FI71553B - Analogifoerfarande foer framstaellning av nya inhibitorer foerett angiotensin omvandlande enzym - Google Patents

Description

71553

Analogiamenetelmä angiotensiiniä muuttavan entsyymin uusien inhibiittoreiden valmistamiseksi

Erotettu jakamalla hakemuksesta 770437

Keksinnön kohteena on analogiamenetelmä angiotensiiniä muuttavan entsyymin uusien inhibiittoreiden valmistamiseksi, joiden kaava on 10 R3 I4 I1 ί] (I)

15 HS—(CH) CH—CO—N-*1—COR

* n * jossa R on hydroksi tai alempi alkoksi, R^ ja R^ tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä, alempaa alkyy-20 liä tai fenyyli-alempi-alkyyliä ja R^ voi lisäksi olla fenyyli, R^ on vety, hydroksi tai alempi alkyyli, ja n on 0, 1 tai 2, ja niiden emäksisten suolojen valmistamiseksi.

Uusia inhibiittoreita voidaan valmistaa siten, 25 että yhdisteestä, jonka kaava on R3

30 J

R4 R1 I ^

i i I

Y — S (CH) —CH —CO —N __*L_ COR

* n * 35 2 71553 jossa R, R^, R^/ R^ ja n tarkoittavat samaa kuin edellä ja Y on alempi alkanoyyli, fenyyli-alempi-alkanoyyli, bentsoyyli, bentsyyli, metoksibentsyyli, trifenyyli-metyyli, tetrahydropyranyyli tai asetamidometyyli, pois-5 tetaan rikkiä suojaava ryhmä Y vetyatomin regeneroimi- seksi.

Tähdet kaavoissa osoittavat asymmetrisiä hiili-atomeita. Jokainen hiilistä, joissa on substituentti Rl, R^ tai R^ , on asymmetrinen, kun mainittu substi-10 tuentti on muu kuin vety.

Stereoisomeerit, joissa proliini on L-muodossa, ovat erikoisen edullisia.

Edellä mainituista substituenteista alemmat al-kyyliryhmät ovat suora- tai haaraketjuisia metyylistä 15 heptyyliin, esim. metyyli, etyyli, propyyli, isopro-pyyli, butyyli, isobutyyli, t-butyyli, pentyyli, iso-pentyyli ja senkaltaiset. Alemmat alkoksiryhmät ovat vastaavaa tyyppiä sisältäen 1-7 hiiliatomia liittyneenä happeen, esim. etoksi, propoksi, isopropoksi.

20 Kaavan I ja sen edullisten alaryhmien mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa erilaisilla synteettisillä menetelmillä.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä valmistetaan yleensä asyloimalla yhdiste, jonka kaava on (II) 25 - Λ HN_1-COR (II) 35 3 71553 merkaptoalkaanihapolla, jonka kaava on , ?4 R1

5 I I

Y - S - (CH)n - CH - COR (IHd)

Suojaryhmän Y poistaminen voidaan suorittaa si-10 nänsä tunnetulla tavalla, kuten käsittelemällä kuu- makka trifluorietikkahapolla, kylmällä trifluorimetaa-nisulfonihapolla, merkuriasetaatilla, natriumilla nestemäisessä ammoniakissa, sinkillä ja kloorivety-hapolla tai sen kaltaisella. Nämä menetelmät on ku-15 vattu julkaisussa: Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Voi. XV, osa I, sivulta 736 alkaen (174).

Suojaryhmä Y on edullisesti alempi alkanoyyli tai fenyyli-alempialkanoyyli ja se poistetaan stan-20 dardihydrolyysin avulla, esimerkiksi ammonolyysin avulla alkoholipitoisella ammoniakilla tai väkevällä ammoniumhydroksidiliuoksella tai alkalisen hydrolyysin avulla vesipitoisella metallihydroksidilla kuten nat-riumhydroksidilla.

25 Kaavan I mukaisissa yhdisteissä on yksi tai useam pia asymmetrisiä hiiliatomeja. Kun R^, R^ tai tarkoittavat muuta kuin vetyä, niin hiili, johon ne ovat kiinnittyneet, on asymmetrinen. Näitä hiiliatomeja on merkitty tähdellä kaavassa I. Yhdisteet ovat näin ollen stereo-30 isomeerisissä muodoissa tai niiden raseemisina seoksina.

4 71553

Kaikki nämä muodot kuuluvat keksinnön piiriin. Edellä kuvatuissa menetelmissä voidaan käyttää lähtöaineina rase-maattia tai enantiomeeriä. Käytettäessä raseemista lähtöainetta edellä kuvatussa synteesissä yhdisteeseen sisäl-5 tyvät stereoisomeerit voidaan erottaa tunnetuilla kroma- tograafisilla tai jakokiteyttämismenetelmi1 1 ä. Yleensä L-isomeeri aminohapon hiilen suhteen käsittää edullisen isomeerisen muodon. Myös D-isomeeri asyylisivuketjun c^-hiileen (hiili, jossa on ) nähden on edullinen.

10 Keksinnön mukaiset yhdisteet muodostavat emäksi siä suoloja erilaisten epäorgaanisten ja orgaanisen emäksien kanssa ja ne kuuluvat myös keksinnön piiriin. Sellaisia suoloja ovat ammoniumsuolat, aikaiimetall isuo.1 at kuten natrium- ja kaliumsuolat (jotka ovat edullisia), maa-15 alkalimetal1isuolat kuten kalsium- ja magnesiumsuolat, suolat epäorgaanisten emästen kanssa, esim. disyklohek-syyliamiinisuola, bentsatsiini-, N-metyyli-D-glukamiini-, hydrabamiinisuolat, suolat aminohappojen, kuten arginii-nin ja lysiinin kanssa. Eimyrkyl1iset, fysiol ogisesti hy-20 väksyttävät suolat ovat edullisia, vaikkakin muut suolat ovat myös käyttökelpoisia, esim. eristettäessä tai puhdistettaessa tuote siten kuin on kuvattu disykloheksyyli-amiini-suolan yhteydessä suoritusesimerkeissä.

Suoloja muodostetaan sinänsä tunnetulla tavalla 25 antamalla tuotteen vapaan happomuodon reagoida emäksen ekvivalentin kanssa halutun kationin aikaansaamiseksi, liuottimessa tai väliaineessa, johon suola liukenee, tai vedessä ja sen jälkeen poistamalla vesi jäähdytyskuivaa-malla. Neutraloitaessa suola liukenemattomalla hapolla, 30 kuten kationinvaihtohartsilla vetymuodossa (esim. poly- styreenisulfonihappohartsi, kuten Dowex 50), tai vesipitoisella hapolla ja uuttamalla orgaanisella liuottimena, esim. etyyliasetaatilla, dikloorimetaanilla tai sen kaltaisella voidaan saada vapaa happo ja haluttaessa muodos-35 taa toinen suola.

5 71553

Keksinnön mukaiset yhdisteet estävät dekapeptidi-angiotensiinin I muuttumisen angiotensiiniksi II ja sen vuoksi ne ovat käyttökelpoisia lievennettäessä tai poistettaessa angiotensiinin aiheuttamaa kohonnutta veren-5 painetta. Entsyymi-reniinin vaikutus angiotensinogeeniin/ veriplasmassa olevaan pseudoglobuliiniin aikaansaa angiotensiinin I. Angiotensiini I muuttuu angiotensiiniä tuottavan entsyymin (ACE) vaikutuksesta angiotensiiniksi II. Viimeksimainittu on aktiivinen painetta aikaansaava 10 aine, jonka on todettu aiheuttavan verenpainetaudin eri laisia muotoja eri nisäkkäissä, esim. rotissa ja koirissa. Keksinnön mukaiset yhdisteet vaikuttavat muutossarjaan angiotensiini(resiini)angiotensiini I—> angiotensiini II estämällä angiotensiiniä muuttavan entsyymin vaikutuksen 15 ja vähentämällä tai poistamalla painetta aiheuttavan angiotensiinin II muodostumisen. Annostelemalla koostumusta, joka sisältää yhtä tai useampaa kaavan I mukaista yhdistettä tai sen fysiologisesti hyväksyttävää suolaa parannetaan nisäkkäissä esiintyvää angiotensiinistä 20 riippuvaista liiallista verenpainetta. Yksinkertainen annos tai edullisesti 2-4 jaettu päivittäistä annosta määrässä noin 0,1.-100 mg kg kohti päivässä, edullisesti noin 1-50 mg kg kohti päivässä on sopiva vähentämään verenpainetta, kuten on osoitettu eläinkokeilla, jotka 25 on kuvattu julkaisussa: S.L. Engel, T.R. Schaeffer, M.H. Waugh ja B. Rubin, Proc. Soc. Exp. Bio!. Med 143, 483 (1973). Ainetta annetaan edullisesti suun kautta, mutta myös voidaan käyttää parenteraalista annostusta, kuten laskimonsisäistä, lihaksensisäistä, ihonalaista 30 tai intraperitoneaalista annostusta.

Eräs ihmisen kehon verenpainetta sääteleviä kohottavia systeemejä on reniini-angiotensiini-aldosteroni-systeemi. Reniiniä, joka on entsyymi, muodostuu munuaisen viereisen glomerulaarisen elinryhmän myoepiteeli-35 soluissa ja vapautuu niistä. Reniinin rekreetion säätely mekanismia kontrolloi ensi sijassa veren suola- ja 6 71553 vesipitoisuus ja paine, jolla sydän pumppaa verta munuaisen lävitse. Kun nämä tekijät alenevat, joutuu renii-niä suoraan vereen. Siinä se kohtaa substraattisen d 2~globuliinin, angiotensinogeenin (aktiivinen prote-5 iini). Reniini hajottaa angiotensinogeenin kahdeksi

myös inaktiiviseksi komponentiksi tetrapeptidiksi ja dekapeptidiksi nimeltä angiotensiini I (A-I). Kiertäessään kapillaareissa (ensi sijassa keuhkon kapillaareissa) A-I kohtaa angiotensiiniä muuttavan entsyymin 10 (ACE), jota on kapillaarien endoteelisoluissa. ACE

hajottaa A-I:n dipeptidiksi ja oktapeptidiksi eli angiotensiini II:ksi (A-II), joka on voimakkain tunnettu verenpainetta kohottava aine ihmisen kehossa.

A-II:n verenpainetta kohottava vaikutus tapahtuu paikal-15 lisesti lihaksissa ja myös keskushermostossa; aivojen takaalue, sen jälkeen kun A-II on stimuloinut sitä, lähettää muuhun kehoon verenpainetta kohottavia impullse-ja. Lisäksi A-II saa aikaan toisen vaikutuksen, nim. aldosteronin erään mineraalikortikoidin adrenaalikortek-20 sista sekrekoitumisen fysiologisen stimulaation. Aldoste- roni lisää natriumionien resorptiota munuaistiehyeistä, jolloin veren tahollinen tilavuus kasvaa, niin että verenpaine vielä kohoaa tämän toisen mekanismin johdosta .

25 Paitsi A-I:n konversiota A-II:ksi ACE:llä on vielä lisäfunktio. Veri sisältää erästä oktapeptidiä bradykiniiniä, jolla on vasodil.atorisia ominaisuuksia; ACE muuttaa bradykiniinien inaktiivisiksi komponenteiksi. Tähän funktioon nähden ACE joskus tunnetaan ni-30 mellä kininaasi II.

Hypertensiosta kärsivillä ihmisillä reniini-angiotensiini-aldosteronisysteemi on häiriytynyt, mikä kohottaa haitallisesti potilaan korkeata verenpainetta. Lääke, joka inhiboi ACE:tä, saa aikaan seuraavat vaiku-35 tukset: 7 71553 1. A-II:n muodostumisen esto ja näin ollen: a) verisuonien supistumisen suora esto b) etäminen aldosteronia kulkeutumasta adrenaali-korteksista (ts. veden ja suolan liiallisen resorption 5 esto) sekä 2. ACE:n inhiboimisen tuloksena bradykiniinin hajoamisen esto, niin että sen vasodilatorinen (verenpainetta alentava) vaikutus) säilyy.

Mikään tavanomaisista antihypertensiivisistä 10 lääkkeistä ei ole ACE:n inhibiittori.

Kaavan I mukaiset yhdisteet ovat voimakkaita ACE:n inhibiittoreita. Ne estävät dekapeptidi angioten-siini I:n konversion angiotensiini II:ksi ja täten minimoivat ja eliminoivat angiotensiini I:n aiheuttamaa 15 hypertensiota. Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet puuttuvat angiotensinogeeni (reniini)-angiotensiini I-angiotensiini II konversioon salpaamalla ACE:tä ja siten minimoimalla ja eliminoimalla angiotensiini II:n muodostumisen, joka angiotensiini II on yhdiste, josta ve-20 renpaineen kohoaminen johtuu. Kaavan I mukaisten yhdis teiden vaikutukseen tehollinen kohta molekyylissä poikkeaa täysin tavallisesti käytettyjen verenpainelääkkeiden tehollisesta kohdasta molekyylissä. Keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden avulla on mahdollista 25 puuttua, päinvastoin kuin tavanomaisia verenpainelääkkei tä käytettäessä, hypertensiota aiheuttaviin tekijöihin.

Kuten edellä jo mainittiin, kaavan I mukaisten yhdisteiden farmakologinen käyttökelpoisuus perustuu niiden kykyyn inhiboida angiotensiiniä muuttavan entsyy-30 min vaikutusta. Inhibointi määritetään in vitro mittaa malla sellaisen angiotensiiniä muuttavan entsyymin vaikutus, joka on eristetty kanin keuhkosta ja määrittämällä marsun sykkyräsuoleen angiotensiini I:llä aiheutettuja supistuksia inhiboiva vaikutus.

35 8 71553

Angiotensiiniä muuttavan, kanin keuhkosta eriste- tyn entsyymin inhibointi____

Kanin keuhkosta eristetyn, angiotensiiniä muuttavan entsyymin aktiviteetti -soluvapaassa uutteessa -5 mitataan spektrofotometrisesti määrittämällä hippurihappo, jota vapautuu hippuryyli-L-histidyyli-L-lensiinistä (HHL) entsyymin vaikutuksesta menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Cushman & Cheung, Biochem. Pharmacol.

20, 1637 (1971).

/ (^) \-Gly-His-Leu -> /—+ His-Leu '-' HHL \-/ hippurihappo 15 Tässä spektrofotometrisessä kokeessa täytyy inku- boida 37°C:ssa 0,25 ml:n tilavuudessa seuraavia komponentteja: 100 mM fosforipuskuria (pH 8,3) 300 mM natriumkloridia 20 0,001-1000 yug/ml inhibiittoria tai ilman sitä 5-10 mYksikköä entsyymiä

Sen jälkeen kun on inkuboitu edellä esitettyjä komponentteja eri inhibiittoripitoisuuksissa (tai ilman inhibiittoria) 30 min ajan, entsyymireaktio pysäytetään 25 lisäämällä 0,25 ml kloorivetyhappoa. Suoritetaan tarkis tus inaktivoimalla entsyymi ajassa nolla siten, että lisätään happo ennen entsyymiä. Jokaiseen koeputkeen lisätään etyyliasetaattia (1,5 ml) entsyymin muodostaman hippurihapon uuttamiseksi. Sen jälkeen kun on sekoitettu 30 voimakkaasti (vortex) 20 sek ajan ja etyyliasetaattikerros on erotettu sentrifugoimal 1 a, otetaan .1,0 ml:n erä ja haihdutetaan kuiviin 100°C:ssa ja hippurihappo liuotetaan uudelleen 1,0 ml:aan vettä ja sen kvantitatiivinen määrä lasketaan absorbanssista 228 nm:ssä.

35 Angiotensiiniä muuttavan entsyymin inhiboiva kyky ilmaistaan arvona I, joka on se määrä inhibiittoria 71553 9 ^ug/ml tai ^uM, joka tarvitaan inhiboimaan 50 % angio-tensiiniä muuttavan entsyymin aktiviteetistä mitattuna spektrofotometrisellä menetelmällä. Tämä arvo saadaan piirtämällä prosentteina inhibitio, jonka saa aikaan 5 inhibiittoripitoisuudessa 2-kertaisesta 3-kertaiseen alu eella 0,001 ^ug/ml - 1000 ^ug/ml. Prosentuaalinen inhibitio lasketaan yhtälöstä % inhibito = (A-A°) - (B-B°) (A-A°) 10 A = hippurihapon absorbanssi 30 min kokeessa ilman inhibiittoria A°= tausta-absorbanssi kokeessa, jossa inkuboi-tiin 0 min.

15 B = hippurihapon absorbanssi 30 min kokeessa sellaisessa inhibiittoripitoisuudessa, jota tutkittiin prosentuaalisen inhibition määrittämiseksi B° = tausta-absorbanssi inhibiittoria sisältävässä kokeessa, mutta inkubointiajän ollessa 0 min.

20 Menetelmä angiotensiini I:tä muuttavan entsyymin (ACE) inhibiittorin aktiviteetin tutkimiseksi marsun sykkyräsuolella in vitro__ Tätä menetelmää käytetään toteamaan onko jokin yhdiste angiotensiini I:tä muuttavan entsyymin inhibiit-25 tori ja koe perustuu tutkittavan yhdisteen aktiviteettiin angiotensiini I:llä aiheutettuja marsun sykkyräsuolen supistuksia vastaan. ACE:n inhibiittorit yleensä inhiboivat angiotensiini I:llä aiheutettuja supistuksia.

Ruokitut Hartley-marsut, joita oli molempaa 30 sukupuolta ja joiden paino oli 300-400 g, tapettiin iskemällä päähän. Sykkyräsuoli poistettiin ja 2-3 cm:n näytteitä preparoitiin Vane'n menetelmällä. Jokainen sykkyräsuolisuikale suspendoitiin 10 ml:n kudoskylpyyn, 2 joka oli täytetty Krebs'in liuoksella ja jonka lämpö-35 tila oli 37°C ja jota ilmastettiin 95 % 0£ ja 5 % CO2 sisältävällä kaasulla, lihasaktiviteetti rekisteröitiin 10 71 553 isotonisesti 1 g:n kuormituksella käyttäen Harvard^ 356 sydän/sileä lihas-muutinta, joka oli yhdistetty laitteeseen Backman Type R Dynograph. Sen jälkeen kun kudokset olivat tasapainottuneet noin 90 min ajan, saa-5 tiin 2 minuutin kontrollivasteita 10 min välein seuraa- valla toimijalla:

Antiotensiini I (A-J) 0,025 yUg/ml FBC (FBC=kylvyn loppu-pitoisuus). Tässä A-I-pitoisuudessa aiheutuneet supistukset edustavat 50-75 % maksimiarvosta.

10 Tutkittava yhdiste liuotetaan tavallisesti ve teen tai suolaliuokseen ja laimennetaan 10-kertaisesti 1^0 :11a. Toimijaa esikäsitellään 2 min ajan tutkittavalla yhdisteellä ja supistusvasteiden prosentuaalinen muutos lasketaan. Erittäin aktiiviset yhdisteet, ts.

15 yhdisteet, jotka todennäköisesti ovat ACE:n inhibiitto- reita, inhiboivat tavallisesti angiotensiini I:llä aiheutettuja supistuksia.

EC50' 3ota joskus kutsutaan nimellä IC^q (tutkittavan yhdisteen pitoisuus, joka aikaansaa 50 %:n inhi- 20 bointi on A-I:n supistustehossa) arvioidaan graafisesti tai biometrisesti.

Kirjallisuus 1. Vane, J.R. Brit. J Pharmacol. 23: 360, 1964 2. Handschumacher, R.C. and J.R. Vane. Brit. J.

25 Pharmacol. 29: 105, 1967.

3. Rubin, B., E. O'Keefe, D.G. Kotler, D.A.

DeMaio and D.W. Cushman. Fed. Proc. 34: 770, 1976.

4. O'Keefe, E.H., Kotler, D.G., Waugh, M.H. & Rubin, B. Fed. Proc. 31: 511, 1972 30 5. Rubin, B., Laffan, R.J., Kotler, D.G., O'Keefe, E.H., DeMaio; D. A., & Goldberg, M.E. J. Pharmacol.

Exper. Therap. 204: 271, 1978.

HA-B χ 100 A = A-I supistuksia (mms) ennen tutkittavan A yhdisteen lisäämistä.

35 B = A-I supistuksia (mms) tutkittavan yhdis teen lisäämisen jälkeen.

n 71553

Seuraavassa taulukossa I on esitetty kaavan I mukaisten yhdisteiden 1^- ja ICj-q (EC^q) -arvot.

12 71 553 s en r- <£> ·*τ cm ro o ro m r- .h

W £> ΓΟ VO O CM U~) O VOrHOO

3 ooooo o r- cm i o o \ V fc, V fc* S ^ ^ ^ w

w OOOOO OfHOOOO

g

Ph o \ m tn oo »h CN

,,^21 <T\ ro ro in r-ι o <N co rH r-4 o

I H 3 r-H (N O Ο <N O LO Ή O O O

\ ^ S V w w l» ^ «k I» 0 '—' ooooo oooooo oT-g'5 *"*Ί I C ΟΟΟιΗιΗ r-lp-I r-l i—! r—I *—i o u - s

M CM

3 κ i

Ή O

2 u <0

H I

«.ns S <N<NCM<N<N <N<N<N<N<NCM

c pfig

I ro w ΖΠ iC

Sg ps κ κ κ κ o κ κ κ κ o o • ♦

pf . > IKK K K K K K K

H QJQJ^Q

* ffi ^ ~ ^ —' Q ^ — roro ro ro ro '—· ro ro

υυκκ δ δ S S δ S

H K K K K K K K K^1 KKK

PS ooooo o o z o o o u 71 553 S 'ä m vo r) nF h ΙΟ Ifi Γ" O <N lT> H 7?, o^rovooo^ro Γ'ΙΠΊ· ooo^oooo ^ ^ (NOO I oooooooo •ä a> ,-, -3r σ> ^ n Γ' Φ

^ [n fTi rovo OVOOCNOrHrHO

iM g <h cn m «noooooooo

0 (NOO (NOOOOOOOO

0

rflglB

|_| ϋ | g (N rHrH i-Hr-lr—IrHr-li—|r—IrHtH

9 4j* 2 tn i

iH O

a u (0

H I

sT-g E <N (N (N <N(N(N(N(N(N(N(N(N

m ofig ^

Jj oT aaa k!EkkkSV°° « « ä

pT4 eg ^ sg aaciEKKKKffiK

g

_ I

et 3 s § - 5 g s § S S u in m fo *'—' s—' ^ S ro ro B ffi U ro ro ro ro

g 8 S ifiTi S ϊ B S

ro af1 ^ « g g g Sgggggggg g i4 71 5 5 3 cf Ϊ =0 örri vomm o m vo vo ro σ\ 3 ·—i o cn m h o ld r-t vo

^ ^ fei ^ ^ ^ ^ V

— OOOIOOOOOO

r-i g cc o \ m ^ o u-ityi voo'J' vocNLnmro I H 3 r-HvOCvirNCOCNOOro^

O —· OOOCOOOOOOrH

u _ε' oT-S-0

M ' 1 C »Hr—li—li—Ι»Η»Η»ΗιΗι—li—I

Q U -Z

.£ CN

2 κ i

»H O

3 u <0

E-ι I

ηϋδ E <N(NrM(NCN|(N(NCNCN(N

I »H

c 8 cr w οΓ-S t g pT ffiffiffiKKKZZK53’^

J -H

Ω rH

>1 -H tn S rH

H Jj i>i -H

« tC 33 ffi K ffi K r~~ S tn >i 3 3 s y lii QQQQQ SS .* C g .g «

’— —^ ·— in in H

ro ro ro ro ro iH h e ii ii ii ^ s s s s s a a Ä

S C C i K

aT a^ ΐ :£ a01 “· I

nkU" ^ 8 I löi I Ö 33 33 33 33 3

CC oooooooooo K

15 71 553

Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää verenpaineen alentamiseksi muodostamalla koostumuksia, kuten tabletteja, kapseleita tai nesteitä suun kautta annettavaksi tai steriilejä liuoksia tai suspensioita 5 parenteraalista annostelua varten. Noin 10-500 mg kaavan I mukaista tai yhdistettä yhdisteiden seosta tai fysiologisesti hyväksyttävää suolaa yhdistetään fysiologisesti hyväksyttävän väliaineen, kantoaineen, lisäaineen, sideaineen, säilöntäaineen, stabiloimisaineen, makua an-10 tavan aineen jne. kanssa yksikköannosmuotoon hyväksytyn farmaseuttisen käytännön mukaisesti. Aktiivisen aineen määrä näissä koostumuksissa tai valmisteissa on sellainen, että saadaan sopiva ainemäärä esitetyllä alueella.

Kuvaavia lisäaineita, joita voidaan käyttää tab-15 lettien, kapselien, ja senkaltaisten yhteydessä ovat seuraavat: sideaine kuten tragakantti, akasia, maissi-tärkkelys tai gelatiini; lisäaine kuten dikalsiumfos-faatti; hajoamista edistävä aine kuten maissitärkkelys, perunatärkkelys, alginiinihappo ja senkaltainen; liukkaak-20 sitekevä aine kuten magnesiumstearaatti; makeuttamisaine kuten sakkaroosi, laktoosi tai sakkariini; makua antava aine kuten piparminttu, wintergreen-öljy tai kirsikka.

Kun annosyksikkömuoto on kapseli, se voi sisältää edellä mainittujen aineiden lisäksi nestemäistä kantoainetta ku-25 ten rasvaöljyä. Erilaisia muita aineita voi olla läsnä päällysteenä tai yksikköannoksen fysikaalisen muodon muuta modifioimista varten. Esim. tabletit voidaan päällystää shellakalla, sokerilla tai molemmilla. Siirappi tai eliksiiri voi sisältää aktiivista yhdistettä, sakka-30 roosia makeuttamisaineen, metyyli- ja propyyli-parabee- nia säilöntäaineena, väriainetta ja makeuttamisainetta kuten kirsikka tai pomeranssiesanssia.

Sopivia koostumuksia injektiota varten saadaan tavanomaisen farmaseuttisen käytännön mukaisesti liuot-35 tamalla tai suspensoimalla aktiivinen aine väliaineeseen, kuten veteen injektiota varten, luonnosta saataviin kas- 16 ?1553 visöljyihin, kuten seesamöljyyn, maapähkinäöljyyn, kookos-pähkinäöljyyn, puuvillasiemenöljyyn jne tai synteettiseen rasva-väliaineeseen, kuten etyylioleaattiin tai senkaltaiseen. Puskuriaineita, säilöntäaineita, hapetuksen-5 estoaineita ja senkaltaisia voidaan lisätä tarvittaessa.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön mukaista menetelmää ja erikoisesti edullisia suoritusmuotoja. Kaikki lämpötilat on ilmoitettu Celsiusasteina.

Esimerkki 1 10 1-(2-merkaptoasetyyli)-L-proliini 1-(2-bentsoyylitioasetyyli)-L-proliini (3,4 g) liuotetaan veden (10,5 ml) ja väkevän ammoniakin (6,4 ml) seokseen. Tunnin kuluttua reaktioseos laimennetaan vedellä ja suodatetaan. Suodos uutetaan etyyliasetaatilla ja 15 tehdään happameksi väkevällä kloorivetyhapolla, kylläs tetään natriumkloridilla ja uutetaan kahdesti etyyliasetaatilla. Etyyliasetaattiuutteet pestään kyllästetyllä natriumkloridilla ja väkevöidään kuiviin, saanto 1,5 g. Tuote 1-(2-merkaptoasetyyli)-L-proliini kiteytetään etyy-20 liasetaatista (sp. 133-135°).

Esimerkki 2 1-(2-merkaptopropanoyyli)-L-proliini 1-(2-bentsoyylitiopropanoyyli)-L-proliini (5,7 g) liuotetaan veden (12 ml) ja väkevän ammoniumhydroksidin 25 (9 ml) seokseen samalla sekoittaen. Tunnin kuluttua seos laimennetaan vedellä (10 ml) ja suodatetaan. Suodos uutetaan kahdesti etyyliasetaatilla, väkevöidään 1/3 tilavuuteen, tehdään happameksi väkevällä kloorivetyhapolla ja uutetaan etyyliasetaatilla. Orgaaninen faasi pestään kyl-30 lästetyllä natriumkloridilla, kuivataan ja väkevöidään kuiviin tyhjössä. Jäännös 1-(2-merkaptopropanoyyli)-L-proliini kiteytetään etyyliasetaatti/heksaanista, saanto 3 g, sp. (105) 116-120°C.

17 71553

Esimerkki 3 1-(3-merkaptopropanoyyli)-L-proliini

Menetelmä A

1-(3-bentsoyylitiopropanoyyli)-L-proliini (4,9 g) 5 liuotetaan seokseen, jossa on vettä (8 ml) ja väkevää ammoniumhydroksidia (5,6 ml), ja liuosta pidetään samalla sekoittaen argon-atmosfäärissä 1 tunti. Reaktioseos laimennetaan vedellä, suodatetaan ja suodos uutetaan etyyliasetaatilla. Vesipitoinen faasi tehdään happameksi 10 väkevällä kloorivetyhapolla, kyllästetään natriumklori- dilla ja uutetaan etyyliasetaatilla. Orgaaniset kerrokset pestään kyllästetyllä natriumkloridilla, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja väkevöidään kuiviin tyhjössä. Jäännös 1-(3-merkaptopropanoyyli)-L-proliini kiteytetään 15 etyyliasetaatti/heksaanista, saanto 2,5 g, sp. 68-70°.

Menetelmä B

1-(3-asetyylitiopropanoyyli)-L-proliini (0,8 g) liuotetaan 5,5 N metanolipitoiseen ammoniakkiin (5 ml) ja liuosta pidetään argon-atmosfäärissä huoneen lämpötilas-20 sa. Kahden tunnin kuluttua liuotin poistetaan tyhjössä, jäännös liuotetaan veteen ja johdetaan ioninvaihtokolon-niin, joka on H+-vaiheessa ^Dowex 50 (analyyttinen laatu),/ ja eluoidaan vedellä. Fraktiot, jotka antavat tioli-positiivisen reaktion, otetaan talteen ja väkevöidään 25 kuiviin, saanto 0,6 g. Tämä tuote kiteytetään etyyyli- asetaatti/heksaanista menetelmän A mukaisesti l-(3-merkaptopropanoyyli) -L-proliinin saamiseksi.

Suolat

Natrium 30 1-(3-merkaptopropanoyyli)-L-proliini (500 mg) liuotetaan seokseen, jossa on vettä (2,5 ml) ja N nat-riumhydroksidia (2,5 ml). Liuos jäähdytyskuivataan nat-riumsuolan saamiseksi.

Magnesium 35 1-(3-merkaptopropanoyyli)-L-proliinia (500 mg), magnesiumoksidia (49,5 mg) ja vettä (10 ml) sekoitetaan 18 71 55 3 samalla lievästi kuumentaen täydellisen liuoksen muodostumiseen saakka. Sen jälkeen liuotin poistetaan jäähdytys-kuivaamalla magnesiumsuolan saamiseksi.

Kaiium 5 1-(3-merkaptopropanoyyli)-2-proliini (500 mg) liuotetaan seokseen, jossa on kalsiumhydroksidia (91 mg) ja vettä (10 ml), ja liuos jäähdytyskuivataan kalsium-suolan saamiseksi.

Kalium 10 1-(3-merkaptopropanoyyli)-L-proliini (500 mg) liuo tetaan seokseen, jossa on kaliumbikarbonaattia (246 mg) ja vettä (10 ml), ja jäähdytyskuivataan kaliumsuolan saamiseksi.

N-metyyli-D-glukamiini 15 1-(3-merkaptopropanoyyli)-L-proliini (500 mg) ja N-metyyli-D-glukamiini (480 mg) liuotetaan veteen (10 ml) ja jäähdytyskuivataan N-metyyli-D-glukamiini-suolan saamiseksi .

Esimerkki 4 20 1-(3-merkaptopropanoyyli)-L-hydroksiproliini Käyttämällä L-hydroksiproliinia ja käsittelemällä tuotetta esimerkin 3 mukaisella menetelmällä A saadaan 1-(3-bentsoyylitiopropanoyyli)-L-hydroksiproliini ja 1-(3-merkaptopropanoyyli)-L-hydroksiproliini vastaavasti 25 (viimemainitun sp. 193,5-195°C disykloheksyyliamiini- suolana).

Esimerkki 5 1-(3-merkaptopropanoyyli)-D-proliini Käyttämällä D-proliinia ja käsittelemällä tuotet- 30 ta esimerkin 3 mukaisella menetelmällä A saadaan 1—(3— bentsoyylitiopropanoyyli)-D-proliinia ja 1-(3-merkaptopropanoyyli) -D-proliinia, sp. 68-70°.

19 71 55 3

Esimerkki 6 1-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliini 0,85 g 1-(3-asetyylitio-2-metyylipropanoyyli)-L-proliinia liuotetaan 5,5 N metanolipitoiseen ammoniak-5 kiin ja liuosta pidetään huoneen lämpötilassa 2 tuntia.

Liuotin poistetaan tyhjössä ja jäännös liuotetaan veteen, syötetään ioninvaihtokolonniin, joka on H+-vaiheessa (Dowex 50, analyyttinen laatu), ja eluoidaan vedellä. Fraktiot, jotka antavat positiivisen tioli-reaktion, 10 otetaan talteen ja jäähdytyskuivataan. Jäännös kiteytetään etyyliasetaatti/heksaanista, saanto 0,3 g. 1-(3-merkapto- 2-D-metyylipropanoyyli-L-proliini sulaa 103-104°:ssa, (o<fO -131 (C, 2, EtOH) .

Esimerkki 7 15 1-(3-merkapto-2-bentsyylipropanoyyli)-L-proliini 1-(3-asetyylitio-2-bentsyylipropanoyyli)-L-pro-liinia käsitellään metanolipitoisella ammoniakilla esimerkin 6 mukaisesti, jolloin saadaan 1-(3-merkapto-2-bentsyylipropanoyyli)-L-proliini öljynä, Rf = 0,47 (si-20 likageeli, bentseeni/etikkahappo 75:25).

Esimerkki 8 1-(3-merkapto-2-metyylipropanoyyli)-L-hydroksipro-lilni Käsittelemällä esimerkin 6 mukaisesti l-(3-ase- 25 tyylitio-2-metyylipropanoyyli)-L-hydroksiproliini-tert.- butyyliesteriä saadaan 1-(3-merkapto-2-metyylipropano- 2 5 yyli)-L-hydroksiproliini amorfisena aineena -61,90 (c = 2, metanoli).

Esimerkki 9 30 1-(4-merkaptobutanoyyli)-L-proliini 1-(4-bentsyylitiobutanoyyli)-L-proliini (1,08 g) liuotetaan veden (4 ml) ja väkevän ammoniakin (2,7 ml) seokseen. Sen jälkeen kun on sekoitettu 1 tunti huoneen lämpötilassa, seos laimennetaan vedellä, suodatetaan, 35 uutetaan etyyliasetaatilla ja vesipitoinen faasi väkevöi- dään tyhjössä. 1-(4-merkaptobutanoyyli)-L-proliinin ammo- 20 , |· r 7 71553 niumsuola puhdistetaan ioninvaihto-kromatografiän avulla käyttäen dietyyliaminoetyyli-Sephadex(ristikytketty dekstraanilla) kolonnia ja eluoimalla ammoniumbikarbonaa-tilla, saanto 0,7 g. Airanoniumsuola liuotetaan veteen (2 ml) 5 ja johdetaan Dowex 50 sulfonihappohartsin (analyyttinen laatu) kolonniin, joka on vety-muodossa, ja vapaa happo eluoidaan vedellä. Fraktiot, jotka sisältävät halutun aineen (sulfhydryyli-reagenssi ja karboksyyli-reagenssi positiivisia) otetaan talteen ja jäähdytyskuivataan l-(4-10 merkaptobutanoyyli)-L-proliinin saamiseksi. Disyklohek- syyliammonium-suola saadaan liuottamalla edellä saatu yhdiste etyyliasetaattiin ja lisäämällä disykloheksyyli-amiinia. Kiteinen suola suodatetaan ja kiteytetään uudelleen isopropanolista, sp. 157-158°.

15 Esimerkki 10 1-(3-merkaptobutanoyyli)-L-proliini 1-(3-asetyylitiobutanoyyli)-L-proliinia (0,86 g) liuotetaan 5,5 N metanolipitoiseen ammoniakkiin (20 ml) ja reaktioseosta pidetään huoneen lämpötilassa 2 tuntia.

20 Liuotin poistetaan tyhjössä ja jäännös kromatografoidaan käyttäen ioninvaihtokolonnia (Dowex 50) ja eluoimisainee-na vettä. Fraktiot, jotka sisältävät halutun 1-(3-merkaptobutanoyyli) -L-proliinin, otetaan talteen ja lyofili-soidaan, saanto 0,6 g. Disykloheksyyliamiini-suolan 25 sp. 183-184°C.

Esimerkki 11 1-(3-merkapto-2-fenyylipropanoyyli)-L-proliini Esimerkin 6 mukaisesti saadaan 1-(3-asetyylitio-2-fenyylipropanoyyli)-L-proliini ja 1-(3-merkapto-2-fenyy-30 lipropanoyyli) -L-proliini. + 2,5° (c = 1/ etano li). Lopputuotteen sp. 49-52°C.

Esimerkki 12 1-(3-merkapto-2-metyylipropanoyyli)-L-proliini 1-^3-(4-metoksifenyyli)metyylitio/-2-metyylipro-35 panyyli-L-proliini-tert.-butyyliesteri (1,2 g, 0,003 moo lia) , anisoli (5 ml) ja trifluorimetaanisulfonihappo (0,5 ml) liuotetaan 20 ml:aan trifluorietikkahappoa typ- 21 7155 3 piatmosfäärissä ja saadun punaisen liuoksen annetaan seistä 1 tunti huoneen lämpötilassa. Liuos haihdutetaan tyhjössä punaiseksi jäännökseksi, joka otetaan etyyliasetaattiin ja pestään vedellä, suolaliuoksella, sitten kui-5 vataan (MgSO^) ja haihdutetaan. Jäännöstä sekoitetaan useita kertoja heksaanin kanssa ja jälelle jäänyt heksaani haihdutetaan; öljymäinen jäännös on 0,4 g. Osa tästä aineesta (180 mg) saatetaan preparatiiviseen ohutkerros-kro-matografiaa käyttäen 2 mm:n silikageeli-levyjä ja eluoi-10 misaineena bentseeni/etikkahappo 75:25. Pää-nitroprussi- di-positiivinen nauha (R^ = 0,40) otetaan talteen, jolloin saadaan 135 mg 1-(3-merkapto-2-metyylipropanyyli)-L-proliinia öljynä. Ohutkerroskromatografiaa käyttäen bent-seeni/etikkahappoa 75:25 (Rf=0,40) ja kloroformi/meta-15 noli/etikkahappoa 50:40:10 (R^=0,62).

Esimerkki 13 1-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliini

Argon-atmosfäärissä lietetään l-^3-(asetyylitio)- 2-D-metyylipropanoyyli7-L-proliinia (10,0 g) 150 ml:aan 20 vettä 10°:ssa. Tähän seokseen lisätään 5N natriumhydrok- sidia ja liuoksen pH pidetään arvossa 13 1,5 tunnin ajan. Sen jälkeen kun natriumhydroksidin kulutus on päättynyt, liuos tehdään happameksi pH-arvoon 2,0 väkevällä rikkihapolla.

25 Sen jälkeen vesipitoinen liuos uutetaan kolmesti metyleenikloridilla (3 x 150 ml) ja yhdistetyt metyleeni-kloridifraktiot väkevöidään öljyksi. Väkevöite otetaan etyyliasetaattiin, suodatetaan ja suodos laimennetaan heksaanilla (30 ml). Lisätään vielä heksaania 1/2 tunnin 30 kuluttua ja seos jäähdytetään 10°:seen 1 tunnin ajaksi.

Kiteet suodatetaan ja pestään heksaanilla 2 x 25 ml) ja kuivataan vakiopainoon, jolloin saadaan 6,26 g 1-(3-merkapto-2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliinia valkoisina kiteinä, sp. 100-102°.

35 22 71 5 5 3

Esimerkki 14 1-(3-merkaptopropanoyyIi)-L-proliini Liuokseen, jossa on 75 mg (0,27 millimoolia) ^"(etyyliamino) karbonyyli/tio7propanoyyl i^-L-pro-5 liinia 1 ml:ssa väkevää ammoniumhydroksidia ja 1 ml:ssa vettä, annetaan seistä huoneen lämpötilassa 18 tuntia argon-atmosfäärissä. Liuos laimennetaan pienellä määrällä vettä ja uutetaan eetterillä. Vesipitoinen kerros tehdään happameksi kylmällä väkevällä kloorivetyhapolla 10 ja uutetaan etyyliasetaatilla. Yhdistetyt uutteet kuiva taan ja väkevöidään tyhjössä, jolloin saadaan esimerkin 3 mukaisen tuotteen kanssa identtinen yhdiste. Ohutker-roskromatografia (silikageeli, bentseeni: etikka-happo 7:3) R^=0,4.

15 Esimerkki 15 1-(3-merkapto-2-metyylipropanoyyli)-L-proliini Sinkkipölyä (10,0 g) lisätään lietteeseen, jossa on l-£“(ditiobis- (2-metyyli-3-propanoyyli)v7bis-L-prolii-nia (5,0 g) 100 ml:ssa 1,0N rikkihappoa, ja seosta se-20 koitetaan 18°:ssa 4 tuntia typpi-atmosfäärissä. Liuos suodatetaan, sinkki pestään vedellä (20 ml) ja yhdistetyt suodokset uutetaan metyleenikloridilla (3 x 75 ml). Metyleenikloridin pesunesteet uutetaan vedellä (25 ml) ja sen jälkeen orgaaninen liuos väkevöidään öljyksi.

25 Tämä öljy otetaan etyyliasetaattiin (20 ml) ja suodate taan. Lisätään heksaania (15 ml) suodokseen ja seosta sekoitetaan 15 minuuttia. Sen jälkeen lisätään vielä heksaania (30 ml) ja liuos jäähdytetään 1 tunnin ajaksi 5°:seen. Sitten seos suodatetaan ja tuote pestään hek-30 saanilla (2 x 10 ml) ja kuivataan, jolloin saadaan 4,17 g 1-(3-merkapto-2-metyylipropanoyyli)-L-proliinia valkoisina kiteinä. TLC, = 0,60 (liuotinjärjestelmä: bentseeni/etikkahappo 75:25).

2λ 71553

Esimerkki 16 1-(3-merkapto-2-metyylipropanoyyli)-L-proliini 1-^3-(bentsyylitiö)-2-metyylipropanoyyli7-L-pro-liinia (0,1 g) suspendoidaan kiehuvaan nestemäiseen ammo-5 niakkiin (10 ml) ja lisätään pieniä palasia natriumia samalla sekoittaen pysyvään siniseen väriin saakka. Väri poistetaan lisäämällä muutamia kiteitä ammoniumsulfaattia ja ammoniakin annetaan haihtuva typpivirrasssa. Jäännös liuotetaan laimean kloorivetyhapon ja etyyliasetaatin seok-10 seen. Orgaaninen kerros kuivataan ja väkevöidään kuiviin tyhjössä, jolloin saadaan 1-(3-merkapto-2-metyylipropano-yyli)-L-proliini. Rf:0,5 (silikageeli; bentseeni/etikka-happo 3:1); R^ 0,5 (silikageeli; metyylietyyliketoni/-etikkahappo/pyridiini/vesi 14:1:2:1), mikä on identtinen 15 esimerkin 6 mukaisen yhdisteen kanssa.

Esimerkki 17 1-(3-merkapto-2-D-metyyli-l-oksopropyyli)-4-cis- metyyli-L-proliini_

Liuokseen, jossa on yhdistettä 1-(3-merkapto-2-D-20 metyyli-l-oksopropyyli)-4-cis-metyyli-L-proliini (1,67 g, 6,1 mmol) ja metanolia (10 ml), lisätään NaOH-vesiliuos-ta (IN, 15,25 ml) ja seoksen annetaan seistä argonkehäs-sä 15 min. ajan. Liuos sentrifugoidaan pienessä määrässä olevan suspendoituneen kiinteän aineen erottamiseksi ja 25 metanoli poistetaan supernatantista tyhjössä. Jäljelle jää vä vesiliuos tehdään happameksi HCl:]lä (3 N, 5 ml) ja uutetaan perusteellisesti etyyliasetaatilla. Etyyliasetaatti poistetaan tyhjössä ja jäännös kromatografoidaan 2 silikageelillä (E. Merck, 70 g) paineessa 1,4 kp/cm 30 käyttämällä eluointiaineena bentseenin ja etikkahapon seosta (7:3). Pylväästä saatava tuote liuotetaan kloroformiin, kloroformi poistetaan tyhjössä, jolloin haluttu tuote saadaan viskoosisena öljynä. Saanto 950 mg (67 %), fiij*5 = -139,7° (c = 1,26, CHC13) . Rf = 0,54 35 (silikageeli, bentseeni:etikkahappo 7:3). Yhdisteen 24 71553 disykloheksyyliamiinisuola saadaan käyttämällä etyyliase-taattia liuottimena. ^/D = -62,6° (c = 1,07, CHCl-j) , sp. (175°) 177-179°C.

Analyysi: cxoH17N03S disykloheksyyliamiini 5 Laskettu C, 64,04, H, 9,77, N, 6,79, S, 7,77 Löydetty C, 63,67, H, 9,98, N, 6,74, S, 7,74 HS: 99,4 %

Esimerkki 18 1-(3-merkapto-2-D-metyyli-l-oksopropyyli)-4-cis- 10 heptyyli-L-proliini___

Yhdistettä 1-^3-(asetyylitio)-2-D-metyyli-l-okso-propyyli7-4-cis-heptyyli-L-proliini (3,3 g) käsitellään argonkehässä kylmällä liuoksella, jossa on 10 ml väkevää ammoniakkia ja 25 ml vettä. Seosta sekoitettaessa usean 15 minuutin ajan se muuttuu liuokseksi. Liuos jäähdytetään ja uutetaan 20 ml:ll.a EtOAc (2 kertaa). Vesifaasi sekoitetaan, sen päälle kaadetaan 20 ml EtOAc, tehdään happa-meksi 6 N kloorivetyhapolla ja kerrokset erotetaan. Vesi-faasi uutetaan EtOAc:llä (2 kertaa). Orgaaniset faasit yh-20 distetään kuivataan MgS0^:lla, suodatetaan ja liuotin erotetaan, jolloin saadaan 2,87 g (98 %) melkein väritöntä siirappia, = “74° (1 % Et0H:ssa), 0,22 (85 % tolueenia - 15 % etikkahappoa silikageelillä,

Rf 0,72 (95:5:5 CH2C1 - MeOH - AcOH silikageelillä).

25 Analyysi: ci6H29N03S·0.25 H20:

Laskettu C, 50,05, H, 9,45, N, 4,38, S, 10,02, SH, 10 Löydetty C, 60,44, H, 9,36, N, 4,48, S, 10,12, SH,10.

30 Esimerkki 19 l-/3-merkapto-2-metyylipropanoyyl j^-L-proliini 1-^3-(trifenyylimetyylitio)-2-metyylipropanoyyli7~ L-proliini-tert.-butyyliesteriä (5 g) liuotetaan sni-solin (55 ml) ja trifluorietikkahapon (110 ml) seokseen.

35 Sen jälkeen kun on pidetty 1 tunti huoneen lämpötilassa.

25 71 55 3 liuotin poistetaan tyhjössä ja jäännös johdetaan silika-geeli-kolonniin, joka on tasapainotettu bentseeni/etikka-hapolla. (75:25) ja joka eluoidaan samalla liuottimena. Fraktiot vastaten komponenttia Rf 0,40 (TLC silikageeli 5 samalla järjestelmällä) otetaan talteen ja väkevöidään kuiviin, jolloin saadaan l-^J-merkapto-2-metyylipropano-yyii )7-l -proliini. Rf 0,62 (s81ikageeli, kloroformi/me-tanoli/etikkahappo/vesi 50:40:10 identtinen esimerkin 6 mukaisen yhdisteen kanssa.

10 Esimerkki 20 1-(3-merkapto-2-metyylipropanoyyli)-L-proliini Liuosta, jossa on l-^3-(tetrahydropyran-2-yyli-tio)-2-metyylipropanoyyli)<7-L-proliinia (1 g) metanolin (25 ml) ja väkevän kloorivetyhapon (25 ml) seoksessa 15 pidetään huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Liuottimet poistetaan tyhjössä 1-(3-merkapto-2-metyylipropanoyyli)-L-proliinin saamiseksi. R^: 0,35 (silikageeli, bent-seeni/etikkahappo, 3:1), R^ 0,5 (silikageeli, metyyli-etyyliketoni/etikkahappo/pyridiini/vesi 14:1:2:1), 20 identtinen esimerkin 6 mukaisen tuotteen kanssa.

Esimerkki 21 1-(3-merkapto-2-metyylipropanoyyli)-L-proliini l-£3-(asetamidometyylitio)-2-metyylipropanoyyli7-L-proliinia (1,4 g) ja merkuriasetaattia (1,93 g) liuote-25 taan etikkahapon (25 ml) ja veden (25 ml) seokseen. Sen jälkeen kun on sekoitettu 1 tunti höyryhauteella annetaan vetysulfidin kuplia lävitse siihen saakka kunnes ei enää todeta merkurisulfidin sakan muodostumista. Seos suodatetaan, sakka pestään etanolilla ja suodos väkevöidään 30 kuiviin tyhjössä, jolloin saadaan 1-(3-merkapto-2-metyy- 1ipropanoyyli)-L-proliini. Rf: 0,35 (silikageeli, bent-seeni/etikkahappo 3:1), R^: 0,5 (silikageeli, metyyli-etyyliketoni/etikkahappo/pyridiini/vesi 14:1:2:1), identtinen esimerkin 6 mukaisen yhdisteen kanssa.

35 26 71 S 5 3

Esimerkki 22 1-(2-(merkaptometyyli)-l-okso-9-fenyylinonyyli/-L- proliini____________

Yhdiste l-/*2- (asetyylitiometyyli) -l-okso-®t-5 fenyylinonyyli)-L-proliini otetaan 15 cm3:iin kylmää metanolia argonkehässä. Tähän lisätään 15 cm3 kylmää väkevää ammoniumhydroksidia. 30 min. kuluttua reaktioseos tehdään happameksi väkevällä HCl:llä ja uutetaan etyyliasetaatilla, jolloin saadaan 4 g kirkasta öljyä (sp. 104-10 110 C adamantyyliamiinisuolana, joka on valmistettu eetteriheksaanista.

Esimerkki 23 1-/2-merkaptometyyli)-1-oksononyyli7-L-proliini 1,7 g yhdistettä 1-(2-(asetyylitiometyyli)-1-15 oksononyyli/-L-proliini otetaan 8 ml:aan kylmää metano lia argonkehässä ja tätä käsitellään 8 ml:11a kylmää väkevää ammoniakkia. 30 min. kuluttua reaktioseos jäähdytetään, tehdään happameksi väkevällä HCl:Jlä ja uutetaan etyyliasetaatilla, jolloin kuiviin haihduttamisen jälkeen 20 saadaan 1,5 g tuotetta öljynä (sp. 159-162° adamantyyli amiinisuolana) .

Esimerkki 24 1-(3-merkapto-l-oksodekyyli)-L-proliini

15 g (0,043 mol) (+)-1-(3-asetyylitio)-1-oksode-25 kyyli/-L-proliinia kohdasta B

3 160 cm vettä 3 65 cm väkevää ΝΗ.0Η 4

Komponenttien seosta sekoitetaan typpikehässä huoneen lämpötilassa noin 3 h ajan. Etyyliasetaatilla uute-30 taan alkaliin liukenematonta ainetta. Vaalean keltainen vesipitoinen kerros peitetään etyyliasetaatilla ja tehdään vahvasti happameksi 20 %:isella HCrllä. Kerrokset 3 erotetaan ja vesipitoinen kerros uutetaan vielä 200 cm :llä etyyliasetaattia. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestään 35 kyllästetyllä NaCl:llä ja kuivataan MgSO^rllä. Liuotin poistetaan, jolloin saadaan 8,7 g (67 %) jäännöstä, joka 27 71 55 3 3 antaa voimakkaan SH-testin. Jäännös liuotetaan 200 cm :iin bentseeniä ja kylmäkuivataan, jolloin saadaan 8,4 g (62 %) otsikkoyhdistettä viskoosisena nesteenä.

Analyysi: C^j-I^^NO^S. 0.5 . ^0: 5 Laskettu: C, 58,02, H, 9,09, S, 10,33, N, 4,51, SH, 100 % Löydetty C, 57,77, H, 9,37, S, 10,24, M, 4,47, SH,98,9 %.

Claims (9)

28 71 553

1. Analogiamenetelmä angiotensiiniä muuttavan entsyymin uusien inhibiittoreiden valmistamiseksi, joiden 5 kaava on I3 R>1 R, I4 i1 I

10 HS—(CH) —CH—CO—N-&—COR * n *c jossa R on hydroksi tai alempi alkoksi, R^ ja R^ tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä, alempaa alkyy-liä tai fenyyli- alempi-alkyyliä ja R^ voi lisäksi olla 15 fenyyli, R^ on vety, hydroksi tai alempi alkyyli, ja n on 0, 1 tai 2, ja niiden emäksisten suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdisteestä, jonka kaava on 20 ;* !> ό Y— S — (CH) — CH—CO —N-^—COR * n * 25 jossa R, R1, R^, R^ ja n tarkoittavat samaa kuin edellä ja Y on alempi alkanoyyli, fenyyli-alempi-alkanoyyli, bentsoyyli, bentsyyli, metoksibentsyyli, trifenyyli-metyyli, tetrahydropyranyyli tai asetamidometyyli pois- 30 tetaan rikin suojaryhmä Y vetyatomin regeneroimiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojaryhmä Y on alempi alkanoyyli, fenyyli-alempi-alkanoyyli ja että suoja-ryhmä poistetaan hydrolysoimalla. 35 29 71 553

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojaryhmä Y poistetaan ammonolyysin avulla.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että suojaryhmä Y poistetaan alkalisesti hydrolysoimalla metallihydroksidilla.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jonka kaava on 10 f· O

15 HS — (CH~) —CH—CO—N-—COR 2' n * jossa R, R^ ja n tarkoittavat samaa kuin vaatimuksessa 1.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on hydroksi.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R^ on metyyli.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 1-(3-merkapto-

2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliini.

9. Yhdisteet, jotka ovat välituotteita valmis tettaessa terapeuttisesti käyttökelpoisia proliinijoh-dannaisia, tunnetut siitä, että niiden kaava on 30 *3 R. R. I4 I1 Γ Y—S — (CH) —CH—CO—N--COR * n * 35 jossa R on hydroksi tai alempi alkoksi, R^ ja R^ tarkoittavat toisistaan riippumatta vetyä, alempaa alkyyliä 71553 tai fenyyli-alempi-alkyyliä ja voi lisäksi olla fe-nyyli, R^ on vety, hydroksi tai alempi alkyyli, suoja-ryhmä Y on alempi alkanoyyli, fenyyli-alempi-alkano-yyli, bentsoyyli, bentsyyli, metoksibentsyyli, trife-5 nyylimetyyli, tetrahydropyranyyli tai asetamidometyy-li ja n on 0, 1 tai 2.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukaiset välituotteet, tunnetut siitä, että niiden kaava on 10 O Y—S — (CH-) —CH—CO—N-1 COR 2 n .* 15 jossa R, R^, Y ja n tarkoittavat samaa kuin vaatimuksessa 9.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukaiset välituotteet, tunnetut siitä, että R on hydroksi.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukaiset välituotteet, 20 tunnetut siitä, että R^ on metyyli.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen välituote, tunnettu siitä, että se on 1-(3-asetyylitio-

2-D-metyylipropanoyyli)-L-proliini. 31 71553