset sitomisomi-20 naisuudet omaavia kuituja kaupallisesti saatavista lasi- kuitutyypeistä yksinkertaisilla sitomistesteillä, kuten selitetään alla esimerkissä 1.

Kuitenkin oletetaan tällä hetkellä, että sopivimpia mikrolasikuituja ovat "Whatman GF/B"-tyyppiä olevat ja 25 samankaltaisia ominaisuuksia, etenkin sitomisominaisuuksia omaavat kuidut. Halutun herkkyyden aikaansaamiseksi mikro-lasikuidut on edullisesti jaettu hienoiksi hiukkasiksi, joiden koko on 2 - 20 Um, ennen niiden käyttöä keksinnön mukaisessa menetelmässä. Tätä varten sopivin kuitumitoi-30 tus ja hienonnusaste voidaan määrittää testeillä ja ne riippuvat myös alustasta, jolle kuidut sijoitetaan sopi-• vimmin analyysin aikaansaamiseksi materiaalin mukaan, jossa mahdollinen histaraiinipitoisuus on määritettävä tai todettava .

35 Mikrolasikuitujen ja histamiinipitoisen materiaalin τ 74818 välinen määräosuus voidaan samoin määrittää testeillä riippuen kuituihin sitoutuvan histamiinin odotetusta määrästä. Eriasteisissa allergioissa vapautuneen histamiinin määrä on tunnettu kirjallisuudesta, niin että 5 ennalta määrättyjen histamiinimäärien standardikäyrät voidaan piirtää ja ne toimivat perustana histaraiinimää-rän määrittämiseksi tuntemattomissa näytteissä, esim. rinnakkaisella määrityksellä, kuten selitetään yksityiskohtaisemmin myöhemmin.

10 Sopivia alustatyyppejä ovat putket, edullisesti muovista olevat koeputket, mutta myös mikrotiitterile-vyjä, kalvoja tai suikaleita voidaan käyttää. Allergia-diagnostiikkaa varten lasikuidut voidaan edullisesti sijoittaa sopivien alustojen päälle esim. sellaisten mik-15 rotiitterilevyjen päälle, joissa on sopiva määrä syven nyksiä, valinnanvaraisesti yhdessä testiallergeenin kanssa, ja jotka on koottu sopiviksi testilaitteiksi , esim. diagnostiikkalaitteistoiksi.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää eten-20 kin allergisen reaktion seurauksena vapautuneen histamii nin toteamiseen tai määritykseen, kun on käytettävä testi-materiaalina verinäytettä.Edellä selitettyjen yleisten etujen lisäksi menetelmän tämä näkökohta saa aikaan sen merkittävän edun tunnettujen menetelmien suhteen, että 25 häiritsevien aineiden, esim. spermidiinin poistamiseksi verinäytteestä riittää veriplasman poistaminen, esim. sentrifugoimalla ja pesemällä fysiologisella puskuriai-neella. Haluttaessa voidaan myös punaiset verisolut (eryt-rosyytit) poistaa, mikä voidaan tehdä yksinkertaisesti 30 sedimentoinnin avulla, esim. lisäämällä dekstraania en nen sentrifugointia plasman poistamiseksi.

Maetelmää voidaan käyttää myös histamiinin toteamiseen tai määrittämiseen muissa ihmisten ja eläinten ruumiin nesteissä, kuten lymfassa, aivoselkäydinnesteissä 35 tai virtsassa, tai kudosnäytteissä tai kudosuutteissa.

β 74818 Tässä yhteydessä todettakoon, että histamiini vapautuu muissakin taudeissa kuin allergioissa, esim. mastosytoo-s i s sa.

Lopuksi menetelmää voidaan käyttää histamiinin tote-5 amiseksi tai määrittämiseksi ruoka-aineissa, esim. kalas sa, kuten makrillissa ja vastaavassa.

Yleisenä toimenpiteenä häiritsevät aineet, jotka voivat olla läsnä riippuen histamiinipitoisuuden suhteen analysoitavasta aineesta, tulisi poistaa ennen näytteen 10 saattamista kosketuksiin mikrolasikuitujen kanssa.

Mikrokuituihin sitoutuneen histamiinin rekisteröinti tai mittaus voi tapahtua kahdella erilaisella periaatteella, nimittäin 1. rinnakkaismäärityksellä mukaanlukien merkityn 15 histamiinin käyttö 2. suoralla määrityksellä 1. Kilpaileva määritys Tämä rekisteröintiperiaate perustuu kilpailuun si-20 toutumispaikoista mikrolasikuiduissanäytteessä mahdolli sesti olevan histamiinin ja lisätyn merkityn histamiinin ennalta määrätyn määrän välillä.

Kun piirretään standardikäyrä eri tunnetuille merkitsemättömän histamiinin konsentraatioille yhdessä mer-25 kityn histamiinin määrätyn määrän kanssa, on helppoa määrittää histamiinin määrä näytteessä lisäämällä stan-dardikäyrään käytetyn merkityn histamiinin määrä. Tätä selitetään tarkemmin esimerkissä 1 viitaten kuvioon 3.

Seuraavissa esimerkeissä 1 ja 2 käytetään radiaktii-

O

30 vista isotooppia ( H-tritiumia) histamiinin merkitsemi seen, mutta myös muita radioaktiivisia isotooppeja voi- .. 125 ...

‘ daan käyttää, kuten I:tä. Radioaktiivisesta merkityn histamiinin sitoutunut määrä voidaan helposti määrittää sinänsä tunnetulla tavalla, esim. tuikeilmaisinlaskimella.

35 Johtuen radioaktiivisten aineiden käsittelyn vaikeu- 9 74818 desta allergiadiagnostiikassa on kehitetty useita uusia testijärjestelmiä, joissa käytetään muita materiaaleja kuin radioaktiivisia isotooppeja aineiden merkitsemiseksi. Esimerkkeinä näistä mainittakoon vapaat radikaalit, 5 fluoresoivat molekyylit (esim. fluoroseiini-isotiosya- naatti- ja rodamiini-väriaineet), luminoivat molekyylit bakteriofagit, entsyymit, koentsyymit ja entsyymi-inhibiittorit .

Yleensä valittava merkkiaine ei ole kriittinen, 10 edellyttäen, että se ei vaikuta ei-toistettavalla taval la histamiinin kuitusitoutumisominaisuuksiin, ja se voidaan siirtää histamiiniin sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti. Keksinnön mukaisen menetelmän ydin on histamiinin mikrolasikuituihin tapahtuvan yllättävän selek-15 tiivisen sitoutumisen hyväksikäyttö.

Kun edelläesitetyn perusteella on todettu, että rin-nakkaisanalyysi on mahdollinen ja tarkoituksenmukainen, tulisi olla rutiiniasia tekniikan tason tuntevalle testata tavanomaisia merkintämenetelmiä sopivimman menetelmän 20 löytämiseksi kyseessä olevalle analyysille. Hyvin toimi vana esimerkkinä on mainittu isotooppimerkityn histamii- . . 3 .... . .

nm käyttäminen 2,5- H-histami im-dihydroklor ι dm muodossa, koska tämä menettely on nopea ja tarkoituksenmukainen ja saa aikaan hyvän tarkkuuden ja toistokelpoisuuden.

25 2. Suora määritys

Selektiivisten adsorptio-ominaisuuksien s a ansiosta mikrolasikuidut soveltuvat tietenkin myös näytteessä läsnäolevan histamiinin suoraan sitomiseen ja tämän jälkeen 30 tapahtuvaan sitoutuneen histamiinin määrittämiseen tavan omaisella tavalla, esim. liittämällä se fluoroforiyhdis-teeseen ja mittaamalla tämän jälkeen fluorometrisesti . Tämä menettely on esitetty esimerkeissä 3 ja It.

Mikrolasikuituja sisältävien muoviputkien valmistus 35 esillä olevassa menetelmässä tapahtuvaa käyttöä varten 10 7481 8 on helppo ja halpa (5000 - 10 000 putkea päivää kohden). Menetelmän on todettu olevan aikaa säästävä, koska yksi laboratorioteknikko voi valmistaa n. ^00 näytettä päivää kohden verrattuna aikaisempaan maksimiin 150. Mene-5 telmä on verta säästävä, koska se vaatii vain 10 ml ver ta 8 - 10 allergian määrittämiseksi potilasta kohden, kun taas tunnetut menetelmät vaativat 50 ml verta.

Koska menetelmä on sekä toistokelpoinen että spesifinen ja omaa hyvän korrelaation fluorometrisen histamii-10 nimäärityksen suhteen, se on etenkin käyttökelpoinen tar kan informaation saamiseksi oletetuista allergeeneistä, kuten huonepölystä , eläinhilseestä, siitepölystä, home-sienistä, lääkkeistä, ruoka-aineista, bakteereista ja autoantigeeneistä. Keksinnön mukainen menetelmä on esitet-15 ty yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä viitaten piirustuksiin, jossa kuvio 1 esittää korrelaatiota Stahl Skov et ai.1 in mukaisen histamiinimäärityksen (viite 5) ja fluorometrisellä 20 analyysillä suoritetun histamiinimäärityksen välillä, kuvio 2 esittää prosentteina tritiumilla käsitellyn histamiinin, histidiinin ja vastaavasti serotoniinin ekvi-molaaristen konsentraatioiden sitoutumisen mikrolasikui-25 tuihin, kuvio 3 esittää tritiumilla käsiteltyjen eri histamiini-konsentraatioiden sitoutumista kahteen erilaiseen mikro-lasikuitutyyppiin sen jälkeen, kun on lisätty tunnettuja 30 määriä merkitsemätöntä histamiinia, ja se osoittaa, että tritiumilla käsiteltyä histamiinia ei syrjäytetä kahdel- ' la histamiinimetaboliitilla, 1,U- ja 1 ,5~metyyli-imidat-soli-etikkahapolla (MEIAA), jota seikkaa selitetään esimerkin 1 yhteydessä, 35 11 7481 8 kuvio 1+ esittää keksinnön mukaisella menetelmällä ja fluo-rometrianalyysillä suoritettujen histamiinimääritysten välistä korrelaatiota, ja sitä selitetään esimerkin 2 yhteydessä, ja 5 kuvio 5 esittää sovellettua suoraa fluorometristä histamiinin määritystä keksinnön mukaisella menetelmällä vaih- televilla pesukäsittelyillä verrattuna tavanomaiseen mää ritykseen ilman kuituja (viite 2), ja sitä selitetään esi -10 merkin 3 yhteydessä.

Kuvion 1 mittaustulokset vahvistavat selvästi korrelaation puuttumisen viitteen 5 menetelmän ja tavanomaisen fluorometrisen määrityksen välillä. Akselit esittävät heinäsiitepölyantigeenin pienentyneitä konsentraati-15 oita (laimennuksia).

Kuviosta 2 nähdään selvästi, että histamiini sitoutuu yllättävästi paremmin kuin pienimolekyyliset yhdisteet histidiini ja serotoniini (5-hydroksi-tryptamiini ) . Tämä on myös hyvin tärkeää histamiinin määrityksen luo-20 tettavuuden kannalta, koska useissa tunnetuissa menetel missä molemmat yhdisteet voivat sekoittua histamiinin kanssa.

Kuviosta 3, jota selitetään yksityiskohtaisemmin myöhemmin, nähdään, että kaksi hi stamiin imetaboliittia , 25 1 »1+-MEIAA ja 1,5-MEIAA, eivät myöskään sitoudu mikrola- sikuituihin samalla konsentraatioalueella kuin histamiini, koska ne eivät pysty syrjäyttämään sidottua merkittyä histamiinia kuiduista rinnakkaisessa sitoutumisanalyysis- S £L · 30

Esimerkki 1 • Lasikuituputkien valmistus "Whatman GF/B" lasikuitusuodattimet leikattiin n.

1/2 mm:n pituuksiin. 3,U g sekoitetaan 500 ml:aan toisto-35 tislattua vettä ja homogenoidaan 2 minuuttia "ULTRA

TURRAX"-sekoittimessa. Murskatut kuidut jätetään 2 tun- 12 7481 8 niksi huoneenlämpötilaan sedimentoitumaan. Raskaat kuidut (pisimmät) saostuvat ja sakan yllä oleva neste, joka selvästi erottuu raskaista kuiduista ja joka sisältää suspendoituja kuituja, joiden mitat ovat n. 20ym...2ym, 5 poistetaan (kaiken kaikkiaan n. 100 ml) ja 100yl tästä siirretään muoviputkiin. Putket kuivataan uunissa 150°C: ssa (viikon ajan) ja sitten ne otetaan pois uunista ja ne ovat valmiita käytettäväksi, kun lämpötila on n. 20°C. Tämän kuivatuskäsittelyn avulla lasikuidut kiinnittyvät 10 putkien pohjaan. Lasikuituvalmisteis il1 a putkilla on ra joittamaton varastoimisaika.

Standardikäyrän piirtäminen histamiinin määritystä varten Merkitsemättömän histamiinin tunnetut laimennukset 15 valmistetaan Tris-AMC-puskuriaineessa (tris-(hydroks ime - tyyli)-aminometaani 25mM, pii 7 ,6 , NaCl 0,12 M, KC1 5 niM, CaCl^ 0,6 mM, MgCl^ 1,1 mM, ihmisen seerurnialbumi inia 0,3 mg/ml ja glukoosia 1 mg/ml). Histamiinipitoisuus oli 25 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng , 1+ 00 ng ja vastaavasti 20 800 ng/ml, ja käytetty 0-näyte oli histamiinista vapaa puskuriaine. Näitä konsentraatioita käytettiin vakiokäy-rän merkitsemiseksi. 100 yl näitä laimennuksia siirrettiin jokaiseen lasikuitukoeputkeen, joihin lisättiin

O

10 yl radioaktiivisesti merkittyä histamiinia (2,5— H-25 histaraiini-dihydrokloridia: 500 nCi/ml, mikä vastaa 5 nCi/ näyte, spesifinen aktiivisuus n. 53 Ci/mmoolia). Näytteitä inkuboitiin U0 minuuttia 37°C:ssa. Yhdenmukaisten tulosten aikaansaamiseksi on olennaista käyttää samoja aikajaksoja jokaisten näytteiden kohdalla. Näytteet pes-30 tiin 15 sekunnin ajan toistotislatulla vedellä cell har- vester-tyyppisessä pesulaitteessa (Tech-Nunc, Roskilde, ' Tanska). Jäämävesi heitetään pois, ja 1,2 ml Filter Count (Packard) lisätään. Näytteitä mitataan 1 minuutin ajan nestetuikelaskimessa, 0-säteilyn emissio tallennetaan 35 pulsseina minuuttia kohden (cpm). Näyte, joka ei sisäl lä merkitsemätöntä histamiinia (0-sitoutuminen) sisältää ,3 7481 8 sidottua merkittyä histamiinia tyypillisesti 2000 cpm:n määränä, mikä muodostaa n. 60% näytteeseen lisätyn merkityn histamiinin määrästä. Näyte, joka sisältää 25 ng/ml merkitsemätöntä histamiinia, sitoutuu kuituihin määränä, 5 joka vastaa n. 15$ O-sitoutumisesta ja siten antaa n.

1700 cpm:n täyden määrän. Histamiinin lisääntyvät määrät tuottavat tuloksena cpm:n vähenemisen - lineaarisesti aina 100 pg:aan histamiinia/ml.

Kuviossa 3 symbolilla GF/B esitetty standardikäyrä 10 kahdelle rinnakkaistestilleosoittaa puolilogaritmi se sti lineaarista korrelaatiota prosentuaalisen sitoutumisen, cpmrnä ilmaistuna (y-akseli) ja histamiinipitoisuuden välillä (x-akseli: logaritminen). Määrityksen herkkyys on n. 25 ng histamiinia/ml. Kuvio esittää kahta vastaa-15 vaa testiä kuitutyypin "Whatman GF/C" kanssa, jotka on valmistettu samalla tavalla, ja nämä kuidut antavat hieman heikomman korrelaation.

Esimerkki 2 20 Spesifisen heinänsiitepölyallergian määritys 12 astmapo- tilaassa ärsyttämällä potilaiden basofiilisia leukosyyttejä heinänsiitepölyllä in vitro.

10 ml verta otetaan jokaisesta potilaasta laskimo-pistolla. Veri sekoitetaan 0,5 ml:aan 0,2 M EDTA (pH 7,2). 25 Näyte jaetaan kahteen osaan, joista toinen analysoidaan kuten on esitetty viitteessä 2 keksinnön mukaisen menetelmän ja fluorometrisen määrityksen välisen korrelaation osoittamiseksi. 5 ml verta sekoitetaan 1 ml :aan dekstraa-nia (molekyylipaino 500 000 g/moolia ä5 g liuotettuna 30 1 ml:aan 0,9$:sta NaCl) erytrosyyttien (punaisten veriso lujen) erottamiseksi. Näyte käännetään ylösalaisin varo-' vasti ja se jätetään 30 minuutiksi huoneenlämpötilaan. Erytrosyyttien laskeutuminen on nopeampaa kuin leukosyyttien (valkoisten verisolujen). Leukosyyttejä sisältävä 35 plasmakerros siirretään toiseen putkeen ju suspendoidaan il. 7481 8 20 ml:aan Tris-AMC-puskuriainetta (katso esimerkki 1). Leukosyyttisuspensiota sentrifugoidaan 10 minuuttia 100 G:ssa ja l6°C:ssa. Pinnalla oleva plasma poistetaan ja heitetään pois ja solut suspendoidaan 20 ml:aan 5 Tris-AMC-puskuriainetta ja sentrifugoidaan 10 minuuttia 60 G:ssa ja l6°C:ssa. Sakan yllä oleva neste poistetaan jälleen ja solut suspendoidaan uudestaan 5 ml:aan Tris-AMC-puskuriainetta. Solususpensio sisältää 2 - h% baso-fiilisia leukosyyttejä.

10 100 yl tätä solususpensiota siirretään mikrolasikui- tuputkeen, joka on valmistettu kuten esimerkissä 1.

10 yl heinänsiitepölyä lisätään heinänsiitepölyn standar- , -3 -k divalmisteen 1 0-kert ai seen laimennussar j aan 1 0 , 10 , 10 v/v) ja 10 yl isotooppi-merkittyä (tritiumilla käsi-15 teltyä) histamiinia lisätään putkiin, mikä vastaa 5 nCi näytettä kohden. Näytteitä inkuboidaan 1*0 minuuttia 3T°C:ssa. Näytteet pestään 15 sekunnin ajan toistotis-latulla vedellä cell harvester-tyyppisessä pesulaittees-sa (Tech-Nunc, Roskilde, Tanska).

20 Jäämävesi heitetään pois, ja 1,2 ml Filter Count (Packard) lisätään. Näytteet mitataan nestetuikeilmaisi-messa. Heinänsiitepölyallergian esiintyessä näytteen ba-sofiiliset solut vapauttavat lisääntyviä määriä histamiinia heinänsiitepölykonsentraatioiden kasvaessa. Vapautu-25 nut histamiini sitoutuu mikrolasikuituputkiin kilpaillen isotooppi-merkityn histamiinin kanssa, ja isotooppi-merkityn histamiinin sitoutuminen vähenee tästä syystä. Isotooppi-merkityn histamiinin sitoutumisen 10%;n lasku suhteessa solunäytteeseen, jossa ei ole heinän siitepölyä, 30 katsotaan positiiviseksi heinäallergiaksi.

Tuntemattomien näytteiden histamiinipitoisuus voi-daan myös laskea esimerkissä 1 esitetyn standardikäyrän avulla.

Kuten nähdään kuviosta 1* , erittäin hyvä korrelaatio 31' todettiin histamiinin vapautumisen, joka mitattiin mikro- las ikuitumenetelmällä , ja f luoromet r i rnäär i t yk sen hiatainii- ,5 7481 8 nin välillä, koska 12 potilaan tutkimus osoitti molemmilla menetelmillä mitatun histamiinin vapautumisen identtiset arvot. Todettakoon, että potilaan herkkyys allergeeniin jaetaan luokkiin, missä 0 tarkoittaa ei reaktiota, 5 kun taas 3 edustaa suurinta reaktiota. Siten korrelaatio soveltuu sekä ei-allergisiin potilaisiin ja allergian kolmeen luokkaan.

Esimerkki 3 10 Edellisen esimerkin 2 mukaisen menetelmän muunnel massa histamiini määritetään suoraan mikrolasikuitusuo-dattimiin tapahtuneen sitoutumisen jälkeen.

Mikrolasikuitulevyt: levyt, joiden läpimitta on 6 mm, leikataan GF/B-suodattimista.

15 A: 10 yl merkitsemätöntä histamiinia, joka on liuotettu Tris-AMC-puskuriaineeseen, vrt. esimerkki 1 (800 ng - 1+00 ng - 200 ng - 100 ng - 50 ng ja 0 histamiinia/ml Tr i s -AMC), inkuboidaan 1+0 minuuttia 37°C:ssa, minkä jälkeen se pestään H^Otlla 15 sekunnin ajan cell harvester-tyyp-20 pisessä pesulaitteessa. Jäljellä oleva HO poistetaan le vyiltä. Levyihin sitoutunut histamiini määritetään fluo-rometr isest i . Liitäntä tehdään 1+00 yl:lla NaOH/OPT (10 mg o-ftaalidialdehydiä (Fluka) liuotetaan 5 mitään metano-lia ja sekoitetaan 18 mitään 0,05 M) k minuuttia huoneen-25 lämpötilassa. Fluoroforin stab iloimi sek s i lisätään 1+00 yl 0,175 M H^PO^. Näytteitä sentrifugoidaan 2800 gtssa 10 minuuttia. Ekstinktion määritys suoritetaan AMINCO-fluo-rometrin avulla (ks. käyrä III kuviossa 5)· B: Seuraava kontrolli otettiin mukaan: 10 yl his- 30 tamiinia samassa konsentraatiossa kuin kohdassa A inku- boitiin levyillä 1+0 minuuttia 37°C:ssa. Näytteitä ei pesty cell harvester-tyyppisessä pesulaitteessa, vaan liitettiin välittömästi kuten on esitetty kohdassa A (ks. käyrä II kuviossa 5)· 35 C: Seuraava lisäkontrolli otettiin mukaan: 10 yl 16 7481 8 histamiinia samassa konsentraatiossa kuin kohdassa A in-kuboitiin UO minuutin ajan 37°C:ssa ilman levyjä. Näytteitä ei pesty cell harvester-tyyppisessä pesulaittees s a, vaan ne liitettiin välittömästi kuten on esitetty kohdas-5 sa A (ks. käyrä I kuviossa 5).

Nämä kolme käyrää osoittivat siten: I: koeputkiin lisätyn histamiinin koko määrän II: koeputkissa oleviin suodatinlevyihin lisätyn 10 histamiinin koko määrän III: suodatinlevyihin sitoutuneen histamiinin määrä pesun jälkeen.

Vaikka tätä menettelyä ei ole optimoitu yllä olevissa esimerkeissä, käyrä III osoittaa selvästi hienoa li-15 neaarista korrelaatiota eri hi stami in ikon sentraatioiden ja kuituihin tapahtuvan sitoutumisen välillä.

Esimerkki k

Parhaimpana pidetyssä suoritusmuodossa käytetään 20 mikrotiitterilevyä apuvälineenä keksinnön mukaisen suo ran histamiinimäärityksen suorittamiseksi.

5 ml verta vapautetaan plasmasta ja erytrosyyteistä esimerkin 2 mukaisesti. Lasista mikrotiitterilevyä, jossa on 96 syvennystä ja joka on preparoitu 100 yl:lla la-25 simikrokuitususpensiota ja kuivattu esimerkin 1 mukai sesti, käytetiin histamiinipitoisuuden toteamiseksi allergisten reaktioiden tuloksena. 10 yl:n te stiallergeeni-en näytettä kolmena konsentraationa lisättiin syvennyksiin. Verinäytteen 100 yl:n osuuksia lisättiin syvennyk-30 siin ja levy jätettiin huoneenlämpötilaan 20 minuutiksi.

Tämän inkuboinnin aikana vapautunut histamiini sitoutui mikrolasikuituihin. Mikrotiitterilevy pestiin vedellä 30 sekuntia, minkä jälkeen levy oli valmis fluorometris-tä analyysiä varten.

35 100 yl NaOH/o-ftaalialdehydiä lisättiin mikrotiitte- rilevyn jokaiseen syvennykseen ja levy jätettiin huoneen- 17 7481 8 lämpötilaan 10 minuutiksi, minkä jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä 100 μΐ H^P0^:a jokaiseen syvennykseen. Yksittäiset näytteet mitattiin sitten f1uorometris - s ä.

Claims (13)

1. Menetelmä histamiinin toteamiseksi tai määrittämiseksi ruumiinnesteessä, jonka menetelmän mukaan ruumiin- 5 nesteen näyte saatetaan kosketuksiin histamiinin sideaineen kanssa ja sitoutunut määrä rekisteröidään tai mitataan, tunnettu siitä, että nestenäyte ja mahdollisesti määrätty määrä merkittyä histamiinia saatetaan kosketuksiin sellaisten murskattujen borosilikaatti-lasimikrokuitujen 10 kanssa, jotka on kerrostettu ja kiinnitetty kantoaineen päälle sellaisissa lasimikrokuitujen ja nesteen välisissä määräosuuksissa, jotka sallivat läsnä olevan histamiinin si-toumisen mikrokuituihin, ja mikrokuituihin sitoutuneen histamiinin määrä rekisteröidään tai mitataan ilman edeltävää 15 desorptiota, joko merkitsemättömän histamiinin tunnettujen määrien avulla saatuun standardikäyrään perustuvalla kilpailevalla määrityksellä (competitive determination) tai suoralla määrityksellä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä allergi-20 sen reaktion johdosta mahdollisesti vapautuneen histamiinin toteamiseksi, tunnettu siitä, että verifraktioon, josta plasma on erotettu, lisätään koeallergeeni, ja rekisteröidään tai määritetään mahdollisesti vapautunut, kuituihin sitoutunut histamiini, joko suoraan tai kilpailevalla 25 määrityksellä merkityn histamiinin kanssa .

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetyt, murskatut lasimikro-kuidut ovat hienojen hiukkasten muodossa, joiden mitat ovat 2-20 pm.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että käytettyjen, murskattujen borosilikaatti-lasimikrokuitujen oksidipitoisuus on seuraava: 20 7 4 8 1 8 * % Si02 57,9 CaO 2,6 B203 10,7 MgO 0,M Fe203 5,9 BaO 5,0

5 A1203 ZnO 3,9 10 1 N a20 ’ F 0,6 K20 2,9

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 4 mukainen menetel- 10 mä, tunnettu siitä, että käytetty merkitty hista miini on radioaktiivisesti merkittyä, fluoresenssiraerkittyä tai entsyymimerkittyä histamiinia tai hi stamiinijohdannais -ta.

6. Analyysilaite, joka on tarkoitettu käytettäväksi 15 histamiinin toteamiseksi tai määrittämiseksi ruumiinnestees sä patenttivaatimusten 1 ja 3 mukaisen menetelmän avulla, tunnettu siitä, että se käsittää histamiinin analyyttisen sideaineen, joka on valmistettu murskaamalla borosilikaatti-mikrolasikuituja jotta saataisiin hienoja 20 mikrolasihiukkasia, valitsemalla ennalta määrätyn määrän muodostuvia lasimikrokuituja, jotka kooltaan ovat 2-20 pm, sekä kerrostamalla ja kiinnittämällä valitut lasiinikrokuidut kantoaineelle.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen analyysilaite, 25 tunnettu siitä, että lasimikrokuidut ovat borosili- kaattikuituja, joiden oksidipitoisuus on seuraava: t % Si02 57,9 CaO 2,6

30 B20 3 10,7 MgO 0,4 F e 20 3 5,9 BaO 5,0 A120 3 ZnO 3,9 10 1 Na20 ’ F 0,6 K20 2,9 35 8. patenttivaatimuksen 6 mukainen analyysilaite, tunnettu siitä, että kantoaine on koeputki, mikro-tiitterilevy, lasilevy, kalvo tai suikale. ζι 7481 8

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen analyysilaite, joka on tarkoitettu käytettäväksi allergisen reaktion johdosta ruumiinnesteeseen vapautuneen histaam'inin toteamiseen tai määritykseen, tunnettu siitä, että se käsittää 5 edelleen ainakin yhden koeallergeenin, joka on reversiibe- listi kerrostettu kantoaineen päälle.

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen analyysilaite, joka on tarkoitettu käytettäväksi histamiinin kilpailevaan toteamiseen tai määritykseen ruumiinnesteessä, tunne t - 10. u siitä, että se lisäksi käsittää merkittyä histamiinia.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen analyysilaite, tu.nnettu siitä, että histamiini on merkitty radikaalilla, joka on tritium, jodi-125, fluoresoiva molekyyli, bakteriofagi, entsyymi, koentsyymi tai entsyymi-inhibiittori.

12. Patenttivaatimuksen 6 mukainen analyysilaite, joka on tarkoitettu käytettäväksi histamiinin suoraksi toteamiseksi tai määrittämiseksi ruumiinnesteissä, tunnet-t u siitä, että se edelleen on yhdistetty fluorofori-yhdisteeseen. 22 7481 8