FI56751C

FI56751C - FOERFARANDE FOER BESTAEMNING AV KALCIUMHALTEN I BLOD

Info

Publication number: FI56751C
Application number: FI781483A
Authority: FI
Inventors: Markus Sandholm
Original assignee: Orion Yhtymae Oy
Priority date: 1978-05-11
Filing date: 1978-05-11
Publication date: 1980-03-10
Also published as: DK193179A; FR2425642A1; NO791570L; DE2918335A1; SE7903631L; FI56751B; AU4683379A

Description

F55F1 [B] (11)KUULUTUSjULKAISUF55F1 [B] (11) NOTICE OF ADVERTISEMENT

Ma l j i ; utlAggningsskrift bb /b 1 C Patentti ftyörjr..· tty 10 -3 1933Ma l j i; utlAggningsskrift bb / b 1 C Patent ftyörjr .. · tty 10 -3 1933

Patent meddelat / (51) Kv.lk.Vlnt.CI.· 6 01 I 33/16 SUOMI —FINLAND (21) P»t*nttlh«k*mu$ — P»t«ntmn*öknlnj 7Ö1U83 (22) Htktmitpllvi — Aiueknlngadaf 11.05*78 (23) Alkupllvft —Glltifhattdif 11.05-78 (41) Tullut julkltaksl — Bllvlt offuntllg 12.11.79Patent meddelat / (51) Kv.lk.Vlnt.CI. · 6 01 I 33/16 FINLAND —FINLAND (21) P »t * nttlh« k * mu $ - P »t« ntmn * öknlnj 7Ö1U83 (22) Htktmitpllvi - Aiueknlngadaf 11.05 * 78 (23) Alkupllvft —Glltifhattdif 11.05-78 (41) Tullut julkltaksl - Bllvlt offuntllg 12.11.79

Patentti· Ja raklstarlhailitu. (44) NlhtivlkllpMien ,t kuuLJullutoun pvm.-Patent · And raklstarlhailitu. (44) Date of issue, date and date of issue.

Patent· och reglsterstyrelaan ' Antektn utiagd och utUkrWwn publkarad 30.11.79 (32)(33)(31) Pyydttty etuoikeus--Begird prlorltet (71) Orion-Yhtymä Oy, Nilsiänkatu 10-lU, 00510 Helsinki 51, Suomi-Finland(Fl) (72) Markus Sandholm, Helsinki, Suomi-Finland(Fl) (7k) Fermion Oy, Patenttiosasto (5I+) Menetelmä verenkalsiumtason määrittämiseksi - Förfarande för bestämning av kalciumhalten i blodPatent · och reglsterstyrelaan 'Antektn utiagd och utUkrWwn publkarad 30.11.79 (32) (33) (31) Claimed privilege - Begird prlorltet (71) Orion-Yhtymä Oy, Nilsiänkatu 10-lU, 00510 Helsinki 51, Finland-Finland (Fl ) (72) Markus Sandholm, Helsinki, Finland-Finland (Fl) (7k) Fermion Oy, Patenttiosasto (5I +) Method for determining blood calcium levels - Förfarande för bestämning av kalciumhalten i blod

Keksinnön tarkoituksena on esittää uusi pikamenetelmä veren kalsium-tason määrittämiseksi.It is an object of the invention to provide a new rapid method for determining the level of calcium in the blood.

On olemassa ihmisten ja eläinten sairauksia, joissa oireiden syynä on veren epänormaali kalsiumpitoisuus. Oikean hoitotavan määräämiseksi on kalsiumtaso pystyttävä määrittämään nopeasti ja luotettavasti. Erityisesti kun on kysymys eläimistä, on taudin määrityksen tapahduttava mieluimmin paikan päällä. Keksinnön mukainen menetelmä on - kehitetty nimenomaan tätä silmälläpitäen.There are diseases in humans and animals where the symptoms are caused by abnormal levels of calcium in the blood. In order to determine the correct treatment, calcium levels must be able to be determined quickly and reliably. Especially in the case of animals, the diagnosis should preferably be made on the spot. The method according to the invention has been - developed specifically with this in mind.

Mayer, G. P. et ai. (3. Am. Vet. Med. Ass. 146/8, 839-842) ovat kuvanneet määritysmenetelmän, joka perustuu etyleenidiamiinin tetra-asetaatin (EDTA) kykyyn kelatoida kalsium ja siihen, että veren hyytymismekanismi riippuu vapaista Ca^+-ioneista. Koe suoritetaan siten, että joukko koeputkia, joissa on nouseva määrä EDTA:ta, täytetään verellä. Koska koaguloituminen tapahtuu vain niissä koeputkissa joissa on ylimäärä kalsiumia, voidaan veren kalsiumpitoisuus määrittää. Koe on kuitenkin hankala suorittaa ja on vaikea määrittää milloin hyytyminen on koeputkisarjassa loppunut ja mikä koeputkista .vastaa 2 56761 oikeaa kalsiumpitoisuutta, koska ekvivalenttipiste on epäselvä, mikä ilmeisesti johtuu siitä, että veren proteiiniin sitoutunut kalsium vapautuu suhteellisen hitaasti.Mayer, G. P. et al. (3. Am. Vet. Med. Ass. 146/8, 839-842) have described an assay method based on the ability of ethylenediamine tetraacetate (EDTA) to chelate calcium and the fact that the mechanism of blood coagulation depends on free Ca 2+ ions. The experiment is performed by filling a series of test tubes with an increasing amount of EDTA with blood. Because coagulation occurs only in test tubes with excess calcium, blood calcium levels can be determined. However, the experiment is cumbersome to perform and it is difficult to determine when clotting has stopped in a series of tubes and which of the tubes corresponds to the correct calcium concentration of 56761 because the equivalent point is unclear, apparently due to the relatively slow release of calcium bound to the protein in the blood.

Tämä keksintö kuvaa uuden pikamenetelmän, jossa lyhyessä ajassa saadaan selvä ekvivalenttipiste ja jonka avulla voidaan päätellä onko veren kalsiumpitoisuus yli tai alle määrätyn raja-arvon.The present invention describes a new rapid method in which a clear equivalent point is obtained in a short time and by means of which it can be determined whether the blood calcium level is above or below a certain limit value.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä verinäytteen kalsium sidotaan ylimäärällä EDTA:ta. Tämä seos lisätään määrättyyn määrään ka 1 siumion eja tai tähän seokseen lisätään määrätty määrä ka Isiumion eja. Se määrä EDTA:ta, joka ei kulunut veren kalsiumin kelatoimiseen reagoi nyt kal-siumionien kanssa. Jos kaikki Ca^+-ionit sitoutuvat EDTA:n kanssa, ei tapahdu koaguloitumista, jos taas Ca^+-ioneja jää sitoutumatta, " tapahtuu hyytyminen.In the method of the invention, the calcium in a blood sample is bound by an excess of EDTA. This mixture is added to a certain amount of ca 1 silicon or a certain amount of silicon is added to this mixture. The amount of EDTA that was not used to chelate blood calcium now reacts with calcium ions. If all Ca 2+ ions bind to EDTA, no coagulation occurs, while all Ca 2+ ions remain unbound, "coagulation occurs.

Koe suoritetaan yhdessä koeputkessa, jossa on ylimäärä EDTA:ta.The test is performed in one test tube with excess EDTA.

Tähän voidaan käyttää erilaisia EDTA:n suoloja, mutta edullisemmaksi on nopean liukenevaisuutensa takia osoittautunut kaliumsuola. Koeputki on varustettu asteikolla, mikä vastaa veren eri kalsiumpitoisuuksia. Kokonaisverta tai plasmaa lisätään koeputkeen raja-arvon asteikkoa vastaava määrä. Sekoitetaan hyvin ja seos lisätään määrättyyn määrään kalsiumioneja tai seokseen lisätään määrätty määrä kalsiumioneja, esim. kalsiumkloridia, ja jotain hyytymistä nopeuttavaa ainetta, esim. tromboplastiinia (valmistettu naudan aivoista].Various salts of EDTA can be used for this, but a potassium salt has proven to be more preferred due to its rapid solubility. The test tube is equipped with a scale that corresponds to different levels of calcium in the blood. Whole blood or plasma is added to the test tube in an amount corresponding to the cut-off scale. The mixture is mixed well and a certain amount of calcium ions is added to the mixture, or a certain amount of calcium ions, e.g. calcium chloride, and a coagulation accelerator, e.g. thromboplastin (made from bovine brain) are added to the mixture.

Viidessä minuutissa on ekvivalenttipiste saavutettu. Jos käytetty EDTA-määrä pystyy sitomaan kaiken kalsiumin, sekä veressä olleen että lisätyn, ei näyte koaguloidu ja se jää juoksevaksi, mikä tarkoittaa sitä, että veren kalsiumtaso on alhaisempi kuin valittu raja-arvo. Jos sensijaan näyte sisältää vapaita kalsiumioneja, käynnistyy koaguloitumismekanismi ja näyte hyytyy tai siinä esiintyy hyytymiä eli veren kalsiumtaso on korkeampi kuin valittu raja-arvo.In five minutes the equivalent point is reached. If the amount of EDTA used is able to bind all the calcium, both present and added, the sample will not coagulate and will remain fluid, which means that the calcium level in the blood will be lower than the selected limit. Instead, if the sample contains free calcium ions, the coagulation mechanism is triggered and the sample clots or clots, i.e. the blood calcium level is higher than the selected limit.

Vaihtelemalla EDTA- ja verinäytemäärää sekä lisättävien kalsium-ionien määrää voidaan valita eri kalsiumpitoisuuksia vastaavia raja-arvoja. Yksinkertaisimmaksi on osoittautunut verinäytemäärän vaihtelu. Se voidaan helposti tehdä varustamalla koeputki täyttömerkein, jotka vastaavat tiettyjä veren kalsiumpitoisuuksia. On luonnollisesti 3 56761 edullisinta valita sellaiset vertailuarvot, jotka ovat lähinnä kriittisiä veren kalsiumpitoisuuksia: 9 mg/100 ml seerumia (2.25 mmol/lit.) ja 8 mg/100 ml seerumia (2.00 mmol/lit.).By varying the amount of EDTA and blood samples as well as the amount of calcium ions to be added, limit values corresponding to different calcium concentrations can be selected. Variation in the number of blood samples has proven to be the simplest. This can easily be done by equipping the test tube with fill marks that correspond to certain blood calcium levels. It is, of course, most preferred to select reference values that are closest to the critical blood calcium levels: 9 mg / 100 ml serum (2.25 mmol / l) and 8 mg / 100 ml serum (2.00 mmol / l).

Mikäli raja-arvoksi valitaan naudan plasman kalsiumpitoisuus 8 mg/100 ml ja näytteenä käytetään 10 ml:aa kokoverta, jonka hyytyminen estetään 10.1 mg:11a K^EDTA^h^O (25.0 μΜ), voidaan naudan keskimääräisen hema-tokriitin mukaan (33.5 %) laskea tarvittava kalsiumlisäys, joksi saadaan 11.7 juM Ca, mikä vastaa 1.72 mg CaCl2· 2(^0.If the limit is chosen to be 8 mg / 100 ml of bovine plasma and 10 ml of whole blood is prevented from coagulating with 10.1 mg of K ^ EDTA ^ h ^ O (25.0 μΜ), the mean bovine hematocrit (33.5 %) calculate the required calcium addition to give 11.7 μM Ca, which corresponds to 1.72 mg CaCl2 · 2 (^ 0.

" Arvioitaessa tarvittavia reagenssimääriä on lähdetty verisolujen tila- vuusarvosta 33,5 tilavuusprosenttia ja siitä, että seerumin kalsium-pitoisuuden ollessa 6 mg/100 ml sisältää 1 ml kokonaisverta 40 /jg ^ kalsiumia, mikä vastaa 1 jjmol/ml:n pitoisuutta. 0os tähän lisätään 1 ml 0,001 N EDTA-liuosta, saavutetaan ekvivalenttipiste eli kaikki kalsium kelatoituu."In estimating the amounts of reagents required, the starting point is 33.5% by volume of blood cells and that at a serum calcium concentration of 6 mg / 100 ml, 1 ml of total blood contains 40 .mu.g of calcium, which corresponds to a concentration of 1 .mu.mol / ml. 1 ml of 0.001 N EDTA solution is added, an equivalent point is reached, i.e. all calcium is chelated.

Jos verinäytteen ja EDTArn seos lisätään kalsiumiin, tarvitaan kokeen suorittamiseen kaksi koeputkea. Jos taas lisäys tapahtuu päinvastoin, voidaan pipetoinnin välttämiseksi suorittaa lisäys kiinteässä muodossa, kuten pulverina tai pillerinä.If a mixture of blood sample and EDTA is added to calcium, two test tubes are required to perform the test. If, on the other hand, the addition takes place in reverse, the addition can be carried out in solid form, such as a powder or a pill, to avoid pipetting.

Raja-arvon valinta riippuu siitä mitä diagnostoidaan. Esimerkiksi haluttaessa varmistua lehmän veren alhaisesta kalsiumtasosta valitaan raja-arvoksi 9 mg%. Jos taas halutaan määrittää veren kalsiumtaso muiden sairauksien takia,(esimerkiksi lihasrappeutumassa tai septi-w sessä kolimastiitissa pienikin ylimäärä kalsiumia voi olla hengen vaarallinen), valitaan raja-arvoksi 8 mg%.The choice of limit value depends on what is being diagnosed. For example, to ensure a low level of calcium in the blood of a cow, a limit of 9 mg% is chosen. If, on the other hand, it is desired to determine the level of calcium in the blood due to other diseases (for example, in muscle degeneration or septic colitis, even a small excess of calcium can be life-threatening), choose a limit of 8 mg%.

Esimerkki 1Example 1

Naudan hypo kalsemian osoittaminenDemonstration of bovine hypo calcemia

Koeputki A, jossa on EDTAjta, täytetään verellä, suoraan suonesta, valittuun raja-arvoon asti (8 tai 9 mg%). Putkea käännellään 20 kertaa, ei saa ravistaa, sillä vaahto estää testin tulkintaa. Lasi-ampulliin B, jossa on kalsiumkloridia ja tromboplastiinia, lisätään noin 10 tippaa tislattua vettä ja ravistetaan. Veri-EOTA-seos kaadetaan koeputkesta A lasiampu11iin B. Ampulli suljetaan ja sekoitetaanTest tube A with EDTA is filled with blood, directly from the vessel, up to the selected limit (8 or 9 mg%). The tube is inverted 20 times and must not be shaken, as the foam will interfere with the interpretation of the test. To glass vial B with calcium chloride and thromboplastin, add about 10 drops of distilled water and shake. The blood-EOTA mixture is poured from test tube A into glass ampoule B. The ampoule is sealed and mixed

Claims

4 S6751 flipped up and down 20 times. The ampoule is allowed to stand for 5 minutes, after which the clotting is checked by turning the ampoule horizontally. If the sample has clotted, then the calcium value of the sample exceeds the selected limit value, while if the sample is fluid, its calcium value falls below the selected limit value and the bovine has hypocalcemia. In field trials (a total of 159 trials), the trial has been shown to be simple and reliable in determining stroke. When the corresponding sera were analyzed by atomic absorption spectrophotometry, it was found that 100% certainty is obtained if a tolerance of -0.5 mg / 100 ml is allowed. The difference between the calorific values obtained by the two methods is mainly due to variations in the hematocrit. The method of the invention measures blood or plasma calcium levels, while classical methods measure serum or plasma calcium levels.

A method for determining blood or plasma calcium levels based on the ability of ethylenediamine tetraacetate to chelate calcium and the fact that the mechanism of blood coagulation depends on free calcium ions, characterized in that blood calcium is bound with excess ethylenediamine tetraacetate and agent.

Process according to Claim 1, characterized in that a sodium or potassium salt is used as the ethylenediamine tetraacetate.

Process according to Claim 1, characterized in that calcium chloride is used as the calcium.

Process according to Claim 1, characterized in that thromboplastin is used as the coagulation accelerator.