FI70425C - Foerfarande foer framstaellning av 4-substituerade 1-beta-ribofuranosyl-1h-imidazo/4,5-c/pyridiner - Google Patents

Description

χ 70425

Menetelmä 4-substituoitujen 1-/3-ribofuranosyyli-lH-imi-datso/iT, 5-a/pyridiinien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee imidatso(4,5-c)pyridiinijoh-5 dannaisten valmistusta, tarkemmin sanottuna 4-substituoitu-jen 1-y? -D-ribosyyli-imidatso-(4,5-c)pyridiinien valmistusta. Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuilla 4-substituoiduilla-l- p> -D-ribosyyli-imidatso(4,5-c)pyri -diineillä on kaava (I) 10

R

i N ' 'N·-' 1¾ JLn^ o»

15 HO

w

OH OH

20 jossa R on amino, halogeeni tai bentsyyliamino. Näillä yhdisteillä on merkitystä farmakologisesti aktiivisina yhdisteinä ja/tai niiden välituotteina. Esimerkiksi 3-deatsa-adenosi ini, 4-amino-1-p -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso-(4,5-c)pyridiini ((I) R=NH2) on herättänyt huomattavaa 25 mielenkiintoa biologisesti potentiaalisena yhdisteenä (katso esimerkiksi P. K. Chiang et ai., Molec. Pharm. 13 (1977) 939-947). Erityisesti 3-deatsa-adenosiinia on ajateltu antifokaaliseksi ja antiviraaliseksi aineeksi (US-patentti no 4 148 888) ja immunosuppressiiviksi 30 (Eurooppalainen patenttihakemus no 79103947.2).

4-kloori-l-jS -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso-(4,5-c)-pyridiini ((I) R=C1) on avainvälituote, kun valmistetaan yhdisteistä, joilla on kaava (I), mukaanlukien 4-amino-johdannaista, johon viitattiin yllä, kuten on kuvanneet 35 esimerkiksi:

Mizuno et ai., Chem. Pharm. Bull (Tokio) 16 (1968) 2011; 2 70425

Montgomery & Townsend, J. Med. Chem. 9 (1966) 105 ja

Rosseau et al., Biochemistry 5 (1966) 756. Muihin mielenkiintoisiin, edellä määriteltyjä kaavan (I) mukaisia 5 yhdisteitä rakenteeltaan lähellä oleviin yhdisteisiin kuuluvat esimerkiksi 4-merkapto- ja H-tiometyylijohdannaiset (Montgomery & Townsend, supra.).

Näiden 4-substituoitujen-1- <5-D-ribofuranosyyli-lH-imidatso-(4,5-c)pyridiinien mahdollisuuksia on kuiten-10 kin rajoittanut se syy, että niitä ei ole helppoa valmistaa. Tavallinen reitti on valittujen välituotteiden, erityisesti 4-kloorijohdannaisen ((I), R=C1), ribosyloimi-nen tavanomaisilla orgaanisen kemian keinoilla ja tarvittaessa tämän jälkeen 4-asemassa olevan substituentin mo-15 difioiminen.

Kuitenkin ribosylaatiovaiheen saannot ovat olleet suhteellisen alhaisia (30-40 %) ja käytettyjen reaktioiden tiedetään hyvin olevan stereokemiallisesti epäspesifisiä, niin että ne johtavat tuotteisiin, joiden stereoke-20 mia on epävarma ja jotka vaativat laajoja puhdistusmenet-telyjä. Lisäksi näiden kemiallisten reaktioiden luonne on sellainen, että ne eivät ole helposti sovitettavissa suurimittaiseen tuotantoon.

On tehty yrityksiä tuottaa parannettuja synteese-25 jä näille 4-substituoiduille yhdisteille, erityisesti 4-amino-yhdisteelle, esim.se, jota kuvaavat May ja Townsend, J.C.S. Chem. Commun., 1973, 64, missä ribo-syloitiin 4,6-dikloori-lH-imidatso(4,5-c)pyridiini.

Vaikka tämä paransi ribosylaatiovaiheen saantoa, noin 30 46 %:iin, haittoina olivat se, että välituotetta on vaikeampi saada, ja se, että ribosylaatiovaiheesta saatu tuote vaatii lisävaiheita, joissa se muutetaan kaavan (I) mukaisiksi yhdisteiksi. Koska tämä menetelmä on kemiallinen, sillä on myös kemialliselle menetel-35 mälle ominaiset haitat, joihin edellä viitattiin.

3 70425

Vaikeudet, jotka liittyvät puriininukleosidien valmistamiseen kemiallisin keinoin, on yleisesti tiedostettu, ja tiettyjen puriiniemästen osalta se on voitettu entsymaattisen pentosylaation avulla (katso esi-5 merkiksi Eurooppalainen patenttihakemus no 78101295.0), käyttäen puriininukleosidifosforylaasia tärkeänä katalysaattorina .

Tiedetään hyvin, että entsyymeillä on korkea spesifisyys ja että pienet muutokset substraat(e)issa 10 voivat huomattavasti vaikuttaa entsyymin kykyyn katalysoida reaktiota. On selostettu, että puriiniemäksen modifioiminen poistamalla tai lisäämällä heterosykli-seen rengassysteemiin typpiatomi vaikuttaa emäksen kykyyn toimia substraattina puriininukleosidifosfory-15 laaseille. Niinpä joukosta 3-deatsapuriineja on osoitettu, että ne eivät ole substraatteja nisäkkäiden pu-riininukleosidifosforylaasille (Townsend et ai.,

Lectures in Heterocyclic Chemistry Voi. H, lisäys artikkeliin J. Hetero. Chem. 15 (1978) S-19 - S-95), ja 20 7-deatsa-adenosiinista, 7-deatsainosiinista ja 8-atsa- guanosiinista on osoitettu, että ne eivät ole substraatteja mikrobiaaliselle puriininukleosidifosforylaasille (Doskocil ja Holy, Coll Czeck. Chem. Commun., 42 (1977) 370-383). Edelleen on osoitettu, että 3-deatsapuriini-25 nukleosideilla on konformaatiot, jotka eroavat niiden puriini-vastineista (Ludemann et ai., A. Naturforsch.

33C (1978) 305-316; May et ai., J. Amer. Chem. Soc. 98 (1976) 825-830) viitaten siihen, että puriinien ja 3-deatsapuriinien voidaan odottaa käyttäytyvän eri tavoin 30 asiaankuuluvissa entsyymisysteemeissä.

Nyt on yllättävästi havaittu, että 4-substituoi-tuja lH-imidatso(4,5-c)pyridiinejä voidaan helposti ri-bosyloida entsymaattisella menetelmällä, jolla on aikaisempiin alan kemiallisiin menetelmiin verrattuna edut, 35 että se on stereospesifinen ja sovitettavissa suurimittai- 11 70425 seen tuotantoon ja tuottaa paremman saannon ribosylaa-tioreaktiossa.

Tämän keksinnön mukaisesti edellä määriteltyjä kaavan I mukaisia 4-substituoituja 1--D-ribofuranosyyli-5 li-lH-imidatso(4,5-c)pyridiinejä valmistetaan siten, että vastaava 4-substituoitu lH-imidatso(4,5-c)pyridii-ni saatetaan reagoimaan riboosi-l-fosfaattia sisältävän riboosi-donorisysteemin kanssa puriininukleosidifosfory-laasin läsnä ollessa.

10 4-substituentti voi olla mikä hyvänsä lopputuot teessa vaadittu substituentti ja substituentin kemiallisella luonteella on vain vähän vaikutusta ribosylaa-tion helppouteen, päinvastoin kun alan aiemmissa, kemiallisissa menetelmissä, joissa 4-substituentin luon-15 ne voi olla kriittinen ribosylaatioreaktion kulun kannalta .

Yhdisteistä, joilla on kaava (I), on 4-amino-l-ib -D-ribofuranoeyyyli-lH-imidatsoC >4,5-c) pyridiini erityisen mielenkiintoinen yhdiste ja sitä voidaan val-20 mistaa suoraan 4-amino-lH-imidatso-(4,5-c)pyridiinin ribosylaat iolla , menetelmällä, joka ei ole mahdollinen suorittaa alan aiemmilla kemiallisilla keinoilla.

Vaihtoehtoisesti 4-amino-yhdiste voidaan valmistaa ribosyloimalla yhdisteitä, joissa 4-aminoryhmä 25 on suojattu suojaryhmällä kuten bentsyylillä tai bents-hydryylillä, ja sen jälkeen poistamalla suojaryhmä tavanomaisilla keinoilla, mukaanlukien pelkistys käyttäen Raney-nikkeliä, metallista natriumia nestemäisessä ammoniakissa tai vetykaasua ja sopivaa katalysaattoria.

30 Lisäksi eräässä vaihtoehdossa 4-amino-yhdiste voidaan valmistaa modifioimalla alan aiempien menetelmien ribosylaatiovaihetta. Sellaiset menetelmät käsittävät 4-kloori-lH-imidatso(4,5-c)pyridiinin ribosy-laation ja sen jälkeen klooriryhmän muuttamisen amino-

II

5 70425 ryhmäksi. Tämä muuttaminen voidaan suorittaa alan aiemmilla menetelmillä kuten suoralla aminoinnilla tai muuttamalla klooriryhmä 4-hydratsinojohdannaiseksi ja sen jälkeen hydrogenoimalla, mikä tuottaa 4-amino-yhdisteen, 5 vaihtoehtoisesti klooriyhdiste voidaan muuttaa suojatuksi aminoryhmäksi, esim. bentsyyliaminoryhmäksi, ja poistaa suojaryhmä tavanomaisilla menetelmillä, esim. niillä, joita kuvataan edellä.

Keksintö tarjoaa eräältä näkökannalta katsoen 10 menetelmä 4-amino-l-y*-D-ribofuranosyyli-lH-imidatso-(4,5-c)pyridiinin valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää kaavan (I), missä R on halogeeni tai suojattu aminoryhmä, mukaisen yhdisteen entsymaattisen ribosyloimisen edellä kuvatul-15 la menetelmällä, ja sen jälkeen 4-substituentin muuttamisen aminoryhmäksi.

Vaikka riboosi-l-fosfaatti, jota tarvitaan tässä kuvattavaan keksintöön, voidaan hankkia synteettisillä prosesseilla, jotka ovat sinänsä tunnettuja 20 kirjallisuudessa (Wright. R. S. ja Khorana, H. G., J. Am. Chem. Soc., 78 (1956) 811), voi olla tarkoituksenmukaista tai jopa edullista, jos se tuotetaan entsymaattisesti in situ ribosyylidonorista ja epäorgaanisesta fosfaatista vaadittavan riboosi-l-fosfaatin saa-25 miseksi. Vaikka reaktiot voidaan suorittaa erikseen, so. eristämällä riboosi-l-fosfaatti entsymaattisesta reaktiosta tai syntetisoimalla kemiallisesti riboosi-1-fosfaattia ja käyttämällä sitä lähtöaineena, on havaittu edulliseksi suorittaa molemmat reaktiot "yksi 30 astia" -prosessissa muodostamalla riboosi-l-fosfaatti-välituote in situ. Kytkettyjen reaktioiden nettovaikutus on siksi donoriribonukleosidin ribosyyliyksikön siirto vapaalle 3-deatsapuriiniemäkselle, jolloin ne tuottavat haluttua ribonukleosidia.

6 70425

Ribosyyliyksikön luovuttaja voi olla puriini-ribonukleosidi, esim. adenosiini, pyrimidiiniribonukleosidi, esim. urasiiliribonukleosidi, tai erilaisen ribonukleosidi- ja ei-nukleosidisen materiaalin seos.

5 Kuitenkin tämän keksinnön tarkoitusta varten on edullista, että ribosyyliyksikön luovuttaja on oleellisesti vapaa ei-nukleosidisesta materiaalista ja myös että se on pyrimidiiniribonukleosidi.

Syyt pyrimidiiniribonukleosidin donorina käyt-10 tämisen edullisuuteen ovat kahtalaiset. Ensiksikin, donoriribonukleosidin ominaisuudet ovat riittävän erilaiset halutun tuotteen ominaisuuksiin verrattuina mahdollistaakseen helpon puhdistuksen. Toiseksi, reaktion kuluessa vapautuva donoriemäs on pyrimidiini eikä purii-15 ni, mikä johtaa oleellisesti vähempään kilpailuun do- noriemäksen ja vastaanottajaemäksen välillä sen entsyymin katalyyttisestä kohdasta, joka entsyymi liittyy suoraan tuotteen synteesiin (puriininukleosidifosfory-laasi).

20 Pyrimidiiniribonukleosididonorit ja puriininuk- leosididonorit voidaan valmistaa millä tahansa alalla tunnetuista menetelmistä, esim. sen menettelyn mukaisesti, jota on kuvannut Hotchiss, R. D., J. Biol. Chem., 175 (1948) 315.

25 On havaittu, että molempia tässä edellä kuvattu ja reaktioita katalysoivat lukuisat entsyymit, joita esiintyy monissa eri mikro-organismeissa ja nisäkkäiden kudoksissa. Donoriribonukleosidin fosforolyysiä katalysoi esim. puriininukleosidifosforylaasi, jos 30 donori on puriiniribonukleosidi, tai pyrimidiininukleo-sidifosforylaasi, tymidiinifosforylaasi tai uridiini-fosforylaasi, jos donori on pyrimidiiniribonukleosidi. Toista reaktiota, jolla haluttu 3-deatsapuriiniribonuk-leosidi syntetisoidaan 3-deatsapuriinista ja riboosi-35 1-fosfaatista, katalysoi puriininukleosidifosforylaasi.

il 7 70425

Vaadittu ribosyyliä siirtävä entsyymisysteemi voi siksi koostua viimeksimainitusta fosforylaasis-ta yksinään, tai yhdistelmässä minkä tahansa ensinmai-nituntyyppisen entsyymin kanssa, jos ribosyylidonori 5 on pyrimidiinin tai pyrimidiinianalogin ribonukleosi-di.

Kuten edellä on todettu, on havaittu, että entsyymejä, joita tarvitaan tämän keksinnön prosessissa käytettyjen reaktioiden katalysoimiseen, esiintyy 10 monissa eri mikro-organismeissa sekä nisäkkäiden kudoksissa. Tämän keksinnön tarkoituksia varten havaittiin kuitenkin aerobisten bakteerien kuten B. stea-rothermophilus ja erityisesti E. coli B, jota on vapaasti saatavissa American type culture collectionista tal-15 letusnumerolla ATCC 11303, olevan erinomaisia sellaisten entsyymien lähteitä. Bakteereita, jotka tuottavat entsyymejä, voidaan viljellä monissa erilaisissa olosuhteissa. Kuitenkin elatusaineiden, jotka sisälsivät suuria määriä glukoosia, havaittiin olevan epätoivot-20 tavia, koska nukleosidifosforylaasientsyymien tasot bakteerisoluissa olivat alentuneita glukoosin läsnäollessa .

On havaittu, että raa'at entsyymivalmisteet ovat vähemmän soveliaita kun puhdistetut valmisteet. Tämä 25 johtuu siitä seikasta, että raa'at valmisteet sisältävät haitallisia nukleiinihappoja sekä muita entsyymejä kun ne, joita vaaditaan tämän keksinnön prosessia varten. Raakavalmisteissa olevat asiaankuulumattomat entsyymit katalysoivat substraattien ja tuotteiden 30 ei-suotavia muutoksia ja voivat jopa aiheuttaa itsensä vaadittujen entsyymien proteolyysiä. Nämä tekijät eivät vähennä vain haluttujen tuotteiden saantoa vaan myös helppoutta, millä nämä voidaan eristää reaktioseoksis-ta.

8 70425

Useimmissa tapauksissa on siksi toivottavaa puhdistaa raa'at entsyymivalmisteet ennen niiden lisäämistä reaktioseokseen. Tämä voidaan saavuttaa useilla tavoilla, jotka ovat sinänsä tunnettuja alalla. Esim.

5 halutut entsyymit voidaan eristää tai väkevöidä solujen uutteista kalsiumfosfaattigeelikäsittelyn ja ionin-vaihtokromatografiän yhdistelmällä. Vaihtoehtoisesti solu-uutetta voidaan käsitellä streptomysiinillä tai nukleaasilla ( DNAasi + RNAasi) ennen kalsiumfosfaat-10 tigeelikäsittelyä tai nukleaasi- ( DNAasi + RNAasi) käsittelyllä ennen ioninvaihtokromatografiaa. Nukleaa-sikäsittely on erityisen edullinen, jos se suoritetaan dialysoivissa olosuhteissa 4° - 40°C:ssa, mieluimmin 25°C:ssa. Geelisuodatus on havaittu erityi-15 sen käyttökelpoiseksi myöhäisenä tai lopullisena puh-distusvaiheena, kun kyseessä ovat vain suhteellisen pienet nestetilavuudet.

Entsyymejä, jotka ovat riittävän tehokkaassa tilassa ja konsentraatiossa, voidaan sitten käyttää 20 edellämainittujen reaktioiden katalysoimiseen. Tyypillinen reaktioseos sisältää ribosyylinluovuttajän, 3-deatsapuriiniemäksen, epäorgaanista fosfaattia, esim. dikaliumvetyfosfaattia (l^HPO ), ja asiaankuuluvan entsyymin tai entsyymit vesiväliaineessa tai väliai-25 neessa, joka sisältää aina 50 %:iin asti orgaanista liuotinta kuten metanolia, etanolia, propanolia, buta-nolia, asetonia, metyylietyyliketonia, etyyliasetaattia, tolueenia, tetrahydrofuraania, dioksaania, dimetyy-lisulfoksidia, trikloorimetaania tai sellosolvia. Edul-30 linen konsentraatio voi olla 0,001 mM - 2000 mM, mieluimmin 1 - 200 mM.

Reaktio suoritetaan lähellä neutraalia olevassa pH:ssa, so. pH-alueella noin 5-9, edullisesti 6,0-8,5, il 9 70425 ja lämpötilassa 3-37°C. Miedot olosuhteet ovat edulliset, koska puriiniribonukleosidien glykosidinen sidos on herkkä happamissa olosuhteissa, erityisesti korkeissa lämpötiloissa, ja entsyymit ovat epästabiileja ääri-5 lämpötiloissa ja pH:ssa. Entsyymien edullinen konsent-raatio on käytettyjen nimenomaisten ribosyylidonorien ja -akseptorien substraattitehokkuuden ja sen ajan, jonka reaktion halutaan antaa edistyä, funktio. Joissakin tapauksissa on edullista käyttää suurempia määriä 10 entsyymiä reaktioajan vähentämiseksi johtuen tiettyjen tuotteiden epästabiilisuudesta vesiliuoksessa. Käytettävien entsyymien puhtaus on mukavuuskysymys. Raaka-uutteet katalysoivat haluttuja reaktioita, mutta tuotteen saanto on tavallisesti pienempi ja sen eristäminen 15 on vaikeampaa kuin silloin, kun käytetään puhdistettuja entsyymejä, edellä selitetyistä syistä. Jos käytettäviä entsyymejä säilytetään ammoniumsulfaatti-suspensioina, ne lisätään reaktioihin edullisesti suspensioista sentrifugoituina pelletteinä mieluummin 20 kuin koko suspensioina.

Entsyymit voidaan ottaa talteen reaktioseok-sista esim. panosadsorptiolla DEAE-selluloosan pinnalle sen jälkeen, kun reaktio on saavuttanut tyydyttävän pisteen, ja sitä seuraavalla poistamisella reaktio-25 seoksen liukoisten komponenttien joukosta reaktioseos-ten sentrifugoinnilla tai geelisuodatukselia. Joissakin tapauksissa entsyymejä voidaan uudelleenkierrät-tää sen seikan ansiosta, että pääosa tuotteesta saostuu reaktioseoksesta ja, kun se poistetaan, reaktio-30 nesteeseen voidaan lisätä lisää lähtöainetta, jotta tuotteen muodostuminen voi alkaa uudelleen.

Tavallisesti on parempi, että kaikki komponentit sisältyvät suspensioon tai liuokseen, mutta kun käytetään erittäin liukoisia substraatteja, voi vaihtoehtoi-35 nen menettely, jossa reaktioseoksen komponenttien, paitsi 10 7042 5 entsyymien, liuosta pumpataan hitaasti kolonnin läpi, joka sisältää stationäärisen faasin, johon asiaankuuluvat entsyymit on kiinnitetty, (esim. kun entsyymit on adsorboitu DEAE-selluloosaan) olla parempi.

5 On havaittu, että jos niin halutaan, entsyymit voidaan säilyttää antamalla reaktioiden jatkua pidennettyjä ajanjaksoja, esim. aina kolmekymmentä päivää tai kauemmin. Kuitenkin sellaisten reaktioseosten tapauksessa, joita inkuboidaan enemmän kuin yhden päivän 10 ajan, on suotavaa panna mikrobivastaista ainetta, esim. natrium- tai kaliumatsidia tai tolueenia, reaktioseok-seen, ellei reaktioseosta steriloida suodattamalla tai jollakin muulla menettelyllä, joka tunnetaan alalla.

Halutut puriiniribonukleosidit voidaan saada 15 talteen tai eristää millä tahansa tunnetuista keinoista, joilla kemiallisten yhdisteiden seokset voidaan jaotella yksittäisiksi yhdisteiksi. Jaottelu voidaan saada aikaan esimerkiksi käyttämällä hyväksi eroja halutun lopputuotteen ja epäpuhtauksien liukoisuuksissa eri liuot-20 timiin, eroa niiden jakaantumiskertoimissa kahden liuo-tinkerroksen välillä, eroa niiden adsorptiokyvyissä adsorbenttiin kuten ioninvaihtohartseihin, eroa niiden kulkunopeuksissa ristisidoksellisten hartsien, kuten polyakryyliamidigeelien, läpi tai eroa niiden kiteyty-25 vyyksissä liuottimesta. Tapauksissa, joissa tuote kiteytyy reaktioseoksesta, se voidaan kerätä sentrifu-goimalla tai suodattamalla käyttäen tai käyttämättä suodatusapuainetta. Käytännössä näitä jaottelu- tai eristämiskeinoja käytetään yhdistelmänä tai toiste-30 tusti riippuen tuotteiden halutusta puhtaudesta ja tilasta.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä .

11 70425

Esimerkki 1 4-amino-1-/¾-D-ribofuranosyyli-lH-imidatso- (4,5-c)pyridiinin valmistus

Reaktioseos, joka käsittää vesisuspension (30 ml), 5 joka sisältää 4-amino-lH-imidatso(4,5-c)pyridiiniä (2,4 mmoolia), uridiinia (7,2 mmoolia), l^HPO^ (2,8 mmoolia), kaliumatsidia (0,14 mmoolia), puriininukleosidifosfo-rylaasia (1 120 kansainvälistä yksikköä IU), (saatuna siten kuin kuvataan Eurooppalaisessa Patenttihakemuk-10 sessa no 78101295.0) ja uridiinifosforylaasia (156 IU) pudistettuna Escherichia colista (Krenitsky, T.A.,

Biochim. Biophys. Acta 429 (1976) 352-358), valmistettiin niin, että reaktioseoksen pH säädettiin 7,0:aan kaliumhydroksidilla ennen entsyymien lisäämistä. Kun 15 reaktioseos oli ollut 15 päivää 37°C:ssa, reaktioseos suodatettiin ja sitten kirkastettiin sentrifugoimal-la 48000xg:ssä 3°C:ssa 10 minuuttia. Pintaneste pantiin Sephadex G-10-kolonniin (2 x 90 cm). Kolonnia elu-oitiin vedellä. Tuotetta sisältävät fraktiot (tark-20 kailtuna käyttäen TLC/H^O) yhdistettiin ja tilavuus supistettiin vakuumissa 40 ml:aan. Liuokseen lisättiin n-propanolia (20 ml). Kun liuos oli kirkastettu suodattamalla, se pantiin kolonniin, joka oli täytetty polyakryyliamidilla (P-2, Bio Rad Laboratories) 25 (5 x 90 cm) ja eluoitiin 30 %:lla n-propanolilla. Kun oli eluoitu 3 litralla 30 %:sta n-propanolia, kolonniin pantiin 50 ml kyllästettyä ammoniumbikarbonaatin liuosta 30 %:ssa n-propanolissa ja sitten alettiin uudelleen eluoiminen 30 %:lla n-propanolilla. Tuote eluoitiin ja 30 kuivattiin vakuumissa. Kuivattu aine liuotettiin veteen (5 ml) ja pantiin Sephadex G-10 -kolonniin (2 x 90 cm) ja eluoitiin vedellä. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 4-ami-no-1-/?-D-ribofuranosyyli-lH-imidatso(4,5-c)pyridii-35 niä hemihydraattina.

12 70425

Anal, laskettuna C^H^N^. yHjOJlle

Teoria: C, 48,00; H, 5,49; N, 20,35 %

Havaittu: C, 48,05; H, 5,51; N, 20,40 % U.V.-spektrit (nm) Haks Min "Olkapää” 5 0,1 N HC1 262 230 275 0. 1 N NaOH 265,5 232

Ohutlevykromatografia (TLC): kromatogrammi selluloosalla käyttäen vettä liuottimena osoitti vain yhden yksittäisen pisteen.

10 Esimerkki 2 4-kloori-1-/2 -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso-(4,5-c)pyridiini

Valmistettiin reaktioseos, joka käsittää 4-kloori-lH-imidatso(4,5-c)pyridiiniä (23 mmoolia), uri-15 diinia (27,4 mmoolia), kaliumfosfaattia (11 mmoolia), vettä (123 ml), n-propanolia (20 ml), puriininukleosi-difosforylaasia (kuten kuvattu esimerkissä 1, 13 000 1. U.) ja uridiinifosforylaasia (kuten kuvattu esimerkissä 1, 1100 I.U.). Ennen entsyymien lisäämistä reak- 20 tioseoksen pH säädettiin 6,7:ään. Suspensiota inkuboi-tiin 37°C:ssa 11 päivää ja sitten lisättiin lisää pu-riininukleosidifosforylaasia (1000 I.U.) ja uridiinifosforylaasia (100 I.U.). Kun reaktioseosta oli pidetty vielä 2 päivää 37°C:ssa, se suodatettiin ja suodosta 25 pidettiin kiertohaihduttimessa, kunnes tilavuus oli pienentynyt puoleen, pantiin Sephadex-kolonniin (G-10) T x 90 cm) ja eluoitiin vedellä, tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin 10 ml:ksi vakuumissa. Tämä liuos pantiin kolonniin, joka oli 30 täytetty polyakryyliamidilla (P-2, Bio Rad Laboratories) (2,5 x 90 cm) ja eluoitiin 30 %:11a n-propanolilla. Fraktiot, jotka sisälsivät tuotetta, joka ei ollut keltaista väriltään, yhdistettiin ja haihdutettiin vakuu-missa, kunnes suurin osa propanolista oli poistettu.

Il 13 70425 Jäljelläoleva vesi poistettiin lyofilisoimalla, jolloin saatiin 4-kloori-1-/2* -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso(4,5-c)pyridiiniä (2,9 g).

Anal, laskettuna C^j^j^ClNgOg : lie 5 Teoria: C, 46,24; H, 4,23; N, 14,70; Cl, 12,41%

Havaittu: C, 46,32; N, 4,26; N, 14,66; Cl, 1238 % U.V.-spektrit (nm):

Liuotin Maks Min "Olkapää" 0,1 N HC1 257,266 236 273 10 0,1 N NaOH 274 235 260,269

Ohutlevykromatografia: Kromatogrammi selluloosalla käyttäen n-propanoli/kyllästetty ammoniumsulfaa-tin vesiliuos/N natriumasetaatti (2: 79: 19) liuottimena antoi yhden yksittäisen pisteen.

15 Esimerkki 3 4-amino-l-/3 -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso(4,5-c)-pyridiinin valmistus 4-kloorianalogista (a) 4-hydratsino-välituotteen kautta 4-kloori-1-/3 -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso(4,5-c)-20 pyridiinin (1 g, 3,5 m moolia) (esimerkki 2) liuosta 40 ml:ssa hydratsiinihydraattia kuumennettiin palautuksella typpiatmosfäärissä 1 tunti. Liuos haihdutettiin kuiviin vakuumissa ja jäännös liuotettiin veteen (80 ml), josta happi oli poistettu. Sen jälkeen, 25 kun oli lisätty Raney-nikkeliä (3,8 g märkäpainoa), seosta keitettiin palautuksella 1 tunti ja sitten suodatettiin seliittipatsaan läpi ja katalysaattori pestiin hyvin kiehuvassa vedessä. Suodos ja pesunesteet haihdutettiin kuiviin vakuumissa, liuotettiin uudelleen ve-30 teen (30 ml) ja lisättiin ammoniumsulfidiliuosta (1 ml). Kun liuosta oli seisotettu yli yön, muodostui saostuma. Se poistettiin suodattamalla vakuumissa ja liuos lyofilisoitiin. Värillinen aine liuotettiin veteen ja kromatografoitiin selluloosalla käyttäen vettä 35 eluanttina. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäännös kromato- ±1 70425 grafoltiin silikageelillä kloroformi/metanoli-seoksissa. Sopivat fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin kuiviin ja jäännökseen lisättiin metanolia. Seurauksena saatu kiinteä aine (0,51 g) liuotettiin veteen ja kä-5 siteltiin kaasumaisella vetysulfidilla. Seisotettaessa muodostunut saostuma poistettiin suodattamalla ja suodos lyofilisoitiin. Jäännös liuotettiin veteen ja pantiin kolonniin, jossa oli Dowex-50-H+. Perusteellisen vesipesun jälkeen ainetta eluoitiin 0,5 N ammonium-10 hydroksidiliuoksella. Fraktiot yhdistettiin, haihdutet tiin kuiviin vakuumissa ja jäännös kiteytettiin vedestä, jolloin saatiin 4-amino-l-/$ -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso(4,5-c)pyridiiniä (0,23 g, 0,86 mmoolia, 25 %). Anal, laskettuna :lie: 15 Teoria: C, 49,62 %; H, 5,30 %; N, 21,04 %

Havaittu: C, 49,36 %; H, 5,12 %; N, 21,01 %.

(b) 4-bentsyyli-välituotteen kautta 4-kloori-1- -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso-(4,5-c)pyridiiniä (28,58 g) ja bentsyyliamiinia (26,75 g) 20 keitettiin palautuksella 2-etoksietanolissa (142 ml) typpiatmosfäärissä 18 tuntia. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin ja jäännös uudelleenkiteytettiin kahdesti seoksesta SD3A-vesi (1:1 v/v), jolloin saatiin 4-bent-syyliamino-1-^ -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso(4,5-c)-25 pyridiiniä (28,23 g).

Täten saatu 4-bentsyyliamino-välituote (28,1 g) liuotettiin lämpimään 2-metoksietanoliin (350 ml), ja 20 % palladiumhydroksidia hiilen pinnalla käsittävä katalysaattori (PdiOH^/C, 5 g) suspendoituna 2-metoksi-30 etanoliin lisättiin liuokseen. Seurauksena saatua reak-tioseosta hydrogenolysoitiin jonkin verran tavallista ilmanpainetta korkeammassa paineessa noin 55°C:ssa 3 päivää. Reaktioseos suodatettiin ja väkevöitiin kuiviin ja jäännöstä sekoitettiin kuumassa vedessä (600 ml), 35 jäähdytettiin 20°C:een ja suodatettiin. Suodos uutet tiin perusteellisesti etyyliasetaatilla, uutteet hei- 15 70425 lettiin pois, ja suodos väkevÖitiin noin 100 ml:ksi ja jäähdytettiin, jolloin saatiin haluttua tuotetta, joka kerättiin suodattamalla. Toinen tuote-erä saatiin säätämällä suodos pH:hon 10 ja edelleen väkevöimällä 5 liuosta. Toinen tuote-erä uudelleenkiteytettiin vedestä, yhdistettiin ensimmäiseen tuote-erään, ja yhdistetyt tuote-erät uudelleenkiteytettiin seoksesta SD3A-vesi (2:1 v/v; 200 ml), jolloin saatiin 4-amino-1-/* -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso(4,5-c)pyridiiniä 10 (12,5 g).

Esimerkki 4 4-bentsyyliamino-l-/? -D-ribofuranosyyli-lH-imidatsoi 4,5-c)pyridiini (a) 4-bentsyyliamino-lH-imidatso(4,5-c)pyridii-15 nin valmistus

Seosta, jossa oli kloori-lH-imidatso(4,5-c)-pyridiiniä (2,0 g, 13 mmol), bentsyyliamiinia (5 ml) ja muutamia tippoja vettä, kuumennettiin palautuksella 4 päivää. Reaktioseos kaadettiin jäiden ja veden se-20 kaan, ja kylmää seosta uutettiin kahdesti dietyyli- eetterillä. Eetteri poistettiin vakuumissa, ja jäljelle jäänyttä öljyä jauhennettiin kahdesti heksaanin kanssa, öljy suspendoitiin veteen ja vesifaasi neutraloitiin jääetikalla. Vesifaasi haihdutettiin kuiviin 25 vakuumissa ja suspendoitiin uudelleen veteen (15 ml) ja pantiin kolonniin, jossa oli Dowex 50 (H+) -hartsia (10 g). Kolonnia pestiin vedellä, kunnes eluantin ultraviolet-tiabsorbanssi oli nolla. Kolonnin täyte poistettiin kolonnista ja sitä kuumennettiin useiden erien väkevää 30 ammoniumhydroksidiliuosta (400 ml) kanssa. Emäksinen liuos suodatettiin vakuumissa, jäähdytettiin ja neutraloitiin jääetikalla. Keltainen kiinteä aine kerättiin ja kuivattiin vakuumissa 40°C:ssa, jolloin saatiin 4-bentsyyliamino-lH-imidatso(4,5-c)pyridiiniä 0,94 g, 35 sulamispiste 60-64°C, 31,5 %.

70425 16

Analyysi laskettu 0,3 F^Orlle

Teoria: C: 67,88 H: 5,53 N: 24,40 %

Havaittu: C: 68,05 H: 5,26 N: 24,23 %.

UV-tiedot: 5 Liuotin maksi nm) E "Olkapää" 0,1 N HC1 277 13000 263 0,1 N NaOH 278 11900 (b) 4-bentsyyliamino-l-/^-D-ribofuranosyyli-lH-imidatso(4,5-c)pyridiinin valmistus 10 Valmistettiin reaktioseos, joka käsittää uridii- nia (4,1 g), 4-bentsyyliamino-lH-imidatso(4,5-c)pyri-diiniä (0,68 g) (valmistettu kuten esimerkissä 4a), 0. 2H KxHyP04 (pH 7,4) (6 ml), 0,13 mM Na2EDTA (6 ml), vettä (200 ml), n-propanolia (10 ml), puriininukleo- 15 sidifosforylaasia (kuten kuvattu esimerkissä 1, 2800 1. U.) ja uridiinifosforylaasia (kuten kuvattu esimerkissä 1, 390 I.U.). Tätä niin saatua suspensiota inku-boitiin 37°C:ssa 4 päivää. Niin saatu suspensio suodatettiin ja suodatinsakka pestiin vedellä ja kuivat- 20 tiin vakuumissa, jolloin saatiin 4-bentsyyliamino-l/) -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso(4,5-c)pyridiiniä (0,39 g) monohydraattinaan.

Jäähdyttämällä suodos 3°C:een saatiin toinen kide-erä, joka pestiin ja kuivattiin vakuumissa, jolloin 25 saatiin kokonaissaanto 0,43 g tuotetta.

Analyysi laskettuna .^0 : lie

Teoria: C, 57,74 H, 5,92 N, 14,96 % 1. tuote-erä, havaittu: C, 57,54; H, 5,94; N, 14,98 % 30 2. tuote-erä, havaittu: C, 57,45; H, 5,96; N, 14,95 % UV-spektri (nm)

Liuotin Maks Min 0,1 N HC1 268 236 35 0,1 N NaOH 273,5 238.

Il

Claims (8)

70425 17

1. Menetelmä 4-substituoitujen l-^-ribofuranosyyli-lH-imidatso/M ,5-^c7pyridiinien valmistamiseksi, joilla on 5 kaava (I) R A (i)

10 HO— Οχ OH OH 15 jossa R on amino, halogeeni tai bentsyyliamino, tunnet-t u siitä, että vastaava 4-substituoitu lH-imidatso/T,5—ς£7— pyridiini saatetaan reagoimaan riboosi-l-fosfaattia sisältävän riboosidonorisysteemin kanssa puriininukleosidifosforylaa-sin läsnä ollessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 4-amino-l- /3 -D-ribofuranosyyli-lH-imidatso/M , 5-cT/pyridiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että ribosyloidaan 4-amino-lH-imidatsO/M,5-c7pyridiini.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että riboosi-l-fosfaatti tuotetaan entsymaattisesti in situ ribosyylidonorista ja epäorgaanisesta fosfaatista.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ribosyylidonori on puriini- tai 30 pyrimidiininukleosidi tai niiden seos.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epäorgaaninen fosfaatti on di-kaliumvetyfosfaatti.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan vesiväliai- neessa tai väliaineessa, joka sisältää enintään 50 % orgaanista liuotinta. ie 7 0 4 2 5

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan pH:ssa 5-9 ja lämpötilassa 3°C - 37°C.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen 4-amino-l-/?-D- 5 ribofuranosyyli-lH-imidatso/M ,5-c/pyridiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 4-halogeeni-lH-imidatso/jT, 5-c7~ pyridiini ribosyloidaan ja sen jälkeen halogeenisubstituentti muutetaan sinänsä tunnetulla tavalla aminoryhmäksi, ja että ribosylaatio suoritetaan entsymaattisesti reaktiolla riboosi-10 1-fosfaatin ja puriininukleosidifosforylaasin kanssa. n i9 70425