FI71997B - Fluorometer och foerfarande foer fluorescensmaetning - Google Patents

Description

1 71997

Fluorometri ja menetelmä fluoresenssin mittaamiseksi Tämä keksintö koskee mittausjärjestelyä nestemäisen, kiinteän tai kaasumaisen näytteen fluoresenssin mittaamiseksi, jossa 5 valonlähteen kirkkauden ja valoniImaisimen herkkyyden vaihteluista johtuvat virheet eliminoidaan käyttämällä hyväksi sisäistä fluoresenssistandardia.

Fluoresenssilla tarkoitetaan ilmiötä, jossa aine, jota valaistaan tietyn aallonpituuden omaavalla valolla, säteilee pi-10 tempiaaltoista valoa. Yksinkertaisessa fluorometrissä on valonlähde, laite valon aallonpituuskaistan valitsemiseksi, paikka johon näyte asetetaan, ja valoilmaisin. Laite valon aallonpituus-kaistan valitsemiseksi voi olla esim. hila- tai prismamonokro-maattori tai suodin. Yksinkertaisuuden vuoksi voidaan puhua vain 1 5 suotimista. Näytteeseen kohdistuvaa valga nimitetään eksitaa-tiovaloksi ja näytteen itsensä säteilemää valoa emissiovaloksi. Eksitaatiovalonsäteen ja emissiovalon keruujärjestelmän keskinäisen geometrisen suhteen valinnalla pyritään useimmiten saavuttamaan sellainen tilanne, että mahdollisimman vähän eksitaa-20 tiovaloa joutuu emissiovalon keruujärjestelmään ja sitä tietä ilmaisimelle. Tästä huolimatta pieni määrä eksitaatiovaloa pääsee sironnan ja heijastusten kautta emissiokanavaan, joten jos halutaan mitata hyvin pieniä määriä fluoresoivaa ainetta, on myös emissiokanavassa käytettävä suodinta.

25 Lampun kirkkaudessa esiintyy sekä pitkäaikaista laskua, että lyhytaikaisia vaihteluja. Myöskään ilmaisimen, varsinkaan valo-monistinputken, herkkyys ei ole vakio, vaan riippuu mm. lämpötilasta. Spektrometrissä, jossa käytetään kerrallaan vain yhtä aallonpituutta, näiden ilmiöiden vaikutus mittaustulokseen saa-30 daan poistetuksi yksinkertaisesti johtamalla aikajaksoisesti osa monokromatisoidusta valosta näytteen ohi vaionilmaisimelle ja käyttämällä tästä saatua signaalia referenssinä tai säätämällä lampun kirkkautta tai valomonistinputken herkkyyttä siten, että mainittu signaali pysyy vakiona. Fluorometrissä, jossa ek-35 sitaatio- ja emissiovalo ovat eriväriset, stabilointia ei voida täydellisesti järjestää yhtä yksinkertaisella tavalla. Valomo- 2 71997 nistinputken herkkyyden lämpötilakerroin nimittäin on erilainen eri aallonpituuksilla: Lämpötilan noustessa herkkyys laskee melkein koko aallonpituusalueella, paitsi aivan sen pitkäaaltoisim-massa päässä, jossa se nousee. Jos nyt referenssivalona käyte-5 tään eksitaatiovaloa, joka johdetaan emissiosuotimen ohitse va-lomonistinputkelle, näyttää referenssisignaali lämpötilan nousun tapahtuessa valomonistinputken herkkyyden pienentyneen, vaikka se tosiasiallisella mittausaallonpituudella onkin kasvanut. Toisaalta eksitaatiovaloa ei voida viedä valomonistinputkelle emis-10 siosuotimen läpi, koska emissiosuodin on eksitaatioaallonpituu-della läpinäkymätön.'Ainoa keino täydellisen stabiloinnin aikaansaamiseksi, joka myös ottaa huomioon mahdolliset muutokset suotimien ominaisuuksissa, on fluoresenssistandardin käyttö.

Ennestään tunnetussa tekniikassa eksitaatiovalon kohdista-15 minen fluoresenssi standardi in ja emissiovalon keruu siitä on tapahtunut olennaisesti samalla tavalla, kuin näytteen ollessa kysymyksessä. Tämä on vaatinut useita linssejä ja muita optisia komponentteja, tai jos näytteen ja fluoresenssistanoardin mittaamiseen on käytetty samaa optista systeemiä, liikkuvia osia näyt-20 teen ja fluoresenssistandardin tai optisen systeemin liikuttamiseksi.

Aikaisemmin sisäistä fluoresenssistandardia käyttävät laitteet ovatkin olleet monimutkaisia ja kalliita. Fluoresenssistan-dardi on ollut fluoresoivan kemikaalin vesiliuos, joka on määrä-, 25 ajoin vaihdettava, tai muoviin valettu fluoresoiva kemikaali.

Yleensä samassa liuoksessa on vain yksi fluoresoiva kemikaali, jolloin fluoresenssistandardia voidaan käyttää vain niillä aallonpituuksilla, joilla kyseinen kemikaali fluoresoi.

Yksinkertaisissa, rutiinikäyttöön tarkoitetuissa fluoromet-30 reissä lampun intensiteetin ja ilmaisimen herkkyyden vaihtelun vaikutus mittaustuloksiin on kompensoitu vain osittain, kuten esim. EFLAB OY:n ,,FLUOROSKAN,,-fluorometrissä, jossa käytetään erillistä referenssi-ilmaisinta lampun kjrkkausvaihteluiden tarkkailuun, tai TDL:n "FlAX"-fluorometrissä (gb 1596521), jos-35 sa suotimen läpi kulkenut lampun valo ohiataan katkoian avulla vuoroin mittausvalon kanssa valomonistinputkelle.

Nyt on keksitty patenttivaatimuksissa esitetty laite ja menetelmä fluoresenssin mittaamiseksi.

• ·· · ♦ «#··♦· ««· ····« t 9 ·*· ·· * »·*···»» · · · 9 9 9 9 · · · ··»» · » 9 9 ·« ·« ··· 0 0 9 9 9 9 0 ···· M ·» Ί 71 997 Tämän keksinnön olennainen uutuus on se, että optinen systeemi, jota pitkin irionokrOrriatisoitu referenscivalo johdetaan enissiomo- nokromaattorille, josta se joutuu valonilmaisimelle, sisältää optisen kuidun, joka on valmistettu sopivasti fluoresoivasta ai-5 neesta, kuten esim. muovista, ja toimii siten samanaikaisesti sekä valojohtimena että fluoresenssistandardina.

Tämän keksinnön mukaiseen laitteeseen sisältyy säteenjaka- ja, kuten muihinkin referenssikanavaa käyttäviin laitteisiin, mutta säteenjakajasta saatu referenssivalo syötetään välittömästi 10 .

optiseen kuituun, joka on valmistettu kokonaan tai osittain sopivasta aineesta, esimerkiksi muovista, joka fluoresoi valoilmaisimen aallonpituusalueella silloin, kun sitä valaistaan jollakin käytössä olevista eksitaatioaal1onpituuksista. Tämän optisen kuidun, jota tässä nimitetään referenssi kuiduksi, toisesta 15 ....... ........

paasta tuieva va*o syötetään errussi omot imen lävitse vai oni imai - sinelle. Koska näytteen fluoresenssia aina verrataan referenssi-kuidun fluoresenssiin, joka on vakio, on tulos riippumaton lampun kirkkaudesta tai ilmaisimen herkkyydestä.

Keksinnön mukaisesti voidaan aikaansaada aikaisemmin tun- 20 nettuja laitteita merkittävästi yksinkertaisempi sisäistä fluc-resenssistandardia käyttävä fluorometri.

Erästä tämän keksinnön mukaista fluorometriä esittää oheinen kuva.

Valonlähteenä toimii lamppu 1. Eksitaatiosuodin 2 erottaa 2 f . ’ valosta sopivan eksitaatioallonpituuskaistan. Säteenjakaja 3 jakaa valon mittaus- ja referenssikanavaan sopivimmin niin, että suurin osa valosta menee mittauskanavaan. Suljin k päästää valon vuoroin referenssikuituun 5 ja eksitaatiokuituun 6. Vuorottelun taajuuden on oltava sellainen, että lamnun kirkkaus ja ilma'-30 . .

simen herkkyys eivät ehdi jakson aikana merkittävästi muuttua.

Tämä taajuus riippuu valonlähteen ja vs 1oni1msi?imen tyypistä ja ominaisuuksista, ja on yleensä sopivimmin välillä 1 ... 1000

Hs. Näytteestä 7 emittoitunut valo kerätään emissiokuituun 8.

Emissiokuidusta ja referenssikuidusta tuleva valo yhdistetään 35 säteenyhai st-äjällä 9 ja johdetaan emi ssiosuotimen 10 lävitse 24 71997 valonilmaisimelle 11. Sulkimen ^ ollessa siinä asennossa, jossa se päästää valon referenssikuituun, mitataan valonilmaisimelta 11 referenssiarvo. Tätä referenssiarvoa voidaan käyttää millä tahansa alan ammattimiehen tuntemalla tavalla, kuten ilmaisimen 5 herkkyyden säätämiseen, jakamaan näytteestä saatu mittausarvo, jolloin saatu osamäärä on lopullinen tulos, tai säätämään näytteestä tehtävän mittauksen integrointiaikaa sen mukaisesti, miten referenssiarvo poikkeaa aikaisemmin mitatusta perusrefe-renssiarvosta.

10 Yllä kuvatussa mittausjärjestelmässä mittausten tarkkuus riippuu periaatteessa vain siitä, miten tarkkaan referenssikui-dun fluoresenssi pysyy vakiona. Yleisesti tunnettua on, että aineiden fluoresenssi heikkenee lämpötilan kasvaessa. Sellaisilla materiaaleilla, joista referenssikuitu voidaan valmistaa, ku-15 ten esim. polymetyylimetakrylaatti, fluoresenssin lämpötilariippuvuus on useita prosentin kymmenesosia Ke'! vin-astetta kohti . Riippuen siitä, miten lämpötila laitteen s i sä i 11 ä käytön ai etana muuttuu ja siitä, Kuinka tarkKa laitteesta halu' aan, voi o s: a tarpeen termostoida referenssi kuitu väkiolämpötilaan. Tämä 20 voidaan toteuttaa sijoittamalla se terrnostoituur tilaan tai sijoittamalla sen kanssa yhteisen vaipan alle yksi tai useampia kuitua myötäileviä vastuslankoja sekä lämpötila-anturi, joiden avulla referenssikuitu pidetään vakiolämpötilassa termostaatin 12 avulla.

25 Kuvan esimerkissä on käytetty erillistä sateenjakajaa ja suljinta. Yhtä hyvin voitaisiin käyttää elintä, joka täyttää molemmat tehtävät samanaikaisesti kuten esim. pyörivä sektori-peili.

Kuvan esimerkissä on eksitaatiovalo viety näytteeseen ja 30 emissiovalo tuotu näytteestä optisten kuitujen avulla. Yhtä hyvin voitaisiin käyttää muunkinlaista optista systeemiä, kuten esim. linsseistä tai peileistä tai molemmista muodostuvaa. Kuvassa on myöskin esimerkin vuoksi käytetty sellaista optista järjestelyä, jossa eksitaatiokanava ja emissiokanava sijait-35 sevat näytteestä katsoen toisiinsa nähden 90° kulmassa. Yhtä hyvin voitaisiin käyttää sellaisiakin tunnettuja järjestelyjä, joissa eksitaatio- ja emissiokanava sijaitsevat, samalla puolen näytettä taikka sen vastakkaisilla puolilla.

Claims (5)

1. Fluorometri, johon sisältyy valonlähde (1), sä-teenjakaja (3) valon jakamiseksi mittauskanavaan ja refe-renssikanavaan, säteenvaihtaja (4) valon päästämiseksi vuo- 5 roin mittauskanavaan ja referenssikanavaan, optinen systeemi (6, 8) mittauskanavan valon kohdistamiseksi näytteeseen sekä näytteestä emitoituvan fluoresenssivalon viemiseksi valonilmaisimeen, tarvittaessa suotimia tai vastaavia (10) tietyn aallonpituuskaistan valitsemiseksi fluore-10 senssivalosta valonilmaisimelle (11), ja optinen systeemi (5) referenssikanavan valon viemiseksi samalle valonilmaisimelle, tunnettu siitä, että optisessa systeemissä (5) referenssikanavan valon viemiseksi valonilmaisimelle on optinen kuitu tai kuitukimppu, ioka on osittain tai ko-15 konaan valmistettu fluoresoivasta aineesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fluorometri, tunnettu siitä, että optinen kuitu tai kuitukimppu on sijoitettu termostoituun tilaan.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen fluorometri, 20 tunnettu siitä, että fluoresoivasta aineesta valmistettu optinen kuitu tai kuitukimppu on ympäröity vaipalla, jonka sisällä on lisäksi lammitysvastus.

4. Menetelmä fluoresenssin mittaamiseksi, jossa ek-sitaatiovalo johdetaan valonilmaisimelle (11) vuoroin mit- 25 tauskanavan läpi, jossa on näyte (7), ja vuoroin referenssikanavan läpi, tunnettu siitä, että referenssi-kanavassa on optinen kuitu tai kuitukimppu (5), joka on kokonaan tai osittain valmistettu fluoresoivasta aineesta.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u n -30 n e t t u siitä, että fluoresoivasta aineesta valmistetun optisen kuidun lämpötila pidetään vakiona mittauksen aikana.