FI59815C - Foerfarande foer framstaellning av en alfa-amylas-inhibitor med peptidstruktur - Google Patents

Description

-Ά rBl KUULUTUSjULKAISU C Q β 1 C

lBJ <11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 5 9815 C <4S> Patcri t "rv; J "leili, " .....

* * (51) Kv.ik.Vci.3 C 12 P 21/00, C 07 G 7/00

SUOMI — FINLAND (21) P»Mnttlh»kemu« — Pattnuniöknlni 78ll0U

(22) Hakamiipllvl — Antöknlnpdif 11.OU.78 ^ (23) Alkup&ivt—Gllti(h«ttdag ll.OU.78 (41) Tullut JulklMktl — Bllvlt off«ntll| 12.10.79 _ 1 (44) Nlhtlvikslpanon ja kuuLJulkaltun pvm. — .

Patent· och registerstyraisen x ' Anattkan utlagd och utl.*krtftan publkarad 30.06.81 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus— B«flrd prloritet (71) Hoechst Aktiengesellschaft, D-6230 Frankfurt/Main 80, Saksan Liitto- t as avalt a-Förbun dsrepubliken Tyskland(DE) (72) Volker Oeding, Kelkheim (Taunus), Werner Pfaff, Hofheim am Taunus,

Laszlo Vertesy, Epps tein/Taunus, Hans-Ludwig Weidenmiiller, Hofheim am Taunus, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) • (7U) Oy Kolster Ab (5U) Menetelmä peptidirakenteisen OC-amylaasi-inhibiittorin valmistamiseksi -Förfarande för framställning av en C£-amylas-inhibitor med peptidstruktur

Keksinnön kohteena on menetelmä peptidirakenteisen 0(-amylaasi-inhibiitto-rin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään Streptomyces tendae-kantaa U158 (ATCC n:o 31210) viljelyväliaineessa, joka sisältää vähintään yhden hiililäh-teen ja yhden typpilähteen ja epäorgaanisia suoloja, ja että viljelmästä eristetään tavanomaisella tavalla inhibiittori, jolla on molekyylipaino 5000-10 000, absorp-tiomaksimi UV-valossa kohdassa 276 nm, isoelektrinen piste U,U ja seuraava aminohappokoostumus : asparagiinihappoa 5-6 isoleusiinia 1-2

treoniinia 5-6 leusiinia 3-U

seriiniä 3-5 tyrosiiniä U-5 glutamiinihappoa 5-6 fenyylialaniinia 0-2 proliinia 2-3 histidiiniä 1-2 glysiiniä 5-6 lysiiniä 0-1 alaniinia 5-6 arginiinia 2-3 kysteiiniä 3-U ' tryptofaania 1-2 valiinia 5-6 2 59815

On tunnettua valmistaa glykosidihydrolaasi-inhibiittoreita vehnästä (FI-patenttijulkaisu li-9 309). Näillä inhibiittoreilla on peptidirakenne.

DE-hakenmsjulkaisusta 20 6U 092 tunnetaan amylaasi-inhibiittorien valmistus mikro-organismeista, varsinkin aktinomyseeteistä. Tässä DE-julkaisussa on mainittu k^si inhibiittoriryhmää. Toinen ryhmä kuuluu kemialliselta luonteeltaan oligo-tai polysakkarideihin ja toisen ryhmän kohdalla on kysymyksessä trypsiinin vaikutuksesta hajoavat polypeptidit, joiden inhibiittoriaktiviteetti amylaasia vastaan on suotuisimmassa tapauksessa 80 AIY/mg. DE-hakemusjulkaisussa 2 702 Ul7 on esitetty glykopeptidi, joka antaa joillakin reagensseilla sokerin positiivisen värireak-tion, mutta ei anna Folin-Ciocalteun-peptidireagenssilla peptidien positiivista reaktiota; happamella hydrolyysilla voitiin tosin osoittaa lysiini.

Streptomyces flavochromogenes-kannasta n:o 280 on eristetty peptidityyppi-nen amylaasi-inhibiittori (US-patenttijulkaisu 3 8θ6 k2l). Se on glykopeptidi, joka sisältää happohydrolyysin perusteella neljä aminohappoa: glutamiinihappoa, aspargiinihappoa, seriiniä ja alaniinia. Se on jopa 1-n suolahapossa pysyvä 15 min. ajan, kun taas 1-n natriumhydroksidiliuoksessa 100°C:ssa se tulee nopeasti tehottomaksi. Se on tehokas entsyymi-inhibiittori. Julkaisussa Chem. Abstr. voi. 83 (1975), 176 706 n on kuvattu Streptomyces fradiae FERM-P2303~kannasta saatu hapan polypeptidi, joka ei myöskään ole irreversiibeli inhibiittori. Mainitussa julkaisussa ei ole kuvattu amfoteerista, irreversiibeliä o^-amylaasi-inhibiittoria, jolla on peptidiluonne. Kirjallisuudessa ei ole aikaisemmin kuvattu 0(-amylaasi-inhibiittorin eristämistä Streptomyces tendae tyyppikannasta ATCC 19812. Sen sijaan tiedetään, että Streptomyces tendae ATCC 19Ö12 tuottaa antibioottia (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edit. 197^, p. 780).

Nyt on löydetty Streptomyces tendae kannan U158 käymispanoksista erittäin aktiivinen haimasta saatavan Ot-amylaasin inhibiittori.

Inhibiittorille on tunnusomaista molekyylipaino 5 000 - 10 000, absorptio-makasimi UV-valosaa kohdassa 276 nm, isoelektrinen piste ja jäljempänä esitetty aminohappokoostumus.

Keksinnön mukaisen inhibiittorin molekyylipaino on melko suuri. Se ei diffundoidu tai diffundoituu vain erittäin vähäisessä määrin kaupallisten dialyy-simembräänien, kuten Visking -membraanien, lävitse. Tarkan molekyyli-painon määrääminen on vaikeaa ja erilaisilla määritysmenetelmillä saadaan erilaisia tuloksia. Jos molekyylipainon määritykseen käytetään analyyttistä ultra-sentrifugia (Biochemisches Taschenbuch, 196U, 2. osa, sivut 7^6-767» saadaan noin 10 000 olevia arvoja. Jos sitä vastoin käytetään molekyyliseulaa, kuten Sephadexv ' G-50 superfein, saadaan molekyylipainoksi 5 000 tai jopa vielä alhaisempi arvo. Nykyisin käytettävissä olevien tutkimustulosten mukaan katso- λ taan molekyylipainon olevan 5000-10 000.

Keksinnön mukainen yhdiste on väritön aine. Se absorboi kuitenkin ultra-violettia valoa maksimikohdan ollessa 276 nm, jossa kohdassa 281 nm on olka.

3 59815 1 ί E, = 16. Absorptiospektn on esitetty kuviossa 1.

1 cm

Inhibiittori on kemiallisen luonteensa perusteella peptidi. Se voidaan erottaa hydrolyysin avulla aminohapoiksi. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole onnistuttu osoittamaan aminohappojen lisäksi muita komponentteja. Määritettäessä aminohappokoostumus menetelmän mukaan, joka on esitetty julkaisussa St. Moore ja W.H. Stein (Methods in Enzymology, osa VI, sivut 819_831 , Colovick ja Kaplan, Academic Press, New York, London 1963)» saadaan seuraava koostumus: asparagiinihappo 5-6 treeniini 5-6 seriini 3-5 glutami inihappo 5~6 proliini 2-3 alaniini 5-6 glysiini 5-6 kysteiini 3-^ väliini 5-6 isoleusiini 1-2 tyrosiini U-5 fenyylialaniini 0-2 histidiini 1-2 lysiini 0-1 arginiini 2-3 tryptofaani 1-2

Tryptofaanin arvo arvioitiin ultraviolettivalon absorption mukaan. On luonnollista, että aminohappotutkimuksen tulokset eivät aina tarkoita yhtä ainoata, kokonaislukua olevaa määräsuhdetta, ja että tämän tapaisiin mittauksiin yleensä liittyy määrättyjä virheitä. Siten eivät luettelossa esitetyt vaihtelurajat tarkoita inhibiittorin epäyhtenäisyyttä, vaan analyysimenetelmään pakostakin liittyvää mittausepätarkkuutta. Keksinnön mukaiselle inhibiittorille on luonteenomaista, että aminohapot asparagiinihappo, glutamiinihappo, treoniini, glysiini, alaniini ja väliini muodostavat peptidin keksimääräistä suuremman molekulaarisen osuuden ja että metioniini näyttää puuttuvan puhtaasta aineesta kokonaan. Koska metioniini on erittäin yleinen aminohappo, on sen täydellinen puuttuminen hyvä tunnusmerkki keksinnön mukaiselle inhibiittorille ja tätä voidaan käyttää myös erikoisesti rikastusmenetelmässä tuotteen puhtauden määrittämiseen.

Keksinnön mukainen inhibiittori reagoi positiivisesti peptidireagensseihin, mutta negatiivisesti fenolirikkihappoon.

Keksinnön mukainen oL-amylaasi-inhibiittori ei sisällä sokerikomponenttia. Tämän perusteella, samoin kuin aminohappokoostumuksensa, molekyylipainonsa ja isoelektrisen pisteensä perusteella se eroaa kaikista tunnetuista o^-amylaasi- £ inhibiittoreista. Puhtaan inhibiittorivalmisteen aktiviteetti on 2-3 x 10 AIY/g.

u 59815

Peptidirakenteiseksi aineeksi on keksinnön mukaisen amylaasi-inhibiittorin terminen stabiliteetti huomattavan hyvä. Vieläpä keittäminen neutraalissa tai heikosti happamessa väliaineessa (pH noin U-8) minuutin ajan ei vaikuta mainittavasti sen glukoosihydrolaasia estäviin ominaisuuksiin.

Pepsiinin» trypsiinin tai kymotrypsiinin vaikutuksesta inhibiittori muuttuu muihin proteiineihin verrattuna vain erittäin hitaasti proteolyyttisesti inaktiiviseksi. Terapeuttisena vaikutusaikana ei siten ole odotettavissa aktiviteetin mainittavaa laskua ruuansulatuskanavassa.

Inhibiittorin vaikutusspesifisyys on suuri. Haimasta saatu -amylaasi inhiboituu erittäin voimakkaasti, kun sitä vastoin bakteeriset °G-amylaasit, esimerkiksi Bacillus subtilis mikro-organismista saadut, eivät inhib.oidu mitat-tavasti. Samoin ei ole havaittu vaikutusta /^-amylaaseja vastaan.

Jo pienet annokset keksinnön mukaista amylaasi-inhibiittoria aiheuttavat haiman amylaasin entsymaattisen aktiivisuuden täydellisen eston. Tätä havaintoa ei voida selittää klassisten estomekanismien avulla, jolloin entsymaattisen katalyysin esto riippuu inhibiittorin ja alustan (tärkkelyksen) välisestä määräsuh-teesta. Pikemminkin on oletettava haiman amylaasin irreversiibeli inaktivoituminen keksinnön mukaisen inhibiittorin vaikutuksesta.

Amylaasi-inhibiittorin valmistukseen käytetään keksinnön mukaisesti Streptomyces tendae-kantaa U158. Tämä kanta eroaa alkuperäisestä S. tendae-kan-nasta ATCC 19Ö12. (Ettlinger et ai., Arch. Mikrobiol. 31, 351 (1958)) itiö-morfologiansa suhteen. Itiöt ovat pallomaisia ja niiden läpimitta on 1 mikro-1 metri. Kannan ominaisuudet ovat seuraavat:

Substraattihuovaston väri: keltaisenruskea, ei värimuutosta pH-siirtymän vaikutuksesta

Itiöpitoisen ilmahuovas- harmaanruskea (heikosti harmahtava punaisenruskea; ton väri: ISCC methods of designating colors)

Itiöketjujen morfologia: Retinaculum apertum (RA)

Itiömorfologia: pallomaisia itiöitä, joiden keskimääräinen läpimitta on 1 ^ua. Sileä tai hieman syylämäinen pinta

Melaniinimuodostus pep-toniväliaineessa: positiivinen

Nitraattipelkistys: positiivinen

Substraatinkäyttöspektri: glukoosi ++ arabinoosi + sakkaroosi + ksyloosi + inositoli + mannitoli ++ fruktoosi + ramnoosi ++ raffinoosi +- selluloosa 5 5981 5

Kanta Streptomyces tendae U15Ö on talletettu American Type Culture Collection'iin (ATCC) deponointinumerolla 31210, lukuunottamatta edellä esitettyjä eroja vastaa kannan Streptomyces tendae ATCC 31210 kuvaus alkuperäisen S. tendae-kannan kuvausta (Ettlinger & ai., Arch. Mikrobioi). 3J_, s. 351-352, 1958.

Viljely voidaan suorittaa 25-35°C:ssa, edullisesti 28-30°C:ssa, joko submers-sina ravisteluviljelmänä tai eri suuruisissa viljelyastioissa sekoittaen ja ilmastaen.

Viljelyaineeksi on erikoisen sopiva hiili- ja typpilähteiden yhdistelmä. Tällai nen viljelyaine sisältää mikro-organismien viljelyssä tavanomaisesti käytettyjen epäorgaanisten suolojen lisäksi vähintään yhden hiililähteen, kuten tärkkelystä, glukoosia, ruokosokeria, fruktoosia, laktoosia, glyseriiniä tai melassia sekä vähintään yhden typpilähteen, kuten soijajauhoa, maissinliuotusnestettä, hiivauutetta, puuvilla-siemenjauhoa, maapähkinäjauhoa, peptonia, maitojauhetta, nitraatteja tai ammonium-suoloja.

Hiililähteiden hyväksikäyttö on esitetty julkaisussa Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edit., s. 772, 197^·

Optimaaliseksi koostumukseksi on osoittautunut: (paino-# liuoksessa) 3-5 % liukenevaa tärkkelystä, 0,2-0,6 % maissinliuotusnestettä, 0,5-1,5 % glukoosia, 0,5-1 % (NH^J^HPO^, 0,3-0,6 % soijajauhoa, 0,5-1,5 % kaseiinipeptonia. Myös käytettäessä muita tärkkelyspitoisia ravintoväliaineita, esimerkiksi koostumusta, joka sisältää 2-6 % maapähkinäjauhoa, 1-3 % perunatärkkelystä, 3-5 % kaurajauhoa, 3-5 % maitojauhetta, 1-2 % herasiirappia, 1-2 % maitosokeria, saadaan amylaasi-inhibiittoria hyvinä saantoina, jolloin typpilähteen ja puskurikomponentin valinta, mikäli pysytään fysiologisella alueella, ei ole niin merkittävä. Jos kuitenkin tärkkelyspitoisuutta vähennetään tai se poistetaan kokonaan, alenee inhibiittorin saanto voimakkaasti.

Jos toisaalta tärkkelyspitoisuutta nostetaan oleellisesti 7 #:n yläpuolelle, ei suuren viskositeetin vuoksi mikro-organismien hapen saanti ole optimaalinen. Tästä johtuen inhibiittorin saanto laskee.

Käymispanoksessa alkaa inhibiittorin muodostuminen säännöllisesti 10. ja 30. tunnin välillä viljelyn alkamisesta. Seuraavien 20 tunnin aikana se etenee oleellisesti loppuun. Pitemmällä viljelyajoilla ei ole haitallista vaikutusta inhibiittorin saantoon, se ei kuitenkaan nouse enää mainittavasti. Tästä johtuu, että viljelyä on suoritettava noin 30-70 tunnin ajan.

Inhibiittorin eristämiseksi poistetaan solumassa viljelyliuoksesta linkoamalla, suodattama!la tai imusuodatuksen avulla, koska suurin osa vaikutusaineesta on säännöllisesti kirkkaassa viljelynesteessä.

Jos erikoisten viljelyolosuhteiden vuoksi osa inhibiittoria jää solumate-riaaliin, ei ole vaikeaa poistaa siitä vaikutusainetta sopivien menetelmien avulla, esimerkiksi sekoittamalla veden kanssa sekoittuvan orgaanisen liuottimen kanssa, jolloin solumassan lisäliuottaminen on eduksi. Uutosaineeseen liuotettu , 59815 6 vaikutusaine voidaan erottaa linkoamalla tai suodattama-! la liukenemattomista solu-aineista ja käsitellä sitä, kuten kirkasta viljelynestettä.

Viljelynesteestä voidaan inhibiittori eristää proteiini- ja peptidikemiassa sinänsä tunnetuilla tavoilla. Siten voidaan käyttää seostamista veden kanssa sekoittuvien orgaanisten liuottimien, kuten asetonin, isopropanolin tai muiden alempien alkoholien avulla tai suolojen, kuten ammoniumsulfaatin avulla.

On edelleen mahdollista absorboida inhibiittori sopivaan kantajaan, esimerkiksi aktiivihiileen ja poistaa tämä suodattamalla tai linkoamalla vesiliuoksesta. Tämä voi tapahtua laajalla, välillä 2 ja 10 olevalla pH-alueella, pH-arvo on kuitenkin edullisesti h-6. Voidaan käyttää myös ioninvaihtajia keksinnön mukaisen oi-amylaasi-inhibiittorin erottamiseen. Koska halutulla aineella on sekä happamia että emäksisiä ominaisuuksia, se on siis amfoteerinen ja se voi reagoida sekä kationi- että anionivaihtajan kanssa ja se voidaan poistaa niiden avulla viljelyliuoksesta. Tällöin voidaan käyttää menetelmiä, joiden periaatteet on esitetty ioninvaihtajia käsittelevässä luvussa kirjassa Biochemisches Taschenbuch, julkaissut H.M. Rauen, Springer-Verlag '\96k) 2. Teil, sivut 808-82U.

Käsiteltäessä viljelypanoksia, jotka sisältävät keksinnön mukaista ainetta viljelyliuoksessa, on usein tarkoituksenmukaista väkevöidä se. Tällöin voidaan käyttää tunnettuja menetelmiä, kuten tislausta, ultrasuodatusta, ruiskutus- tai jäädytyskuivausta tai muita tunnettuja menetelmiä. Siten saadusta tiivisteestä inhibiittori voidaan sitten erottaa edellä esitetyillä tavoilla. Rikasteista, jotka vastaavat tiivistettyjä viljelysuodoksia, voidaan inhibiittori saada myös siten, että poistetaan oleelliset epäpuhtaudet. Rasvamaisten aineiden poistamiseen soveltuu uuttaminen orgaanisilla liuottimilla. Dialyysin tai haluttaessa ultrasuodatuksen avulla (C.J.O.R. ja P. Morris "Separation methods in Biochemistry", Ditman Publishing, London 1976, sivut 9^-950) voidaan liuos puhdistaa pienimolekyylisistä aineista. Suurimolekyyliset aineet, kuten nukleiinihapot, polysakkaridit tai useat valkuaisaineet voidaan erottaa jakosaostuksen avulla muodostamalla suola tai lisäämällä veden kanssa sekoittuvaa liuotinta, kuten asetonia tai alempaa alkoholia. Saostusaineen lisäys annostellaan näissä tapauksissa siten, että helposti saostuvat aineet, joiden molekyylipainot ovat suurempia kuin 100 000, saostuvat, kun taas o<-amylaasi jää liuokseen. Esitettyjä rikastusvaiheita voidaan yhdistellä ja vaihdella valinnanvaraisessa järjestyksessä. Tällä tavoin saadaan liuoksia, joihin inhibiittori on voimakkaasti rikastunut.

τ 59815

Loppupuhdis tus voidaan suorittaa erilaisilla tarkoituksenmukaisilla menetelmillä, kuten geeli- tai ioninvaihtokromatografiaa käyttäen tai vastaavilla menetelmillä, joiden erotusperiaate ei pelkästään perustu ioninvaihtoon, kuten esimerkiksi erottamalla hydroksyyliapatiitilla. Edelleen voidaan käyttää liuotinta! suolasaostuksia, preparatiivista elektroforeesia tai muita sinänsä tunnettuja menetelmiä. Erikoisen sopivia ovat erottamiset dietyyliaminoetyyli-(DEAE)-ryhmiä sisältävillä ioninvaihtajilla sekä jakosaostukset ammoniumsulfaatilla tai etanolilla, jolloin saadaan jopa kiteistä materiaalia.

Keksinnön mukaisen inhibiittorin ominaisuudet ovat mielenkiintoisia sen käytön suhteen terapeuttisena aineena sokeritaudin ja sokeritaudin esivaiheen sekä liikalihavuuden hoidossa ja ruokavalion tukiaineena.

Tärkkelyspitoiset ravinto- ja nautintoaineet aiheuttavat eläimessä ja ihmisessä verensokerin nousua ja siten myös haiman insuliinin lisääntyvää erittymistä. Hyperglykemiaa esiintyy tärkkelyksen hajotessa ruuansulatuskanavassa amylaasin ja maltaasin vaikutuksesta glukoosiksi.

Diabeetikoilla on tämä hyperglykemia erikoisen voimakas ja pitkäaikainen.

Lihavilla ihmisillä vaikuttaa kasvanut insuliinin erittyminen lipogeneesiin ja alentaa lipolyysiä.

Alimentääristä hyperglykemiaa sekä hyperinsuliininemiaa voidaan tärkkelyksen nauttimisen jälkeen vähentää keksinnön mukaisen amylaasi-inhibiittorin avulla. Tämä vaikutus riippuu annoksen suuruudesta. Keksinnön mukaista amylaasi-inhibiittoria voidaan siten käyttää terapeuttisena aineena sokeritaudissa, sokeritaudin esivaiheessa ja liikalihavuustapauksissa sekä ruokavalion tukemiseen.

Tällöin on erikoisen soveliasta nauttia sitä ruoka-aikoina. Annostus, joka on sovitettava potilaan painon sekä yksittäisen tarpeen mukaan, on noin 10 000-300 000 AIY:tä, se voi kuitenkin rajoitetuissa yksittäistapauksissa olla joko sitä suurempi tai pienempi.

Keksinnön mukainen amylaasi-inhibiittori soveltuu erikoisesti oraaliseen annostukseen. Sitä voidaan käyttää puhtaana aineena tai myös farmaseuttisena valmisteena käyttäen lisäksi tavanomaisia apu- ja kantaja-aineita.

Ifyös yhdistetty käyttö muiden lääkeaineiden, kuten verensokeria alentavien tai lipidejä alentavien aineiden kanssa voi olla edullista. Koska suurimolekyy-liset peptidit sellaisinaan eivät lainkaan tai eivät mainittavassa määrässä resor-boidu ruuansulatuskanavasta, ei keksinnön mukaisella aineella ole odotettavissa toksikologisesti arveluttavia sivuvaikutuksia. Tavanomaisen aminohappokoostumuksen 8 59815 vuoksi ovat myös mahdolliset proteolyyttiset hajoamistuotteet vaarattomia. Täten annosteltaessa amylaasi-inhibiittoria oraalisesti suuria määriä koe-eläimille, ei havaittu erikoisia oireita. Myöskään annosteltaessa suonensisäisesti hiirille (1 g/kg) keksinnön mukaista inhibiittoria, ei 2k tuntia kestäneen tarkkailuajan kuluessa havaittu toksikologista vaikutusta.

Amylaasi-inhibiittorin farmakologisen vaikutuksen tutkimiseksi annosteltiin ruokkimattomille, urospuolisille Wistar-rotille, joiden paino oli välillä 200-250 g, keksinnön mukaista estoainetta samanaikaisesti 2 g:n kanssa tärkkelystä kg:a kohti ruumiinpainoa oraalisesti, minkä jälkeen suoritettiin välittömästi verinäytteen otto lähtöverensokeriarvon määräämiseksi. Verinäytteitä otettiin edelleen 15 ja 30 minuutin sekä 1, 2, 3 ja 5 tunnin kuluttua häntäsuonesta. Verensokerin määritys suoritettiin Hoffman'in menetelmän mukaan autoanalysaattorissa (J. Biol. Chem. 120, 51 (1937).

NZO-hiirillä esiintyy häiriytynyt glukoosinsieto. Ne soveltuvat siten erikoisen' hyvin tutkimuksiin, joissa vaikutetaan verensokeritasoon. Koejärjestely oli sama kuin rotilla. Verinäytteiden otto tapahtui orbitaalisuoniverkostosta. Verensokeritason kulkua seurattiin yli kolme tuntia.

Vastaavalla tavalla suoritettiin vaikutusaineen tutkimus NMRI-hiirillä. Verinäytteiden otto suoritettiin myös orbitaalisuoniverkostosta ja verensokeri-tason kulkua seurattiin yli kolme tuntia.

Näissä kokeissa esiintyi keksinnön mukaisella inhibiittorilla käsitellyillä eläimillä käsittelemättömiin eläimiin verrattuna vähäisempi, viivästynyt verensokerin nousu.

Amylaasikoe

Amylaasi-inhibiittoriyksiköksi (AIY) määritellään se inhibiittorimäärä, joka koeolosuhteissa pystyy estämään kaksi amylaasiyksikköä (AY) 50-#:sesti. Amylaasiyksikkö on kansainvälisen sopimuksen mukaan entsyymimäärä, joka hajottaa yhdessä minuutissa 1 μ-ekvivaltentin glukosidisia sidoksia tärkkelyksessä. Hajor tettujen glukosidisten sidosten ;u-val-arvo määrätään pelkistävän sokerin ,μ-val-arvona fotometrisesti dinitrosalisyylihapon kanssa. Tulokset on laskettu^μ-mooleina maltoosia, jotka määritetään maltoosikalibrointikäyrän avulla.

Kokeet suoritettiin seuraavasti: od-amylaasia, joka oli saatu sianhaimasta, ja tutkittavaa liuosta esiinkuboi-daan yhdessä 1,0 ml:ssa 20 mM fosfaattipuskuria, pH 6,9 + 10 mM NaCl 10-20 minuuttia 37°C:ssa. Entsymaattinen reaktio käynnistetään lisäämällä 1,0 ml liuke- 9 59815 nevaa tärkkelystä Zulkowski'n mukaan (0,25 % käytetystä puskurista). Tarkalleen 10 minuutin kuluttua keskeytetään reaktio 2,0 ml:11a dinitrosalisyylihappo-väri-reagenssia (Boehringer Mannheim'in mukaan: Biochemica-information II) ja kuumennetaan värin kehittämiseksi viisi minuuttia kiehuvassa vesihauteessa. Jäähdytyksen jälkeen mitataan ekstinktio kohdassa 51+6 nm reaktiokomponenttien tyhjäarvoa vastaan. 50-%:inen esto määrätään vertaamalla inhiboimattomaan entsyymireaktioon lisäämällä erilaisia inhibiittorimääriä graafisesti todennäköisyysmenetelmän avulla.

Esimerkki 1

Streptomyces tendae kantaa 1+158 ympätään vinoputkissa seuraavan koostumuksen omaavaan ravintoalustaan: 50 g kaurahiutaleita ad. 1 000 ml H20 pHA =7,2 • ... . O .....

Ympättyjä putkia inkuboidaan seitsemän vuorokautta 30 C:ssa ja niitä pidetään sitten +l+°C:ssa, Itiöt virutetaan pois vinoista putkista 10 ml:11a steriloitua tislattua vettä tai fysiologisella NaCl-liuoksella. 1,0 ml suspensiota käytetään 300 ml:n erlenmeyer-pullon ymppäämiseen, johon on pantu 35 ml steriloitua ravintoliuosta, jonka pH-arvo on 7.7 ja koostumus: 1 % glukoosia 1 % soijajauhoa 0,25 % NaCl pH 7,7

Pulloa ravistellaan ravistelukoneessa nopeudella 220 "rpm +30°C:ssa amplitudin ollessa k cm 1+8 tuntia. Sitten siirretään kulloinkin 5 ml tätä esiviljelmää useampiin erlenmeyer-pulloihin, joihin on pantu kuhunkin 35 ml steriloitua ravinto-liuosta pH-arvon ollessa 8,3. Tämän pääviljelmän koostumus on seuraava: 1+ % tärkkelystä 0,k % maissinuutosliuosta 1.0 % glukoosia 0,8 % (NHj^HPO^ 0,1+ % soijajauhoa 1.0 % peptonia pH^ 8,3 Pääviljelmiä ravistellaan myös +30°C:ssa nopeudella 220 rpm ravistelukoneessa amplitudin ollessa 1+ cm 2-3 vuorokautta. Ensimmäisenä, toisena ja kolmantena viljelypäivänä määrätään «k-amylaasi-inhibiittorin pitoisuus koeohjeen mukaan.

Kanta Streptomyces tendae 1+158 antaa esitetyissä koe- ja viljelyolosuhteissa keskimäärin 100 AIY/ml pH-arvon ollessa lopussa 5,2.

l0 5981 5

Esimerkki 2

Panos on kuten esimerkissä t, mutta valitaan kokonaistilavuudeltaan 300 litran käymisastia, johon on pantu 200 litraa steriloitua, seuraavan koostumuksen omaavaa ravintoliuosta: l+ % tärkkelystä 0,k % maissinuutosliuosta 1.0 % glukoosia 0,8 % (NH^KPO^ 1.0 % kaseiinipeptonia 0,1 % Desmophen' ,(polyeetteri, valmistaja Bayer AG, Leverkusen) PHa 8,3-8,5

Sterilointiaika panosta varten on 1+5 minuuttia 121°C:ssa ja 1 baarin paineessa, jolloin glukoosi steriloidaan erikseen ja käymisliuoksen käyttölämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen se lisätään steriilisti.

Steriloinnin jälkeen täytyy pH-arvon olla 6,8 ja se säädetään tarvittaessa steriloidulla hapolla (2 n H^PO^) tai emäksellä (2 n NäOH) tähän arvoon. Päävaihe ympätään 20 litralla, mikä vastaa 10 % esimerkissä 1 esitettyä ja kokonaistilavuudeltaan 30 litran pienviljelylaitteessa valmistettua esiviljelmää.

Viljelyä suoritetaan 50-70 tuntia 30°C:ssa. Ilmastus on 6 m^/h sekoittaen nopeudella 250 rpm ja ylipaineen ollessa 0,3 baaria.

Ottamalla näytteitä seurataan ja valvotaan käymisen kulkua inhibiittorin aktiviteetin, substraatin hajaantumisen, biomassan muodostumisen ja viljelyliuok-sen fysikaalis-teknisen käyttäytymisen suhteen (pintajännitys, viskositeetti, tiheys, osmoottinen paine).

Maksimaalinen inhibiittorin aktiivisuus saavutetaan 60 viljelytunnin jälkeen ja se on keskimäärin 105 AIY/ml. Käymisastian sisältö siirretään sitten jatkokäsittelyyn.

Esimerkki 3

Panos on sama kuin esimerkissä 1 ja esimerkissä 2, päävaiheena käytetään kuitenkin kokonaistilavuudeltaan !+ 000 litran bioreaktoria, johon on pantu 2 500 litraa seuraavaa ravintoliuosta: 6 % tärkkelystä 1.0 % glukoosia 0,1+ % maissinuutosliuosta 0,8 % (NHU)2HP0u 1.0 % soijapeptonia 0,1 % Desmophen pHA 7,0-7,3 5981 5 11

Sterilointiaika tätä panosta varten on 60 minuuttia 121°C:ssa ja 1 baarin paineessa, mutta glukoosi steriilisuodatetaan erikseen ja lisätään käymisliuoksen käyttölämpötilaan jäähtymisen jälkeen siihen steriileissä olosuhteissa.

Tarvittaessa säädetään pH-arvo steriilillä hapolla (H^PO^) tai emäksellä (NaOH) alkuarvoon 7>0-7»3.

Ymppäys suoritetaan 200 litralla esimerkissä 2 esitettyä ja valmistettua esiviljelmää,

Viljelyaika on 70 tuntia, jolloin viljellään 30°C:n lämpötilassa ilmastuksen ollessa 60 Nm"3/h, ylipaineen 0,5 baaria ja nopeuden 1Ö0 rpm.

Ottamalla näytteitä - kuten esimerkissä 1 - seurataan kaikkia tärkeitä prosessi-, organismi- ja aktiivisuusarvoja koko viljelyajan.

70 tunnin viljelyn jälkeen on saavutettu keskimääräinen aktiivisuus' 95 AIY/ml. Viljely lopetetaan tällöin ja viljelyliuos siirretään jatkokäsittelyyn.

Esimerkki U

10 litraa suodatettua viljelynestettä, jonka aktiivisuus' on 1Q0 AIY/ml, kuivataan ruiskukuivauslaitteessa, jolloin saadaan UOO g vaaleanruskeaa jauhetta. Tälle suoritetaan sitten perusteellinen rasvanpoisto seoksella, joka sisältää 1 litran metanolia ja 1 litran kloroformia ja suodatetaan sitten imun avulla. Vielä liuo-tinkostea liukenematon tuote, joka sisältää vaikutusaineen, liuotetaan 3 litraan vettä, sen pH säädetään arvoon 6,5 ja lisätään ^,5 litraa metanolia. Tällöin muodostuu vaalea, hiutalemainen sakka, joka erotetaan linkoamalla ja hävitetään, koska se sisältää vain merkityksettömän määrän od-amylaasi-inhibiittoria. Meta-nolisaostuksessa saatu tumma yläpuolinen osa, joka sisältää halutun inhibiittorin, vapautetaan metanolista tyhjössä ja dialysoidaan sitten 2,5 litraksi väkevöityä liuosta suolavapaaksi tislattua vettä vastaan. Retentaatti sisältää 9 g kuiva-ainetta (ominaisaktiviteetti 96 AIY/mg). Retentaatti saatetaan sitten pH-arvossa 5,5 ammoniumsulfaatilla 50 %:n kyllästystilaan, jolloin tarvitaan 250 ml varten 79 g suolaa. Suolaa lisättäessä muodostuu sakka, joka sisältää noin 90 % aktiivisesta aineesta. Linkoamisen jälkeen hävitetään yläpuolinen osa. Sakka liuotetaan uudestaan tislattuun veteen ja pH-arvossa 8 lisätään uudestaan ammoniumsulfaattia, mutta tällä kerralla ensin 15 $:n kyllästykseen ja sakan poistamisen jälkeen edelleen 35 $:n kyllästykseen. Sakka, joka muodostuu suolaa lisättäessä 15—35 prosentin välillä, sisältää amylaasi-inhibiittorin pääosan. Tämä jakosaostus toistetaan.

12 5981 5

Saatua tuotetta on dialyysin ja kuivauksen jälkeen 360 mg ja sen ominais-aktiivisuus 992 AIY/mg. 350 mg tätä raaka-ainetta erotetaan ja rikastetaan sitten käyttäen Sephadex v ; G-50 fine 100 cm pitkässä ja 1,2 litran vetoisessa lasipyl-väässä. Lähde- ja eluointiaineena käytetään vesipitoista 5 millimolaarista fosfaat-tipuskuriliuosta, jonka pH on 8 ja johon on lisätty 0,02 % natriumatsidia. Raaka-aine liuotetaan 15 mlraan samaa puskuria ja pannaan pylvääseen. Eluointi tapahtuu kahden vuorokauden aikana, jolloin otetaan 15 ml:n suuruiset jakeet. Neljä aktii-visinta jaetta yhdistetään, dialysoidaan suolavapaiksi ja jäädytyskuivataan. Saadaan 60 mg valkoista jauhetta, jonka aktiivisuus on 2520 AIY oC-amylaasi-inhibiittori /mg.

Esimerkki 5 2 200 litraa viljelynestettä jäähdytetään 6°C:seen ja lisätään 2 % pii-maata sekä suodatetaan kammiopuristimen avulla. Suodoskakku (noin 1+50 kg kosteana) hävitetään, kirkas suodos (1 750 litraa, aktiviteetti 95 AIY/ml) väkevöidään 500 g:n suuruisen natriumatsidimäärän lisäämisen jälkeen pudotusvirtaushaihdutti-messa 120 litran tilavuuteen. Saatu konsentraatti jäähdytetään 1°C:seen ja siihen lisätään hitaasti 120 litraa esijäähdytettyä asetonia sekoittaen. Saostumisen saamiseksi täydelliseksi, sekoitetaan vielä 1/k tuntia ja 1 kg:n piimaalisäyksen jälkeen selkeytetään levypuristimessa. Kiinteä aine suodatusapuaineen kanssa hävitetään. Asetonipitoiseen suodokseen, joka sisältää vaikutusaineen, sekoitetaan jäähdyttäen 380 litraa asetonia, jolloin saadaan noin 80-$:nen asetonisus-pensio. Muodostunut (2..) sakka sisältää halutun amylaasi-inhihiittorin. Se otetaan talteen siten, että saostusliuoksen annetaan seistä sekoittamatta. Tällöin sakka laskeutuu pohjaan ja yläpuolella oleva neste voidaan poistaa. Tämän toisen asetonisaostuman yläpuolella olevasta nesteestä voidaan erottaa pieniä saosmääriä linkoamalla. Tämä kiinteä aine liuotetaan pH-arvossa 7 ja lisätään sakan liuokseen (katso seuraavassa). Saostusastiaan jäänyt pääsakka liuotetaan pH-arvossa (r) 7 120 litraan vettä ja muodostunut liuos selkeytetään läpivirtauslingossa (Cepal , valmistaja Karl Padberg, Zentrifugenbau GmbH, Lahr/Schwarzwald, 1 700 rpm).

Tällöin poistetaan 90 g inaktiivisia leijuvia osasia. Kirkas vesifaasi väkevöidään sitten DDS-ultrasuodatuslaitteen avulla, valmistaja De Danske Sukkerfabrikker Aktieselskapet, Nakskov, Danmark (membraani n:o 800) 15 litraksi ja dialysoidaan. Suolanpoiston saamiseksi täydelliseksi, retentaatti laimennetaan tislatulla vedellä ja väekvöidään uudestaan. Kaksi- tai kolmekertaisen toiston jälkeen on retentaatti, joka sisältää amylaasi-inhibiittorin, käytännöllisesti katsoen suolaton. Retentaatin 50 litran liuoksesta saostetaan sitten inhibiittori pH-arvos-sa 5>5 lisäämällä 19,5 kg ammoniumsulfaattia, sakka poistetaan linkoamalla ja ylä- 13 Γ* Λ Λ ^ 3 y ö ί b puolinen neste hävitetään. Sakka liuotetaan uudestaan 1+0 litraan vettä ja saoste-taan tällä kertaa pH-arvossa 7»5 12,5 kg:11a ammoniumsulfaattia, Kirkkaan faasin putkilingossa erottamisen jälkeen saostetaan fraktioivasti, kuten esimerkissä 1+; 1+0 litrasta uudestaan liuotettua ainetta ensin pH-arvossa 5,5 lisäämällä 3,2 kg ammoniumsulfaattia inaktiivinen sakka, joka erotetaan ja hävitetään. Väkevöimällä nestemäinen faasi uudestaan erotetaan nesteestä 7,1+ kg:11a ammoniumsulfaattia pääosa aktiivisesta aineesta. Tämä sakka kootaan,diälysoidaan tislattua vettä vastaan ja jäädytyskuivataan. Saadaan 11U g ruskeaa jauhetta, jonka aktiivisuus on 1 100 AIY/mg.

Jatkoerotusta varten täytetään lasipylvästä, jonka läpimitta on 5 cm ja (R) korkeus 50 cm (tilavuus noin 1 1), DEAE-Sephadex A-25 7 (dekstraaniperustainen ioninvaihtaja, valmistaja Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) täytteellä, joka on etukäteen säädetty pH-arvoon 7,5 1/30-molaarisella fosforipuskurilla ja tasapainotettu 0,02 $:sella natriumatsidilla. Sitten 10 g ainetta liuotetaan 100 ml:aan samaa puskuria ja siirretään pylvääseen. Ensin pestään pylväs 1 litralla samaa puskuria, sitten tähän eluointiaineeseen sekoitetaan vähitellen keittosuolaa, niin että taataan jatkuva gradientti. Otettaessa poisto pylväästä talteen jakeittain, on amylaasi-inhibiittori niissä jakeissa, joissa NaCl-pitoisuus on noin 0,5-molaarinen.

Nämä jakeet kootaan ja dialysoidaan tislattua vettä vastaan. Jäädytyskui-vauksessa saadaan 5,6 g vaaleanruskeaa jauhetta, jonka aktiviteetti on 2 200 AIY/mg.

Tämän jälkeen suoritetaan vielä geelikromatografinen puhdistus, kuten esimerkissä U on esitetty. 5,6 g:sta materiaalia saadaan i+,1 g väritöntä jauhetta, jonka aktiviteetti on 2 800 AIY/mg. Tuotteen aminohappoanalyysi antaa 20-tuntisen suolahappohydrolyysin jälkeen Beckman-multikrom-analysaattorin avulla seuraavan koostumuksen: asparagiinihappo 7,72 % metioniini 0,U1 % treoniini 7,66 % isoleusiini 2,30 % seriini 5,35 % leusiini 5,1 δ % glutamiinihappo 10,05 % tyrosiini 10,2U % proliini 3,1+3 % fenyylialaniini 3,35 % glysiini 1+,93 % histidiini 3,01 % alaniini 5,81+ % lysiini 1,1+5 % 1/2 kysteiini 1+,26 % arginiini 5,16 % väliini 7,72 %

Claims (3)

5981 5 lU

1. Menetelmä peptidirakenteisen Οί-amylaasi-inhibiittorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään Streptomyces tendae-kantaa 1*158 (ATCC n:o 31210) viljelyväliaineessa, joka sisältää vähintään yhden hiililähteen sekä yhden typpilähteen ja epäorgaanisia suoloja, ja että viljelmästä eristetään tavanomaisella tavalla inhibiittori, jolla on molekyylipaino 5000 - 10 000, absorptiomaksimi UV-va-lossa kohdassa 276 nm, isoelektrinen piste ja seuraava aminohappokoostumus: asparagiinihappoa 5-6 isoleusiinia 1-2 treoniinia 5-6 leusiinia 3-*+ seriiniä 3-5 tyrosiiniä U-5 glutamiinihappoa 5-6 fenyylialaniinia 0-2 proliinia 2-3 histidiiniä 1-2 glysiiniä 5-6 lysiiniä 0-1 alaniinia 5-6 arginiinia 2-3 kysteiiniä 3-^ tryptofaania 1-2 väliinia 5 -6

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ravintoaine sisältää 3-5 % liukoista tärkkelystä; 0,2-0,6 % maissinuutosliuosta; 0,5-1,5 % glukoosia; 0,5-1 % NagHPO^; 0,3-0,6 % soijajauhoa ja 0,5-1,5 % kaseiini-peptonia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ravintoaine sisältää 2-6 % maapähkinäjauhoa; 1-3 % perunatärkkelystä; 3-5 % kaura-jauhoja; 3-5 % herajauhoa; 1-2 % herasiirappia ja 1-2 % maitosokeria.