FI64349C

FI64349C - Foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart l-pyroglutamyl-l-histidyl-glysin och dess salter

Info

Publication number: FI64349C
Application number: FI782714A
Authority: FI
Inventors: Karl-Ludwig Reichelt; Olav Edvardt Trygstad
Original assignee: Nyegaard & Co As
Priority date: 1977-09-06
Filing date: 1978-09-05
Publication date: 1983-11-10
Also published as: EP0001174B1; AU518157B2; ATA642878A; NO147601B; EP0001174A1; NO147601C; FI64349B; ZA785022B; DK390678A; NO783027L; DE2860944D1; AT363624B; IT7850967A0; JPS5951935B2; FI782714A7; JPS5488267A; ES473090A1; AU3955478A; IT1106283B; CA1105926A

Description

I -.- -·Ί ,., .... KUULUTUSJULKAISU £L Λ ~L Λ Q

B 11 UTLÄGGN I NGSSKRI FT 64 34 9 • C (*5) Tatontti rsyör.netty 10 11 1933

Parent ^sddslat V * , (51) Kr.lk.>t.CI. c 0? C ^03/52 SUOMI—"FINLAND (21) Pttenttlhakemu* — Patentansöknlng ^8271^ (22) HakemItpilvS — Ansöknlng*dag 05.09*78 (23) Alkupllvi —GHtlghetadag 05.09.78 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offentHg g^,

Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nihtlvlkslpanon ja kuul.Julkalsun pvm.—

Patent· och registerstyrelsen ' An»ek»n utiagd och uti.skriften pubiieerad 29.07.83 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlorltet < gg 7γ

Englanti-England(G3) 37193/77 (71) Nyegaard & Co. A/S, Nycoveien 2, Oslo b, Norj a.-Norge (70) (72) Karl-Ludwig Eeicheit, Oslo, Olav Edvardt Trygstad, Oslo,

Norja-Norge(NO) (7U) Oy Kolster Ab (5!) Menetelmä uuden terapeuttisesti käytettävän L-pyrcglutamyyli-L-histi-dyyli-glysiinin ja sen suolojen valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av ett terapeutiskt an van db art L-py r oglut any.l - L-h i s t i dy Γ. --glycin cch dess salter

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä uuden terapeuttisesti käytettävän, kaavan I mukaisen L-pyroglufamyyii-L-histi-dyyli-glysiinin ja sen suolojen valmistamiseksi, Γ > / (I)

Jv xL Γ2"

O N

I CO-NH-CH-CONH-CH -COOH

H

jossa pyroglutamyyli-ja histidyyliosat ovat L-sarjaa.

Esillä oleva keksintö perustuu vakavasta ruokahaluttomuudesta kärsivien potilaiden virtsasta löydetyn uuden peptidin keksimiseen, jolla peptidillä on mielenkiintoisia ruokahalua vähentäviä ominaisuuksia ja jota niin ollen voidaan käyttää ylensyömisen aiheuttaman lihavuuden hoitamiseen.

64349

Fl-patettihakemuksessa 76 0538 on kuvattu pyroglutamyyli-L-histidyyli-proliiniamidien tiettyjä alkyyii- ja/tai alkoksijohdannaisia. Nämä yhdisteet eroavat esillä olevan keksinnön mukaisista yhdisteistä siinä, että ne sisältävät proliiniamidiryhmän glysiini-ryhmän tilalla. Julkaisussa on lisäksi mainittu, että näillä yhdisteillä on antidepressiivinen aktiivisuus, mutta ruokahalua vähentävästä aktiivisuudesta ei ole mitään mainintaa.

Julkaisussa J. Med. Chem. 1971 14(6) s. 484-487 (J-K. Chang et ai.) on kuvattu L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-glysiiniamidi, mutta tämä yhdiste on terapeuttisissa kokeissa havaittu biologisesti inaktiiviseksi.

Suolat, jotka ovat käyttökelpoisia liitettäväksi farmaseuttisiin valmisteisiin, ovat fysiologisesti yhteensopivia suoloja. Muut suolat voivat kuitenkin olla hyödyllisiä uuden tripeptidin ja sen fysiologisesti yhteensopivien suolojen valmistuksessa.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) poistetaan suojaryhmä(t) yhdisteestä, jolla on kaava L) _ R3 I 1 c«2 nn

O ^ J CO-NH-CH-CONH-CH -COR

R1 jossa pyroglutamyyli- ja hi stidyyliosat ovat molemmat L-sarjaa, kumpikin ryhmistä R^ ja R^ on vetyatomi tai aminoryhmää suojaava ryhmä ja R2 hydroksyyliryhmä tai karboksyyliryhmää suojaava ryhmä, edellyttäen, että vähintään yksi ryhmistä R , R2 ia R^ on suojaryhmä, cai b) annetaan yhdisteen, jolla on kaava L> __ 11 (lila) .ΛΑ "

H CO-NH-CH-COX

II

3 jossa pyroglutamyyli- ja histidyyliosat ovat molemmat L-sarjaa ja X on hydroksyyliryhmä tai karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä, reagoida glysiinin kanssa, tai c) annetaan yhdisteen L-isomeerin, jolla on kaava i i

H

jossa X on hydroksyyliryhmä tai karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä, reagoida yhdisteen L-isomeerin kanssa, jolla on kaava ΓΛ /

__N

H (VIb) ^2

NH2-CH-COM-CH2-COOH

minkä jälkeen näin saatu kaavan I mukainen yhdiste mahdollisesti muutetaan suolaksi.

Kaavan II mukainen yhdiste menetelmävaihtoehdossa a) voi olla vain osittain suojattu vain yhden tai kahden ryhmistä R^ , R2 ja R^ ollessa tällöin suojatussa muodossa; tällaiset yhdisteet voidaan poistamalla osa suojaryhmistä selektiivisesti kaavan II mukaisesta yhdisteestä, jossa kaikki ryhmät , R2 ja ovat suojatussa muodossa, tai tällainen yhdiste voidaan syntetisoida osittain suojatluun muotoon. Erityisesti R, on tavallisesti vetyatomi. Kuitenkin silloin kun käytetään kaavan II mukaista yhdistettä, jossa kaikki ryhmät , R2 ja R^ ovat suojaryhmiä, on edullista poistaa kaikki suojaryhmät samanaikaisesti.

Kaavan II mukainen yhdiste voidaan valmistaa esimerkiksi antamalla yhdisteen, jolla on kaava r\ —N / ,_ R3 ( I CH (III)

X I

0/ CO-NH-CH-COX

Ri 4 64349 jossa pyroglutamyyli- ja histidyyliosat ovat molemmat L-sarjaa, molemmat ryhmät R-^ ja ovat vetyatomeja tai amiiniryhmää suojaa-via ryhmiä ja X on hydroksyyliryhmä tai karboksyylihappoa aktivoivaa ryhmää, reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava nh2-ch2-cor2 (IV) (jossa R^ on hydroksyyliryhmä tai karboksyyliryhmää suojaava ryhmä), jolloin saadaan kaavan II mukainen yhdiste.

Käytetään edullisesti kaavan III mukaista yhdistettä, jossa R-j^ on amiiniryhmää suojaava ryhmä ja/tai X on karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä. R^ on edullisesti vetyatomi. Käytetään edullisesti kaavan IV mukaista yhdistettä, jossa R2 on karboksyyliryhmää suojaava ryhmä.

Kaavan II mukainen yhdiste voidaan valmistaa esimerkiksi myös antamalla L-isomeerin, jolla on kaava T" ' i f; 0 COX (V)

Ri jossa R^ on vetyatomi tai amiiniryhmää suojaava ryhmä ja X on hydroksyyliryhmä tai karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä, reagoida yhdisteen L-isomeerin kanssa, jolla on kaava rw !: 7 — r/ r3 (VI) ch2 NH2-CH-CONH-CH -C0R2 jossa R2 on hydroksyyliryhmä tai karboksyyliryhmää suojaava ryhmä ja R^ on vetyatomi tai amiiniryhmää suojaava ryhmä, jolloin saadaan kaavan il mukainen yhdiste.

Käytetään edullisesti kaavan V mukaista yhdistettä, jossa R·^ on amiiniryhmää suojaava ryhmä ja/tai X on karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä. R^ on edullisesti vetyatomi. Käytetään edullisesti kaavan IV mukaista yhdistettä, jossa R2 on karboksyyliryhmää suojaava ryhmä.

Il 5 64349

Yllä määritelty kaavan III mukainen yhdiste (jossa X on kar-boksyylihappoa aktivoiva ryhmä) voidaan valmistaa esimerkiksi antamalla kaavan III mukaisen yhdisteen L-isomeerin (jossa X on hydrok-syyliryhmä) reagoida tunnetuilla menetelmillä kaavan III mukaisen yhdisteen muodostamiseksi, jossa X on karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä.

Yllä määritelty kaavan III mukainen yhdiste (jossa X on hyd-roksyyliryhmä) voidaan valmistaa esimerkiksi antamalla yhdisteen L-isomeerin, jolla on kaava

' I

_ J, (V)

0 ' " COX

R1 (jossa on vetyatomi tai amiiniryhmää suojaava ryhmä ]a X on hyc-roksvyliryhmä tai karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä) reagoida yhdisteen L-isomeerin kanssa, jolla on kaava ' N\ 1/ r3 (VII)

CH J

! nh2-ch-cor (jossa R2 3a R-j tarkoittavat samaa kuin yllä) ja kun käytetään kaavan VII mukaista yhdistettä, jossa R2 on karboksyvliryhmää suojaava ryhmä, konvertoidaan näin saatu yhdiste kaavan III mukaiseksi yhdisteeksi (jossa X on hydroksyy1iryhmä) poistamalla karboksyyliryhmää suojaava ryhmä.

On edullista käyttää kaavan V mukaista yhdistettä, jossa on amiiniryhmää suojaava ryhmä ja/tai jossa X on karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä. On myös edullista käyttää kaavan VII mukaista yhdistettä, jossa R2 on karboksyylihappoa suojaava ryhmä, joka ryhmä sitten poistetaan reaktion jälkeen, jolla muodostetaan kaavan III mukainen yhdiste, jossa X on hydroksyyliryhmä.

Yllä määritelty kaavan VI mukainen yhdiste voidaan valmistaa esimerkiksi poistamalla amiiniryhmää suojaava ryhmä tai ryhmät yhdisteestä, jolla on kaava 6 64349 r\ 1/ R7 (Via) Φ2 I Δ R^Mi-CH-CGNH-Q^ -ΟΟί^ (jossa R| on amiiniryhmää suojaava ryhmä ja on vetyatomi tai amiiniryhmää suojaava ryhmä),jolloin saadaan kaavan VI mukainen yhdiste.

Kaavan VI tai Via mukainen yhdiste voidaan valmistaa esimerkiksi antamalla yhdisteen L-isomeerin, jolla on kaava fs / I— n' »3

Π-Ϊ J

| 2 (VIII)

RjNH-CH-COX

(jossa ja tarkoittavat samaa kuin yllä ja X on hydroksyyli-ryhmä tai karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä), reagoida yhdisteen kanssa, jolla on kaava nh2-ch2-cor2 (IV) (jossa R2 on hydroksyyliryhmää tai karboksyyliryhmaä suojaava ryhmä), jolloin saadaan kaavan VI tai Via mukainen yhdiste.

On edullista käyttää kaavan VIII mukaista yhdistettä, jossa R^ on amiiniryhmää suojaava ryhmä, joka ryhmä poistetaan reaktion jälkeen. On myös edullista käyttää kaavan VIII mukaista yhdistettä, jossa X on karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä. Käytekään edullisesti kaavan IV mukaista yhdistettä, jossa R2 on karboksyyliryhmaä suojaava ryhmä. R^ on edullisesti vetyatomi.

Il 7 64349

Kun jossakin yllä mainituista reaktioista saadaan tuotteiden seos, haluttu tuote voidaan eristää reaktioseoksesta tavanomaisin tunnetuin menetelmin.

On huomattava, että tämän keksinnön yhdisteet voidaan haluttaessa valmistaa tässä kuvattujen menetelmien mukaisesti käyttäen peptidisynteesin kiinteän faasin menetelmää. Tällaisessa menetelmässä C-pääteaminohapon karboksyyliryhmää suojaava ryhmä voi olla hartsin muodossa.

Kaavojen IV, V, VII ja VIII yhdisteet ovat joko helposti saatavissa olevia lähtöaineita tai ne voidaan helposti johtaa saatavissa olevista lähtöaineista kirjallisuudessa hyvin tunnettujen menetelmien mukaisesti.

Suuri valikoima suojaavia ja aktivoivia ryhmiä sekä menetelmiä aminohappojen suojaamiseksi, aktivoimiseksi ja yhdistämiseksi tunnetaan ja niistä ovat esittäneet esimerkkejä Schroder, E., ja Lubke, K., The Peptides, osat 1 ja 2, Academic Press, New York ja Lontoo, 1965 & 1966; Pettit, G.R, Synthetic Reptides, osat 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1875 & 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischer Chemie, Synthese von Peptiden, Band 15, Georg Thiene Verlag, Stuttgart 1974; ja Amino Acids, Peptides and Proteins, osat 4-8. The Cbeinica.. Society,

Lontoo 1972, 1974, 1975 & 1976.

Niinpä esimerkiksi amiuniryhmää suojaavia ryhmiä, "oi:a voidaan käyttää, ovat karbobentsoksi-, (jäljempänä käj^etry myös merkintää Cbz tai Z), t-butoksikarbonyyli, (jäljempänä Käytetty myös merkintää BOC) ja asyyl i ryhmät; kuten esimerkiksi a s s t yyl :i. ryhmä tai formyyliryhmä.

Karboksyyliryhmää suojaavia ryhmiä, joita esimerkiksi voidaan käyttää, ovat helposti lohkaistavat esteriryhmät, kuten oentsyyli-, (jäljempänä käytetty myös merkin tää Bzl), p- n i t robe n + s yv li- tai t-butyyliryhmät.

Karboksyylihappoa aktivoivia ryhmiä, joita esimerkiksi voidaan käyttää, ovat seku-anhydridit, atsidi t tai akt ίvoidut esterit, kuten esimerkiksi p-nitrofenyyliesteri, 2,4,5-trLkiooriSenyyli esteri tai N-hydroksisukkinimidyyliesteri.

On huomattavaa, että suuri joukko muita tällaisia ryhmiä on olemassa, kuten on yksityiskohtaisesti esitetry es imerkiks i yllä mainituissa kirjallisuusviitteissä ja kaikkien äl 'öisten ryhmien 8 64349 käyttö edellä kuvatuissa prosesseissa kuuluu tämän keksinnön suoja-piiriin.

Tämän keksinnön prosessit toteutetaan yleensä käyttämällä L-pyroglutamyyli- ja L-histidyylilähtöaineita ilman niiden D-iso-meereja. Näin ollen on toivottavaa suorittaa reaktiot olosuhteissa, joilla vältetään rasemoituiainen, jotta ei tarvittaisi erotus-prosessia koko reaktiosarjän lopussa.

On myös mahdollista, mutta vähemmän edullista käyttää rasee-misia pyroglutamyyli- ja histidyylilähtöaineita ja sisällyttää prosessiin yksi tai useampia optisia erotusvaiheita.

Karboksyyliryhmää suojaavat ryhmät voidaan liittää mukaan tavanomaisin menetelmin, esim. reaktiolla sopivan esteröintiaineen, esimerkiksi alkoholin, kuten bentsyyli- tai p-nitrobentsvylialkoho-lin kanssa hapon, esim. p-tolueenisulfonihapon läsnäollessa.

Amiiniryhmää suojaavat ryhmät voidaan liittää mukaan tavanomaisilla menetelmillä, esim. reaktiolla sopivien happohalogenidien, kuten karbobentsoksyylikloridin tai pivaloyy1ikloridien tai happo-anhydridien, kuten etikkahappoanhydridin kanssa.

Yleensä on edullista suorittaa yhdistämisreaktiot matalissa lämpötiloissa, esimerkiksi -20°C:sta ympäristön lämpötilaan vaivattomasti sopivassa liuotinsysteemissä, esimerkiksi tetrahydrofuraanissa, dioksaanissa, dimetyyliformamidissa, metyleenikloridissa tai näiden liuottimien seoksessa.

Vapaiden amino- ja karboksyyliryhmien yhdistäminen voidaan suorittaa käyttäen esimerkiksi disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC). Toinen yhdiste, jota esimerkiksi voidaan käyttää, on N-etoksikarbo-nyyli-2-etoksi-l,2-dihydrokinoliini.

Karboksyyliryhmien aktivointi voidaan suorittaa esimerkiksi muuttamalla happo reaktiokykyiseksi johdannaiseksi, esim. happoan-hydridiksi, joka voidaan valmistaa esimerkiksi käyttäen etyyli-tai isobutyyliklooriformaattia. Toisen aminohapon asylointi seka-anhydridillä tai muulla aktivoidulla karboksyylijohdannaisella voidaan suorittaa menetelmillä, jotka ovat tavanomaisia peptidisyn-teeseissä.

Tavallisesti reaktiotuote sisältää yhdistämisvaiheen jälkeen yhden tai useampia suojaavia ryhmiä. Haluttaessa nämä voidaan poistaa esimerkiksi selektiivisellä tavalla. Niinpä on mahdollista poistaa vain tietyt ryhmät pitäen muut koskemattomina seuraavien reaktioiden aikana.

ti 9 64349

Kuten yllä esitettiin on olemassa suuri joukko menettelyjä amiiniryhmiä suojaavien ryhmien ja karboksyyliryhmää suojaavien ryhmien poistamiseksi. Niinpä esimerkiksi amiiniryhmää suojaava ryhmä voidaan poistaa happohydrolyysillä, hydrogenolyysiliä, käsittelemällä laimealla ammoniumhydroksidilla, käsittelemällä natriumilla, käsittelemällä natriumamidiila, käsittelemällä hydratsiini11 a tai entsymaattisella hydrolyysillä esimerkiksi leusiiniaminopepti-daasilla. Mielenkiintoisia menetelmiä ovat myös käsittely vedettömällä broinivedyllä esimerkiksi jääetikassa, käsittely trifluori-etikKahapoIla ja katalyyttinen hydraus.

Niinpä karbobentsoksi-ja t-butoksikarbonyyliryhmät voidaan poistaa esimerkiksi käyttäen vedetöntä bromivetyä sopivasti jääeti-kan läsnäollessa tai käyttäen trifluorietikkahappoa sopivasti väkevän kloorivetyhapon läsnäollessa; asyyliryhmät voidaan poistaa esimerkiksi tavanomaisella hydrolyysillä hapon avulla tai entsymaattisella hydrolyysillä yllä kuvatulla tavalla.

Karboksyyiiryhmaä suojaavien ryhmien poisto voidaan suorittaa esimerkiksi saippuoinnilla, happohydrolyysillä, hydrogenolyy-siiiä tai entsymaattisella hydrolyysillä. Niinpä esimerkiksi saippu-ointi voidaan suorittaa aikaiimetallihydroksidilla sopivasti veden, alkoholin ja/tai asetonin läsnäollessa. Happohydrolyysi voidaan suorittaa esimerkiksi käyttäen vedetöntä bromivetyä tai trifluoriet ikkahappoa ja hydrogenolyysi voidaan suorittaa esimerkiksi katalyyttisellä hydrsuksella käyttäen esim. palladiumia hiilen pinnalla, sopivasti 1Q % palladiumia puuhiilellä. Entsymaattinen hydrolyysi voidaan suorittaa esimerkiksi käyttäen leusiiniaminopeptidaasia. Niinpä esimerkiksi bentsyyli- ja p-nitrobentsyyliryhmät voidaan poistaa hydrogenolyysillä ja t-butyyliryhmät voidaan poistaa esimerkiksi happohydrolyysillä tai. saippuoinnilla.

Amiiniryhmää suojaavat ryhmät ja karboksyyli ryhmää suojaavat ryhmät voidaan poistaa esimerkiksi samanaikaisesti happohydrolyysillä, alkaalisella hydrolyysillä, hydrogenolyysillä, käsittelemällä natriumilla tai natriumamidiila tai entsymaattisella hydrolyysillä. Tällaisia menetelmiä ovat käsittely bromivedyllä sopivasti jääetikan läsnäollessa ja käsittely alkoholilla, joka sopivasti sisältää liuennutta kuivaa kloorivetyä.

Eräs suojauksen poistomenetelmä on esimerkiksi katalyyttinen hydraus käyttäen katalyyttinä sopivasti palladiumia esim. hiilen pinnalla ja sopivasti liuottimen, esim. veden, metanoIin, dioksaa- 10 64349 nin, etikkahapon tai t-butanolin läsnäollessa. Tämä menetelmä poistaa esimerkiksi karbobentsoksiryhmän,, mutta jättää t-butoksikarbo-nyyli- tai asyyliryhnän koskemattomaksi.

Reaktiotuote voidaan sitten eristää ja puhdistaa tunnetuilla menetelmillä, Kuten esimerkiksi uuttamalla, kiteyttämällä tai kroinat ©graafisesti (esim. ohutlevy- tai pylväskromatografialla). Saattaa olla edullista eristää ja puhdistaa haluttu peptidituote suo-lanmuodostuksella (esim. hydrokloridi-, hydrobromidi- tai disyklo-neksyyliair.iinxsuolan muodostus). Välituotteet ja lopputuotteet voidaan karakterisoida esimerkiksi kromatograafisillä parametreille (puhtaustarkastus), optisen kiertokyvyn ja mahdollisesti spektroskooppisten tietojen perusteella.

Keksinnön mukaisista yhdisteistä valmistetaan farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät aktiivisena aineosana vähintään yhtä edellä määritellyn kaavan I yhdistettä tai sen fysiologisesti yhteensopivaa suolaa yhdessä farmaseuttisen kantoa!neen tai laimentimen Kanssa. Keksinnön mukaiset valmistee" voidaan saattaa esimerkiksi muotoon, joka sopii oraaliseen, ruoansulatuskanavan ulkopuoliseen tai peräpuikkokäyttöön.

Tässä käytettynä sanonta "farmaseuttinen" käsittää keksinnön eläinlääketieteelliset sovellutukset.

Keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan saattaa tavanomaisiin farmakologisiin käyttömuotoihin, kuten tableteiksi, päällystetyiksi tableteiksi, liuoksiksi, emulsioksi, jauheiksi, kapseleiksi tai jatkuvasti vapautuviksi muodoiksi. Tavanomaisia farmaseuttisia taitoaineita samoin kuin tavallisia valmistusmenetelmiä voidaan käyttää näiden muotojen valmistukseen. Tabletit voidaan valmistaa esimerkiksi sekoittamalla aktiiviseen aineosaan tai aineosiin tunnettuja kantoaineita, kuten esimerkiksi 1 alinentimia, kuten kalsium-karbonaattia , kalsiumfosfaattia tai laktoosia, hajotusaineita, kuten maissitärkkelystä ta: algiinihappoa, sideaineita kuten tärkkelystä tai gelatiinia, voiteluaineita kuten magnesiumstearaattia nai talkkia ja/tai aineita jatkuvan vapautumisen aikaansaamiseksi, kuten kerboksipolymetyleeniä, karboksimetyyiiselluloosaa, sei 1uloosa-ase-taattiftalaattia tai polyvinyyliasetaattia.

Tabletit voivat haluttaessa koostua useista kerroksista. Päällystettyjä tabletteja voidaan valmistaa päällystämällä sisuksia, jotka on saatu samalla tavoin kuin tabletit, aineilla, joita yiei- il 11 64349 sesti käyttää tabletinpäällysteiksi, esimerkiksi polyvinyylipyr-rolidonilla tai sellakalla, arabikumilla, talkilla, titaanidioksidilla tai sokerilla. Jatkuvan vapautumisen saavuttamiseksi tai yhteensopimattomuuksien välttämiseksi myös sisus voi koostua useista kerroksista. Tabletin päällyste voi myös koostua useista kerroksista jatkuvan vapautumisen aikaansaamiseksi, missä tapauksessa yllä tableteille mainittuja kantoaineita voidaan käyttää.

Keksinnön mukaisen aktiivisen aineosan tai aktiivisten aineosien yhdistelmien siirapit voivat lisäksi sisältää makeutusainetta, kuten sakkariinia, syklamaattia, glyserolia, tai sokeria ja/tai makua parantavia aineita, kuten mausteita, esim. vanilliinia tai appelsiiniuutetta. Ne voivat myös sisältää suspendointiaineita tai paksuntimia, kuten natriumkarboksimetyyliselluloosaa, kostutusainei-ta, kuten esimerkiksi rasva-alkoholien kondensaatiotuotteita ety-leenioksidin kanssa tai säilöntäaineita, kuten p-hydroksibentsoaat-te ja.

Ruiskeliuokset voidaan valmistaa esimerkiksi tavanomaiseen tapaan, kuten lisäämällä säilöntäaineita, kuten p-hydroksibentsoaat-teja tai stabilisaattoreita, kuten Complexon-valmisteita. Ruiske-pullot tai -ampullit täytetään sitten liuoksella.

Kapselit, jotka sisältävät yhtä tai useampia aktiivisia aineosia, voidaan valmistaa esimerkiksi sekoittamalla aktiivisia aineosia inertteihin kantoaineisiin, kuten laktoosiin tai sorbitoliin ja täyttämällä gelatiinikapselit ko. seoksella.

Sopivia peräpuikkoja voidaan valmistaa esimerkiksi sekoittamalla aktiivista aineosaa t.ai aktiivisten aineosien yhdistelmiä tavanomaisiin kantoaineisiin, jotka on ajateltu tähän tarkoitukseen, kuten luonnon rasvoihin tai polyetyleeniglykoliin tai sen johdannaisiin.

Valmisteet voidaan edullisesti muodostaa annostusyksiköiksi, jolloin jokainen yksikkö luovuttaa määrätyn annoksen aktiivista aineosaa. Tabletit, päällystetyt tabletit, kapselit, peräpuikot ja ampullit ovat esimerkkejä sopivista annostusyksikkömuodoista. Jokainen annostusyksikkö sisältää edullisesti 5-100 nanomoolia sanottua aktiivista aineosaa ja erityisesti 15-50 nanomoolia aktiivista aineosaa.

Kuten yllä mainittiin näitä uusia yhdisteitä voidaan antaa ihmisille tai muille eläinyksiköille. Valinnainen annos on yleensä 2 64349 suhteessa pinta-alaan ja on välillä 5-50 nanomoolia/m pinta-alaa/ 2 päivä. Niinpä ihmisillä, joiden pinta-ala on luokkaa 1,5-2,0 m , valinnainen päivittäinen annos on välillä 7,5-100 nanomoolia/päivä.

1-5 viikon, esimerkiksi 3 viikon käsittelyjakso on sopiva. Yleensä hoito tapahtuu mieluummin ruiskeena.

Keksinnön mukaisilla yhdisteillä voidaan täten hoitaa ylensyönnin aiheuttamaa liikalihavuutta antamalla tehokas määrä edellä määriteltyä farmaseuttista valmistetta potilaalle, joka kärsii tällaisesta liikalihavuudesta. Peptidejä voidaan myös käyttää eläin-mallien valmistamiseen, joita voidaan tutkia ja käyttää terapeuttisiin kokeisiin.

Keksinnön mukaista peptidiä voidaan käyttää myös immunologiseen määritystekniikkaan tarkoitetun materiaalin valmistuksessa. Peptidi voidaan sitten liittää kovalenttisesti sopivaan suurmole-kyyliseen kantoaineeseen, kuten albumiiniin, polylysiiniin tai poly-proliiniin ruiskutettavaksi vasta-ainetta tuottavaan eläimeen (esim. kaniineihin, marsuihin tai vuohiin). Erittäin spesifisiä vasta-seerumeja saadaan käyttämällä hyvin tunnettua absorptiotekniikkaa, jossa käytetään suurmolekyylistä kantoainetta. Liittämällä radioaktiivisuutta (^C, ^0, "^N jne) peptidimolekyyliin säteilyimmuu-nisuusmääritys voidaan helposti laatia ja käyttää sitä erilaisissa biologisissa nesteissä, kuten seerumissa (plasma), virtsassa ja aivo-selkäydinnesteessä olevan peptidin määrittämiseen.

Esimerkissä suojauksen poisto katalyyttisella hydrauksella suoritetaan käyttäen katalyyttinä 10.% palladiumia hiilen pinnalla. Esimerkin menetelmä on valittu siten, että vältetään sivuketjun suojaaminen, mikä yksinkertaistaa koko koemenettelyä.

Esimerkissä käytetään seuraavia lyhenteitä: DCC = disykloheksyy1ikarbodi-imidiä DCU = disykloheksyyliurea DME = dimetoksietaani DMF = dimetyyliformamidi

Gly = glysyyli-

His = L-histidyyli- pGlu= L-(pyro)glutamyyli- H0Su= N-hydroksisukkinimidi 0Bzl= bentsyyliesteri TEA = trietyyliamiini

II

13 64349 THF = tetrahydrofuraani p-TosOH = p-tolueenisuifonihappo Z = karbobentsoksi- i-PrOH - isopropanoli

Gel = piihappogeeli G

SI CK2C1 /KeOH (20:3)

MeOH/bentseeni (1:1) S4 Et0H/H20 (7:3) KV ultraviolettivalo -254 nm N ninhydriir.i CT kloori/o-toluidiini ? diaf-sotoitu sulfani: lihappo (Palyrn reagenssi) Käytetyt liuottimet olivat pro analyysi (p.a.) niitä käsiteltiin tavallisten laboratoriomenettelyjen mukaisesti ennen niiden käyttöä.

Synteesikaavio pGlu His Gly Z--- OSu H---ONa Z--—--OK H--OBzl Z----OBzl

H----OH

a) Karbobentsoksi-L- (pyro ) glut amiini-N-hydrok s isukki r. imidi-esteri (Z-pglu (OSu)) Z-p Glu (OSu) syntetisoitiin samalla tavoin kuin ovat esittäneet P. Kurath, A.M. Thomas, Helv. Chim. Acta 56 1656-61 (1973), ts. seuraavalla tavalla: Z-p Glu (OH) (15 g, 57 mmoolia) ia HOSu (7,26 g, 63 rnmool ia) liuotettiin DM E: in (50 ml) ja liuos -jäähdylTt-ti in -2fi°C: en (CC l,, /C02 : s s a ) . DCO: a (13 g, 63 mmoo.i’a) 1 i uo f e t I un,: 14 64349 3ME:m (2o ml) lisättiin tipoittain liuokseen voimakkaasti sekoittaen. Kancen tunnin kuluttua -20°C:ssa lämpötila nostettiin hitaasti nuor.een 1 ärr.pö111 aan ja sekoitusta jatkettiin yli yön. Saostunut DCU suodatettiin pois ja liuotin haihdutettiin tyhjössä. Jäännös kiteytettiin i-?rOh:sta, jolloin saatiin 14 g (70.%, kirjall. 71 %) tuotetta, jonka sp. oli 130°C (kirjall. 130-131°C). Rf (SI) 0,73-0,75.

k) Karbcoentsoksi-L-(pyro)glutamyyli-histidllni (Z-pGlu-His (OH) Z-pGlu-His(OH) syntetisoitiin seuraavalla tavalla: Z-pGlu(OSu) (5,4 g, 15 mmoolia) liuotettiin cioksaa-r.iin (25 ml) 5 a lisättiin liuokseen, jossa oli H is (2,56 g, 16,5 mmoo-iia) ja Ka2C0;r lOH^O (4,72 g, 16,5 mmoolia) Heissä (20 mi ) 0°C:ssa. Kun seosta oli sekoitettu 2 tuntia huoneenlämpötilassa, aktiivinen ester_ 0*1 reagoinut täydellisesti (seurattiin TLC:n avulla). Seos vakevöitxm puoleen, tilavuudestaan: tyhjössä, jäähdytettiin O^Creen 0a 3-M HC1:a (5,5 ml) lisättiin voimakkaasti sekoittaen. Saostunut tilaa vievä materiaali suodatettiin pois, pestiin H2Q:11a ja kiteytettiin MeOH/H 0:sta (2:5). Saanto 3,5 g (60 %, kirjall. 62 %), hajoaa 140-16D°C, Rf (54) 0,45.

c) Karbobentsoks'i-L- (pyro )glutamyyli-L-hist idyyli-glysiinin bentsyyliesteri (Z-pGlu-His-Gly(OBzl)

Gly ( OEzl) . pTos ( OH) syntetisoitiin samalla tavoir·, kuin ovat esittäneet L. Tervas, M. Viinitz, J.P. Greenstein, J.O.C. 22, 1515-21 (1957). Niinpä TEA (77 ^ul, 0,5 mmoolia) lisättiin Z-pglu-his(OH):in (203 mg, 0,5 mmoolia) ja Gly(OSzl).pTos(OH):in (185 mg, 0,5 mmoolia) DMF:ssa (5 ml) 0°C:ssa.

DCC:a (133 mg, 0,55 mmoolia) DMF:ssa (2 mi) lisättiin sitten seokseen, lämpötila nesteitiin hitaasti huoneenlämpötilaan ja seosta sekoitettiin yli yön. Saostunut DCU suodatettiin noin ja senjäl-keen, kun liuotin oli haihdutettu tyhjössä, jäännös liuotettiin K20:en (5 ml) ja seos uutettiin CH2C12:11a (3 x 2 md). Kun orgaaninen liuotin oli haihdutettu, epäpuhdasta tuotetta (Rp (1 1) 0,25, UV +, CT +, P +) käytettiin, enempää puhdistamatta seuraavansa vaiheessa.

d) L~(pyro)glutamyyli-L-histidyyliglysiini(pGIu-His-Gly(OH))

Epäpuhdas Z-pGlu-His-Gly( OBzl)-tuote liuotett iin THF/H20 : en (1:1, 20 ml), Pd/C (100 mg) lisättiin ja H^-kaasua puhallettiin liuoksen Jäpi r .· o rma ali pa i n ··.· e s s a 1 turmin ajan. Reak-* iota seurattiin 15 64349 TLC:n avulla, joka osoitti että polaarisempaa tuotetta muodostui.

Kun reaktio oli saatu päätökseen, katalyytti suodatettiin pois ia liuotin haihdutettiin tyhjössä, jolloin jäljelle jäi jäännös, joka liuotettiin H^Chen. Vesifaasi uutettiin Cl-^Cl^ulla (3 χ 2 ml), .mikä poisti vähemmän polaariset sivutuotteet. Epäpuhdas tuote puhdistettiin py1väs k romat ograafisesti oiihappogeelillä (KG 6C (70-23C m.esh) ja käyttäen EtCH/H^O (7:3) eluointil iuott imena. Krorr.atograaf isesti puhtaan tuotteen saanto oli 104 ng (6 m %).

(S ä) 0,^5.

j.

Käin saadun synteettisen peptidin on osoitetr.u olevan identtinen useissa kromatograafisissä systeemeissä luonnollisen materi-aliin kanssa, joka on eristetty virtsasta edellä kuvatulla tavalla. Synteettisellä peptidillä on myös havaittu olevan, vertai lukeinoinen biologinen aktiivisuus.

Seuraavat farmaseuttiset esimerkit annetaan ainoastaan kuvaa-mistarkoituksessa. Sanonta "peptidi" tarkoittaa tässä esitetyn kaavan (I) peptidiä.

Esimerkki A

Ihonalaiseen ruiskutukseen tarkoitetut valmisteet.

Lääkepullot täytetään pakastekuivatulla peptidillä sen kahtena eri väkevyytenä.

Jokainen lääkepuilo sisältää:

Peptidiä G,G5 mg tai G,10 mg

Glysiiniä 5,0 mg

Jokaisen lääkepullon sisältö liuotetaan 1 ml:an isotonista ruiskeisiin tarkoitettua r.atriumkloridia ennen käyttöä.

Esimerkki B Tabletit Jokainen tabletti sisältää:

Peptidiä 0,1 mg

Maissitärkkelystä 24,G mg Laktoosia 80,0 mg

Gelatiinia .1 , s mg

Talkkia 6,0 mg

Magnesiumstearaa ttia 0,6 mg 16 64 34 9

Esimerkki C Nenätippaliuos tai suihke Liuoksen jokainen 1 ,C ir.1 sisältää:

Peptidiä 0,5 mg tai 1,0 ng

Eatriumkloridia 5,5 ng

NaH2?0i,· 2H20 5,2 mg

Na2H?C4*12H20 15,3 mg 3entsalkoniumkloridia 0,125 mg Steriiliä vettä ad 1,0 ml 1 annos eli 2-3 tippaa (tai vastaava suihkemäärä) sisältää 0,05-0,10 mg peptidiä.

Esimerkki D Peräpuikot Jokainen peräpuikko sisältää:

Peptidiä 0,1 mg tai 0,2 mg

Adept solidus (Witepsoi K. 15 ) 1,8 g

Esimerkki E Peräpuikot

Jokainen peräpuikko sisältää:

Peptidiä 0,1 mg tai 0,2 mg

Polyetyleeniglykolia 1500 1,2 g tai 1,1 g

Polyetyleeniglykolia 3000 0,5 g

Tislattua vettä 100,0 mg

Esimerkki F Peräruiske

Sisältö peräruisketta kohti:

Peptidiä 0,1 mg tai 0,2 mg

Fenyylikarbinolla 15,0 mg

Metyyiiselluloosaa 50,0 mg

Steriiliä vettä ad 2,0 ml.

li

Claims

17 64349 Menetelmä uuden terapeuttisesti käytettävän, kaavan I mukaisen L-pyroglutamyyli-L-histidyyli-glysiinin ja sen suolojen valmis-tamikseksi, P -N -- H (I) 1 L. ^ CO-NH-CH—CONH-CH -COOH I 2 H jossa pyroglutamyyli- ja histidyyliosat ovat L-sarjaa, tunnet-t u siitä, että a) poistetaan suojaryhmä(t) yhdisteestä, jolla on kaava —- N ! \\ / -N I-, R3 (II) ! I Γ2 0. CO-NH-CH-CONH-CH2-COR2 R1 jossa pyroglutamyyli- ja histidyyliosat ovat molemmat L-sarjaa, kumpikin ryhmistä R^ ja on vetyatomi tai aminoryhmää suojaava ryhmä ja R2 on hydroksyyliryhmä tai karboksyyliryhmää suojaava ryhmä, edellyttäen, että vähintään yksi ryhmistä R^, R2 ja R^ on suoja-ryhmä, tai b) annetaan yhdisteen, jolla on kaava ! > ---N ,__ H (Ula) JP =¾ 0. CO-NH-CH-COX 64349 18 jossa pyroglutamyyli- ja histidyyliosat ovat molemmat L-sarjaa ja X on hydroksyyliryhmä tai karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä, reagoida glysiinin kanssa, tai c) annetaan yhdisteen L-isomeerin, jolla on kaava f™ Ί i I (Va) N/\ 0. COX jossa X on hydroksyyliryhmä tai karboksyylihappoa aktivoiva ryhmä, reagoida yhdisteen L-isomeerin kanssa, jolla on kaava: Π --N H (vib) CH_ 1 2 NH2-CH-CONH-CH2-COOH minkä jälkeen näin saatu kaavan I mukainen yhdiste mahdollisesti muutetaan suolaksi. Il 19 64349 Förfarande för framställning av ett nytt terapeutiskt användbart L-pyroglutamyl-L-histidyl-glycin med formeln I ooh dess salter, |7~~ N i W ! / -'-N H (I)

1. CH0 i I

2 CO-NH-CH-CONH-CH2-COOH H väri pyroglutamyl- och histidyldelarna hör tili L-serien, kanne-t e c k n a t därav, att a) man avlägsnar skyddsgruppen (skyddsgrupper) frän en förening med formeln T---N /' --N R (ϊϊ) f CH2

3 CO-NH-CH-CONH-CH2~COR2 R1 väri pyroglutamyl- coh histidyldelarna bäda hör tili L-serien, var och en av grupperna R^ och R3 Sr en väteatom eller en aminoskydds-grupp och R2 är en hydroxylgrupp eller en karboxylskyddsgrupp, förutsatt, att atminstone en av grupperna R1, R2 och är en skydds-grupp, eller b) man omsätter en förening med formeln