FI71997B

FI71997B - FLUOROMETER OCH FOERFARANDE FOER FLUORESCENSMAETNING

Info

Publication number: FI71997B
Application number: FI853298A
Authority: FI
Inventors: Hannu Harjunmaa
Original assignee: Labsystems Oy
Priority date: 1984-08-29
Filing date: 1985-08-28
Publication date: 1986-11-28
Also published as: FI853298A0; FI71997C; FI853298L

Description

1 719971 71997

Fluorometri ja menetelmä fluoresenssin mittaamiseksi Tämä keksintö koskee mittausjärjestelyä nestemäisen, kiinteän tai kaasumaisen näytteen fluoresenssin mittaamiseksi, jossa 5 valonlähteen kirkkauden ja valoniImaisimen herkkyyden vaihteluista johtuvat virheet eliminoidaan käyttämällä hyväksi sisäistä fluoresenssistandardia.This invention relates to a measuring arrangement for measuring the fluorescence of a liquid, solid or gaseous sample, in which errors due to variations in the brightness of the light source and the sensitivity of the light detector are eliminated by utilizing an internal fluorescence standard.

Fluoresenssilla tarkoitetaan ilmiötä, jossa aine, jota valaistaan tietyn aallonpituuden omaavalla valolla, säteilee pi-10 tempiaaltoista valoa. Yksinkertaisessa fluorometrissä on valonlähde, laite valon aallonpituuskaistan valitsemiseksi, paikka johon näyte asetetaan, ja valoilmaisin. Laite valon aallonpituus-kaistan valitsemiseksi voi olla esim. hila- tai prismamonokro-maattori tai suodin. Yksinkertaisuuden vuoksi voidaan puhua vain 1 5 suotimista. Näytteeseen kohdistuvaa valga nimitetään eksitaa-tiovaloksi ja näytteen itsensä säteilemää valoa emissiovaloksi. Eksitaatiovalonsäteen ja emissiovalon keruujärjestelmän keskinäisen geometrisen suhteen valinnalla pyritään useimmiten saavuttamaan sellainen tilanne, että mahdollisimman vähän eksitaa-20 tiovaloa joutuu emissiovalon keruujärjestelmään ja sitä tietä ilmaisimelle. Tästä huolimatta pieni määrä eksitaatiovaloa pääsee sironnan ja heijastusten kautta emissiokanavaan, joten jos halutaan mitata hyvin pieniä määriä fluoresoivaa ainetta, on myös emissiokanavassa käytettävä suodinta.Fluorescence refers to the phenomenon in which a substance illuminated with light of a certain wavelength emits pi-10 tempial light. A simple fluorometer has a light source, a device for selecting the wavelength band of light, the place where the sample is placed, and a light detector. The device for selecting the wavelength band of light can be, for example, a gate or prism monochromator or a filter. For simplicity, we can only talk about 1 of 5 filters. The Valga directed at the sample is called the excitation light and the light emitted by the sample itself is called the emission light. The choice of the geometrical relationship between the excitation light beam and the emission light collection system is most often aimed at achieving a situation where as little excitation light as possible enters the emission light collection system and that path to the detector. Nevertheless, a small amount of excitation light enters the emission channel through scattering and reflections, so if very small amounts of fluorescent substance are to be measured, a filter must also be used in the emission channel.

25 Lampun kirkkaudessa esiintyy sekä pitkäaikaista laskua, että lyhytaikaisia vaihteluja. Myöskään ilmaisimen, varsinkaan valo-monistinputken, herkkyys ei ole vakio, vaan riippuu mm. lämpötilasta. Spektrometrissä, jossa käytetään kerrallaan vain yhtä aallonpituutta, näiden ilmiöiden vaikutus mittaustulokseen saa-30 daan poistetuksi yksinkertaisesti johtamalla aikajaksoisesti osa monokromatisoidusta valosta näytteen ohi vaionilmaisimelle ja käyttämällä tästä saatua signaalia referenssinä tai säätämällä lampun kirkkautta tai valomonistinputken herkkyyttä siten, että mainittu signaali pysyy vakiona. Fluorometrissä, jossa ek-35 sitaatio- ja emissiovalo ovat eriväriset, stabilointia ei voida täydellisesti järjestää yhtä yksinkertaisella tavalla. Valomo- 2 71997 nistinputken herkkyyden lämpötilakerroin nimittäin on erilainen eri aallonpituuksilla: Lämpötilan noustessa herkkyys laskee melkein koko aallonpituusalueella, paitsi aivan sen pitkäaaltoisim-massa päässä, jossa se nousee. Jos nyt referenssivalona käyte-5 tään eksitaatiovaloa, joka johdetaan emissiosuotimen ohitse va-lomonistinputkelle, näyttää referenssisignaali lämpötilan nousun tapahtuessa valomonistinputken herkkyyden pienentyneen, vaikka se tosiasiallisella mittausaallonpituudella onkin kasvanut. Toisaalta eksitaatiovaloa ei voida viedä valomonistinputkelle emis-10 siosuotimen läpi, koska emissiosuodin on eksitaatioaallonpituu-della läpinäkymätön.'Ainoa keino täydellisen stabiloinnin aikaansaamiseksi, joka myös ottaa huomioon mahdolliset muutokset suotimien ominaisuuksissa, on fluoresenssistandardin käyttö.25 There is both a long-term decrease and a short-term variation in lamp brightness. The sensitivity of the detector, especially the light-amplifier tube, is also not constant, but depends e.g. temperature. In a spectrometer using only one wavelength at a time, the effect of these phenomena on the measurement result can be eliminated simply by periodically passing some of the monochromatic light past the sample to the bias detector and using the signal as a reference or adjusting the lamp brightness or photomultiplier tube sensitivity. In a fluorometer where the excitation and emission lights are of different colors, stabilization cannot be perfectly arranged in the same simple way. Namely, the temperature coefficient of the sensitivity of a light tube 71 717 differs at different wavelengths: As the temperature rises, the sensitivity decreases over almost the entire wavelength range, except at the very longest end at which it rises. If an excitation light is now used as a reference light, which is passed past the emission filter to the photomultiplier tube, the reference signal shows a decrease in the sensitivity of the photomultiplier tube as the temperature rises, even though it has increased at the actual measurement wavelength. On the other hand, excitation light cannot be introduced into the photomultiplier tube through the emission filter because the emission filter is opaque at the excitation wavelength.

Ennestään tunnetussa tekniikassa eksitaatiovalon kohdista-15 minen fluoresenssi standardi in ja emissiovalon keruu siitä on tapahtunut olennaisesti samalla tavalla, kuin näytteen ollessa kysymyksessä. Tämä on vaatinut useita linssejä ja muita optisia komponentteja, tai jos näytteen ja fluoresenssistanoardin mittaamiseen on käytetty samaa optista systeemiä, liikkuvia osia näyt-20 teen ja fluoresenssistandardin tai optisen systeemin liikuttamiseksi.In the prior art, the application of excitation light to the fluorescence standard and the collection of emission light therefrom have taken place in essentially the same way as in the case of a sample. This has required several lenses and other optical components, or if the same optical system has been used to measure the sample and fluorescence board, moving parts to move the sample and the fluorescence standard or optical system.

Aikaisemmin sisäistä fluoresenssistandardia käyttävät laitteet ovatkin olleet monimutkaisia ja kalliita. Fluoresenssistan-dardi on ollut fluoresoivan kemikaalin vesiliuos, joka on määrä-, 25 ajoin vaihdettava, tai muoviin valettu fluoresoiva kemikaali.In the past, devices using an internal fluorescence standard have been complex and expensive. The fluorescence standard has been an aqueous solution of a fluorescent chemical, which is a periodic, periodically replaceable, or a fluorescent chemical molded into a plastic.

Yleensä samassa liuoksessa on vain yksi fluoresoiva kemikaali, jolloin fluoresenssistandardia voidaan käyttää vain niillä aallonpituuksilla, joilla kyseinen kemikaali fluoresoi.Generally, there is only one fluorescent chemical in the same solution, so that the fluorescence standard can only be used at the wavelengths at which that chemical fluoresces.

Yksinkertaisissa, rutiinikäyttöön tarkoitetuissa fluoromet-30 reissä lampun intensiteetin ja ilmaisimen herkkyyden vaihtelun vaikutus mittaustuloksiin on kompensoitu vain osittain, kuten esim. EFLAB OY:n ,,FLUOROSKAN,,-fluorometrissä, jossa käytetään erillistä referenssi-ilmaisinta lampun kjrkkausvaihteluiden tarkkailuun, tai TDL:n "FlAX"-fluorometrissä (gb 1596521), jos-35 sa suotimen läpi kulkenut lampun valo ohiataan katkoian avulla vuoroin mittausvalon kanssa valomonistinputkelle.In simple fluorometers for routine use, the effect of variations in lamp intensity and detector sensitivity on the measurement results is only partially compensated, such as EFLAB OY's FLUOROSKAN fluorometer, which uses a separate reference detector to monitor lamp fluctuations, or In a "FlAX" fluorometer (gb 1596521), if the lamp light passing through the filter is bypassed by a breaker alternately with the measuring light on the photomultiplier tube.

Nyt on keksitty patenttivaatimuksissa esitetty laite ja menetelmä fluoresenssin mittaamiseksi.An apparatus and method for measuring fluorescence as set out in the claims have now been invented.

• ·· · ♦ «#··♦· ««· ····« t 9 ·*· ·· * »·*···»» · · · 9 9 9 9 · · · ··»» · » 9 9 ·« ·« ··· 0 0 9 9 9 9 0 ···· M ·» Ί 71 997 Tämän keksinnön olennainen uutuus on se, että optinen systeemi, jota pitkin irionokrOrriatisoitu referenscivalo johdetaan enissiomo- nokromaattorille, josta se joutuu valonilmaisimelle, sisältää optisen kuidun, joka on valmistettu sopivasti fluoresoivasta ai-5 neesta, kuten esim. muovista, ja toimii siten samanaikaisesti sekä valojohtimena että fluoresenssistandardina.• ·· · ♦ «# ·· ♦ ·« «· ····« t 9 · * · ·· * »· * ···» »· · · · 9 9 9 9 · · · ··» »· »9 9 ·« · «··· 0 0 9 9 9 9 0 ···· M ·» Ί 71 997 An essential novelty of the present invention is that the optical system along which the irionochromatized reference light is conducted to the primary monochromator from which it is exposed for a photodetector, includes an optical fiber suitably made of a fluorescent material, such as plastic, and thus simultaneously acts as both a light guide and a fluorescence standard.

Tämän keksinnön mukaiseen laitteeseen sisältyy säteenjaka- ja, kuten muihinkin referenssikanavaa käyttäviin laitteisiin, mutta säteenjakajasta saatu referenssivalo syötetään välittömästi 10 .The device according to the present invention includes a beam splitter, as with other devices using a reference channel, but the reference light obtained from the beam splitter is immediately supplied 10.

optiseen kuituun, joka on valmistettu kokonaan tai osittain sopivasta aineesta, esimerkiksi muovista, joka fluoresoi valoilmaisimen aallonpituusalueella silloin, kun sitä valaistaan jollakin käytössä olevista eksitaatioaal1onpituuksista. Tämän optisen kuidun, jota tässä nimitetään referenssi kuiduksi, toisesta 15 ....... ........an optical fiber made wholly or partly of a suitable material, for example plastic, which fluoresces in the wavelength range of the photodetector when illuminated at one of the excitation wavelengths in use. Of this optical fiber, referred to herein as the reference fiber, from another 15 ....... ........

paasta tuieva va*o syötetään errussi omot imen lävitse vai oni imai - sinelle. Koska näytteen fluoresenssia aina verrataan referenssi-kuidun fluoresenssiin, joka on vakio, on tulos riippumaton lampun kirkkaudesta tai ilmaisimen herkkyydestä.fasting is fed through the suction or on the suction. Since the fluorescence of the sample is always compared to the fluorescence of the reference fiber, which is constant, the result is independent of the brightness of the lamp or the sensitivity of the detector.

Keksinnön mukaisesti voidaan aikaansaada aikaisemmin tun- 20 nettuja laitteita merkittävästi yksinkertaisempi sisäistä fluc-resenssistandardia käyttävä fluorometri.According to the invention, a fluorometer using an internal fluctuation standard, which is significantly simpler than previously known devices, can be provided.

Erästä tämän keksinnön mukaista fluorometriä esittää oheinen kuva.A fluorometer according to the present invention is shown in the accompanying figure.

Valonlähteenä toimii lamppu 1. Eksitaatiosuodin 2 erottaa 2 f . ’ valosta sopivan eksitaatioallonpituuskaistan. Säteenjakaja 3 jakaa valon mittaus- ja referenssikanavaan sopivimmin niin, että suurin osa valosta menee mittauskanavaan. Suljin k päästää valon vuoroin referenssikuituun 5 ja eksitaatiokuituun 6. Vuorottelun taajuuden on oltava sellainen, että lamnun kirkkaus ja ilma'-30 . .The light source is lamp 1. The excitation filter 2 separates 2 f. ’From the appropriate excitation wavelength band. The beam splitter 3 preferably distributes the light to the measurement and reference channel so that most of the light goes to the measurement channel. The shutter k transmits light alternately to the reference fiber 5 and the excitation fiber 6. The frequency of the alternation must be such that the brightness of the lamp and the air'-30. .

simen herkkyys eivät ehdi jakson aikana merkittävästi muuttua.the sensitivity of the simulant does not change significantly during the period.

Tämä taajuus riippuu valonlähteen ja vs 1oni1msi?imen tyypistä ja ominaisuuksista, ja on yleensä sopivimmin välillä 1 ... 1000This frequency depends on the type and characteristics of the light source and the vs 1oni1msi? S, and is usually preferably between 1 ... 1000

Hs. Näytteestä 7 emittoitunut valo kerätään emissiokuituun 8.Hs. The light emitted from the sample 7 is collected in the emission fiber 8.

Emissiokuidusta ja referenssikuidusta tuleva valo yhdistetään 35 säteenyhai st-äjällä 9 ja johdetaan emi ssiosuotimen 10 lävitse 24 71997 valonilmaisimelle 11. Sulkimen ^ ollessa siinä asennossa, jossa se päästää valon referenssikuituun, mitataan valonilmaisimelta 11 referenssiarvo. Tätä referenssiarvoa voidaan käyttää millä tahansa alan ammattimiehen tuntemalla tavalla, kuten ilmaisimen 5 herkkyyden säätämiseen, jakamaan näytteestä saatu mittausarvo, jolloin saatu osamäärä on lopullinen tulos, tai säätämään näytteestä tehtävän mittauksen integrointiaikaa sen mukaisesti, miten referenssiarvo poikkeaa aikaisemmin mitatusta perusrefe-renssiarvosta.The light from the emission fiber and the reference fiber is combined 35 by a beam detector 9 and passed through an emission filter 10 24 71997 to a light detector 11. When the shutter is in the position where it emits light to the reference fiber, a reference value is measured from the light detector 11. This reference value can be used in any way known to a person skilled in the art, such as to adjust the sensitivity of the detector 5, to divide the measured value from the sample to the final result, or to adjust the integration time of the sample measurement according to how the reference value deviates.

10 Yllä kuvatussa mittausjärjestelmässä mittausten tarkkuus riippuu periaatteessa vain siitä, miten tarkkaan referenssikui-dun fluoresenssi pysyy vakiona. Yleisesti tunnettua on, että aineiden fluoresenssi heikkenee lämpötilan kasvaessa. Sellaisilla materiaaleilla, joista referenssikuitu voidaan valmistaa, ku-15 ten esim. polymetyylimetakrylaatti, fluoresenssin lämpötilariippuvuus on useita prosentin kymmenesosia Ke'! vin-astetta kohti . Riippuen siitä, miten lämpötila laitteen s i sä i 11 ä käytön ai etana muuttuu ja siitä, Kuinka tarkKa laitteesta halu' aan, voi o s: a tarpeen termostoida referenssi kuitu väkiolämpötilaan. Tämä 20 voidaan toteuttaa sijoittamalla se terrnostoituur tilaan tai sijoittamalla sen kanssa yhteisen vaipan alle yksi tai useampia kuitua myötäileviä vastuslankoja sekä lämpötila-anturi, joiden avulla referenssikuitu pidetään vakiolämpötilassa termostaatin 12 avulla.In the measuring system described above, the accuracy of the measurements depends in principle only on how accurately the fluorescence of the reference fiber remains constant. It is well known that the fluorescence of substances decreases with increasing temperature. For materials from which the reference fiber can be made, such as, for example, polymethyl methacrylate, the temperature dependence of the fluorescence is several tenths of a percent Ke '! per degree of vin. Depending on how the temperature changes during use of the device and how accurate the device is, it may be necessary to thermostat the reference fiber to a constant temperature. This can be accomplished by placing it in a thermostating space or by placing one or more resistance wires following it under the common sheath, as well as a temperature sensor by means of which the reference fiber is kept at a constant temperature by means of a thermostat 12.

25 Kuvan esimerkissä on käytetty erillistä sateenjakajaa ja suljinta. Yhtä hyvin voitaisiin käyttää elintä, joka täyttää molemmat tehtävät samanaikaisesti kuten esim. pyörivä sektori-peili.25 In the example of the figure, a separate rain divider and shutter have been used. An organ that performs both functions simultaneously, such as a rotating sector mirror, could just as well be used.

Kuvan esimerkissä on eksitaatiovalo viety näytteeseen ja 30 emissiovalo tuotu näytteestä optisten kuitujen avulla. Yhtä hyvin voitaisiin käyttää muunkinlaista optista systeemiä, kuten esim. linsseistä tai peileistä tai molemmista muodostuvaa. Kuvassa on myöskin esimerkin vuoksi käytetty sellaista optista järjestelyä, jossa eksitaatiokanava ja emissiokanava sijait-35 sevat näytteestä katsoen toisiinsa nähden 90° kulmassa. Yhtä hyvin voitaisiin käyttää sellaisiakin tunnettuja järjestelyjä, joissa eksitaatio- ja emissiokanava sijaitsevat, samalla puolen näytettä taikka sen vastakkaisilla puolilla.In the example of the figure, the excitation light is introduced into the sample and the emission light is introduced from the sample by means of optical fibers. Other types of optical systems could equally well be used, such as lenses or mirrors, or both. Also shown by way of example in the figure is an optical arrangement in which the excitation channel and the emission channel are located at an angle of 90 ° to each other when viewed from the sample. As well known in the art could be used in such arrangements in which the excitation and emissiokanava are located at the same side of the sample or its opposite sides.

Claims

A fluorometer comprising a light source (1), a beam splitter (3) for distributing light to a measurement channel and a reference channel, a beam exchanger (4) for passing light alternately to a measurement channel and a reference channel, an optical system (6, 8) for directing measurement channel light to a sample and for introducing fluorescent light emitted from the sample into the photodetector, if necessary filters or the like (10) for selecting a specific wavelength band from the fluorescent light to the photodetector (11), and an optical system (5) for introducing the reference channel light to the same the light detector has an optical fiber or a bundle of fibers made in part or in whole of a fluorescent material.

Fluorometer according to Claim 1, characterized in that the optical fiber or fiber bundle is arranged in a thermostated space.

Fluorometer according to Claim 2, characterized in that the optical fiber or bundle of fibers made of the fluorescent substance is surrounded by a jacket which also has a heating element inside.

A method for measuring fluorescence, wherein the excitation light is passed to the light detector (11) alternately through a measuring channel having a sample (7) and alternately through a reference channel, characterized in that the reference channel has an optical fiber or fiber bundle (5), made wholly or partly of a fluorescent material.

A method according to claim 3, characterized in that the temperature of the optical fiber made of the fluorescent substance is kept constant during the measurement.