FI64272C - Foerfarande foer framstaellning av naeringsmedel innehaollandeett i magtarmkanalen aktiverbat antibakteriellt system - Google Patents

Description

1 64272

Menetelmä ravintoaineiden valmistamiseksi, jotka sisältävät vatsa-suoliseudul.la aktivoituvan antibakteerisen järjestelmän Tämä keksintö kohdistuu menetelmään uusien ravintoaineiden valmistamiseksi, jotka sisältävät vatsa-suoliseuduila aktivoituvan antibakteerisen järjestelmän.

On tunnettua, että erityisesti lapset voivat saada vakavia maha-suoli-infektioita, jotka pääasiallisesti johtuvat E.coli'n ja erilaisten Salmonella-Lajien aiheuttamista infektioista. Ennestään tunnetut menetelmät näiden infektioiden eliminoimiseksi ovat siten käsittäneet antibioottien terapeuttisen määrän antamisen sillä uhalla, että muodostuu antibioottiselle aineelle resistenttejä bakteeri-kanto j a.

Nyt on yllättäen havaittu mahdolliseksi välttää nämä viimeksimainitut haitat ja ehkäistä ja/tai eliminoida tällaisia bakteeritartuntoja tämän keksinnön avulla, jolle on tunnusomaista se, että sinänsä tunnettuihin ravintoaineseoksi in lisätään antibakteerinen järjestelmä, joka sisältää ainakin 1 mg/k g ravintoainetta (50-5000 U/kg ravintoainetta) iaktoperoksidaasia, ainakin 16 ppm tiosyanaattia laskettuna natriumtiosyanaattina ja ainakin 21 ppm kiinteää, vesiliukoista peroksidiluovuttajaa, joka on alkaaliperkar-bonaatti, maa-aIkaliperoksidi tai karbamidiperoksidi, laske ttuna natriumperkarbonaattina.

Peroksidia luovuttavan aineen ja tiosyanaatin välinen rnolaarinen suhde on edullisesti pienempi kuin 4:1, edullisesti 1-2:1.

Eräässä suositussa suoritusmuodossa lisätään tiosyanaattia .160-3500, edullisesti 160-1750 ppm/kg ravintoainetta laskettuna NaSCN:ksi, peroksidia luovuttavaa ainetta määrässä 2 64272 210-4000, edullisesti 210-2000 ppm/kg ravintoainetta natri-umperkarbonaattina laskettuna ja laktoperoksidaasia 10-200, edullisesti 10-100 mg/kg ravintoainetta.

Tiosyanaatin määrä valitaan niin, että sen pitoisuudeksi ruoansulatusseudulla saadaan 0,1, edullisesti 0,2-0,4 mM, jolloin pitoisuus ei saa ylittää myrkyllisiä pitoisuuksia (10 mM) . Peroksidia luovuttavan aineen määrä valitaan niin, että saadaan ekvimolaarinen määrä :ta, so. niin, että muodostuneen H^C^rn pitoisuus yltää 0,1, edullisesti 0,2-0,4 nM:ään. Laktoperoksidaasin määrä riippuu entsyymin aktiviteetista, mutta olettaen, että 1 mg entsyymiä sisältää 50 yksikköä (U), on ainakin 1 mg entsyymiä oltava läsnä mahanesteen Litraa kohti.

Liuoksessa tiosyanaatin pitoisuus on siten 0,1, edullisesti 0,2-0,4 mM, peroksidia luovuttavan aineen pitoisuus on sellainen, että vetyperoksidin pitoisuus on 0,1, edullisesti 0,2-0,4 mM ja laktoperoksidaasin pitoisuus on 1 mg/1 (50 U/l) . Jälkimmäinen voi rnuös vaihdella mutta sen on oltava 1-2 mg/1 (50-100 U/l).

Yksi laktoperoksidaasiyksikkö on se määrä laktoperoksidaa-hih, 5oka muodostaa 1 mg pyrogalliinia pyrogallolista 80 sekunnissa pH-arvossa 6,0 ja 20°C:ssa.

Laktoperoksidaasin määrä nautaherassa (pastöroimaton) tai uLtrasuodatctussa herassa voi luonnollisesti vaihdella, fv'audan maito sisältää kirjallisuuden mukaan laktoperoksidaasia noin 30 mg/i, kun taas laktoperoksidaasin määrä ihmisen maidossa kirjallisuuden mukaan 1/30 naudan maidosta.

Keksintöä selostetaan alla lähemmin esimerkin avulla.

£simciKki

Pienille lapsille tarkoitettu velli valmistettiin seuraa- v i. st a a i.neksista 3 64272 50,;3 kg suolatonta hera jauhetta.

19.0 kg kuorittua maitojauhetta (Z 100 mg LP/kg) 14.0 kg rasvaseosta 8,0 ke laktoosia 7,5 kg hövrytettyä riisijauhetta __1,0 kg vitamiineja ja mineraaleja 100,0 kg 21 g natriumperkarbonaattia 16 g natriurr.tiosyanaattia

Ainekset sekoitettiin oerusteellisesti sekoittimessa. Kuiva velliseos liuotetaan veteen, jonka lämpötila on noin 30-3 5°·"; 10-15 %:seksi vesiliuokseksi (10-15 % kuiva-ainetta) ja annetaan noin 0,2 litran määrässä 4-5 kertaa päivässä.

Natriumperkabonaatin määrä tällaisessa vellissä voi vaihdella välillä 210-420 ppm ja natriumtiosyanaatin välillä 160-320, jolloin määrät edullisesti ovat ekviinolaarisia.

Yllä olevassa esimerkissä käytetty natriumperkarbonaatt.i on suojattu lilan aikaista reaktiota vastaan pääLlvstämäliä se n grunulaatti sellaisen polymeerin kerroksella, joka liukenee tai on läpäisevä vasta suoliseuduila.

Tällaisia suojaavia polymeerejä ovat vahat, selluloosa-ase -tantti., ftalaatti ja sellaiset polymeerit, jotka liukenevat tai läpäisevät suoli seudussa. Lisäksi voidaan käyttää kak-soisoäälIvstettä, jos ennen antamista suoritettava liettäni-?ien johtaisi ympäristöön, jossa polymeeri liukenee.

Biologinen vaikutus

Neljä 10 ml heraa sisältävää koeputkea, joissa oli 21 ppm (0,25 mM) natriumtiosyanaattia haudutettiin 30°C:ssa, joka hera oli ympätty Ps. Fluoresenssilla EF 1998. Yksi putkista oli kontrollina. Kolmeen muuhun koeputkeen lisättiin natri-umperkarbonaattia määrässä, joka vastasi 0,1, 0,2 ja 0,3 mM U 00. Bakteerien määrä määritettiin ympättäessä ja 2 tuntia ymppeyksen jä Ikeen. LaktoDeroksidaasia oli Läsnä 5 ^ug/ml. Tulokset on annettu alla olevassa taulukossa 1.

64272

Taulukko 1

Natriumperkarbonaattia Bakteerien lukumäärä/ml määrässä, joka vastaa _ . ~ mM H202 ° tuntia 2 tuntia

Kontrolli (0,0 mM) 2,1 · 106 2,1 · lO6 0,1 mM 2,1-106 1,8-105 0,2 mM 2,1 - 106 2,8 · 103 0. 3 mM 2,1-106 2,6-103

Kuten tästä nähdään saatiin voimakas parannus bakteerin-vastaisessa vaikutuksessa, kun 0,2 mM H202 tai enemmän on läsnä. Jo 0,1 mM:n H202 lisäys antaa kuitenkin voimakkaan bakteereja tappavan vaikutuksen.

Ps. fluoresenssia EF 1998 haudutettiin +30°C:ssa kahdessa koeputkessa 1) ja 2), jolloin putki 1) sisälsi 1. g kaupallista maidon korviketta, jossa oli 15 % uitrasuodatettua herajauhetta, 57 % herajauhetta, 8 % rasvaa, 16 % eläinproteiinia ja 4 % vitamiineja sekä mineraaleja 10 mlrssa vettä, jolloin se sisälsi 50 ^ug laktcperoksidaaseja ja 27,5 ppm natriumperkarbonaattia lisättiin siihen ja jolloin putki 2) sisälsi saman määrän maidon korviketta (50 ^ug laktoperoksidaasia) ja jolloin 21 ppm natriumtiosyanaattia ja 27,5 ppm natriumperkarbonaattia I isätri in.

Bakteerien lukumäärä koeputkissa on annettu alla olevassa taulukossa 2, jossa on annettu tulokset O, 2, 4 ja 6 tunnin 'a Ikeen.

5 64272

Taulukko 2 Näyte 0246 tuntia

Koeputki 1 4,5-106 3,5-106 5,3-106 6,0-106

Koeputki 2 4,5-106 3,5-105 5,3-104 5,6*l03

Kuten taulukosta ilmenee on bakteerien lukumäärä putkessa 2) 6 tunnin jälkeen ainoastaan 1/1000 koeputken 1/ määrästä samana ajankohtana, jolloin ei mitään tai ainoastaan vähäistä kasvua on tapahtunut koeputkessa 1), mutta sen sijaan on koeputkessa 2) bakteereja kuollut.

Bakteerinvastaisen järjestelmän vaikutusta määritettiin koelasissa. Tällöin erilaisia E.coli-kantoja haudutettiin +37°C:ssa vesiliuoksessa, jossa oli 5 g hera-jauhetta/100 ml, 21 ppm natriumtiosyanaattia ja natrium-perkarbonaattia määrässä, joka vastasi 0,25 mM H9°2* E.coli'n kuolintulos 2 tunnin jälkeen on annettu alla olevassa taulukossa 3.

Taulukko 3 E. coli-kanta Prosentuaalinen kuolema 0-139 299/66 >99,98 0-149 853/67 >99,98 0-138 355/67 >99,95 0-8 915/66 >99,99 0-147 949/66 >99,99 0-141 220/65 >99,99

Useat yllä testatuista E-coli-kannoista ovat vastustuskykyisiä antibiooteille. Tulokset osoittavat siten järjestelmän korkeaa sovellutusastetta.

Korkeasta novellutusasteestä on myös osoituksena se, että järjoste 1 mä I Iä on myös vaikutus qram-positilvi si in ta k t oe- ro 64272 E.coli'n 97Q3 vastaisessa testissä käytettiin vasikoille tarkoitettua maidon korviketta, jossa oli 45 paino-% kuorittua maitojauhetta (> 40 mg LP/kg), 22,5 paino-% herajauhetta, 12,5 paino-% soijajauhetta, 15,0 paino-% eläinrasvaa, 4,5 paino-% laktoosia ja 0,5 paino-% vitamiineja. Kantaa haudutettiin +37°C:ssa maidon korvikkeen 10 %:sessa vesiliuoksessa, jossa oli 5 ^ug/ml laktoperoksidaasia. Käytettiin kahta eri väkevyyttä natriumtiosyanaattia ja kolmea eri väkevvyttä H~0o:ta natriumperkarbcnaatin muodossa, kuten alla olevassa taulukossa 4 on esitetty.

Taulukko 4

Pitoisuus m.M;na Bakteerien lukumäärä/ml SCM K2^2 ^ tunn:i-n 2 tunnin jälkeen jälkeen 0,25 0 2,5-106 7,7-107 0,25 0,25 2,5-106 5,3-104 0,50 0 1,8-106 1,0-108 0,50 0,50 1,8-106 1,5-104

Kuten taulukosta 4 ilmenee antaa bakteerinvastainen järjestelmä voimakkaan bakteereja tappavan vaikutuksen molemmissa testatuissa pitoisuuksissa, samalla kun on osoite v-t u, että 3'IN ei sinänsä anna mitään vaikutusta, mutta bakteerien kasvu jatkuu, kun mitään peroksidia luovut ta-vaa ainetta ei o.Le läsnä. ^ j*'

Peroksidia luovut tava aine voi myös olla alkaiimet.«iiTLip-rsul faaiti, joka reaktiossa antaa vetyperoksidia - sulfaattia.

64272 Föreliggande uppfinning avser förfarande för framställning av nyn näringsmedel innehällande ett i mag-tarmkanalen akti -verbart antibakter.iel.lt system.

Det är t.idigare känt att speciellt barn kan drabbas av svara gastrointestinala infektioner som huvudsakligen härrör fran infektioner av E.coli och olika Salmonella-arter. Hittills kända sätt att eliminera dessa infektioner är därvid att t.Lil-föra terapeutisk mängd antibiotika, med ätföljande risk för uppkomsten av antibiotikaresistenta bakteriestammar.

Det bar nu överraskande visat sig möjligt att undvika dessa sistnämnda nackdeiar och att förebygga och/eller eliminera sädana bakterieinfektioner genom föreliggande uppfinning som karaktäriseras av att man till i och för sig kända närings-ämnessaTranansättningar tillsätter ett antibakteriellt system innehällande laktoperoxidas, i en mängd av ätrninstone ,1 mg/kg näringsmedel (50^-5000 U/kg näringsmedel, tiocyanat i en mängd av ätrninstone 16 ppm beräknat som natrxumtiocyanat och en fast, vattenlöslig peroxlddonator, som utgörs av alkaliperkarbonat, jordalkaliperoxid eller karbamidperoxid i en mängd av ätmins tone 21 ppm beräknac som natriumperkarbonat.

Dot mol era förhällandet mellan peroxiddonator och tiocyanat är företrädesvis mindre än 4:1, företrädesvis 1-2:1-

Enligt en föredragen utföringsform tillsätts tiocyanat i en mängd av 160-3500, företrädesvis .160-1750 ppm/kg närincsmodo.l beräknat som NaSCN, peroxiddonatorn i en mängd av 210-4000, företrädesvis 210-2000 ppm/kg näringsmedel beräknat som nntrium-perkarbonn.t och laktoperoxidas i en mängd av 10-200, förcträdos-vis 10-100 mg/kg.

Mängden tiocyanat väljs sä att man i digestionskanalen uppnär en koncentration av 0,1, företrädesvis 0,2-0,4 mM, varvi.d kon-centiationen ej skall överstiga toxiska koncentrationer (10 m.M) . Mängden peroxiddonator väljs sä att en ekvimolär mängd H 2°2 erhäils, dvs. att koncentrationen av bildad 0,1, företrädesvis 0,2-0,4 mM. Laktoperoxidasmängden be/.or 8 64272 pa enzymets aktivitet, men baserat pa ett antagande att 1 mg enzym halier 50 enheter (U), bör minst 1 mg enzym inga per liter digestionsvätska.

T en lösning är sälunda tiocyanatkoncentrationen 0,1, före-trädesvis 0,2-0,4 mM, peroxiddonatorkoncentrationen sadan att väteperoxidkoncentrationen är 0,1, företrädesvis 0,2-0,4 mM, sarat laktoperoxidaskoncentrationen 1 mg/1 (50 U/l) . Den senare kan ocksa varieras men bör vara 1-2 mg/1 (50-100 U/l}.

En laktopercxidasenhet är den mängd laktoperoxidas, som bildar 1 mg pyrogallin av pyrogallol under 80 sekunder vld pH-värdet 6.0 och 20°C.

Mängden laktoperoxidas i vassle frän bovin mjölk (opastöri-serad) eller i ultratiltrerad vassle kan helt naturligt variera. Bovin mjölk innehailer laktoperoxidas enllgt litteraturen i en mängd av ca 30 mg/1, tnedan mängden laktoperoxidas 1 människo-mjölk enllgt litteraturen är 1/30 av den 1 bovin mjölk.

Uppfinningen beskriys i det följande närmare med hjälp av ett exempel.

Exempel

En välling avsedd for smä barn framställdes frän följande ingredienser 50,5 kg avsaltat vasslepulver 19.0 kg skummjölkpulver (z. 100 mg LP/kg) 14.0 kg fettblandning 8,0 kg laktcs 7,5 kg ängpreparerat rismjöl 1,Vitäminen och mlneraler 100.0 kg och ?] g nevriumperkarbonat 16 g natriumitiocyanat 9 64272

Ingredienserna blandades väl i en blandare. Den torra vailing--blandningen loses i vatten med en temperatur av 30-35°C som en .10-15 % vattenlösning (10-15 % torrsubstans) och ges i e.: mängd av ca 0,2 liter 4-5 ganger om dygnet.

Mängden natriumperkarbonat kan varieras i en sadan vailing mellan 210-420 ppm och mängden natriumtiocyanat mellan 160-320 ppm, varvid mängderna är företrädesvls ekvimolära,

Den i exemplet ovan använda natriumperkarbonaten har skyddats mot för tidig reaktion genom att granulat därav överdragits med ett först i tarmkanalen lösligt-permeabelt skikt av en polymer .

Sadana skyddande polymerer är vaxer, cellulosaacetat, ftalai: samt liknande i tarmkanalen löslxga-permeabla polymerer.

Vidare kan dubbelskikt användas om en uppslamnlng fore admi-nistrering skulle ge en polymerlösande miljö.

Biologisk e£ fekt

Fyra provrör innehällande 10 ml vassle med irmehall av 21 pom (0,25 mM) natriumtiocyanat xnkuberades vxd 30°C, vaarvid vass.'len inokulerats med Ps. fluorescens EF 1998. Ett rör utg;crae kontroll. Natriumperkarbonat motsvarande 0,1, 0,2 respektive 0,3 mM H202 satfes till respektive övriga tre rör. Mängden oakterier bestämdes vid inokuleringen samt 2 timmar efter inokuleringen. Laktoperoxxdas var närvarande i en mängd av 5 /jg/ml. Resultatet framgär av tabell 1 nedan.

/

Tabell 1

Natriumperkarbonat i en Antal bakterier/ml mängd motsvarande min H2C>2 0 tim 2 tim

Kontroll (0,0 mM) 2,1 · 10^ 2,1 * 10^ 0,1 mM 2,1 · 106 1,8 · 105 0,2 mM 2,1 · 106 2,8 103 0,3 mM 2,1 * 106 2,6 - 1C3 10 64272

Som framgar därav sker en inarkant förbättring av den anti-bakteriella effekten da 0,2 mM ei-ler rasr finns närvarande.

Redan tillsatsen av 0,1 mM 9er en markant baktericid effekt.

Ps. fluorescens EF 1998 inkuberades vid +30°C i tvä provrör 1) och 2), varvid rör 1) innehäll lg av en kommersiell mjölk-ersättningsprodukt bestäende av 15 % ultra?iltrerat vassle-pulver, 57 % vasslepulver, 8 % fett, 16 % animaliskt protein, samt 4 % vitaminer och mlneraler i 10 ml vatten, varvid den innehöll 50 ^ug laktoperoxidas samt tillsattes natriumperkar-bonat 27,5 ppm och varvid rör 2) innehöll samma mängd mjölker-sattningsmedel, (50 ^ug laktoperoxidas), samt tillsattes 21 ppm natriumtiocyanat och 27,5 ppm natriumperkarbonat.

Mängden bakterier i provrören framgär av nedanstaende tabeli 2 dSr resultatet efter 0, 2, 4 och 6 timmar framgär,

Tabeli 2

Prov 0246 timmar provrör 1 4,5 · 106 3,5 . 106 5,3 * 106 6,0 · 106 Provrör 2 4,5-106 3,5-105 5,3-104 5,6 * 103

Som framgar av tabellen är mängden bakterier i rör 2) efter G timmar endast 1/1000 av mängden i rör 1) vid samma tidpunkt, varvid ingen eller ringa tillväxt skett i provrör 1) utan i stället avdödning skett i provrör 2).

Det antibakteriella systemets effekt bestämdes in vitro. Dar--vid inkuberades olika E.coli stammar vid +37°C ien vattenlös-ning av 5 g vasslepulver/100 ml, 21 ppm natriumtiocyanat och natriiimperkarbonat i en mängd motsvarande 0,25 mM ^2^2 ’ ^esu·*·" tat av E.coli-avdödningen efter 2 timmar framgar av nedanstaende tabeli 3.

64272 11

Tabell 3 E. coli-stam Procentuell avdödning 0-139 299/66 >99,98 0-149 853/67 >99,98 0-138 355/67 >99,95 0-8 915/66 >99,99 0-147 949/66 >99,99 0-141 220/65 > 99,99

Flera av de testade E. coli-stammarna är antibiotikaresistenta. Resultaten utvisar en mycket hög användningsgrad för systemet.

Hög användningsgrad föreligger även genom att systemet utövar effekt även pä gramposltiva bakterier.

I en test mot E.coli 9703 användes en för kalvar avsedd miclk-ersättningsprodukt innehäl,lande 45 vikt-% skummjölkspxilver (> 40 mg LP/kg), 22,5 vikt-% vasslepulver, 12,5 vikt-% soja-pulver, 15,0 vikt-% animaliskt fett, 4,5 vikt-% laktos och 0,5 vikt-% vitaminer. Stammen inkuberades vid +37°C i en 10 vattenlösning av mjölkersättningsraedlet innehallande 5 ^ug/ml .1 aktoperoxidas. ^vs olika koncentrationer av natriurntiocyanat ooh tre oi ikä koncentrationer av i natriumperkarbonat torni användes, säsom av nedanstaende tabell 4 framgär.

Tabell 4

Kone e n hr at i o n j jmM Antal bakteri.er/ml SCI·: H„0,. efter 0 tim efter 2 tim z 2 0,25 0 2,5 · 106 7,7 * 107 0,25 0,25 2,5 * 106 5,3 * 104 0,50 0 1,8 · 106 1,0 * 108 0,50 0,50 1,8 · 106 1,5 * 104 12 64272

Som av tabell 4 framgär ger det antibakteriella systemet en kraftig baktericid effekt via de bada testade koncentrationerna samtidigt son det pavisas at SCN i och för sig ej har nagor. effekt, utan bakterietillväxten fortsätter da ingen peroxid-donator är närvaratade,

Pej:oxiddonatorn kan ocksa utgöras av ett alkaliraetallpersulf at, som vid reaktionen ger väteperoxid och sulfat.

Claims (9)

64272

1. Menetelmä ravintoaineiden valmistamiseksi, jotka sisältävät vatsa-suoliseudulla aktivoituvan antibak-teerisen järjestelmän, tunnettu siitä, että sinänsä tunnettuihin ravintoaineseoksiin lisätään antibakteerinen järjestelmä, joka sisältää ainakin 1 my/kg ravintoainetta (50-5000 U/kg ravintoainetta) laktooeroksidaas i a , ainakin 16 ppm tiosyanaattia laskettuna natriumtiosya-naattina ja ainakin 21 ppm kiinteää, vesiliukoista peroksidiluovuttajaa, joka on alkaaliperkarbonaatti, maa-alkaaliperoksidi tai karbamidiperoksidi, laskettuna natriumperkarbonaattina.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- n e t t u siitä, että käytetään puhtaassa muodossa olevaa laktoperoksidaasia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään laktoperoksidaasia laktoperoksidaasia sisältävän maitotuotteen muodossa.

4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä, t u n-n e t t u siitä, että kiinteä, vesiliukoinen peroksidi-1 .icvuttaja on natriumperkarbonaatti.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t. u n-n ett u siitä, että raemuodossa oleva natriumperkarbonaatti päällystetään suolistossa liukenevalla s uo j a ke rro k sella.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, t u n- n a t t u siitä, että suojakerros on selluloosa-asetaat-tiftalaatti. 14 64272

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-n e t t u siitä, että peroksidiluovuttajan ja tio-syanaatin moolisuhde on pienempi kuin 4:1, edullisesti 1-2:1.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 160-3500 ppm, edullisesti 160-1750 ppm tiosyanaattia, 210-4000 ppm, edullisesti 210-2000 ppm peroksidiluovuttajaa, ja 10-200 mg/kg, edullisesti 10-100 mg/kg laktoperoksidaasia.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peroksidiluovuttaja on magnesium-peroksidi.