FI124927B - Adenovirus vectors and methods and uses thereof - Google Patents
Adenovirus vectors and methods and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- FI124927B FI124927B FI20105991A FI20105991A FI124927B FI 124927 B FI124927 B FI 124927B FI 20105991 A FI20105991 A FI 20105991A FI 20105991 A FI20105991 A FI 20105991A FI 124927 B FI124927 B FI 124927B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cancer
- adenoviral vector
- oncolytic
- cells
- tumor
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Adenovirusvektoreita ja niihin liittyviä menetelmiä ja käyttöjäAdenovirus vectors and related methods and uses
Keksinnön alaField of the Invention
Esillä oleva keksintö liittyy biotieteiden ja lääketieteen aloihin. Erityisesti keksintö liittyy syöpähoitoihin. Tarkemmin sanottuna esillä oleva keksintö koskee onkolyyttisiä adenovirusvektoreita ja mainittuja vektoreita käsittäviä in vitro -soluja ja farmaseuttisia koostumuksia. Esillä oleva keksintö koskee myös mainittuja vektoreita ja farmaseuttista koostumusta käytettäviksi kohteen syövän hoitoon. Lisäksi esillä oleva keksintö koskee in vitro -menetelmää mono-klonaalisten anti-CTLA4-vasta-aineiden tuottamiseksi solussa sekä onkolyyttis-ten adenovirusvektoreiden käyttöä monoklonaalisten anti-CTLA4-vasta-ainei-den tuottamiseksi solussa in vitro ja onkolyyttisiä adenovirusvektoreita käytettäväksi kasvainspesifisen immuunivasteen ja apoptoosin lisäämiseksi kohteessa.The present invention relates to the fields of life sciences and medicine. In particular, the invention relates to cancer treatments. More particularly, the present invention relates to oncolytic adenoviral vectors and in vitro cells and pharmaceutical compositions comprising said vectors. The present invention also relates to said vectors and a pharmaceutical composition for use in treating cancer in a subject. Additionally, the present invention relates to an in vitro method for producing cellular anti-CTLA4 monoclonal antibodies, and the use of oncolytic adenoviral vectors for in vitro production of anti-CTLA4 monoclonal antibodies, and oncolytic adenoviral vectors for use in the treatment of tumor-specific apoptosis and in.
Keksinnön taustaBackground of the Invention
Syöpää voidaan hoitaa leikkauksella, hormonihoidoilla, kemoterapi-oilla, sädehoidoilla ja/tai muilla hoidoilla, mutta useissa tapauksissa syöpiä, joille on usein tunnusomaista se, että ne ovat pitkälle edenneessä vaiheessa, ei voida parantaa nykyisillä hoidoilla. Tämän vuoksi tarvitaan uusia syöpäsoluihin kohdistuvia lähestymistapoja, kuten geenihoitoja.Cancer can be treated with surgery, hormonal treatments, chemotherapies, radiation treatments and / or other treatments, but in many cases, cancers, often characterized by their advanced stage, cannot be cured by current treatments. Therefore, new approaches to cancer cells, such as gene therapy, are needed.
Viimeisten kahdenkymmenen vuoden aikana geeninsiirtoteknologi-aa on tutkittu paljon. Syövän geenihoitojen tarkoituksena on viedä terapeuttinen geeni kasvainsoluun. Nämä kohdesoluun viedyt terapeuttiset geenit voivat esimerkiksi korjata mutatoituneita geenejä, suppressoida aktiivisia onkogeene-jä tai luoda soluun lisäominaisuuksia. Sopivia eksogeenisiä terapeuttisia geenejä ovat, mainittuihin rajoittumatta, immunoterapeuttiset, antiangiogeeniset ja kemoprotektiiviset geenit sekä "itsemurhageenit", ja ne voidaan viedä soluun hyödyntämällä modifioituja virusvektoreita tai ei-viraalisia menetelmiä, kuten esimerkiksi elektroporaatio, geenipyssyja lipidi- tai polymeeripäällysteet.Gene transfer technology has been the subject of much research in the last twenty years. The purpose of gene therapy for cancer is to introduce a therapeutic gene into a tumor cell. These therapeutic genes introduced into the target cell may, for example, repair mutated genes, suppress active oncogenes, or create additional cellular properties. Suitable exogenous therapeutic genes include, but are not limited to, immunotherapeutic, anti-angiogenic and chemoprotective genes, and "suicide genes" and may be introduced into the cell utilizing modified viral vectors or non-viral methods, such as electroporation, gene terminals, lipid or polymers.
Optimaalisten virusvektoreiden vaatimuksiin kuuluu tehokas kyky löytää spesifisiä kohdesoluja ja ilmentää virusgenomia kohdesoluissa. Lisäksi optimaalisten vektoreiden tulee pysyä aktiivisina kohdekudoksissa tai -soluissa. Kaikkia näitä virusvektoreiden ominaisuuksia on kehitetty viimeisten vuosikymmenien aikana, ja esimerkiksi retrovirus- ja adenovirusvektoreita ja adenoassosioituneita virusvektoreita on tutkittu laajasti biolääketieteessä.Requirements for optimal viral vectors include an effective ability to locate specific target cells and to express the viral genome in the target cells. In addition, optimal vectors must remain active in the target tissues or cells. All these properties of viral vectors have been developed over the last decades, and retroviral and adenoviral vectors and adeno-associated viral vectors, for example, have been extensively studied in biomedicine.
Kasvaimeen penetraation ja kasvaimenvastaisen vaikutuksen paikallisen monistumisen parantamiseksi edelleen on muodostettu selektiivisesti onkolyyttisiä aineita, esimerkiksi ehdollisesti replikoituvia adenoviruksia. Onko-lyyttiset adenovirukset ovat lupaava keino syöpien hoitoon, ja ne ovat osoittautuneet hyvin turvallisiksi ja jonkin verran tehokkaiksi kliinisissä kokeissa. Onko-lyyttiset adenovirukset tappavat kasvainsoluja, koska virus replikoituu kasvain-solussa, jolloin replikaation viimeinen vaihe johtaa tuhansien virionien vapautumiseen ympäröiviin kasvainkudoksiin tehokasta kasvaimeen penetraatiota ja vaskulaarista reinfektiota varten. Kasvainsolut sallivat viruksen replikaation, kun taas normaalit solut säästyvät, koska virusgenomiin on räätälöity muutoksia, jotka estävät replikaation muissa kuin kasvainsoluissa.To further improve local penetration of tumor penetration and antitumor activity, selectively oncolytic agents, e.g., conditionally replicating adenoviruses, have been formed. Are-lytic adenoviruses are a promising tool for the treatment of cancers and have proven to be very safe and somewhat effective in clinical trials. Are-lytic adenoviruses kill tumor cells because the virus replicates in the tumor cell, whereby the final stage of replication leads to the release of thousands of virions into the surrounding tumor tissues for efficient tumor penetration and vascular reinfection. Tumor cells allow viral replication, whereas normal cells are spared because modifications are made to the viral genome that prevent replication in non-tumor cells.
Replikaatio voidaan rajoittaa kasvainkudokseen joko tekemällä osittaisia deleetioita adenoviruksen E1-alueelle tai käyttämällä kudos- tai kas-vainspesifisiä promoottoreita (TSP). Tällaisen promoottorin lisääminen saattaa tehostaa vektorien vaikutuksia kohdesoluissa, ja eksogeenisten kudos- tai kasvainspesifisten promoottoreiden käyttö on yleistä rekombinanteissa adeno-virusvektoreissa.Replication can be limited to tumor tissue either by partial deletions in the E1 region of the adenovirus or by the use of tissue or tumor specific promoters (TSPs). Insertion of such a promoter may enhance the effects of the vectors on target cells, and the use of exogenous tissue or tumor-specific promoters is common in recombinant adeno-viral vectors.
Useimmat kliiniset kokeet on suoritettu varhaisten sukupolvien ade-noviruksilla, jotka perustuvat adenovirus 5:een (Ad5). Onkolyyttisten adenovi-rusten kasvaimenvastainen vaikutus riippuu niiden geeninsiirtokyvystä. Valitettavasti useimmat kasvaimet ilmentävät heikosti tärkeintä Ad5-reseptoria, minkä vuoksi modifikaatioita on viety Ad5-kapsidiin. Esimerkiksi kapsidimodifikaatio serotyypin 3 ulokkeella on parantanut infektiivisyyttä ja tehoa munasarjasyövässä (Kanerva A, et ai., Clin Cancer Res 2002;8:275-80; Kanerva A, et ai., Mol Ther 2002;5:695-704; Kanerva A, et ai., Mol Ther 2003;8:449-58). Lisäksi koska Ad-vektorien säie ja penton base -yksikkö ovat soluun sisäänmenome-kanismin avainvälittäjiä, rekombinanttien Ad-vektorien kohdentaminen voidaan saavuttaa näiden kapsidiproteiinien geneettisten modifikaatioiden kautta (Dmit-riev I., et ai. 1998, Journal ofVirology, 72, 9706-9713). Useimmat tällä hetkellä kliinisessä käytössä olevat onkolyyttiset virukset ovat suuresti heikennettyjä replikaation suhteen monien kriittisissä viruksen geeneissä olevien deleetioi-den johdosta. Näillä viruksilla on erinomainen turvallisuusaineisto, mutta kasvaimenvastainen teho on ollut rajallinen.Most clinical trials have been performed on early-generation ade-viruses based on adenovirus 5 (Ad5). The antitumor activity of oncolytic adenoviruses depends on their gene transfer ability. Unfortunately, most tumors poorly express the most important Ad5 receptor, which is why modifications have been introduced into the Ad5 capsid. For example, capsid modification with the serotype 3 protrusion has improved infectivity and efficacy in ovarian cancer (Kanerva A, et al., Clin Cancer Res 2002; 8: 275-80; Kanerva A, et al., Mol Ther 2002; 5: 695-704; Kanerva A, et al., Mol Ther 2003; 8: 449-58). Further, since the Ad vectors strand and the penton base unit are key mediators of cell entry, targeting of recombinant Ad vectors can be achieved through genetic modifications of these capsid proteins (Dmitry I., et al. 1998, Journal of Virology, 72, 9706-9713 ). Most of the currently used oncolytic viruses are severely attenuated in replication due to many deletions in the critical viral genes. These viruses have excellent safety data, but their antitumor efficacy has been limited.
Kliiniset ja esikliiniset tulokset kuitenkin osoittavat, että hoito ei-aseistetuilla onkolyyttisillä viruksilla ei ole riittävän immunostimulatorista johtaakseen pidempiaikaisiin kasvaimenvastaisiin terapeuttisiin immuunivasteisiin. Tässä suhteessa onkolyyttisiä viruksia on aseistettu, jotta ne olisivat enemmän immunostimulatorisia. Lisäksi viruksen replikaatio ja immunomodulatoristen proteiinien ilmentyminen kasvaimen sisällä voimistaa immuunijärjestelmää indusoimalla sytokiinituotantoa ja kasvainantigeenien vapautumista (Ries SJ, et ai., Nat Med 2000;6:1128-33).However, clinical and preclinical results indicate that treatment with non-armed oncolytic viruses is not sufficiently immunostimulatory to result in longer-term anti-tumor therapeutic immune responses. In this regard, oncolytic viruses have been armed to make them more immunostimulatory. In addition, viral replication and expression of immunomodulatory proteins within the tumor enhance the immune system by inducing cytokine production and release of tumor antigens (Ries SJ, et al., Nat Med 2000; 6: 1128-33).
Onkolyyttisten virusten aseistaminen yhdistää perinteisen geeninsiirron edut ja replikoitumiskykyisten aineiden tehon. Eräs virusten aseistamisen päämäärä on immuunireaktion indusointi viruksen replikaation sallivia soluja vastaan. Kuten edellä on mainittu, virusreplikaatio, vaikkakin se on immu-nogeenistä, ei normaalisti yksin riitä indusoimaan tehokasta kasvaimenvastais-ta immuniteettia. Terapeuttisen immuniteetin indusoinnin vahvistamiseksi viruksia on aseistettu stimulatorisilla proteiineilla, kuten sytokiineilla, tarkoituksena helpottaa kasvainantigeenien viemistä antigeenejä esitteleville soluille, kuten dendriittisoluille, ja näiden stimulaatiota ja/tai kypsymistä. Immunoterapeut-tisten geenien vieminen kasvainsoluihin ja lisäksi niiden proteiinien translaatio johtavat immuunivasteen aktivoitumiseen ja tehokkaampaan kasvainsolujen tuhoutumiseen. Merkittävimmät immuunisolut tässä suhteessa ovat luonnolliset tappajasolut (NK:t) ja sytotoksiset CD8+ T -solut.Arming oncolytic viruses combines the benefits of traditional gene transfer with the efficacy of replicating agents. One purpose of viral armamentation is to induce an immune response against cells that allow viral replication. As mentioned above, viral replication, although immunogenic, is normally not sufficient alone to induce effective anti-tumor immunity. To enhance the induction of therapeutic immunity, viruses are armed with stimulatory proteins, such as cytokines, to facilitate the delivery of tumor antigens to antigen presenting cells, such as dendritic cells, and their stimulation and / or maturation. The introduction of immunotherapeutic genes into tumor cells and furthermore the translation of their proteins results in activation of the immune response and more efficient destruction of the tumor cells. The most important immune cells in this regard are natural killer cells (NKs) and cytotoxic CD8 + T cells.
Avainoivallus syövän immunoterapiassa on ollut sen ymmärtäminen, että kasvaimen immuunijärjestelmän välttämismekanismien johdosta kas-vaimenvastaisen immuunivasteen induktio ei ole riittävä taudin poistamiseksi. Sen sijaan, pitkälle edenneiden kasvainten immunosuppressiivisen luonteen johdosta tarvitaan myös inhiboivien T-solujen vähentämistä (Dranoff G., Nat Rev Cancer 2004;4:11-22; de Visser KE et ai., Nat Rev Cancer 2006;6:24-37). Eräs näistä säätelevistä avainreiteistä käsittää sytotoksisiin T-lymfosyyt-teihin liittyvän antigeeni 4:n (CTLA-4, CD152), joka toimii B7/CD28-välitteistä stimulaatiota vastaan. CTLA-4-vastaisten vasta-aineiden prekliininen kasvai-menvastainen teho on aikaisemmin osoitettu useissa kasvainmalleissa (Leach DR et ai., Science 1996;271:1734-6; Kwon ED et ai., Proc Natl Acad Sei USA 1999;96:15074-9). Tällä hetkellä kahta täysin ihmisperäistä monolonaalista vasta-ainetta (mAb:t) CTLA-4:ää vastaan kehitetään kliinisesti; lgG1 ipilimumabi (aikaisemmin MDX-010) ja lgG2 tremelimumabi (aikaisemmin CP-675,206). Useat julkaistut tutkimukset pyrkivät vahvistamaan oikeiksi ipilimumabin ja treme-limumabin biologisen ja kliinisen aktiivisuuden melanoomaa ja muita syöpiä sairastavissa potilaissa (Kirkvvood JM et ai., Clin Cancer Res 2010;16:1042-8;A key realization in cancer immunotherapy has been the realization that, due to mechanisms of avoidance of the tumor immune system, induction of an anti-tumor immune response is not sufficient to eliminate the disease. Instead, due to the immunosuppressive nature of advanced tumors, a reduction in inhibitory T cells is also required (Dranoff G., Nat Rev Cancer 2004; 4: 11-22; de Visser KE et al., Nat Rev Cancer 2006; 6: 24-37). . One of these regulatory key pathways comprises antigen 4 (CTLA-4, CD152) associated with cytotoxic T lymphocytes, which acts against B7 / CD28-mediated stimulation. The preclinical anti-tumor activity of anti-CTLA-4 antibodies has previously been demonstrated in several tumor models (Leach DR et al., Science 1996; 271: 1734-6; Kwon ED et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 15074 -9). Currently, two fully human monolonal antibodies (mAbs) to CTLA-4 are being developed clinically; IgG1 ipilimumab (formerly MDX-010) and IgG2 tremelimumab (formerly CP-675,206). Several published studies seek to validate the biological and clinical activity of ipilimumab and treme-lumumab in patients with melanoma and other cancers (Kirkvood JM et al., Clin Cancer Res 2010; 16: 1042-8;
Hodi FS et ai., N Engl J Med. 2010; 363;8:711—23; Ribas A et ai., Oncologist 2007;12:873-83). Vaikka kasvaimenvastainen aktiivisuus on nähty monissa kokeissa, on raportoitu myös vakavia ja jopa kuolemaan johtaneita sivuvaikutuksia Sivuvaikutukset koskevat normaalien kudosten altistumista, mikä johtuu systeemisestä annosta, kun taas tehon määrää immuunisuppression väheneminen kasvaimessa. Siten mahdollisuudet CTLA-4 mAb:n paikalliseen tuotantoon ovat perusteltuja. CTLA-4 on aktivaatiolla indusoituva tyypin I transmembraaniproteii-ni, joka kuuluu Ig-superperheeseen, sitä ilmentävät T-lymfosyytit kovalenttise-na homodimeerinä, joka toimii inhiboivana reseptorina kostimulatorisille molekyyleille B7.1 (CD80) ja B7.2 (CD86) (Ribas A et ai., Oncologist 2007; 12:873-83). CTLA-4:n esto mAb:illa johtaa lisääntyneeseen interleukiini-2- (IL-2) ja gamma-interferoni (IFN-γ) -tuotantoon lymfosyyttien toimesta; ja lisääntyneeseen kudosten yhteensopivuuskompleksin (major histocompatibility complex, MHC) luokan I molekyylien tuotantoon (Lee KM et ai., Science 1998; 282:2263-6; ParadisTJ et ai., Cancer Immunol Immunother 2001;50:125-33).Hodi FS et al., N Engl J Med. 2010; 363; 8: 711-23; Ribas A et al., Oncologist 2007; 12: 873-83). Although antitumor activity has been seen in many experiments, serious and even fatal side effects have also been reported. The side effects concern the exposure of normal tissues due to systemic administration, while the efficacy is determined by the reduction of immune suppression in the tumor. Thus, the potential for local production of CTLA-4 mAb is justified. CTLA-4 is an activation-inducible type I transmembrane protein belonging to the Ig superfamily, expressed by T lymphocytes as a covalent homodimer that acts as an inhibitory receptor for costimulatory molecules B7.1 (CD80) and B7.2 (CD86) (Rib86). et al., Oncologist 2007; 12: 873-83). Inhibition of CTLA-4 by mAbs results in increased production of interleukin-2 (IL-2) and interferon-gamma (IFN-γ) by lymphocytes; and increased production of Class I molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC) (Lee KM et al., Science 1998; 282: 2263-6; ParadisTJ et al., Cancer Immunol Immunother 2001; 50: 125-33).
Eräs tärkeimmistä mekanismeista, joita kasvaimet käyttävät välttääkseen kasvaimenvastaisen immuniteetin, välittyy regulatoristen T-solujen kautta. Monista tähän saakka käytetyistä lähestymistavoista T-Reg:ien vähentämiseksi anti-CTLA4-mAb on ainoa, jonka turvallisuus ja teho on osoitettu suuressa satunnaistetussa tutkimuksessa (Hodi FS et ai., N Engl J Med. 2010; 363;8:711-23). Vaikka tämä koe edustaa läpimurtoa kasvainimmunoterapialle, sitä edelsi negatiivinen faasin 3 tutkimus toisella anti-CTLA4 mAb:lla (Ribas A et ai. J Clin Oncol ASCO suppl. 2008; 287). Lisäksi kaikissa anti-CTLA4-mAb-kokeissa vakavat immuunijärjestelmään liittyvät haittavaikutukset (irAEs) ovat aiheuttaneet kuolemia, mikä johtaa huoleen tämän lähestymistavan turvallisuudesta. Siksi tarvitaan muita lähestymistapoja, kuten geeniterapiamallin käyttöä, koska se voisi lisätä paikallista pitoisuutta lisääntyneen tehon saamiseksi samalla vähentäen systeemiseen altistukseen liittyviä haittavaikutuksia.One of the most important mechanisms used by tumors to evade anti-tumor immunity is mediated through regulatory T cells. Of the many approaches hitherto used to reduce T-Regs, anti-CTLA4 mAb is the only one whose safety and efficacy have been demonstrated in a large randomized study (Hodi FS et al., N Engl J Med. 2010; 363; 8: 711-23). . Although this experiment represents a breakthrough in tumor immunotherapy, it was preceded by a negative phase 3 study with another anti-CTLA4 mAb (Ribas A et al. J Clin Oncol ASCO suppl. 2008; 287). In addition, in all anti-CTLA4 mAb assays, serious immune-related adverse reactions (irAEs) have resulted in deaths, which raises concerns about the safety of this approach. Therefore, other approaches, such as the use of a gene therapy model, are needed as it could increase the local concentration to obtain increased efficacy while reducing the adverse effects associated with systemic exposure.
On raportoitu, että kasvaimeen paikallistuneen anti-CTLA4-scFv:n ilmentämisen yhdistämisellä menetelmiin systeemisen T-Reg:n poistamiseksi on synergistisiä vaikutuksia (Tuve S, et ai. Cancer Res 2007;67:5929-39). Kirjoittajat eivät myöskään havainneet autoimmuunireaktioita hiirimallissa, kun kasvaimet ilmentävät jatkuvasti anti-CTLA-4-scFv-vasta-ainetta ja anti-CD25-vasta-aineita annetaan i.p. (Tuve S, et ai. Cancer Res 2007;67:5929-39). Sitä vastoin, kun anti-CTLA4-mAb annetaan systeemisesti yhdessä T-Reg-solujen kanssa, havaitaan autoimmuunireaktioita (Sutmuller RP et ai., J Exp Med 2001;194:823-32; Takahashi T et ai. J Exp Med 2000;192:303-10). Yksi mahdollinen syy synergiaan on, että T-Reg-solujen poisto vähentää regulatoristen solujen lukumäärää, samalla kun anti-CTLA-4 vähentää suppressiivisten solujen aktiivisuutta. Lisäksi anti-CTLA4 voi myös vähentää antigeeniä esittelevien solujen suppressiota.Combining expression of tumor-localized anti-CTLA4-scFv with methods to remove systemic T-Reg has been reported to have synergistic effects (Tuve S, et al. Cancer Res 2007; 67: 5929-39). Also, the authors did not detect autoimmune reactions in a mouse model when tumors continuously express anti-CTLA-4-scFv antibody and anti-CD25 antibodies are administered i.p. (Tuve S, et al. Cancer Res 2007; 67: 5929-39). In contrast, when anti-CTLA4 mAb is administered systemically with T-Reg cells, autoimmune reactions are observed (Sutmuller RP et al., J Exp Med 2001; 194: 823-32; Takahashi T et al. J Exp Med 2000; 192 : 303-10). One possible reason for the synergy is that removal of T-Reg cells reduces the number of regulatory cells, while anti-CTLA-4 reduces the activity of suppressive cells. In addition, anti-CTLA4 can also reduce suppression of antigen-presenting cells.
Adenovirukset ovat keskikokoisia (90-100 nm), vaipattomia ikos-ahedraalisia viruksia, joilla on noin 36 000 emäsparin kaksijuosteinen lineaarinen DNA proteiinikapsidissa. Viruksen kapsidissa on säierakenteita, jotka osallistuvat viruksen kiinnittymiseen kohdesoluun. Ensinnäkin säieproteiinin uloke-domeeni sitoutuu kohdesolun reseptoriin [esimerkiksi CD46:n tai coxsackievi-ruksen adenovirusreseptoriin (CAR)], toiseksi virus on vuorovaikutuksessa in-tegriinimolekyylin kanssa ja kolmanneksi virus endosytosoituu kohdesoluun. Seuraavaksi virusgenomi kuljetetaan endosomeista tumaan, ja kohdesolun replikaatiokoneistoa hyödynnetään myös viruksen tarkoituksiin (Russell W. C., J General Virol 2000; 81, 2573-2604).Adenoviruses are medium-sized (90-100 nm), non-enveloped icosahedral viruses with approximately 36,000 base pairs of double-stranded linear DNA in a protein capsid. The viral capsid has filamentous structures that are involved in attaching the virus to the target cell. First, the protruding domain of the fiber protein binds to the target cell receptor [e.g., CD46 or coxsackievivirus adenovirus receptor (CAR)], second, the virus interacts with the integrin molecule, and third, the virus is endocytosed to the target cell. Next, the viral genome is transported from endosomes to the nucleus, and the replication machinery of the target cell is also utilized for viral purposes (Russell W. C., J General Virol 2000; 81, 2573-2604).
Adenovirusgenomissa on varhaisvaiheen (E1-E4), keskivaiheen (IX ja IVa2) ja myöhäisvaiheen geenejä (L1-L5), jotka transkriptoidaan peräkkäisessä järjestyksessä. Varhaisvaiheen geenituotteet vaikuttavat isäntäsolun puolustusmekanismeihin, solusykliin ja solumetaboliaan. Keski- ja myöhäisvaiheen geenit koodaavat virusten rakenneproteiineja uusien virionien tuottamiseksi (Wu ja Nemerovv, Trends Microbiol 2004; 12: 162-168; Russell W. C., J General Virol 2000; 81, 2573-2604; Volpers C. ja Kochanek S., J Gene Med 2004; 6 suppl 1, S164—71; Kootstra N. A. ja Verma I. M., Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003; 43, 413-439).The adenovirus genome contains early (E1-E4), intermediate (IX and IVa2), and late (G1-L5) genes, which are transcribed sequentially. Early gene products affect the host cell defense mechanisms, the cell cycle and cell metabolism. Mid- and late-stage genes encode structural proteins of viruses to produce new virions (Wu and Nemerov, Trends Microbiol 2004; 12: 162-168; Russell WC, J General Virol 2000; 81, 2573-2604; Volpers C. and Kochanek S., J Gene Med 2004; 6 suppl 1, S164-71; Kootstra NA and Verma IM, Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003; 43, 413-439).
Ihmiseltä on löydetty yli 50 adenovirusten eri serotyyppiä. Serotyypit luokitellaan kuuteen alaryhmään A-F, ja eri serotyyppien tiedetään liittyvän eri sairauksiin, kuten hengityselinsairauksiin, sidekalvontulehdukseen ja maha-suolitulehdukseen. Adenovirusserotyypin 5 (Ad5) tiedetään aiheuttavan hengityselinsairauksia, ja se on yleisin geenihoidon alalla tutkittu serotyyppi. Ensimmäisistä Ad5-vektoreista deletoitiin E1- ja/tai E3-alueet, jolloin vierasta DNA:ta voitiin viedä vektoreihin (Danthinne X, Imperiale, MJ. Gene Therapy. 2000;7:1707-1714). Lisäksi muiden alueiden deleetiot ja lisämutaatiot ovat tuottaneet lisäominaisuuksia virusvektoreille. Useita adenovirusten eri modifikaatioita on siis ehdotettu tehokkaiden kasvaimenvastaisten vaikutusten aikaansaamiseksi.More than 50 different serotypes of adenoviruses have been found in humans. The serotypes are classified into six subgroups A-F, and the different serotypes are known to be associated with various diseases such as respiratory, conjunctivitis and gastrointestinal inflammation. Adenovirus serotype 5 (Ad5) is known to cause respiratory disease and is the most common serotype studied in the field of gene therapy. E1 and / or E3 regions were deleted from the first Ad5 vectors, allowing foreign DNA to be introduced into the vectors (Danthinne X, Imperiale, MJ. Gene Therapy. 2000; 7: 1707-1714). In addition, deletions and further mutations in other regions have provided additional features for viral vectors. Thus, various modifications of the adenoviruses have been proposed to provide effective antitumor effects.
Silti tarvitaan tehokkaampaa ja tarkempaa geeninsiirtoa ja geenihoitojen lisääntynyttä spesifisyyttä ja riittävää kasvaintentappokykyä. Terapeuttisten vektorien turvallisuustietojen on myös oltava erinomaisia. Esillä oleva keksintö tarjoaa näillä edellä mainituilla ominaisuuksilla varustetun syövänhoito-keinon hyödyntämällä sekä adenovirusten onkolyyttisiä että immunoterapeutti-sia ominaisuuksia uudella ja keksinnöllisellä tavalla.However, more efficient and accurate gene transfer and increased specificity of gene therapies and sufficient tumor-killing capacity are needed. The safety data of therapeutic vectors must also be excellent. The present invention provides a cancer treatment with these above-mentioned properties by utilizing both the oncolytic and immunotherapeutic properties of adenoviruses in a novel and inventive manner.
Keksinnön lyhyt kuvausBrief Description of the Invention
Keksinnön tavoitteena on tuottaa uusia menetelmiä ja välineitä adenovirusten edellä mainittujen ominaisuuksien aikaansaamiseksi ja siten myös perinteisten syöpähoitojen ongelmien ratkaisemiseksi. Tarkemmin sanottuna keksintö tarjoaa uusia menetelmiä ja välineitä geenihoitoa varten.It is an object of the invention to provide new methods and means for providing the above-mentioned properties of adenoviruses and thus also for solving the problems of conventional cancer therapies. More particularly, the invention provides novel methods and tools for gene therapy.
Esillä oleva hakemus kuvaa rekombinanttien virusvektoreiden muodostamista, näihin vektoreihin liittyviä menetelmiä ja niiden käyttöä kasvainso-lulinjoissa, eläinmalleissa ja syöpäpotilaiden ja normaalien luovuttajien verisoluissa.The present application describes the generation of recombinant viral vectors, methods related to these vectors and their use in tumor cell lines, animal models and blood cells of cancer patients and normal donors.
Esillä oleva keksintö koskee onkolyyttistä adenovirusvektoria, joka käsittää 1) adenovirusserotyypin 5 (Ad5:n) nukleiinihappopääketjun, joka käsittää kapsidimodifikaation, edullisesti kapsidimodifikaation adenoviruksen se-rotyypin 3 (Ad3) ulokkeella (Ad5/3-kapsidikimerismi), 2) 24 emäsparin deleetion (D24) E1:n Rb:tä sitovalla varoalueella 2 ja 3) nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa CTLA-4-spesifistä täysin ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta (aCTLA-4-mAb), deletoidun gp19k/6.7K.r\ tilalla E3-alueella.The present invention relates to an oncolytic adenovirus vector comprising 1) a nucleic acid backbone of adenovirus serotype 5 (Ad5) comprising a capsid modification, preferably a capsid modification of the adenovirus serotype 3 (Ad3), (D5 / 3 capsidele), ) In the Rb binding lane 2 and 3 of E1) in place of the deleted gp19k / 6.7Kr1 region of the nucleic acid sequence encoding a CTLA-4 specific fully human monoclonal antibody (aCTLA-4 mAb).
Esillä oleva keksintö koskee edelleen in vitro -solua, joka käsittää keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin.The present invention further relates to an in vitro cell comprising an oncolytic adenoviral vector of the invention.
Esillä oleva keksintö koskee myös farmaseuttista koostumusta, joka käsittää keksinnön mukaisen adenovirusvektorin.The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising an adenoviral vector of the invention.
Esillä oleva keksintö koskee myös keksinnön mukaista adenovirusvektoria käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa.The present invention also relates to an adenoviral vector of the invention for use in treating cancer in a subject.
Esillä oleva keksintö koskee myös keksinnön mukaista farmaseuttista koostumusta käytettäväksi syövän hoitoon kohteessa.The present invention also relates to a pharmaceutical composition of the invention for use in treating cancer in a subject.
Esillä oleva keksintö liittyy myös menetelmään kohteen syövän hoitamiseksi, jolloin menetelmä käsittää keksinnön mukaisen vektorin tai farmaseuttisen koostumuksen antamisen kohteelle, joka sairastaa syöpää, erityi sesti tavanomaisiin kemoterapeuttisiin ja/tai sädehoitoihin huonosti reagoivaa syöpää.The present invention also relates to a method of treating a subject's cancer, the method comprising administering a vector or pharmaceutical composition of the invention to a subject suffering from cancer, in particular a cancer that is poorly responsive to conventional chemotherapeutic and / or radiation therapies.
Lisäksi esillä oleva keksintö koskee in vitro -menetelmää CTLA-4-spesifisen täysin ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi solussa, jolloin menetelmä käsittää: a) kuljetetaan keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin soluun ja b) ilmennetään kyseisen vektorin CTLA-4-spesifistä täysin ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta solussa.The present invention further relates to an in vitro method for producing a fully human monoclonal antibody to CTLA-4 in a cell comprising: a) delivering a vehicle comprising an oncolytic adenovirus vector of the invention to a cell; and b) expressing the CTLA-4 specific monoclonal antibody in the cell.
Lisäksi esillä oleva keksintö liittyy menetelmään kohteen kasvain-spesifisen immuunivasteen lisäämiseksi, jolloin menetelmässä kuljetetaan keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käsittävä kuljetin kohdesoluun tai -kudokseen, ilmennetään kyseisen vektorin täysin ihmisperäistä, CTLA-4:lle spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta solussa, lisätään anti-CTLA4-mAb-tuotannon määrää kasvaimissa (mutta ei normaaleissa kudoksissa) viruksen genomin kasvainspesifisen replikoitumisen ansiosta.Additionally, the present invention relates to a method of enhancing a tumor-specific immune response of a subject, comprising delivering a vehicle comprising the oncolytic adenoviral vector of the invention to a target cell or tissue, expressing a fully human CTLA-4 specific monoclonal antibody in the cell, The amount of mAb production in tumors (but not in normal tissues) is due to tumor-specific replication of the viral genome.
Esillä oleva keksintö koskee vielä myös keksinnön mukaisen onko-lyyttisen adenovirusvektorin käyttöä täysin ihmisperäisen, CTLA-4:lle spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi solussa in vitro.The present invention further relates to the use of the oncytic adenovirus vector of the invention for the production of a fully human CTLA-4 specific monoclonal antibody in a cell in vitro.
Esillä oleva keksintö liittyy vielä myös keksinnön mukaiseen onko-lyyttiseen adenovirusvektoriin täysin ihmisperäisen, CTLA-4:lle spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi solussa.The present invention further relates to an oncolytic adenoviral vector of the invention for the production of a fully human CTLA-4 specific monoclonal antibody in a cell.
Esillä oleva keksintö liittyy vielä myös keksinnön mukaisen onkolyyt-tisen adenovirusvektorin käyttöön kohteen kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi.The present invention further relates to the use of the oncolytic adenoviral vector of the invention to enhance the tumor-specific immune response of the subject.
Esillä oleva keksintö liittyy vielä keksinnön mukaisen onkolyyttiseen adenovirusvektoriin kohteen kasvainspesifisen immuunivasteen lisäämiseksi.The present invention further relates to an oncolytic adenoviral vector of the invention for enhancing the tumor-specific immune response of a subject.
Esillä oleva keksintö koskee vielä keksinnön mukaista onkolyyttistä adenovirusvektoria käytettäväksi kasvainspesifisen immuunivasteen ja apop-toosin lisäämiseksi kohteessa.The present invention further relates to an oncolytic adenoviral vector of the invention for use in enhancing a tumor-specific immune response and apoptosis in a subject.
Esillä oleva keksintö tarjoaa uuden välineen syöpien hoitamiseksi, jotka reagoivat huonosti nykyhoitoihin tai eivät ole nykyhoidoilla parannettavissa. Lisäksi hoitoon sopiviin kasvaintyyppeihin liittyviä rajoituksia on vähän verrattuna moniin muihin hoitoihin. Itse asiassa kaikkia kiinteitä kasvaimia voidaan hoitaa esitetyllä keksinnöllä. Esillä oleva keksintö voi auttaa tuhoamaan massaltaan suurempia kasvaimia ja kompleksisempia kasvaimia kuin aikaisemmilla tekniikoilla. Hoito voidaan antaa kasvaimensisäisesti, ontelonsisäisesti, laskimonsisäisesti ja käyttämällä näiden yhdistelmää. Hoitotapa voi antaa systeemisen tehon huolimatta paikallisesta injektiosta. Hoitotapa voi myös tuhota soluja, joiden oletetaan olevan kasvaimen aiheuttajia ("syöpäkantasolut”). (Eriksson M et ai. Mol Ther2007; 15(12):2088-93).The present invention provides a novel tool for the treatment of cancers that are poorly responsive to, or not amenable to, current therapies. In addition, there are few limitations regarding the types of tumors that can be treated compared to many other treatments. In fact, all solid tumors can be treated with the present invention. The present invention can help destroy tumors of greater mass and more complex tumors than previous techniques. The treatment can be administered intravenously, intravitreally, intravenously and in combination. The method of treatment can provide systemic efficacy despite local injection. The treatment can also kill cells that are thought to be tumor-causing ("cancer stem cells") (Eriksson M et al. Mol Ther2007; 15 (12): 2088-93).
Sen lisäksi, että keksinnön mukainen vektori mahdollistaa vektorin kuljettamisen kohdealueelle, se myös varmistaa siirtogeenin ilmentymisen ja pysyvyyden. Esillä oleva keksintö ratkaisee ongelman, joka liittyy perinteisten hoitojen hoitoresistenssiin. Lisäksi esillä oleva keksintö tarjoaa keinoja ja menetelmiä selektiivisiä hoitoja varten vähemmällä toksisuudella tai vaurioilla terveissä kudoksissa. Esillä olevan keksinnön etuja ovat myös erilaiset ja vähentyneet sivuvaikutukset verrattuna muihin hoitoihin. Tärkeä seikka on, että hoitokeino on synergistinen monien muiden hoitomuotojen kanssa, mukaan lukien kemoterapia, pienimolekyyliset inhibiittorit ja sädehoito, ja sitä voidaan siten käyttää yhdistelmähoito-ohjelmissa.Not only does the vector of the invention allow delivery of the vector to the target region, it also ensures expression and stability of the transgene. The present invention solves the problem of treatment resistance to conventional therapies. In addition, the present invention provides means and methods for selective treatment with less toxicity or damage to healthy tissues. The present invention also has the advantages of different and reduced side effects compared to other treatments. Importantly, the treatment is synergistic with many other therapies, including chemotherapy, small molecule inhibitors and radiation therapy, and can thus be used in combination regimens.
Immuunireaktion aiheuttaminen sellaisia soluja vastaan, jotka sallivat aseistamattomien adenovirusten replikaation, ei normaalisti ole riittävän voimakas saamaan aikaan terapeuttisen kasvainimmuniteetin kehittymisen. Tämän heikkouden poistamiseksi esillä oleva keksintö tuottaa aseistettuja ade-noviruksia, joissa on täysin ihmisperäistä, CTLA-4:lle spesifistä monoklonaalis-ta vasta-ainetta, joka voimistaa kasvaimenvastaista immuniteettiä aktivoimalla sytotoksisia T-soluja ja antigeeniä esitteleviä soluja ja vähentämällä regulatori-sia T-soluja ja muita suppressiivisia soluja. Anti-CTLA-4-mAb:t voivat myös suoraan indusoida usein CTLA-4:ää ilmentävien kasvainsolujen apoptoosia. Keksinnön mukaisten adenovirusvektoreiden kautta realisoituvat monet edellä kuvatut CTLA-4:ää estävien vasta-aineiden välittämät kasvaimenvastaiset mekanismit: (A) : Anti-CTLA-4-mAb:t voivat estää aktivoitujen T-solujen pinnalla olevasta CTLA-4-molekyylistä peräisin olevaa immuunivastetta suppressoivaa signalointia (Chambers CA et ai., Annu Rev Immunol 2001;19:565-94). (B) : Tärkeä T-solujen inhiboiva alajoukko (regulatoriset T-solut, T-Reg) ilmentää konstitutiivisesti CTLA-4:ta ja voi sitoa B7-molekyylejä dendriit-tisolujen pinnalla, jotka ovat avainasemassa olevia antigeeniä esitteleviä soluja (Paust S et ai., Proc Natl Acad Sei USA 2004;101:10398-403). Tästä seuraa- va indoliamiini-2,3-dioksigenaasin ja muiden suppressiivisten verkostojen lisääminen johtaa T-solujen toleranssin induktioon mikroympäristössä sytotoksi-sen vaikutuksen sijasta (Munn DH et ai., J Clin Invest 2004; 114:280-90). (C) : CTLA-4:ää ilmentävät T-solut (mukaan lukien T-Reg-solut) voivat myös sitoutua suoraan aktivoituihin T-soluihin, koska kostimulatorisia B7-molekyylejä ilmennetään aktivoitujen ihmisen T-solujen pinnalla. CTLA-4:ää estävät mAb:t häiritsevät tätä suppressiivista signalointia ja johtavat kasvainan-tigeenispesifisten T-solujen paikalliseen ekspansioon (Paust S et ai., Proc Natl Acad Sei USA 2004; 101:10398^103). (D) : CTLA-4 ilmentyy monien kasvainsolujen pinnalla (Contardi E et ai., Int J Cancer 2005;117:538-50), mikä oletettavasti heijastaa suoraa immu-nosuppressiivista vaikutusta sytotoksisten T-solujen B7:ään ja DC:ihin. On mielenkiintoista, että CTLA-4:ää estävät mAb:t voivat indusoida kasvainsolujen suoraa tappamista käynnistämällä apoptoosin (Ribas A et ai., Oncologist 2007;12:873-83; Contardi E et ai., Int J Cancer 2005; 117:538-50) ja in vivo tätä voitaisiin lisätä edelleen vasta-aineesta riippuvaisella sellulaarisella sytotok-sisuudella (Jinushi M et ai. Proc Natl Acad Sei U S A 2006;103:9190-5). (E) : Kasvaimen ilmentämä CTLA-4 voi käynnistää lisääntyneen in-doliamiini-2,3-dioksigenaasin kasvainta infiltroivissa DC:issä, ja CTLA-4:lle spesifiset monoklonaaliset vasta-aineet voisivat myös estää tämän efektin (Ribas A et ai., Oncologist 2007;12:873-83).The induction of an immune response against cells that allow replication of unarmed adenoviruses is normally not potent enough to induce the development of therapeutic tumor immunity. To overcome this weakness, the present invention provides armed adeoviruses with a fully human CTLA-4 specific monoclonal antibody that enhances antitumor immunity by activating cytotoxic T cells and antigen presenting cells and reducing regulatory T- cells and other suppressive cells. Anti-CTLA-4 mAbs can also directly induce apoptosis of tumor cells that frequently express CTLA-4. Many of the above-described anti-tumor mechanisms mediated by CTLA-4 inhibitory antibodies are realized through the adenoviral vectors of the invention: (A): Anti-CTLA-4 mAbs can inhibit an immune response from a CTLA-4 molecule on activated T cells. suppressive signaling (Chambers CA et al., Annu Rev Immunol 2001; 19: 565-94). (B): An important T cell inhibitory subset (regulatory T cells, T-Reg) constitutively expresses CTLA-4 and can bind B7 molecules on the surface of dendritic cells, which are key antigen presenting cells (Paust S et al. ., Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 10398-403). The subsequent addition of indolamine-2,3-dioxygenase and other suppressive networks results in induction of T cell tolerance in the microenvironment instead of cytotoxic action (Munn DH et al., J Clin Invest 2004; 114: 280-90). (C): T cells expressing CTLA-4 (including T-Reg cells) may also bind directly to activated T cells, since costimulatory B7 molecules are expressed on the surface of activated human T cells. CTLA-4-blocking mAbs interfere with this suppressive signaling and lead to local expansion of tumor-antigen-specific T cells (Paust S et al., Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 10398-103). (D): CTLA-4 is expressed on the surface of many tumor cells (Contardi E et al., Int J Cancer 2005; 117: 538-50), presumably reflecting a direct immunosuppressive effect on B7 and DCs of cytotoxic T cells. Interestingly, CTLA-4 blocking mAbs can induce direct killing of tumor cells by initiating apoptosis (Ribas A et al., Oncologist 2007; 12: 873-83; Contardi E et al., Int J Cancer 2005; 117: 538 -50) and in vivo this could be further enhanced by antibody-dependent cellular cytotoxicity (Jinushi M et al. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 9190-5). (E): CTLA-4 expressed by the tumor may initiate increased inaminamine-2,3-dioxygenase in tumor-infiltrating DCs, and monoclonal antibodies specific for CTLA-4 could also block this effect (Ribas A et al., Oncologist 2007; 12: 873-83).
Siten viisi eri mekanismia tekee keksinnön mukaisista adenoviruk-sista, jotka käsittävät monoklonaalista anti-CTLA-4:ää, tehokkaan kasvaimen-vastaisen lähestymistavat ilman systeemiseen altistukseen liittyviä sivuvaikutuksia, jotka ovat johtaneet huoliin turvallisuudesta (Hodi FS et ai., N Engl J Med. 2010; 363;8:711-23; Sanderson K et ai., J Clin Oncol 2005;23:741-50. Näiden viiden siirtogeenin välittämän mekanismin lisäksi viruksen onkolyytti-nen replikaatio lisää kasvaimenvastaista tehoa. Kun otetaan huomioon itse adenoviruksen välittämä voimakas immunostimulatorinen aktiivisuus (Tuve S, et ai. Vaccine. 2009;27(31 ):4225-39), onkolyysi lisää lähestymistavan kokonaista immunologista käyttöä. Alla olevassa esimerkissä 9 (kuviot 1, 11, 12) kuvaamme lisäparannuksen tässä suhteessa: CpG-ryhmien lisääminen adenoviruksen genomiin tekee viruksen vielä immunostimulatorisemmaksi.Thus, five different mechanisms render the adenoviruses of the invention comprising monoclonal anti-CTLA-4 effective anti-tumor approaches without systemic exposure-related side effects that have led to safety concerns (Hodi FS et al., N Engl J Med. 2010; 363; 8: 711-23; Sanderson K et al., J Clin Oncol 2005; 23: 741-50 In addition to these five transgene-mediated mechanisms, oncolytic replication of the virus enhances antitumor activity, given the potent immunostimulatory mediated by the adenovirus itself activity (Tuve S, et al. Vaccine. 2009; 27 (31): 4225-39), oncolysis increases the total immunological use of the approach. In Example 9 below (Figures 1, 11, 12), we describe an additional improvement in this regard: Addition of CpG groups adenovirus genome makes the virus even more immunostimulatory.
Tunnetun tekniikan mukaisiin adenovirusvälineisiin verrattuna esillä oleva keksintö tarjoaa yksinkertaisemman, tehokkaamman, edullisemman, myr- kyttömämmän ja/tai turvallisemman välineen syöpähoitoa varten. Lisäksi autta-javiruksia tai rekombinanttimolekyylin samanaikaista annostelua ei tarvita.Compared to prior art adenoviral devices, the present invention provides a simpler, more efficient, less expensive, non-toxic and / or safer means for the treatment of cancer. In addition, helper viruses or co-administration of the recombinant molecule are not required.
Esillä oleva keksintö tarjoaa uuden sukupolven infektiivisyydeltään parempia ja erittäin tehokkaita adenoviruksia, joissa säilyy aikaisempien virusten hyvä turvallisuus mutta jotka johtavat tasoltaan korkeampiin tehokkuuksiin. Mikä tärkeää: esillä oleva keksintö kuvaa onkolyyttisiä adenoviruksia, jotka tuottavat immunologisia tekijöitä, jotka ovat kriittisiä onkolyyttisten virusten tehokkuuden suhteen.The present invention provides a new generation of improved and highly effective adenoviruses with high infectivity, which retains good safety but prevents higher levels of efficacy. Importantly, the present invention describes oncolytic adenoviruses that produce immunological factors critical for the efficacy of oncolytic viruses.
Keksinnön mukaiset uudet tuotteet mahdollistavat lisäparannuksia syöpähoitoon.The novel products of the invention allow for further improvements in the treatment of cancer.
Kuvioiden lyhyt kuvausBrief description of the figures
Kuviossa 1 esitetään yksöis- ja kaksoiskohdennettujen ja anti-CTLA-4:llä aseistettujen onkolyyttisten adenovirusten muodostaminen. Kaavamainen esitys onkolyyttisistä asenoviruksista Ad5/3-A24aCTLA4 (yksöis-kohdennettu; muut ovat kaksoiskohdennettuja), Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4, Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4-CpG, Ad5/3-E2F-A24aCTLA4 ja Ad5/3E2F-A24aCTLA4-CpG, replikoitumiskyvytön Ad5/3-aCTLA4 sekä aseistamaton on-kolyyttinen Ad5/3-A24 (positiivinen kontrolli) ja replikoitumiskyvytön Ad5/3-Luc1 (negatiivinen kontrolli).Figure 1 shows the formation of single and double targeted oncolytic adenoviruses armed with anti-CTLA-4. Schematic representation of oncolytic asenoviruses Ad5 / 3-A24aCTLA4 (single-targeted; others are double-targeted), Ad5 / 3-hTERT-A24aCTLA4, Ad5 / 3-hTERT-A24aCTLA4-CpG, Ad5 / 3-E2F-A24aCT -CpG, replication-defective Ad5 / 3-aCTLA4, as well as unarmed oncolytic Ad5 / 3-A24 (positive control) and replication-deficient Ad5 / 3-Luc1 (negative control).
Kuvioissa 2A - 2D esitetään viruksen tuottaman monoklonaalisen anti-CTLA4-vasta-aineen ilmentymisen ja toiminnan arviointi.Figures 2A-2D show an evaluation of the expression and function of the anti-CTLA4 monoclonal antibody produced by the virus.
Kuvio 2A: Viruksella infektoitujen A549- (kaistat 1 ja 2 vasemmalta oikealle) tai PC3-MM2 (kaistat 3 ja 4) -solujen seerumia sisältämättömät su-pernatantit analysoituna Western blot -määrityksellä ihmisen lg:n (sekä raskaat että kevyet ketjut) toteamiseksi spesifisesti natiiveissa (ylempi rivi) tai denaturoivissa olosuhteissa (alempi rivi). Kaistat 1 ja 3: Ad5/3-A24aCTLA4:llä infektoidut solut; kaistat 2 ja 4: Ad5/3-aCTLA4:llä infektoidut solut.Figure 2A: Serum-free supernatants from virus-infected A549 (lanes 1 and 2, left to right) or PC3-MM2 (lanes 3 and 4) analyzed by Western blot to specifically detect human Ig (both heavy and light chains). in native (upper row) or denaturing conditions (lower row). Lanes 1 and 3: Ad5 / 3-A24aCTLA4-infected cells; lanes 2 and 4: cells infected with Ad5 / 3-aCTLA4.
Kuvio 2B: Funktionaalinen määritys, joka osoittaa viruksen tuottaman monoklonaalisen anti-CTLA4-vasta-aineen aktiivisuuden. Jurkat-soluja in-kuboitiin ionomysiinin, forboli-12-myristaatti-13-asetaatin (PMA) ja rekombinan-tin ihmisen B7:n kanssa, mikä johtaa CD28- ja CTLA-4-positiivisiin soluihin, jotka muistuttavat T-soluja, joita stimuloivat antigeeniä esittelevät solut mutta joita inhiboivat suppressorisolut, tilanne, joka usein havaitaan pitkälle edenneissä kasvaimissa. Supernatantti Ad5/3-A24aCTLA4:llä tai Ad5/3-aCTLA4:llä infektoiduista soluista johti B7/CTLA-4-välitteisen suppression inhibitioon. Tämä nähdään T-solun aktivaatiomerkin, IL-2:n, lisääntyneenä tuotantona. Re- kombinantti monoklonaalinen anti-CTLA4-vasta-aine oli mukana positiivisena kontrollina.Figure 2B: Functional assay showing the activity of virus-produced monoclonal anti-CTLA4 antibody. Jurkat cells were incubated with ionomycin, phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), and recombinant human B7, resulting in CD28- and CTLA-4-positive cells resembling T cells stimulated by antigen presenting cells but inhibited by suppressor cells, a condition often found in advanced tumors. Supernatant from cells infected with Ad5 / 3-A24aCTLA4 or Ad5 / 3-aCTLA4 resulted in inhibition of B7 / CTLA-4-mediated Suppression. This is seen in the increased production of the T-cell activation mark, IL-2. The recombinant anti-CTLA4 monoclonal antibody was included as a positive control.
Kuvio 2C: Loss of function (toiminnon menetys) -määritys, joka osoittaa rekombinantin CTLA-4:n (rCTLA-4) affiniteetin viruksen tuottamaan monoklonaalisen anti-CTLA4-vasta-aineeseen. Jurkat-solut aktivoitiin kuten edellä, mutta nyt lisättiin myös rCTLA-4:ää sitomaan B7:ää, mikä estää CTLA-4:n aktivaation. Kun aCTLA4:ää sisältävä supernatantti lisättiin, rCTLA-4 estyi ja B7 kykeni sitomaan CTLA-4:ää, jolloin IL-2-tuotanto alenee. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo; tangot, SE *, P < 0,05; ***, P < 0,001.Figure 2C: Loss of function assay showing the affinity of recombinant CTLA-4 (rCTLA-4) for a virus-produced monoclonal anti-CTLA4 antibody. Jurkat cells were activated as above, but now rCTLA-4 was also added to bind B7, which prevents CTLA-4 activation. When aCTLA4-containing supernatant was added, rCTLA-4 was inhibited and B7 was able to bind CTLA-4, thereby decreasing IL-2 production. Columns, mean of three independent experiments; rods, SE *, P <0.05; ***, P <0.001.
Kuvio 2D: CTLA4:n ilmentymistasot A549-, SKOV3-ip1-, PC3-MM2-kasvainsolulinjoissa ja alhaisen kasvatuksen kasvaineksplantissa (low-passa-ge tumor explant) UT-SCC8. Kaikki kasvainsolulinjat olivat positiivisia CTLA4:n suhteen fluoresenssiavusteisessa solulajittelussa.Figure 2D: CTLA4 expression levels in A549, SKOV3-ip1, PC3-MM2 tumor cell lines and low-passage tumor explant UT-SCC8. All tumor cell lines were positive for CTLA4 in fluorescence-assisted cell sorting.
Kuvio 3 esittää anti-CTLA4:lla aseistettujen adenovirusten ja kont-rollivektoreiden solutappotehokkuuden. Kasvainsolulinjat (A) PC3-MM2, (B) SKOV3-ip1, (C) A549 ja (D) alhaisen kasvatuksen kasvaineksplantti UT-SCC8 infektoitiin. Ad5/3-A24aCTLA4:llä oli samanlainen onkolyyttinen teho kuin positiivisella kontrolliviruksella Ad5/3-A24 kaikissa solulinjoissa. Myös replikoitu-miskyvyttömällä Ad5/3-aCTLA4:llä oli kasvaimenvastaista aktiivisuutta, koska kasvainsolut ilmentävät CTLA4:ää. Pylväät, kolmoismäärityksen keskiarvo; tangot, SE. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.Figure 3 shows the cell killing efficiency of anti-CTLA4-armed adenoviruses and control vectors. Tumor cell lines (A) PC3-MM2, (B) SKOV3-ip1, (C) A549 and (D) low-growth tumor implant UT-SCC8 were infected. Ad5 / 3-A24aCTLA4 had similar oncolytic activity as the positive control virus Ad5 / 3-A24 in all cell lines. Also, replication-defective Ad5 / 3-aCTLA4 had antitumor activity because tumor cells express CTLA4. Columns, Triple Assay Mean; rods, SE. **, P <0.01; ***, P <0.001.
Kuvio 4 esittää kasvaimen kasvun suppression ja apoptoosin im-muunipuutteiseissa hiirissä, joissa oli ihmisen eturauhassyöpäksenograftit ja joita oli käsitelty monoklonaalista anti-CTLA-4-vasta-ainetta ilmentävällä onko-lyyttisellä adenoviruksella. PC3-MM2-kasvaimet (n = 8/ryhmä) muodostettiin karvattomiin hiiriin, joissa ihmisen anti-CTLA-4:llä ei ole immunologista aktiivisuutta. Siksi malli mittaa vain anti-CTLA-4:n onkolyysiä ja proapoptoottista vaikutusta. Seitsemän päivän kuluttua kasvaimia (5-8 mm halkaisijaltaan) käsiteltiin kasvaimensisäisesti 1*108 viruspartikkelilla päivinä 0, 2 ja 4 (nuolet). Mock-hiiret injektoitiin vain kasvualustoilla.Figure 4 shows tumor growth in suppression and apoptosis in immunodeficient mice bearing human prostate cancer xenografts treated with oncolytic adenovirus expressing anti-CTLA-4 monoclonal antibody. PC3-MM2 tumors (n = 8 / group) were formed in nude mice in which human anti-CTLA-4 lacks immunological activity. Therefore, the model only measures oncolysis and proapoptotic effect of anti-CTLA-4. After seven days, tumors (5-8 mm in diameter) were treated intravenously with 1x108 viral particles on days 0, 2 and 4 (arrows). Mock mice were injected with media only.
Kuvio 4A: Ad5/3-A24aCTLA4:lla oli paras kasvaimenvastainen aktiivisuus tässä erittäin aggressiivisessa mallissa. Kasvainkoko esitetään suhteessa keskimääräiseen alkuperäiseen kokoon. Pisteet, keskiarvo; tangot, SE; **, P < 0.01 (Studentin t-testi päivänä 7).Figure 4A: Ad5 / 3-A24aCTLA4 had the best antitumor activity in this highly aggressive model. The tumor size is plotted against the average original size. Score, average; rods, SE; **, P <0.01 (Student's t-test on day 7).
Kuvio 4B: Päivänä 5 kasvainten jääleikkeet värjättiin anti-CTLA4:n ilmentymisen suhteen (ihmisen IgG, ylempi rivi) tai apoptoosin suhteen (aktiivi nen kaspaasi-3, alempi rivi) immunohistokemialla (ruskea). Kuvat on otettu suurennoksella *40.Figure 4B: On day 5, ice sections of tumors were stained for anti-CTLA4 expression (human IgG, upper row) or apoptosis (active caspase-3, lower row) by immunohistochemistry (brown). Pictures were taken at a magnification of * 40.
Kuvio 4C: Päivänä 7 ihmisen lgG:n pitoisuudet Ad5/3- A24aCTLA4:llä tai Ad5/3-aCTLA4:llä käsiteltyjen hiirten kasvaimissa ja plasmassa mitattiin. Ad5/3-Ä24aCTLA4:llä käsitellyillä kasvaimilla havaittiin 81-kertaisesti enemmän anti-CTLA4-mAb:tta verrattuna Ad5/3-aCTLA4:llä käsiteltyihin kasvaimiin (p<0,05). Lisäksi 43,3-kertaisesti enemmän anti-CTLA4-mAb:tta havaittiin kasvaimissa, joita oli käsitelty Ad5/3-A24aCTLA4:llä kuin samojen eläinten plasmassa (p<0,05). Keskimääräinen plasmapitoisuus oli 392,6 pg/g (SE 312,0), mikä on alle pitoisuuksien, joita on raportoitu siedetyiksi ihmisillä, joita on hoidettu ipilimumabilla (561 pg/ml) ja vastaavasti tremeli-mumabilla, 450 pg/m, (REFS) (1 ml plasmaa painaa noin 1 g). Ad5/3-Ä24aCTLA4-kasvaimissa mAb-pitoisuus oli 16 977 pg/g ja siten paljon korkeampi kuin plasmassa. Pylväät, kolmoismääritysten keskiarvo; tangot, SE.Figure 4C: At day 7, human IgG levels in tumors and plasma of Ad5 / 3-A24aCTLA4 or Ad5 / 3-aCTLA4 treated mice were measured. Ad5 / 3-Ä24aCTLA4-treated tumors showed 81-fold higher anti-CTLA4 mAb compared to Ad5 / 3-αCTLA4-treated tumors (p <0.05). In addition, 43.3-fold more anti-CTLA4 mAb was detected in tumors treated with Ad5 / 3-A24aCTLA4 than in the plasma of the same animals (p <0.05). The mean plasma concentration was 392.6 pg / g (SE 312.0), which is below the tolerated concentrations reported in humans treated with ipilimumab (561 pg / ml) and tremel-mumab, 450 pg / m, respectively (REFS ) (1 ml of plasma weighs about 1 g). In Ad5 / 3-Ä24aCTLA4 tumors, the mAb concentration was 16,977 pg / g and thus much higher than in plasma. Columns, average of triplicate determinations; rods, SE.
Kuviossa 5 esitetään Ad5/3-Ä24aCTLA4:n välittämä lisääntynyt IL-2- ja IFN-y-tuotanto syöpäpotilaiden stimuloiduissa perifeerisen veren mono-nukleaarisisa soluissa (PBMC). Syöpäpotilaiden (potilas I244, potilas C261, potilas M158 tai potilas X258) PBMC:t stimuloitiin ionomysiinillä, PMA:lla ja re-kombinantilla ihmisen B7:llä kasvaimen indusoiman immuunisuppression matkimiseksi ja käsiteltiin suodatetuilla supernatanteilla viruksella infektoiduista PC3-MM2-soluista. IL-2 (A) ja IFN-γ (B) ovat T-soluaktivaation merkkejä, ja ne mitattiin FACS-arraylla. Rekombinantti monoklonaalinen anti-CTLA-4-vasta-aine sisällytettiin positiiviseksi kontrolliksi. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo; tangot, SE. *, P < 0,05; **, P < 0,01 ; ***, P < 0,001.Figure 5 shows the increased production of IL-2 and IFN-γ mediated by Ad5 / 3-Ä24aCTLA4 in stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in cancer patients. PBMCs from cancer patients (patient I244, patient C261, patient M158, or patient X258) were stimulated with ionomycin, PMA, and recombinant human B7 to mimic tumor-induced immune suppression and treated with filtered supernatants from virus-infected PC2-MM3. IL-2 (A) and IFN-γ (B) are indicative of T cell activation and were measured by FACS array. Recombinant monoclonal anti-CTLA-4 antibody was included as a positive control. Columns, mean of three independent experiments; rods, SE. *, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001.
Kuviossa 6 esitetään Ad5/3-A24aCTLA4:n välittämä IL-2- ja IFN-y-tuotanto terveiden luovuttajien perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC). PBMC:t kahdesta terveestä luovuttajasta stimuloitiin ionomysiinillä, PMA:lla ja rekombinantilla ihmisen B7:llä ja niitä käsiteltiin suodatetuilla supernatanteilla viruksella infektoiduista PC3-MM2-soluista. IL-2- (A) tai IFN-γ- (B) pitoisuudet kasvatusalustoissa mitattiin FACS-arraylla. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo; tangot,SE. *, P < 0,.05; ***, P < 0,001.Figure 6 shows Ad5 / 3-A24aCTLA4-mediated IL-2 and IFN-γ production in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy donors. PBMCs from two healthy donors were stimulated with ionomycin, PMA, and recombinant human B7 and treated with filtered supernatants from virus-infected PC3-MM2 cells. Concentrations of IL-2 (A) or IFN-γ (B) in the media were measured with a FACS array. Columns, mean of three independent experiments; bars, SE. *, P <0, .05; ***, P <0.001.
Kuviossa 7 esitetään kuvioissa 2, 5 ja 6 esitetyissä esimerkeissä esitettyjen anti-CTLA-4:n funktionaalisuusmääritysten kaavio. In vivo, dendriit-tisolut esittelevät antigeenejä kudosten yhteensopivuuskompleksin (MHC) kautta T-solureseptorille (TCR) T-solun pinnalla. Immuunivasteelle toleranssin sijasta tarvitaan myös kostimulaatiota. Tätä välittää (DC:iden pinnalla olevien) B7.1:n tai B7.2:n sitoutuminen CD28:aan T-solulla. T-soluaktivaatio voidaan kvantitoida IL-2:n ja IFN-γιη tuotannolla.Figure 7 is a diagram of the anti-CTLA-4 functionality assays shown in the examples shown in Figures 2, 5 and 6. In vivo, dendritic cells present antigens via the Tissue Compatibility Complex (MHC) to the T cell receptor (TCR) on the surface of the T cell. Costimulation is required instead of tolerance to the immune response. This is mediated by the binding of B7.1 or B7.2 (on the surface of DCs) to CD28 by the T cell. T cell activation can be quantified by the production of IL-2 and IFN-γιη.
Kuvio 7A: Koskemattoman immuunisysteemin puuttuessa T-solu-aktivaatio voidaan stimuloida in vitro inkuboimalla PBMC:t forboli-12-myris-taatti-13-asetaatin (PMA) ja ionomysiinin kanssa, mikä johtaa aktivaatioon, joka on riippumaton TCR-ja CD28-signaloinnista.Figure 7A: In the absence of an intact immune system, T cell activation can be stimulated by in vitro incubation of PBMCs with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) and ionomycin, leading to activation independent of TCR and CD28 signaling. .
Kuvio 7B: T-soluaktivaatiossa negatiivisena palautekontrollimeka-nismina myös CTLA-4:n ilmentyminen lisääntyy.Figure 7B: As a negative feedback control mechanism in T cell activation, expression of CTLA-4 is also increased.
Kuvio 7C: CTLA-4:lla on 10O-kertaisesti korkeampi affiniteetti kuin CD28:lla B7:ään, mikä johtaa T-solukiinniottoon.Figure 7C: CTLA-4 has a 10 0-fold higher affinity than CD28 for B7, leading to T cell uptake.
Kuvio 7D: CTLA-4-signaloinnin esto anti-CTLA-4-vasta-aineiden toimesta estää inhibition, mikä johtaa T-solujen aktivaatioon.Figure 7D: Inhibition of CTLA-4 signaling by anti-CTLA-4 antibodies inhibits inhibition leading to T cell activation.
Kuvio 7E: Kun liukoista rekombinanttia ihmisen CTLA-4:ää lisätään, anti-CTLA-4-mAb otetaan kiinni, mikä jättää B7:n vapaaksi sitoutumaan CTLA-4:ään T-solukiinniottoa varten.Figure 7E: When soluble recombinant human CTLA-4 is added, the anti-CTLA-4 mAb is captured, leaving B7 free to bind to CTLA-4 for T cell capture.
Kuvio 7F: Jos rekombinanttia CTLA-4:ää lisätään kasvatusalustaan ilman anti-CTLA4-mAb:iden läsnäoloa, se ottaa kiinni B7:n jättäen T-solun aktivoituun tilaan.Figure 7F: If recombinant CTLA-4 is added to the culture medium in the absence of anti-CTLA4 mAbs, it will capture B7, leaving the T cell in an activated state.
Kuviossa 8 esitetään spesifinen anti-CTLA4-mAb-aktiivisuus Ad5/3-A24aCTLA4:n vaikutuksesta syöpäpotilaiden stimuloiduissa perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC). Syöpäpotilaiden (potilas I244, potilas C261, potilas M158tai potilas X258) PBMC:t stimuloitiin ionomysiinillä, PMA:lla ja rekombinantilla ihmisen B7:llä ja rekombinantilla ihmisen CTLA-4:lla; ja niitä käsiteltiin suodatetuilla supernatanteilla viruksella infektoiduista PC3-MM2-soluista. IL-2- (A) tai IFN-γ- (B) pitoisuudet kasvatusalustoissa mitattiin FACS-arraylla. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo; tangot,SE. *, P < 0,05.Figure 8 shows specific anti-CTLA4 mAb activity by Ad5 / 3-A24aCTLA4 in cancer patient-stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). PBMCs of cancer patients (patient I244, patient C261, patient M158, or patient X258) were stimulated with ionomycin, PMA, and recombinant human B7 and recombinant human CTLA-4; and treated with filtered supernatants from virus-infected PC3-MM2 cells. Concentrations of IL-2 (A) or IFN-γ (B) in the media were measured with a FACS array. Columns, mean of three independent experiments; bars, SE. *, P <0.05.
Kuviossa 9 esitetään Ad5/3-A24aCTLA4:n välittämä spesifinen anti-CTLA4-mAb-aktiivisuus terveiden luovuttajien stimuloiduissa perifeerisen veren mononukleaarisisa soluissa (PBMC). PBMC:itä inkuboitiin ionomysiinin, PMA:n ja rekombinantin ihmisen B7:n kanssa, ja niitä käsiteltiin suodatetuilla supernatanteilla viruksella infektoiduista PC3-MM2-soluista. IL-2- (A) tai IFN-y-(B) pitoisuudet kasvatusalustoissa mitattiin FACS-arraylla. Pylväät, kolmen itsenäisen kokeen keskiarvo.Figure 9 shows the specific anti-CTLA4 mAb activity mediated by Ad5 / 3-A24aCTLA4 in healthy donor-stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). PBMCs were incubated with ionomycin, PMA, and recombinant human B7, and treated with filtered supernatants from virus-infected PC3-MM2 cells. Concentrations of IL-2 (A) or IFN-γ (B) in the media were measured with a FACS array. Columns, mean of three independent experiments.
Kuvio 10 osoittaa replikoitumiskykyisen mallin käyttökelpoisuuden anti-CTLA4-mAb:n ilmentymisen lisäämisessä verrattuna replikoitumiskyvyttö-mään virukseen. PC3-MM2-solut istutettiin pitoisuutena 20 000 solua kuoppaa kohti ja infektoitiin 10 viruspartikkelilla vastaavilla viruksilla. 24, 48 ja 72 tuntia infektion jälkeen supernatantit otettiin talteen ja analysoitiin ELISA:Ma ihmisen lgG:n määrän suhteen. Kolminkertainen lisäys havaittiin onkolyyttisellä viruksella Ad5/3-A24aCTLA4 verrattuna replikoitumiskyvyttömään Ad5/3-aCTLA4:ään. Pylväät, nelinkertaisten määritysten keskiarvo; tangot, SE. ***, P <0,001.Figure 10 shows the utility of a replication-capable model in increasing the expression of anti-CTLA4 mAb compared to replication-defective virus. PC3-MM2 cells were inoculated at 20,000 cells per well and infected with 10 viral particles of the respective viruses. At 24, 48 and 72 hours after infection, supernatants were harvested and analyzed by ELISA for human IgG. A threefold increase was observed with the oncolytic virus Ad5 / 3-A24aCTLA4 compared to non-replicating Ad5 / 3-aCTLA4. Columns, average of four determinations; rods, SE. ***, P <0.001.
Kuviossa 11 osoitetaan onkolyyttisen adenoviruksen, joka sisältää TLR-9:ää (toll-like receptor 9) stimuloivia CpG-molekyylejä, vaikutus keuhkosyövän ksenograftihiirimallissa. Karvattomiin hiiriin (5 hiirtä ryhmää kohti, kaksi kasvainta hiirtä kohti) istutettiin A549-soluja ja niitä käsiteltiin seuraavasti: fysiologinen suolaliuos (musta kolmio), CpG-rikas onkolyyttinen adenovirus (Ad5-A24CpG, valkoinen ympyrä), onkolyyttinen adenovirus (Ad5-A24, musta neliö), onkolyyttinen adenovirus + rekombinantit CpG-oligot (valkoinen neliö). CpG-rikas virus oli tehokkain välittämään kasvaimenvastaista immuniteettiä, ja se oli jopa tehokkaampi kuin onkolyyttinen adenovirus annettuna yhdessä re-kombinantin CpG-molekyylin kanssa.Figure 11 demonstrates the effect of an oncolytic adenovirus containing TLR-9 (toll-like receptor 9) stimulating CpG molecules in a xenograft mouse model of lung cancer. Nude mice (5 mice per group, two tumors per mouse) were implanted with A549 cells and treated as follows: saline (black triangle), CpG-rich oncolytic adenovirus (Ad5-A24CpG, white circle), oncolytic adenovirus (Ad5-A24CpG), black square), oncolytic adenovirus + recombinant CpG oligos (white square). The CpG-rich virus was most effective in transmitting anti-tumor immunity, and was even more effective than the oncolytic adenovirus when co-administered with the recombinant CpG molecule.
Kuviossa 12 esitetään tulokset MTS-solutappomäärityksestä, joka suoritettiin pernasoluilla, jotka oli otettu käsitellyistä hiiristä ajanhetkellä 72 tuntia (samat hiiret kuin kuviossa 11). Raportoidaan vielä elossa olevien A549-solujen määrä osoitettuna ajanhetkenä.Figure 12 shows the results of an MTS cell killing assay performed on spleen cells taken from treated mice at 72 hours (same mice as in Figure 11). The number of A549 cells still alive at the indicated time point is reported.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvausDetailed Description of the Invention
AdenovirusvektoriThe adenoviral vector
Ad5:ssä, kuten myös muissa adenoviruksissa, ikosahedraalinen kapsidi koostuu kolmesta pääproteiinista: heksonista (II), penton base -proteiinista (III) ja ulokkeisesta säikeestä (IV), lisäksi siinä on pieniä proteiineja; VI, Vili, IX, lila ja IVa2 (Russel W. C., J General Virol 2000;81, 2573-2604). Proteiinit VII, pienpeptidi mu ja terminaaliproteiini (TP) ovat liittyneinä DNA:han. Proteiini V tarjoaa rakennelinkin kapsidiin proteiinin VI välityksellä. Viruksen koodaama proteaasi tarvitaan joidenkin rakenneproteiinien käsittelyä varten.In Ad5, as in other adenoviruses, the icosahedral capsid is composed of three major proteins: hexone (II), penton base protein (III), and protruding strand (IV), in addition to small proteins; VI, Vili, IX, lila and IVa2 (Russel W. C., J General Virol 2000; 81, 2573-2604). Proteins VII, small peptide mu and terminal protein (TP) are linked to DNA. Protein V provides a structural link to the capsid via protein VI. A virus-encoded protease is required for processing some structural proteins.
Esillä olevan keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori perustuu adenoviruksen serotyypin 5 (Ad5) nukleiinihappopääketjuun, joka käsittää kapsidimodifikaation, kuten adenoviruksen serotyypin 3 (Ad3) ulokkeen (Ad5/3-kapsidikimerismi), 24 emäsparin deleetion (D24) E1:n Rb:tä sitovalla vakioalueella 2 ja nukleiinihapposekvenssin, joka koodaa CTLA-4:lle spesifistä täysin ihmisperäistä monoklonaalista vasta-ainetta (anti-CTLA4 mAb tai aCT-LA4) poistetun gp19k/6.7K:n tilalla E3-alueella.The oncolytic adenoviral vector of the present invention is based on an adenovirus serotype 5 (Ad5) nucleic acid backbone comprising a capsid modification such as an adenovirus serotype 3 (Ad3) protuberance (Ad5 / 3 capsid chimerism) with a 24 bp deletion (D24) E1 region: and a nucleic acid sequence encoding a fully human monoclonal antibody specific for CTLA-4 (anti-CTLA4 mAb or aCT-LA4) in place of deleted gp19k / 6.7K.
Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa adenovirusvektori perustuu ihmisen adenovirukseen.In a preferred embodiment of the invention, the adenoviral vector is based on human adenovirus.
Ad5-genomi sisältää varhaisvaiheen (E1-4), keskivaiheen (IX ja IVa2) ja myöhäisvaiheen geenejä (L1-5), joiden vasemmalla ja oikealla puolella on invertoituneita terminaalisia toistoja (LITR:iä ja vastaavasti RITR:iä), jotka sisältävät DNA:n replikaatioon tarvittavat sekvenssit. Genomi sisältää myös pakkaussignaalin (Ψ) ja MLP:n (major late promoter).The Ad5 genome contains early (E1-4), intermediate (IX and IVa2) and late (G1-5) genes with inverted terminal repeats (LITR and RITR, respectively) containing DNA: n sequences required for replication. The genome also contains the packaging signal (Ψ) and MLP (major late promoter).
Varhaisvaiheen geenin E1A transkriptio aloittaa replikaatiosyklin, jonka jälkeen E1B-, E2A-, E2B-, E3-ja E4-proteiinit ilmentyvät. E1 -proteiinit moduloivat solun metaboliaa tavalla, joka tekee solusta alttiimman virusrepli-kaatiolle. Esimerkiksi ne häiritsevät NF-κΒ-, p53- ja pRb-proteiineja. E1A ja E1B estävät yhdessä apoptoosia. E2- (E2A-ja E2B-) ja E4-geenituotteet välittävät DNA:n replikaatiota ja E4-tuotteet vaikuttavat myös viruksen RNA-metaboliaan ja estävät isännän proteiinisynteesiä. E3-geenituotteet vastaavat puolustautumisesta isännän immuunijärjestelmää vastaan, edistävät solun hajoamista ja virusjälkeläisten vapautumista (Russel W. C., J General Virol 2000;81,2573-2604).Transcription of the early stage gene E1A initiates a replication cycle, followed by expression of E1B, E2A, E2B, E3 and E4 proteins. E1 proteins modulate cell metabolism in a way that renders the cell more susceptible to viral replication. For example, they interfere with NF-κΒ, p53 and pRb proteins. E1A and E1B together inhibit apoptosis. The E2 (E2A and E2B) and E4 gene products mediate DNA replication and the E4 products also affect viral RNA metabolism and inhibit host protein synthesis. E3 gene products are responsible for defense against the host immune system, promote cell lysis and release of virus progeny (Russel W. C., J General Virol 2000; 81,2573-2604).
Keskivaiheen geenit IX ja IVa2 koodaavat viruskapsidin pieniä proteiineja. MLP vaikuttaa myöhäisvaiheen geenien L1-5 ilmentymiseen, joka johtaa viruksen rakennekomponenttien tuotantoon, viruspartikkeleiden kapsidoi-tumiseen ja kypsymiseen tumassa (Russel W. C., J General Virol 2000;81, 2573-2604).The intermediate genes IX and IVa2 encode the small proteins of the viral capsid. MLP affects the expression of late-stage genes L1-5, which results in the production of viral structural components, encapsulation and maturation of viral particles (Russel W. C., J General Virol 2000; 81, 2573-2604).
Verrattuna villityypin adenoviruksen genomiin keksinnön mukaisesta adenovirusvektorista puuttuu 24 emäsparia E1-alueen, tarkemmin sanottuna E1A-alueen, CR2:sta, ja gp19k ja 6.7K E3-alueelta ja se käsittää kapsidimodi-fikaation viruksen säikeessä. Joissakin suoritusmuodoissa verrattuna villityypin adenoviruksen genomiin, keksinnön mukainen adenovirusvektori lisäksi käsittää hTERT-promoottorin tai E2F-promoottorin E1-alueella, erityisesti ylävirtaan E1A-alueesta, ja siitä puuttuu gp19k ja 6.7K E3-alueelta. Joissakin suoritusmuodoissa keksintö sisältää myös adenoviruksen rungon, joka on rikastettu TLR-9:ää sitovilla CpG-saarekkeille, jotka on laitettu E3-alueelle (kuvio 1).Compared to the wild-type adenovirus genome, the adenoviral vector of the invention lacks 24 bp of the E1 region, more specifically the E1A region, CR2, and the gp19k and 6.7K E3 region, and comprises capsid modifications in the virus strand. In some embodiments, compared to the wild-type adenovirus genome, the adenoviral vector of the invention further comprises an hTERT promoter or an E2F promoter in the E1 region, particularly upstream of the E1A region, and lacks the gp19k and 6.7K E3 region. In some embodiments, the invention also includes an adenovirus backbone enriched in TLR-9 binding CpG islands inserted into the E3 region (Figure 1).
Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa muunnettujen/-osittaisten E1-ja E3-alueiden lisäksi keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää lisäksi yhden tai useamman alueen, jotka valitaan ryhmäs tä, joka koostuu E2:sta, E4:stä ja myöhäisvaiheen alueista. Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää seu-raavat alueet: vasen ITR, osittainen E1, plX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5, E4 ja oikea ITR. Alueet voivat olla vektorissa missä tahansa järjestyksessä, mutta eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa alueet ovat peräkkäisessä järjestyksessä 5-3’-suunnassa. Avoimet lukukehykset (ORF:t) voivat olla samassa DNA-juosteessa tai eri DNA-juosteissa. Eräässä keksinnön edullisessa sovellusmuodossa E1-alue käsittää viruksen pakkaussignaalin. Tässä yhteydessä ilmaisu "adenovirusserotyypin 5 (Ad5) nukleiini-happopääketju” tarkoittaa Ad5:n genomia tai osagenomia, joka käsittää yhden tai useampia alueita, jotka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat Ad5:stä peräisin olevat osittainen E1, plX, plVa2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, osittainen E3, L5 ja E4. Edullisessa sovellusmuodossa keksinnön mukainen vektori käsittää Ad5:n pääketjun yhdessä osan Ad3:a (esimerkiksi osan kapsidirakennetta) kanssa. Tässä yhteydessä ilmaisu "osittainen” alue tarkoittaa aluetta, josta puuttuu jokin osa verrattuna vastaavaan villityypin alueeseen. Esimerkiksi "osittainen E3” viittaa E3-alueeseen, josta puuttuu gp19k/6.7K. Tässä yhteydessä ilmaisut ”VA1” ja ”VA2” tarkoittavat virukseen liittyviä RNA:ita 1 ja 2, jotka adenovirus transkriptoi mutta jotka eivät translatoidu. VA1:Mä ja VA2:lla on osuutensa solun puolustusmekanismeja vastaan taistelemisessa. Tässä yhteydessä ilmaisu "viruksen pakkaussignaali” tarkoittaa viruksen DNA:n osaa, joka koostuu sarjasta AT-rikkaita sekvenssejä ja ohjaa kapsidoitumisprosessia. E1:n 24 emäsparin deleetio (D24) vaikuttaa CR2-domeeniin, joka on vastuussa kasvaimen suppressori/solusyklin säätelyproteiinin Rb sitomisesta ja siten sallii (S)-faasin, ts. DNA-synteesin tai replikaatiovaiheen, synteesin induktion. pRb:n ja E1A:n vuorovaikutus vaatii E1A-proteiin säilyneen alueen kahdeksan aminohappoa, 121-127 (Heise C. et ai. 2000, Nature Med 6, 1134-1139), jotka on poistettu esillä olevassa keksinnössä. Esillä olevan keksinnön mukainen vektori käsittää aminohappoja 122-129 vastaavien nukleiinihappojen deleetion Heise C. et ai.’n (2000, Nature Med 6, 1134-1139) vektorista. Viruksilla, joissa on D24, tiedetään olevan vähentynyt kyky kiertää G1-S-tarkistuspiste ja replikoituvan tehokkaasti vain soluissa, joissa tämä vuorovai kutus ei ole välttämätön, esim. kasvainsoluissa, jotka ovat puutteellisia Rb-p16-reitin suhteen (Heise C. et ai. 2000, Nature Med 6, 1134-1139; Fueyo J et ai. 2000, Oncogene 19, 2-12). E3-alue ei ole olennainen in vitro -virusreplikaatiossa, mutta E3-pro-teiineilla on tärkeä osa isännän immuunivasteen säätelyssä, toisin sanoen sekä luontaisten että spesifisten immuunivasteiden estämisessä. gp19k/6.7K-6e-leetio E3:ssa tarkoittaa 965 emäsparin deleetiota adenoviruksen E3A-alueella. Seurauksena olevassa adenovirusrakenteessa sekä gp19k- että 6.7K-geeni on poistettu (Kanerva A. et ai., Gene Therapy 2005; 12, 87-94). gp19k-geenin tuotteen tiedetään sitovan ja eristävän MHC1-molekyylejä (major histocompa-tibility complex I) solulimakalvostossa ja estävän sytotoksisia T-lymfosyyttejä tunnistamasta infektoituneita soluja. Koska monista kasvaimista puuttuu MHC1, gp19k\n deleetio lisää virusten kasvainselektiivisyyttä (virus poistetaan nopeammin kuin villityypin virus normaaleista soluista, mutta kasvainsoluissa ei ole eroa). 6.7K-proteiinit ilmentyvät solun pinnoilla ja osallistuvat TNF:n kaltaisen apoptoosia indusoivan ligandin (TRAIL) reseptorin 2 vähentämiseen.In a preferred embodiment of the invention, in addition to the modified / partial E1 and E3 regions, the oncolytic adenoviral vector of the invention further comprises one or more regions selected from the group consisting of E2, E4, and late stage regions. In a preferred embodiment of the invention, the oncolytic adenoviral vector comprises the following regions: left ITR, partial E1, p1x, p1Va2, E2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, partial E3, L5, E4 and right ITR. The regions may be in the vector in any order, but in a preferred embodiment of the invention, the regions are in a sequential order in the 5-3 'direction. Open reading frames (ORFs) may be on the same DNA strand or on different DNA strands. In a preferred embodiment of the invention, the E1 region comprises a virus compression signal. As used herein, the term "adenovirus serotype 5 (Ad5) nucleic acid backbone" means an Ad5 genome or osagenome comprising one or more regions selected from the group consisting of partial E1, p1x, p1Va2, E2, VA1 derived from Ad5 , VA2, L1, L2, L3, L4, partial E3, L5 and E4 In a preferred embodiment, the vector of the invention comprises the backbone of Ad5 together with part of Ad3 (e.g., part of the capsid structure). which is missing some element compared to the corresponding wild type region. For example, "partial E3" refers to the E3 region lacking gp19k / 6.7K. In this context, "VA1" and "VA2" refer to virus-associated RNAs 1 and 2, which are transcribed by the adenovirus but not translated. VA1 and VA2 In this context, the term "viral packaging signal" refers to a portion of the viral DNA that is made up of a series of AT-rich sequences and directs the process of encapsidation. The 24 base pair deletion of E1 (D24) affects the CR2 domain responsible for binding the tumor suppressor / cell cycle regulatory protein Rb and thus allows the induction of the synthesis of the (S) phase, i.e., DNA synthesis or replication. The interaction of pRb and E1A requires eight amino acids, 121-127 (Heise C. et al. 2000, Nature Med 6, 1134-1139), of the E1A conserved region, which have been deleted in the present invention. The vector of the present invention comprises a deletion of nucleic acids corresponding to amino acids 122-129 from the vector of Heise C. et al (2000, Nature Med 6, 1134-1139). Viruses with D24 are known to have a reduced ability to bypass the G1-S checkpoint and to replicate effectively only in cells where this interaction is not necessary, e.g., tumor cells deficient in the Rb-p16 pathway (Heise C. et al. 2000, Nature Med 6, 1134-1139; Fueyo J et al. 2000, Oncogene 19, 2-12). The E3 region is not essential for viral replication in vitro, but the E3 proteins play an important role in the regulation of the host immune response, that is, in the suppression of both natural and specific immune responses. The gp19k / 6.7K-6e deletion in E3 represents a deletion of 965 bp in the E3A region of the adenovirus. In the resulting adenovirus construct, both the gp19k and the 6.7K gene have been deleted (Kanerva A. et al., Gene Therapy 2005; 12, 87-94). The product of the gp19k gene is known to bind and isolate major histocompatibility complex I (MHC1) molecules in the mucosa and prevent cytotoxic T lymphocytes from recognizing infected cells. Because many tumors lack MHC1, deletion of gp19k increases viral tumor selectivity (virus is cleared more rapidly than wild-type virus from normal cells, but there is no difference in tumor cells). 6.7K proteins are expressed on cell surfaces and are involved in the downregulation of TNF-like apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 2.
Esillä olevassa keksinnössä CTLA4-mAb:tta koodaava cDNA sijoitetaan gp19k/6.7/f-deletoidulle E3-alueelle E3-promoottorin alaisuuteen. Tämä rajoittaa siirtogeenin ilmentymisen kasvainsoluihin, jotka sallivat viruksen repli-kaation ja sen jälkeisen E3-promoottorin aktivoinnin. E3-promoottori voi olla mikä tahansa alalla tunnettu eksogeeninen tai endogeeninen promoottori, edullisesti endogeeninen promoottori. Keksinnön eräässä edullisessa sovel-lusmuodossa anti-CTLA4-mAb:ta koodaava nukleiinihapposekvenssi on viruksen E3-promoottorin säätelyn alainen. gp 19k-de\eet\o on erityisen käyttökelpoinen CD40L:n ilmentymisen yhteydessä, koska se voi lisätä kasvainepitooppien MFlC1-esittelyä sellaisissa kasvaimissa, joissa tämä kyky säilyy. Tässä yhteydessä APC-ja T-solujen stimulaatio anti-CTLA-mAb:n vaikutuksesta voi johtaa optimaaliseen hyötyyn.In the present invention, the cDNA encoding the CTLA4 mAb is inserted into the gp19k / 6.7 / f deleted E3 region under the E3 promoter. This restricts the expression of the transgene on tumor cells, which allow replication of the virus and subsequent activation of the E3 promoter. The E3 promoter may be any exogenous or endogenous promoter known in the art, preferably an endogenous promoter. In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid sequence encoding the anti-CTLA4 mAb is under the control of the viral E3 promoter. gp 19k-de \ eet \ o is particularly useful for expression of CD40L because it can increase MF1Cl presentation of tumor epitopes in tumors that retain this ability. In this context, stimulation of APC and T cells by anti-CTLA mAb may result in optimal benefits.
Anti-CTLA4-mAb toimimalla monien eri mekanismien kautta, kuten esimerkiksi sytotoksisten T-solujen aktivaatio, regulatoristen T-solujen (T-Reg:t) vähentäminen ja CTLA-4:ää ilmentävien kasvainsolujen vaikutuksesta tapahtuvan sytotoksisten T-solujen ja antigeeniä esittelevien solujen (esim. dendriit-tisolujen) suoran immunosuppression inhibointi. Näiden 5 siirtogeenin välittämän, edellä yksityiskohtaisesti selitetyn mekanismin lisäksi viruksen onkolyytti-nen replikaatio lisää kasvaimenvastaista vaikutusta. CTLA4-mAb:tta koodaava nukleotidisekvenssi voi olla mistä tahansa eläimestä, kuten ihmisestä, apinasta, rotasta, hiirestä, koirasta tai kissasta riippuen hoidettavasta kohteesta, mutta edullisesti CTLA4-mAb:tta koodaa täysin ihmisperäinen sekvenssi ihmisten hoidon yhteydessä. CTLA4-mAb:tta koodaava nukleotidisekvenssi voi olla modifioitu sen vaikutusten parantamiseksi, tai modifioimaton, ts. villiä tyyppiä. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa CTLA4-mAb:tta koodaava nukleiinihapposekvenssi on modifioimaton.The anti-CTLA4 mAb acts through a variety of mechanisms such as activation of cytotoxic T cells, reduction of regulatory T cells (T-Regs), and cytotoxic T cells and antigen presenting cells by CTLA-4-expressing tumor cells ( inhibition of direct immunosuppression of dendritic cells). In addition to the mechanism mediated by these 5 transgenes, described in detail above, the oncolytic replication of the virus enhances the anti-tumor effect. The nucleotide sequence encoding the CTLA4 mAb can be from any animal, such as a human, monkey, rat, mouse, dog or cat depending on the subject being treated, but preferably the CTLA4 mAb is fully encoded by a human sequence. The nucleotide sequence encoding the CTLA4 mAb may be modified to enhance its effects, or unmodified, i.e., wild type. In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid sequence encoding the CTLA4 mAb is unmodified.
Eksogeenisten elementtien lisääminen saattaa lisätä vektoreiden vaikutuksia kohdesoluissa. Eksogeenisten kudos- tai kasvainspesifisten pro-moottoreiden käyttö on yleistä rekombinanteissa adenovirusvektoreissa, ja niitä voidaan käyttää hyväksi myös esillä olevassa keksinnössä Joissakin suoritusmuodoissa keksinnön mukaiset adenovirukset käsittävät hTERT:in tai hTERT:n variantin tai E2F:n E1A-alueen kontrolloimiseksi, edullisesti ylävirtaan E1A:sta. hTERT ohjaa vektorin soluihin, jotka ilmentävät telomeraasia, kun taas E2F ohjaa vektorin soluihin, joissa on Rb/p16-reitin puutteita. Tällaiset puutteet johtavat vapaan E2F:n korkeisiin ilmentymistasoihin ja E2F-promoot-torin korkeaan aktiivisuuteen. Kuitenkin viruksen replikaatio voidaan rajoittaa kohdesoluihin millä tahansa muulla sopivalla promoottorilla, joita ovat mainittuihin rajoittumatta CEA, SLP, Cox-2, Midkine, CXCR4, SCCA2 ja TTS. Ne lisätään tavallisesti kontrolloimaan E1A-aluetta, mutta sen lisäksi tai vaihtoehtoisesti muita geenejä, kuten E1B tai E4, voidaan myös säädellä. Eksogeenisiä insulaattoreita, ts. estäviä elementtejä epäspesifisiä tehostajia vastaan, vasen ITR, natiivi E1A-promoottori tai kromatiiniproteiineja, voidaan myös sisällyttää rekombinantteihin adenovirusvektoreihin. Mitä tahansa lisäkomponenttia tai modifikaatiota voidaan mahdollisesti käyttää, mutta ne eivät ole välttämättömiä esillä olevan keksinnön mukaisissa vektoreissa.Addition of exogenous elements may increase the effects of vectors on target cells. The use of exogenous tissue or tumor specific promoters is common in recombinant adenoviral vectors and may also be utilized in the present invention. In some embodiments, the adenoviruses of the invention comprise a hTERT or hTERT variant or E2F for controlling the E1A region, preferably: from. hTERT directs the vector to cells expressing telomerase, while E2F directs the vector to cells lacking the Rb / p16 pathway. Such deficiencies result in high levels of free E2F expression and high activity of the E2F promoter. However, viral replication may be restricted to target cells by any other suitable promoter, including but not limited to CEA, SLP, Cox-2, Midkine, CXCR4, SCCA2 and TTS. They are usually added to control the E1A region, but in addition or alternatively other genes such as E1B or E4 can also be regulated. Exogenous insulators, i.e., inhibitory elements against non-specific enhancers, left ITR, native E1A promoter or chromatin proteins, may also be incorporated into recombinant adenoviral vectors. Any additional component or modification may optionally be used, but are not necessary in the vectors of the present invention.
Muissa keksinnön suoritusmuodoissa keksinnön mukaisissa adenovirusvektoreissa esiintyy TLR-9:ää sitova CpG-rikas DNA-alue adenoviruksen rungossa (kuviot 1, 11, 12).In other embodiments of the invention, the adenoviral vectors of the invention exhibit a TLR-9 binding CpG-rich DNA region in the adenovirus backbone (Figures 1, 11, 12).
Keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää kap-sidimodifikaation. Useimmat aikuiset ovat altistuneet laajimmin käytetylle ade-novirusserotyypille Ad5 ja siksi immuunijärjestelmä kykenee nopeasti tuottamaan neutraloivia vasta-aineita (NAb:tä) sitä vastaan. Itse asiassa anti-Ad5-NAb:n esiintyvyys voi olla jopa 50 %. On osoitettu, että NAb voi olla indusoitunut useimpia adenoviruskapsidin immunogeenisiä proteiineja vastaan, ja toisaalta on osoitettu, että jopa pienet muutokset Ad5:n säieulokkeessa voivat sallia paon kapsidispesifiseltä NAb:lta (Särkioja M, et ai. Gene Ther. 2008; 15(12):921-9). Siten ulokkeen modifioiminen on tärkeää geeninsiirron ylläpitämiseksi tai lisäämiseksi käytettäessä adenoviruskontaktia ihmisissä.The oncolytic adenoviral vector of the invention comprises a Kap linkage modification. Most adults are exposed to the most widely used ade-novovirus serotype Ad5 and therefore the immune system is able to rapidly produce neutralizing antibodies (NAb) against it. In fact, the incidence of anti-Ad5 NAb can be up to 50%. It has been shown that NAb can be induced against most immunogenic proteins of the adenovirus capsid, and on the other hand it has been shown that even small changes in the Ad5 filament protrusion may allow escape from capsid-specific NAb (Särkioja M, et al., Gene Ther. 2008; 15 (12)). : 921-9). Thus, modification of the protuberance is important to maintain or increase gene transfer when using adenovirus contact in humans.
Lisäksi Ad5:n tiedetään sitoutuvan CAR:ksi kutsuttuun reseptoriin säikeen ulokeosan välityksellä, ja tämän ulokeosan tai säikeen modifikaatiot voivat parantaa kohdesoluun pääsyä ja aiheuttaa vahvistetun onkolyysin monissa tai joissakin syövissä (Ranki T. et ai., Int J Cancer 2007; 121, 165-174). Kapsidimodifioidut adenovirukset ovatkin edullisia välineitä parannetulle geeninsiirrolle syöpäsoluihin. Tässä yhteydessä "kapsidi” tarkoittaa viruksen proteiinikuorta, joka sisältää heksoni-, säie-ja penton base -proteiineja. Mitä tahansa kapsidimodi-fikaatiota, toisin sanoen alalla tunnettua heksoni-, säie- ja/tai penton base -proteiinien modifikaatiota, joka parantaa viruksen viemistä kasvainsoluun, voidaan hyödyntää esillä olevassa keksinnössä. Modifikaatiot voivat olla geneettisiä ja/tai fysikaalisia modifikaatioita ja sisältää mainittuihin rajoittumatta modifikaatioita, joilla lisätään ligandeja, jotka tunnistavat spesifisiä solureseptoreja ja/tai estävät natiiveja reseptoreja sitoutumasta, ja joilla korvataan adenovirusvekto-rin säie- tai ulokedomeeni toisen adenoviruksen ulokkeella (kimerismi) ja lisätään spesifisiä molekyylejä (esimerkiksi fibroblastikasvutekijä 2, FGF2) adeno-viruksiin. Näin ollen kapsidimodifikaatiot sisältävät mainittuihin rajoittumatta pienojen peptidimotiivi(e)n, peptidi(e)n, kimerismi(e)n tai mutaatio(ide)n lisäämisen säikeeseen (esimerkiksi uloke-, häntä- tai varsiosaan), heksoniin ja/tai penton base -yksikköön. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kimerismi, integriiniä sitovan alueen (RGD:n) in-sertio ja/tai hepariinisulfaattia sitovan polylysiinin modifikaatio säikeeseen. Keksinnön erityisessä suoritusmuodossa kapsidimodifikaatio on Ad5/3-kime-rismi. Tässä yhteydessä kapsidin ”Ad5/3-kimerismi” tarkoittaa kimerismiä, jossa säikeen ulokeosa on Ad-serotyyppi 3:sta ja loppusäie on Ad-serotyyppi 5:stä.In addition, Ad5 is known to bind to a receptor called a CAR through a fiber protrusion, and modifications of this protrusion or fiber may improve target cell entry and result in enhanced oncolysis in many or some cancers (Ranki T. et al., Int J Cancer 2007; 121, 165- 174). Indeed, capsid-modified adenoviruses are preferred tools for improved gene transfer to cancer cells. As used herein, "capsid" means a viral protein coat containing hexon, filament and penton base proteins. Any capsid modulation, i.e., modification of the hexon, filament and / or penton base proteins known in the art to enhance virus delivery Modifications may be genetic and / or physical modifications and include, but are not limited to, modifications that add ligands that recognize specific cellular receptors and / or inhibit native receptors for binding, and substitute for adenoviral or non-adenoviral vector. adenovirus protrusion (chimerism) and specific molecules (e.g., fibroblast growth factor 2, FGF2) are added to adeno viruses. Thus, the capsid modifications include, but are not limited to, small peptide motif (s), peptide (s), chimerism (s) or mutation (s). to increase n thread (e.g., protrusion, tail or shaft), hexone and / or penton base unit. In a preferred embodiment of the invention, the capsid modification is Ad5 / 3 chimerism, insertion of an integrin binding region (RGD), and / or modification of a heparin sulfate binding polylysine into a strand. In a particular embodiment of the invention, the capsid modification is Ad5 / 3-Kime. In this context, "Ad5 / 3 chimerism" of the capsid means chimerism in which the protrusion of the strand is Ad serotype 3 and the end strand is Ad serotype 5.
Keksinnön mukainen vektori voi sisältää myös muita modifikaatioita, kuten E1B-alueen modifikaatioita. Tässä yhteydessä ”RGD” tarkoittaa arginiini-glysiini-asparagiini-happo (RGD) -motiivia, joka on paljastettuna penton base -yksikön pinnalla ja toimii vuorovaikutteisesti adenoviruksen internalisaatiota tukevien solun α-ν-β-integriinien kanssa. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kapsi- dimodifikaatio on RGD-4C-modifikaatio. ”RGD-4C-modifikaatio” tarkoittaa hete-rologisen integriiniä sitovan RGD-4C-motiivin insertiota säikeen ulokealueen Hl-silmukkaan. 4C tarkoittaa neljää kysteiiniä, jotka muodostavat rikkisiltoja RGD-4C:ssä. RGD-4C-peptidin sisältävää säiettä koodaavan rekombinantti-Ad5-säiegeenin rakentaminen kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkiksi Dmit-riev I. et ai:n artikkelissa (Journal ofVirology 1998; 72, 9706-9713). Tässä yhteydessä "heparaanisulfaattia sitova polylysiinimodifikaatio” tarkoittaa seitsemän lysiinin jakson lisäämistä säieulokkeen C-päähän.The vector of the invention may also contain other modifications, such as modifications of the E1B region. In this context, "RGD" refers to the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) motif revealed on the surface of the penton base unit and interacts with cellular α-ν-β integrins that support adenovirus internalization. In a preferred embodiment of the invention, the capsid modification is an RGD-4C modification. "RGD-4C modification" refers to the insertion of the heterologous integrin-binding RGD-4C motif into the H1 loop of the filament region. 4C refers to the four cysteines that form sulfur bridges in RGD-4C. The construction of a recombinant Ad5 filament gene encoding a strand containing a RGD-4C peptide is described in detail, for example, in an article by Dmitry I. et al. (Journal of Virology 1998; 72, 9706-9713). In this context, "heparan sulfate binding polylysine modification" means the addition of seven cycles of lysine to the C-terminus of a filament.
Ekspressiokasetteja käytetään siirtogeenien ilmentämisessä kohteessa, esimerkiksi solussa, käyttämällä vektoreita. Tässä yhteydessä ilmaisu "ekspressiokasetti” tarkoittaa DNA-vektoria tai sen osaa, joka käsittää cDNA:ita tai geenejä koodaavia nukleotidisekvenssejä tai mainittujen cDNA:iden tai geenien ilmentymistä ohjaavia ja/tai sääteleviä nukleotidisekvenssejä. Samanlaisia tai erilaisia ekspressiokasetteja voidaan insertoida yhteen vektoriin tai useampaan erilaiseen vektoriin. Esillä olevan keksinnön mukaiset Ad5-vektorit voivat käsittää joko useita ekspressiokasetteja tai yhden ekspressiokasetin. Vain yksi ekspressiokasetti on kuitenkin riittävä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää ainakin yhden ekspressiokasetin. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori käsittää vain yhden ekspressiokasetin.Expression cassettes are used to express transgenes in a subject, e.g., a cell, using vectors. As used herein, the term "expression cassette" means a DNA vector or portion thereof comprising nucleotide sequences encoding cDNAs or genes or nucleotide sequences that direct and / or regulate expression of said cDNAs or genes. The same or different expression cassettes may be inserted into one or more vectors The Ad5 vectors of the present invention may comprise either multiple expression cassettes or a single expression cassette, however, only one expression cassette is sufficient In one preferred embodiment of the invention, the oncolytic adenoviral vector comprises at least one expression cassette, In one preferred embodiment, the oncolytic adenoviral vector comprises only one expression cassette.
Keksinnön mukaisen adenovirusvektorin käsittävä solu voi olla mikä tahansa solu, esimerkiksi eukaryoottisolu, bakteerisolu, eläinsolu, ihmissolu, hiirisolu ja niin edelleen. Solu voi olla in vitro-, ex vivo- tai in vivo -solu. Solua voidaan esimerkiksi käyttää adenovirusvektorin tuottamiseen in vitro, ex vivo tai in vivo tai solu voi olla kohde, esimerkiksi kasvainsolu, joka on infektoitu adenovirusvektorilla.The cell comprising the adenoviral vector of the invention may be any cell, for example a eukaryotic cell, a bacterial cell, an animal cell, a human cell, a mouse cell and so on. The cell may be an in vitro, ex vivo or in vivo cell. For example, the cell may be used to produce an adenoviral vector in vitro, ex vivo or in vivo, or the cell may be a target, e.g., a tumor cell infected with the adenoviral vector.
Menetelmässä CTLA4-mAb:ien tuottamiseksi solussa keksinnön mukaisen vektorin käsittävä kuljetin kuljetetaan soluun, ja CTLA4-mAb-geeni ilmennetään ja proteiini translatoidaan ja sekretoidaan parakriinisesti. "Kuljetin” voi olla mikä tahansa virusvektori, plasmidi tai muu väline, kuten partikkeli, joka kykenee kuljettamaan keksinnön mukaisen vektorin kohdesoluun. Mitä tahansa alalla tunnettua tavanomaista menetelmää voidaan käyttää vektorin kuljettamisessa soluun.In a method for producing CTLA4 mAbs in a cell, a vehicle comprising the vector of the invention is delivered to a cell, and the CTLA4 mAb gene is expressed and the protein is paracrine translated and secreted. A "vehicle" can be any viral vector, plasmid or other medium, such as a particle, capable of delivering a vector of the invention to a target cell. Any conventional method known in the art can be used to deliver a vector to a cell.
Esillä olevalla keksinnöllä voidaan lisätä kasvainspesifistä immuunivastetta kohteessa. Sytotoksisten T-solujen aktivaatio, regulatoristen T-solujen (T-Reg:t) vähentäminen ja CTLA-4:ää ilmentävien kasvainsolujen suoraa syto- toksisten T-solujen ja dendriittisolujen immunosuppression inhibointi tapahtuu seurauksena CTLA4-mAb:n ilmentymisestä.The present invention can enhance the tumor-specific immune response in a subject. Activation of cytotoxic T cells, reduction of regulatory T cells (T-Regs), and direct inhibition of immunosuppression of CTLA-4-expressing tumor cells and dendritic cells results from the expression of CTLA4 mAb.
Keksinnön vaikutusten seuraamiseksi tai tutkimiseksi voidaan määrittää erilaisia immuunivasteen parametreja. Yleisimpiä merkkejä ovat esimerkiksi mainittuihin rajoittumatta muutokset kasvain- tai adenovirusspesifisissä sytotoksisissa T-soluissa veressä tai kasvaimissa. Antigeeniä esittelevien solujen rekrytointia ja aktivaatiota voidaan tutkia kasvaimissa tai imukudoksessa. Lisäksi voidaan tutkia regulatoristen solujen alaryhmiä (esim. regulatorisia T-soluja) lukumäärän tai aktiivisuuden suhteen. Seerumin sytokiiniprofiilit voivat valaista Th1/Th2-ympäristöä, mikä myös on tärkeää immuunisuus versus toleranssille. Näiden merkkiaineiden tasoja voidaan tutkia minkä tahansa alalla tunnetun tavanomaisen menetelmän mukaisesti mukaan lukien mutta mainittuihin rajoittumatta menetelmät, jotka hyödyntävät vasta-aineita, koettimia, alukkeita ja niin edelleen, esimerkiksi ELISPOT-määritys, tetrameerianalyysi, pentameerianalyysi, solunsisäinen sytokiinivärjäys, vasta-aineiden analyysi veressä ja veren tai kasvainten eri solutyyppien analyysi.Various immune response parameters may be determined to monitor or investigate the effects of the invention. The most common signs include, but are not limited to, changes in tumor or adenovirus specific cytotoxic T cells in blood or tumors. Recruitment and activation of antigen presenting cells can be studied in tumors or lymphoid tissue. In addition, subgroups of regulatory cells (e.g., regulatory T cells) can be examined for number or activity. Serum cytokine profiles can illuminate the Th1 / Th2 environment, which is also important for immunity versus tolerance. The levels of these markers can be assayed according to any conventional method known in the art, including, but not limited to, methods utilizing antibodies, probes, primers and the like, e.g., ELISPOT assay, tetramer assay, pentamer assay, intracellular cytokine staining, antibody assay. analysis of different cell types of blood or tumors.
SyöpäCancer
Keksinnön mukaiset rekombinantit Ad5/3-vektorit on rakennettu kykeneviksi replikoitumaan soluissa, joissa on puutteita Rb-reitissä, erityisesti Rb-p16-reitissä. Nämä puutteiset solut sisältävät kaikki kasvainsolut eläimissä ja ihmisissä (Sherr C.J. 1996, Science 274, 1672-1677). Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa vektori kykenee replikoitumaan selektiivisesti soluissa, joissa on puutteita Rb-reitissä. Tässä käytettynä “puutteita Rb-reiteissä” viittaa mutaatioihin ja/tai epigeneettisiin muutoksiin missä tahansa reitin geeneistä tai proteiineista. Näiden puutteiden johdosta kasvainsolut yli-ilmentävät E2F:ääja siten Rb:n sitominen E1A-CR2:n toimesta, mitä normaalisti tarvitaan tehokkaaseen replikaatioon tarvittavan E2F:n vapauttamiseksi, on tarpeeton.The recombinant Ad5 / 3 vectors of the invention are engineered to be capable of replication in cells lacking the Rb pathway, especially the Rb-p16 pathway. These deficient cells include all tumor cells in animals and humans (Sherr C.J. 1996, Science 274, 1672-1677). In a preferred embodiment of the invention, the vector is capable of selectively replicating in cells deficient in the Rb pathway. As used herein, "deficiencies in Rb pathways" refers to mutations and / or epigenetic changes in any of the genes or proteins of the pathway. Due to these deficiencies, E2F is overexpressed by tumor cells and thus binding of Rb by E1A-CR2, which is normally required to release E2F required for efficient replication, is redundant.
Jotkut keksinnön mukaiset onkolyyttiset adenovirusvektorit on lisäksi rakennettu kykeneviksi replikoitumaan soluissa, jotka ilmentävät ihmisen te-lomeraasin käänteistranskriptaasia (hTERT), joka on ihmisen telomeraasin katalyyttinen aladomeeni. Näihin sisältyy yli 85 % ihmisen kasvaimista, joiden havaitaan lisäävän hTERT-geenin ja sen promoottorin ilmentymistä, kun taas useimmista aikuisten somaattisista soluista telomeraasi puuttuu tai sitä ilmentyy lyhytaikaisesti erittäin matalina entsyymipitoisuuksina. (Shay ja Bacchetti 1997, Eur J Cancer 33:787-791). Tällaiset Rb-p16-reittipuutteiset/hTERT-pro-mottori-yhdistelmät voivat kohdentua mihin tahansa syöpään tai kasvaimeen mukaan lukien sekä pahalaatuiset että hyvälaatuiset kasvaimet, samoin kuin geeniterapian kohteena voivat olla primaariset kasvaimet ja metastaasit. E2F-transkriptiotekijät säätelevät monimuotoisen geenijoukon ilmentymistä, jotka geenit ovat mukana kasvun kontrollointiin liittyvissä avaintapahtumissa soluissa (Johnson ja Schneider-Broussard 1998, Role of E2F in cell cycle Control and cancer, Front Biosci. 1998 huhtikuu 27;3:d447-8; Muller ja Helin 2000, The E2F transcription factors: key regulators of cell proliferation, Biochim Biophys Acta. 2000 Helmikuu 14;1470(1):M1-12).In addition, some of the oncolytic adenoviral vectors of the invention have been engineered to be capable of replication in cells expressing human telomerase reverse transcriptase (hTERT), a catalytic subdomain of human telomerase. These include more than 85% of human tumors that are found to increase expression of the hTERT gene and its promoter, while most adult somatic cells lack or transiently express very low levels of enzymes. (Shay and Bacchetti 1997, Eur J Cancer 33: 787-791). Such Rb-p16 pathway-deficient / hTERT-promoter combinations can target any type of cancer or tumor, including both malignant and benign tumors, and may target primary tumors and metastases. E2F transcription factors regulate the expression of a diverse set of genes involved in key growth-controlling events in cells (Johnson and Schneider-Broussard 1998, Role of E2F in Cell Cycle Control and Cancer, Front Biosci 1998 Apr 27; 3: d447-8; Muller and; Helin 2000, The E2F transcription factors: key regulators of cell proliferation, Biochim Biophys Acta 2000 Feb 14; 1470 (1): M1-12).
Ei-jakautumisvaiheessa olevissa (non-cycling) normaalisoluissa E2F jää kiinni pRb/E2F-komplekseihin ja siten vähän vapaata E2F:ää on vapaasti saatavilla. pRb-reitti on katkaistu lähes kaikissa ihmisen syövissä johtaen vapaaseen E2F:ään useimmissa syövissä, mikä osoittaa sen merkitystä fysiologisen kasvun kontrolloinnissa. Reitti voidaan katkaista mutaatiolla missä tahansa monista eri molekyyleistä. Kuitenkin yleinen piirre on seurauksena oleva E2F-promottorin aktivaatio lisääntyneiden E2F-pitoisuuksien aikaansaamiseksi. E2F sitoo monien kohdegeenien promoottoria, mutta sen toiminnalle on tärkeä myös autoaktivaatio. Siksi soluissa, jotka eivät ole toimintakykyisiä p16/Rb:n suhteen, esiintyy korkeita E2F-pitoisuuksia, jotka monistuvat edelleen E2F:n sitoutumisen kautta promoottoriinsa (Hanahan ja VVeinberg 2000, Cell 7; 100(1 ):57—70; Johnson et ai. 2002, Cancer Cell 1(4):325-37).In non-cycling normal cells, E2F is trapped in pRb / E2F complexes and thus little free E2F is freely available. The pRb pathway has been cleaved in almost all human cancers, leading to free E2F in most cancers, indicating its importance in controlling physiological growth. The pathway can be cut by mutation in any of a number of different molecules. However, a common feature is the resulting activation of the E2F promoter to provide increased E2F levels. E2F binds the promoter of many target genes, but autoactivation is also important for its function. Therefore, cells inactive for p16 / Rb exhibit high levels of E2F, which are further amplified through binding of E2F to their promoter (Hanahan and Weinberg 2000, Cell 7; 100 (1): 57-70; Johnson et al. ., 2002, Cancer Cell 1 (4): 325-37).
Kuitenkin, jos adenoviruksen E1A:ta kontrolloidaan E2F-promootto-rilla (kuten esimerkiksi patenttijulkaisussa US 2008118470 A1), on olemassa riski itse-monistuvalle pahalle silmukalle, jollei samanaikaisesti käytetä E1A/Rb:tä poistavaa D24-deleetiota. Spesifisesti jopa normaalisoluissa läsnä olevat matalat pitoisuudet E2F:ää sitoutuisivat E2F-promoottoriin, mikä johtaa E1A:n ilmentymiseen, mikä johtaa E2F:n lisävapautumiseen pRb/E2F-kom-plekseista, mikä johtaa lisääntyneeseen E2F-promoottorin aktivaatioon ja siten suurempaan määrään E1A:ta. Siten ilman D24-deleetiota, joka katkaisee E1A:n sitoutumisen pRb:hen, E2F-promootti johtaa onkolyyttisiin adenoviruk-siin, jotka voivat replikoitua myös normaaleissa soluissa, millä saattaisi olla turvallisuusvaikutuksia.However, if E1A of the adenovirus is controlled by the E2F promoter (such as, for example, US 2008118470 A1), there is a risk of self-replicating a bad loop unless a D24 deletion of E1A / Rb is used concurrently. Specifically, low levels of E2F present even in normal cells would bind to the E2F promoter, leading to E1A expression leading to further release of E2F from the pRb / E2F complexes, leading to increased activation of the E2F promoter and thus greater E1F activation. . Thus, in the absence of the D24 deletion, which interrupts the binding of E1A to pRb, the E2F promoter results in oncolytic adenoviruses, which can also replicate in normal cells, which may have safety effects.
Metyloitumaton kaksisäikeinen DNA voi stimuloida TLR9:ää, endo-somaalista reseptoria, joka yhdistää luontaisen ja hankitun immuunivasteen. CpG-rikkaiden alueiden lisääminen adenoviruksen runkoon lisää adenoviruksen kykyä stimuloida TLR9:ää antigeeniä esittelevissä soluissa siten lisäten T- solustimulaatiota ja kypsymistä samoin kuin NK-aktivaatiota (Nayak S, Herzog RW. Gene Ther. 2010 Mar; 17(3):295-304).Non-methylated double-stranded DNA can stimulate TLR9, an endo-somatic receptor that combines an innate and acquired immune response. Addition of CpG-rich regions to the adenovirus backbone enhances the adenovirus's ability to stimulate TLR9 in antigen presenting cells, thereby increasing T-cell stimulation and maturation as well as NK activation (Nayak S, Herzog RW. Gene Ther. 2010 Mar; 17 (3): 295-304 ).
Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa syöpä on mikä tahansa kiinteä kasvain. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa syöpä valitaan ryhmästä, johon kuuluvat nasofaryngeaalinen syöpä, synoviaa-linen syöpä, hepatosellulaarinen syöpä, munuaissyöpä, sidekudossyöpä, melanooma, keuhkosyöpä, suolistosyöpä, paksusuolen syöpä, peräsuolen syöpä, kolorektaalinen syöpä, aivosyöpä, kurkkusyöpä, suusyöpä, maksasyöpä, luu-syöpä, haimasyöpä, istukkasyöpä, gastrinooma, feokromosytooma, prolakti-nooma, T-soluleukemia/lymfooma, neurooma, von hippel-lindaun tauti, zollin-ger-ellisonin oireyhtymä, lisämunuaissyöpä, anaalinen syöpä, sappitien syöpä, virtsarakon syöpä, virtsajohtimen syöpä, oligodendrogliooma, neuroblastooma, meningiooma, selkäydinkasvain, osteokondrooma, kondrosarkooma, Evvingin sarkooma, tuntemattoman primäärisijainnin syöpä, karsinoidi, maha-suolikana-van karsinoidi, fibrosarkooma, rintasyöpä, Pagetin tauti, kohdunkaulan syöpä, ruokatorven syöpä, sappirakon syöpä, pään syöpä, silmäsyöpä, niskasyöpä, munuaissyöpä, VVilmsin kasvain, Kaposin sarkooma, eturauhassyöpä, kives-syöpä, Hodgkinin tauti, non-Hodgkinin lymfooma, ihosyöpä, mesoteliooma, multippeli myelooma, munasarjasyöpä, endokriininen haimasyöpä, gluka-gonooma, haimasyöpä, paratyroidinen syöpä, penissyöpä, aivolisäkesyöpä, pehmytkudossarkooma, retinoblastooma, ohutsuolisyöpä, mahalaukkusyöpä, kateenkorvasyöpä, kilpirauhassyöpä, trofoblastisyöpä, rypäleraskaus, kohtu-syöpä, endometriaalinen syöpä, emätinsyöpä, ulkosynnytinsyöpä, kuuloher-mokasvain, mucosis fungoides, insulinooma, karsinoidioireyhtymä, somatosta-tinooma, iensyöpä, sydänsyöpä, huulisyöpä, kalvosyöpä, suusyöpä, her-mosyöpä, suulakisyöpä, korvasylkirauhassyöpä, vatsakalvosyöpä, nielusyöpä, pleuraalinen syöpä, sylkirauhassyöpä, kielisyöpä ja risasyöpä.In a particular embodiment of the invention, the cancer is any solid tumor. In one advantageous embodiment, the cancer is selected from the group consisting of nasopharyngeal cancer, synovia-alkaline cancer, hepatocellular cancer, kidney cancer, connective tissue cancer, melanoma, lung cancer, bowel cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, brain cancer, throat cancer, oral cancer, liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, placental cancer, gastrinoma, pheochromocytoma, prolactoma, T-cell leukemia / lymphoma, neuroma, von Hippel-Lindau disease, zollin-ger-ellison syndrome, adrenal cancer, anal cancer, gallbladder cancer, urinary tract , neuroblastoma, meningioma, spinal neoplasm, osteochondromoma, chondrosarcoma, Evving's sarcoma, cancer of unknown primary location, carcinoid, gastrointestinal carcinoid, fibrosarcoma, breast cancer, Paget's disease, cervical cancer, cancer of the esophagus, esophageal cancer, head, neck cancer, kidney cancer, Wilms tumor, Kaposi's sarcoma, prostate cancer, testicular cancer, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, skin cancer, mesothelioma, multiple myeloma, ovarian cancer, endocrine pancreatic cancer, endocrine pancreatic cancer, , soft tissue sarcoma, retinoblastoma, small intestine cancer, stomach cancer, thymic carcinoma, thyroid cancer, trofoblastisyöpä, hydatidiform mole, uterine cancer, endometrial cancer, vulval, ulkosynnytinsyöpä, kuuloher-mokasvain, mucosis fungoides, insulinoma, carcinoid syndrome, somatostatin-tinooma, iensyöpä, heart cancer, lip cancer, the membrane of cancer , oral cancer, hormone cancer, palatine cancer, parathyroid cancer, peritoneal cancer, pharyngeal cancer, pleural cancer, salivary gland cancer, tongue cancer and tonsillectomy.
Farmaseuttinen koostumusPharmaceutical composition
Keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus käsittää ainakin yhtä keksinnön mukaista vektorityyppiä. Lisäksi koostumus voi käsittää ainakin kahta, kolmea tai neljää keksinnön mukaista eri vektoria. Keksinnön mukaisen vektorin lisäksi farmaseuttinen koostumus voi käsittää myös muita vektoreita kuten muita adenovirusvektoreita, kuten julkaisussa US2010166799 A1 kuvattuja vektoreita, muita terapeuttisesti tehokkaita aineita, muita aineita, kuten farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia, puskureita, apuaineita, adjuvantteja, antisepteja, täyte-, stabilointi- tai sakeutusaineita ja/tai mitä tahansa komponentteja, joita on normaalisti vastaavissa tuotteissa.The pharmaceutical composition of the invention comprises at least one type of vector of the invention. In addition, the composition may comprise at least two, three or four different vectors of the invention. In addition to the vector of the invention, the pharmaceutical composition may also comprise other vectors such as other adenoviral vectors such as those described in US2010166799 A1, other therapeutically effective agents, other agents such as pharmaceutically acceptable carriers, buffers, adjuvants, adjuvants, antiseptics, and / or any components normally present in similar products.
Farmaseuttinen koostumus voi olla muodoltaan millainen tahansa annettavaksi sopiva koostumus, esimerkiksi kiinteä, puolikiinteä, tai nestemäinen. Formulaatio voidaan valita ryhmästä, joka koostuu mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta liuoksista, emulsioista, suspensioista, tableteista, pelleteistä ja kapseleista.The pharmaceutical composition may be in any form suitable for administration, for example solid, semi-solid, or liquid. The formulation may be selected from the group consisting of, but not limited to solutions, emulsions, suspensions, tablets, pellets, and capsules.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttinen adenovirusvektori tai farmaseuttinen koostumus toimii in situ -syöpärokot-teena. Tässä yhteydessä "in situ -syöpärokote” tarkoittaa syöpärokotetta, joka sekä tappaa kasvainsoluja että lisää immuunivastetta kasvainsoluja vastaan. Virusreplikaatio on voimakas vaaranmerkki immuunijärjestelmälle (tarpeellinen TH1 -tyyppiselle sytotoksiselle T-soluvasteelle) ja toimii siten voimakkaana ko-stimulatorisena tekijänä APC:iden kypsymiselle ja aktivoinnille ja NK-solujen rekrytoinnille.In a preferred embodiment of the invention, the oncolytic adenoviral vector or pharmaceutical composition acts as an in situ cancer vaccine. In this context, "in situ cancer vaccine" means a cancer vaccine that both kills tumor cells and enhances the immune response against tumor cells. Viral replication is a potent sign of danger to the immune system (necessary for TH1-type cytotoxic T cell response) and thus acts as a potent co-stimulatory factor. and NK cell recruitment.
Kriittinen havainto kasvainimmunologian alalla on se, että kasvai-menvastaisen immuunivasteen induktio ei ole riittävä terapeuttiselle vaikutukselle. Sen sijaan on kriittistä myös vähentää kasvaimen välittämää immuuni-suppressiota. Kasvainsolujen hajoaminen auttaa myös esittelemään kasvain-fragmentteja ja -epitooppeja APC:ille ja inflammaatio tuottaa lisää kostimu-laatiota. Siten epitooppiriippumaton (eli-ei HLA-rajoitettu) vaste tuotetaan kunkin kasvaimen yhteydessä ja näin ollen tapahtuu in situ. Kasvainspesifinen immuunivaste aktivoituu kohdesolussa sallien tämän jälkeen kasvaimenvas-taisten vaikutusten tapahtumisen koko kohteen tasolla, esim. kaukaisissa etäpesäkkeissä.A critical finding in the field of tumor immunology is that the induction of an anti-tumor immune response is not sufficient for a therapeutic effect. Instead, it is also critical to reduce tumor-mediated immune suppression. Tumor cell lysis also helps to present tumor fragments and epitopes to APCs and inflammation produces more costimulation. Thus, an epitope-independent (i.e., non-HLA-restricted) response is generated with each tumor and thus occurs in situ. The tumor-specific immune response is activated in the target cell, subsequently allowing anti-tumor effects to occur at the entire target level, e.g., distant metastases.
Vektoreiden tehokas annos riippuu monista tekijästä, kuten esimerkiksi hoitoa tarvitsevasta kohteesta, kasvaimen tyypistä, kasvaimen sijainnista ja kasvaimen luokasta. Annos voi vaihdella esimerkiksi noin 108 viruspartikke-lista (VP:stä) noin 1014 VP:hen, edullisesti noin 5x109 VP:stä noin 1013 VP:hen ja edullisemmin noin 8x109 VP:stä noin 1012VP:hen. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa annos on noin 5x101°-5x1011 VP.The effective dose of vectors depends on many factors, such as the subject to be treated, the type of tumor, the location of the tumor, and the category of the tumor. For example, the dose may vary from about 108 viral particles (VP) to about 1014 VP, preferably from about 5x109 VP to about 1013 VP, and more preferably from about 8x109 VP to about 1012VP. In one particular embodiment of the invention, the dosage is about 5x101 ° -5x1011 VP.
Farmaseuttisia koostumuksia voidaan tuottaa millä tahansa alalla tunnetulla tavanomaisella menetelmällä, esimerkiksi hyödyntämällä jotakin seuraavista: erä-, panossyöttö- ja perfuusiokasvatusmoodit, pylväskromato-gradiapuhdistus, CsCI-gradienttipuhdistus ja perfuusiomoodit leikkaustehol-taan alhaisissa soluretentiolaitteissa.The pharmaceutical compositions can be produced by any of the conventional methods known in the art, for example, using one of the following: batch, batch feed and perfusion cultivation modes, column chromatography gradient purification, CsCl gradient purification and perfusion modes in low-throughput solids.
AntoAllocation
Keksinnön mukainen vektori tai farmaseuttinen koostumus voidaan antaa mille tahansa eukaryoottiselle kohteelle, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu kasveista, elämistä ja ihmisistä. Keksinnön eräässä edullisessa sovel-lusmuodossa kohde on ihminen tai eläin. Eläin voidaan valita ryhmästä, joka koostuu lemmikkieläimistä, kotieläimistä ja tuotantoeläimistä.The vector or pharmaceutical composition of the invention may be administered to any eukaryotic subject selected from the group consisting of plants, living and humans. In a preferred embodiment of the invention, the subject is a human or animal. The animal may be selected from the group consisting of pet animals, domestic animals, and farm animals.
Vektorin tai koostumuksen antamisessa kohteeseen voidaan käyttää mitä tahansa tavanomaista menetelmää. Antoreitti riippuu koostumuksen formulaatiosta tai muodosta, taudista, kasvainten sijainnista, potilaasta, liitännäissairauksista ja muista tekijöistä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellus-muodossa anto suoritetaan kasvaimensisäisellä, lihaksensisäisellä, valtimonsisäisellä, laskimonsisäisellä, keuhkopussinsisäisellä, rakkulansisäisellä, onte-lonsisäisellä tai peritoneaalisella injektiolla tai suun kautta.Any conventional method of administering a vector or composition to a subject can be used. The route of administration will depend on the formulation or form of the composition, the disease, the location of the tumors, the patient, the comorbidities, and other factors. In a preferred embodiment of the invention, administration is by intravenous, intramuscular, intra-arterial, intravenous, pleural, intracellular, intrathecal or peritoneal injection or oral administration.
Jo yhdellä keksinnön mukaisen onkolyyttisen adenovirusvektorin antamisella voidaan saada hoitovaikutuksia. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia annetaan kuitenkin useita kertoja hoitojakson aikana. Onkolyyttisiä adenovirusvektoreita tai farmaseuttisia koostumuksia voidaan antaa esimerkiksi 1-10 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, neljän viikon ensimmäisen aikana, kuukausittain tai hoitojakson aikana. Keksinnön eräässä sovellus-muodossa niitä annetaan 3-7 kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, sitten neljännellä viikolla ja sitten kuukausittain. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa niitä annetaan neljä kertaa kahden ensimmäisen viikon aikana, sitten neljännellä viikolla ja sitten kuukausittain. Hoitojakson pituus voi vaihdella ja kestää esimerkiksi 2-12 kuukautta tai pidempään.Even one administration of the oncolytic adenoviral vector of the invention can provide therapeutic effects. However, in a preferred embodiment of the invention, the oncolytic adenoviral vectors or pharmaceutical compositions are administered several times during a treatment period. Oncolytic adenoviral vectors or pharmaceutical compositions may be administered, for example, 1 to 10 times during the first two weeks, during the first four weeks, monthly or during a treatment period. In one embodiment of the invention, they are administered 3 to 7 times in the first two weeks, then in the fourth week and then monthly. In one particular embodiment of the invention, they are administered four times in the first two weeks, then in the fourth week and then monthly. The length of the treatment period can vary, for example from 2 to 12 months or longer.
Lisäksi keksinnön mukaisten onkolyyttisten adenovirusvektoreiden anto voidaan edullisesti yhdistää muiden onkolyyttisten adenoviruvektoreiden, kuten julkaisussa US201066799 A1 kuvattujen vektoreiden, antoon. Anto voi olla samanaikaista tai peräkkäistä.In addition, administration of the oncolytic adenoviral vectors of the invention may advantageously be combined with administration of other oncolytic adenoviral vectors, such as those described in US201066799 A1. The administration may be simultaneous or sequential.
Jotta vältetään neutraloivat vasta-aineet kohteessa, keksinnön mukaiset vektorit voivat vaihdella hoitojen välillä. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa kohteelle annetaan onkolyyttisiä adenovirusvektoria, jossa on erilainen kapsidin säieuloke verrattuna aikaisemman hoidon vektoriin nähden. Tässä yhteydessä "kapsidin säieuloke” tarkoittaa säieproteiinin ulokeosaa (kuvio 1a). Vaihtoehtoisesti viruksen koko kapsidi voidaan vaihtaa eri serotyy-pin kapsidiksi.To avoid neutralizing antibodies in a subject, the vectors of the invention may vary between treatments. In a preferred embodiment of the invention, the subject is provided with an oncolytic adenoviral vector having a different capsular filament protrusion compared to the prior treatment vector. In this context, the "capsular filament protrusion" refers to the protrusion portion of the filament protein (Figure 1a).
Keksinnön mukainen geenihoito on tehokas yksinäänkin, mutta ade-novirusgeenihoidon yhdistäminen jonkin toisen hoidon, esimerkiksi perinteisen hoidon, kanssa voi olla tehokkaampi kuin kumpikaan yksin. Esimerkiksi yhdistelmähoidon jokainen aine voi toimia itsenäisesti kasvainkudoksessa, adenovi-rusvektorit voivat herkistää soluja kemoterapialle tai sädehoidolle ja/tai kemo-terapia-aineet voivat voimistaa virusreplikaation tasoa tai vaikuttaa kohdesolu-jen reseptoristatukseen. Vaihtoehtoisesti yhdistelmä voi modifioida kohteen immuunijärjestelmää siten, että se on edullista hoidon tehokkuudelle. Esimerkiksi kemoterapiaa voitaisiin käyttää suppressoivien solujen, kuten regulatoris-ten T-solujen, vähentämiseen. Vaihtoehtoisesti kemoterapiaa voidaan käyttää onkolyyttisellä viruksella hoidon jälkeen immunologisen vasteen tehostamiseksi tappamalla kasvainsoluja ja siitä seurauksena olevalla epitooppien ja/tai virusten vapauttamisella. Kemoterapia voi myös herkistää kasvainsoluja onko-lyyttisille viruksille ja päinvastoin. Yhdistelmähoidon aineet voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin. Edullisessa tämän keksinnön suoritusmuodossa potilaat saavat samanaikaisesti syklofosfamidia hoidon immunologisen vaikutuksen tehostamiseksi.The gene therapy of the invention is effective on its own, but combining ade-noviral gene therapy with another treatment, such as conventional therapy, may be more effective than either alone. For example, each agent of the combination therapy may function autonomously in tumor tissue, adenoviral vectors may sensitize cells to chemotherapy or radiation therapy, and / or chemotherapeutic agents may enhance viral replication levels or affect target cell receptor status. Alternatively, the combination may modify the immune system of the subject so as to be beneficial to the efficacy of the treatment. For example, chemotherapy could be used to reduce suppressive cells, such as regulatory T cells. Alternatively, chemotherapy may be used after treatment with an oncolytic virus to enhance the immunological response by killing the tumor cells and the consequent release of epitopes and / or viruses. Chemotherapy can also sensitize tumor cells to on-lytic viruses and vice versa. The combination therapy agents may be administered simultaneously or sequentially. In a preferred embodiment of the present invention, patients are simultaneously receiving cyclophosphamide to enhance the immunological effect of the treatment.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi rinnakkaisen sädehoidon antamisen kohteelle. Keksinnön eräässä toisessa edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi rinnakkaisen kemoterapian antamisen kohteelle. Vielä eräässä edullisessa sovellutusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi muiden onkolyyttisten adenovirus- tai vacciniavirusvektoreiden annon kohteelle. Vektorit voidaan antaa samanaikaisesti tai peräkkäin. Tässä yhteydessä "rinnakkainen” tarkoittaa hoitoa, joka on annettu ennen, jälkeen tai samanaikaisesti keksinnön mukaisen geenihoidon kanssa. Rinnakkaishoidon jakso voi vaihdella minuuteista useisiin viikkoihin. Edullisesti rinnakkaishoito kestää joitakin tunteja. Eräässä sovellutusmuodossa syklofos-famidi annetaan sekä suonensisäisenä boluksena että metronomisella tavalla.In a preferred embodiment of the invention, the method or use further comprises administering concurrent radiation therapy to the subject. In another preferred embodiment of the invention, the method or use further comprises the administration of concurrent chemotherapy to the subject. In another preferred embodiment, the method or use further comprises administering to the subject other oncolytic adenovirus or vaccinia virus vectors. The vectors may be administered simultaneously or sequentially. As used herein, "concurrent" refers to treatment given before, after or concurrently with the gene therapy of the invention. The period of concurrent treatment may vary from minutes to several weeks. Preferably, the concurrent treatment lasts several hours. In one embodiment, cyclophosphamide is administered both intravenously.
Yhdistelmähoitoon sopivia aineita ovat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta all-trans-retinoidihappo, atsasitidiini, atsatiopriini, bleomysiini, karbo-platiini, kapesitabiini, sisplatiini, klorambusiili, syklofosfamidi, sytarabiini, dau-norubisiini, dosetakseli, doksifluridiini, doksorubisiini, epirubisiini, epotiloni, eto-posidi, fluorourasiili, gemsitabiini, hydroksiurea, idarubisiini, imatinibi, meklore-tamiini, merkaptopuriini, metotreksaatti, mitoksantroni, oksaliplatiini, paklitakse- li, pemetreksedi, temotsolomidi, teniposidi, tioguaniini, valrubisiini, vinblastiini, vinkristiini, vindesiini ja vinorelbiini.Suitable agents for combination therapy include, but are not limited to, all-trans-retinoic acid, azacitidine, azathioprine, bleomycin, carboplatin, capecitabine, cisplatin, chlorambucil, cyclophosphamide, cytarabine, dau-norubicin, docetaxel, doxiflubidine, , fluorouracil, gemcitabine, hydroxyurea, idarubicin, imatinib, mecorothamine, mercaptopurine, methotrexate, mitoxantrone, oxaliplatin, paclitaxel, pemetrexed, temozolomide, teniposide, thioguanine, valrubicin, vinblastine, vincristine
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi verapamiilin tai jonkin muun kalsiumkanavan salpaajan antamisen kohteelle. "Kalsiumkanavan salpaaja” tarkoittaa luokkaa lääkkeitä ja luonnonaineita, jotka häiritsevät kalsiumkanavien johtumista, ja se voidaan valita ryhmästä, joka koostuu verapamiilista, dihydropyridiineistä, gallopamiilista, diltiatseemista, mibefradiilista, bepridiilista, fluspirileenista ja fendiliinista.In a preferred embodiment of the invention, the method or use further comprises administering verapamil or another calcium channel blocker to the subject. "Calcium channel blocker" refers to a class of drugs and natural substances that interfere with calcium channel conduction and may be selected from the group consisting of verapamil, dihydropyridines, gallopamil, diltiazem, mibefradiil, bepridil, fluspirilene, and fendilin.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi autofagiaa indusoivat aineiden antamisen kohteelle. Au-tofagia tarkoittaa katabolista prosessia, jossa solun omat komponentit hajoavat lysosomaalisen koneiston kautta. "Autofagiaa indusoivat aineet” tarkoittavat aineita, jotka kykenevät indusoimaan autofagian ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu mainittuihin kuitenkaan rajoittamatta mTOR-inhibiittoreista, PI3K-inhibiittoreista, litiumista, tamoksifeenista, klorokiinista, bafilomysiinista, temsirolimuksesta, sirolimuksesta ja temotsolomidistä. Keksinnön eräässä erityisessä sovellusmuodossa menetelmä käsittää lisäksi temotsolom idin antamisen kohteelle. Temotsolomidi voi olla joko oraalista tai laskimonsisäistä temotsolom idia. Autofagiaa indusoivia aineita voidaan yhdistää immunomoduloivien aineiden kanssa. Eräässä suoritusmuodossa onkolyyttinen adenovirus, joka koodaa anti-CTLA4-mAb:ta, yhdistetään sekä temotsolomidiin että syklofosfa-midiin.In a preferred embodiment of the invention, the method or use further comprises administering agents to induce autophagy. Autophagy refers to a catabolic process in which the cellular components are broken down by lysosomal machinery. "Autophagy-inducing agents" means substances which are capable of inducing autophagy, and may be selected from the group consisting of, but not limited to, mTOR inhibitors, PI3K inhibitors, lithium, tamoxifen, chloroquine, bafilomycin, temozirolimus, temozirolimus, and temsirolimus. further comprises administering a temozolomide to a subject Temozolomide may be either oral or intravenous temozolomide, Autophagy inducing agents may be combined with immunomodulatory agents In one embodiment, the oncolytic adenovirus encoding an anti-CTLA4 mAb is combined with both a temozolomid and a temozolomid.
Keksinnön eräässä sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi kemoterapian tai anti-CD20-hoidon tai muun neutraloivia vasta-aineita estävän hoidon antamisen. ”Anti-CD20-hoito” tarkoittaa aineita, jotka kykenevät tappamaan CD20-positiviisia soluja ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu rituksimabista ja muista monoklonaalisista anti-CD20-vasta-aineista. "Neutraloivia vasta-aineita estävä hoito” tarkoittaa aineita, jotka kykenevät estämään normaalisti infektion seurauksena muodostuvien antiviraalisten vasta-aineiden kehittymisen ja jotka voidaan valita ryhmästä, joka koostuu eri kemo-terapia-aineista, immunomodulatorisista aineista, kortikoideista ja muista lääkkeistä. Nämä aineet voidaan valita ryhmästä, joka koostuu mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta syklofosfamidistä, syklosporiinistä, atsatiopriinista, metyyli-prenisolonista, etoposidista, CD40L:stä, CTLA4lg4:stä, FK506:sta (takrolis-muksesta), IL-12:sta, IFN-gammasta, interleukiini 10:stä, anti-CD8:sta, anti-CD4-vasta-aineista, myeloablaatiosta ja oraalisista adenovirusproteiineista. Tässä hakemuksessa kuvattu lähestymistapa voidaan yhdistää myös molekyyleihin, jotka kykenevät voittamaan neutraloivat vasta-aineet. Sellaisia aineita ovat liposomit, lipopleksit ja polyetyleeniglykoli, jotka voidaan sekoittaa viruksen kanssa. Vaihtoehtoisesti neutraloivat vasta-aineet voidaan poistaa immunofereesikolonnilla, joka koostuu adenoviruksen kapsidiproteii-neista.In one embodiment of the invention, the method or use further comprises administering chemotherapy or anti-CD20 treatment or other treatment that inhibits neutralizing antibodies. "Anti-CD20 treatment" refers to agents capable of killing CD20 positive cells and which may be selected from the group consisting of rituximab and other anti-CD20 monoclonal antibodies. "Neutralizing Antibody Therapy" refers to agents that are capable of inhibiting the development of antiviral antibodies normally produced as a result of infection, and which may be selected from the group consisting of various chemotherapeutic agents, immunomodulatory agents, corticoids, and other drugs. a group consisting of, but not limited to, cyclophosphamide, cyclosporine, azathioprine, methyl-prenizolone, etoposide, CD40L, CTLA4Ig4, FK506 (tacrolimus black), IL-12, IFN-gamma, interleukin , anti-CD8, anti-CD4 antibodies, myeloablation, and oral adenovirus proteins, the approach described in this application may also be combined with molecules capable of overcoming neutralizing antibodies, such as liposomes, lipoplexes, and polyethylene glycol, which may be Alternatively, neutralize These antibodies can be removed by an immunophoresis column consisting of adenovirus capsid proteins.
Keksinnön mukainen onkolyyttinen adenovirusvektori käynnistää kasvainsolujen virionivälitteisen onkolyysin ja aktivoi ihmisen immuunivasteen kasvainsoluja vastaan. Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi sellaisten aineiden annon, jotka kykenevät vähentämään regulatorisia T-soluja kohteessa. "Regulatoristen T-solujen vähentämiseen kykenevät aineet” tarkoittavat aineita, jotka pienentävät suppres-sori-T-soluiksi tai regulatorisiksi T-soluiksi tunnistettujen solujen määrää. Näiden solujen on tunnistettu sisältävän yhtä tai useaa seuraavista immunofeno-tyyppimerkeistä: CD4+, CD25+, FoxP3+, CD127-ja GITR+. Tällaiset suppres-sori-T-solujen tai regulatoristen T-solujen määrää pienentävät aineet voidaan valita ryhmästä, joka koostuu anti-CD25-vasta-aineista tai kemoterapia-ai-neista. Nämä aineet voivat olla käyttökelpoisia regulatoristen T-solujen lukumäärän vähentämiseksi, joiden aktiivisuuden suppressoinnissa aCTLA4 on pääasiassa tehokas.The oncolytic adenoviral vector of the invention initiates virion-mediated oncolysis of tumor cells and activates the human immune response against tumor cells. In a preferred embodiment of the invention, the method or use further comprises administering agents which are capable of reducing regulatory T cells in the subject. "Regulatory T Cell Reduction Agents" refers to agents that reduce the number of cells identified as suppressor T cells or regulatory T cells. These cells have been identified to contain one or more of the following immunophenotype characters: CD4 +, CD25 +, FoxP3 +, CD127 and GITR + Such suppressor T-cell or regulatory T-cell depleting agents may be selected from the group consisting of anti-CD25 antibodies or chemotherapy agents, and may be useful in regulating T-cell counts. aCTLA4 is mainly effective in suppressing activity.
Keksinnön eräässä edullisessa sovellusmuodossa menetelmä tai käyttö käsittää lisäksi syklofosfamidin antamisen kohteelle. Syklofosfamidi on yleinen kemoterapia-aine, jota on myös käytetty joissakin autoimmuunitaudeissa. Esillä olevassa keksinnössä syklofosfamidia voidaan käyttää voimistamaan virusreplikaatiota ja aCTLA4:n käynnistämän NK-solujen ja sytotoksisten T-solujen stimulaation vaikutuksia parannetun immuunivasteen saamiseksi kasvainta vastaan. Sitä voidaan käyttää laskimonsisäisinä bolusannoksina tai antaa suun kautta pieninä annoksina metronomisesti tai näiden yhdistelmänä.In a preferred embodiment of the invention, the method or use further comprises administering cyclophosphamide to the subject. Cyclophosphamide is a common chemotherapy agent that has also been used in some autoimmune diseases. In the present invention, cyclophosphamide can be used to enhance viral replication and the effects of aCTLA4-induced stimulation of NK cells and cytotoxic T cells to elicit an improved immune response to the tumor. It can be used as intravenous bolus doses or orally in small doses metronomically or in combination.
Esillä olevassa keksinnössä sen varmistamiseksi, ettei CTLA-4:ää estävä mAb tapa aktivoituja sytotoksisia T-soluja, jotka voivat olla hyödyllistä hoidon kannalta, valittiin ihmisen lgG2-alatyyppi. lgG2 saa aikaan minimaalisen komplementin aktivaation ja Ab-riippuvaisen soluvälitteisen sytotoksisuu-den (Bruggemann M. et ai. J Exp Med 1987;166:1351-1361) ja myös vähentää sytokiinisyndrooman mahdollisuutta ihmiskäytön yhteydessä (Ribas A. et ai., Oncologist 2007;12:873-83).In the present invention, a human IgG2 subtype was selected to ensure that the CTLA-4 inhibitory mAb does not kill activated cytotoxic T cells, which may be useful for therapy. IgG2 produces minimal complement activation and Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity (Bruggemann M. et al. J Exp Med 1987; 166: 1351-1361) and also reduces the possibility of cytokine syndrome in human use (Ribas A. et al., Oncologist 2007; 12: 873-83).
Mikä tahansa keksinnön menetelmä tai käyttö voi olla joko in vivo, ex vixo tai in vitro -menetelmä tai käyttö.Any method or use of the invention may be either an in vivo, an ex vixo or an in vitro method or use.
Esillä olevassa keksinnössä onkolyyttinen adenovirus on aseistettu täysin ihmisperäisellä, CTLA-4:lle spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella. Tässä lähestymistavassa kasvainsolut kuolevat viruksen replikaation johdosta ja anti-CTLA4-mAb:n kasvaimenvastaisen immuuniaktivaation ja suora pro-apoptoottisen kasvainsolutapon johdosta. Lisäetua voi syntyä kasvainantigee-nin vapautumisesta viruksen replikaation johdosta, mikä voi parantaa anti-CTLA-4-mAb-hoitoa potentiaalisesti sallimalla spesifisemmän immuunivasteen kasvainkohteita vastaan (Hodi FS et ai., N Engl J Med 2010; 363;8:711—23; Mokyr MB et ai., Cancer Res 1998;58:5301-4; VVoIchok JD ja Saenger Y., On-cologist 2008; 13 Suppl 4:2-9 ). Myöskään hoitojen sivuvaikutukset eivät ole päällekkäisiä, mikä saattaisi mahdollistaa lisääntyneen tehokkuuden toksisuutta lisäämättä. Osoitetaan, että onkolyyttiset adenovirukset voivat tehokkaasti ilmentää toimivaa anti-CTLA4-mAb:tta siirtogeeninä syöpäsolulinjoissa (kuvio 2). Havaittiin myös, että on mahdollista yhdistää onkolyyttisen adenoviruksen replikaatio anti-CTLA4-mAb:n kanssa ja saada lisääntynyt solutappo (kuviot 3-4). Tämä on aiheuttanut huolta, koska CTLA-4:n esto mAb:iella johtaa lisääntyneeseen IFN-y:n ja kudosten yhteensopivuuskompleksin (MHC) luokan I molekyylien tuotantoon, joka potentiaalisesti voi inhiboida viruksen replikaatiota (McCart JA et ai., Gene Ther 2000;7:1217-23; Nakamura H et ai., Cancer Res 2001;61:5447-52). Virusonkolyysi yhdessä anti-CTLA4-mAb:n ilmentymisen kanssa johti korkeampaan kasvaimenvastaiseen aktiivisuuteen in vivo kuin kumpikaan hoito yksin (kuvio 4). On olemassa aikaisempia raportteja syöpäpotilaiden hoidosta onkolyyttisillä viruksilla, jotka ilmentävät granulosyytti-makro-fagikasvutekijää (GMCSF) yhdessä matala-annoksisen metronomisen syklo-fosfamidin kanssa T-Reg:ien vähentämiseksi (Cerullo V et ai., Cancer Res;70:4297-309; Koski A et ai., Mol Ther. 2010 Jul 27. [Epub ahead of print], PMID: 20664527). Lisäksi hiiren anti-CTLA-4:n soluvälitteinen anto GM-CSF:a erittävästä kasvainsoluimmunoterapiasta aktivoi voimakkaita kasvaimenvastai-sia vasteita ja pidensi kokonaiseloonjäämistä, jolloin esiintyi myös vähemmän todisteita systeemisestä autoimmuunisuudesta (Simmons AD et ai., Cancer Immunol Immunother 2008;57:1263-70). Siksi lähestymistavan tehokkuutta voidaan edelleen parantaa multimodaalisessa lähestymistavassa, jossa käytetään tavanomaisia syöpähoitoja, esim. säteilytys+kemoterapia, rokotteet, esim. GM-CSF tai/ja T-Reg:ien vähentämien esim. syklofosfamidilla. Tämä on ensimmäinen kerta, kun on osoitettu, että täyspitkää mAb:a voidaan tuottaa onkolyyttisestä adenoviruksesta. Lisäksi se on ensimmäinen täysin ihmisen anti-CTLA4-mAb, jota ilmennetään kasvaimeen kohdistuvalla replikoitumiskykyisellä mallilla. Suoritetussa hiirikokeessa ei nähty mitään sivuvaikutuksia. Tulokset syöpäpotilaiden PBMC:illä antavat perustelut sille, että Ad5/3-A24aCTLA4 kääntyy kliinisesti onkolyyttiseksi virusvektoriksi pitkälle edennyttä syöpää sairastavien potilaiden hoitamiseksi. Koska p16-Rb-reitti on puutteellinen monissa, jollei kaikissa, kiinteissä kasvaimissa (Sherr CJ., Science 1996;274:1672-724), Ad5/3-A24aCTLA4 ja muut keksinnön mukaiset A24-puutteiset adenovirukset sopivat useimpien käytettävissä oleviin hoitoihin reagoimattomien syöpätyyppien hoitoon. Ne keksinnön suoritusmuodot, jotka käsittävät Δ24:η lisäksi myös hTERT- tai E2F-promoottorit, laajentavat esillä olevan keksinnön käytettävyyttä käytännössä kaikkiin syöpiin. Lisäksi promoottorin lisääminen voi sallia suuremmat hoitoannokset, vähäisemmät sivuvaikutukset ja tehostetun systeemisen käytön. Mikä tärkeää CpG-ryhmien lisääminen viruksen genomiin voi lisätä kasvaimenvastaista immuunivastetta.In the present invention, the oncolytic adenovirus is armed with a fully human CTLA-4 specific monoclonal antibody. In this approach, tumor cells die due to viral replication and direct anti-tumor activation of anti-CTLA4 mAb and direct pro-apoptotic tumor cell killing. An additional benefit may arise from the release of tumor antigen due to viral replication, which can potentially improve anti-CTLA-4 mAb therapy by potentially allowing a more specific immune response against tumor targets (Hodi FS et al., N Engl J Med 2010; 363; 8: 711-23; Mokyr MB et al., Cancer Res 1998; 58: 5301-4; Volochok JD and Saenger Y., Oncologist 2008; 13 Suppl 4: 2-9). Also, the side effects of the treatments do not overlap, which could allow for increased efficacy without increasing toxicity. It is shown that oncolytic adenoviruses can efficiently express a functional anti-CTLA4 mAb as a transgene in cancer cell lines (Figure 2). It was also found possible to combine replication of the oncolytic adenovirus with anti-CTLA4 mAb and obtain increased cell killing (Figures 3-4). This is of concern because inhibition of CTLA-4 by the mAb results in increased production of IFN-γ and Tissue Compatibility Complex (MHC) class I molecules, which can potentially inhibit viral replication (McCart JA et al., Gene Ther 2000; 7: 1217-23; Nakamura H et al., Cancer Res 2001; 61: 5447-52). Viral cololysis, together with expression of anti-CTLA4 mAb, resulted in higher antitumor activity in vivo than either treatment alone (Figure 4). There have been previous reports on the treatment of cancer patients with oncolytic viruses expressing granulocyte-macrophage growth factor (GMCSF) in combination with low-dose metronomic cyclophosphamide to reduce T-Regs (Cerullo V et al., Cancer Res; 70: 4297-30; Koski A et al., Mol Ther. Jul 27, 2010 [Epub ahead of print], PMID: 20664527). In addition, cell-mediated administration of mouse anti-CTLA-4 from GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy activates potent antitumor responses and prolonged overall survival, with less evidence of systemic autoimmunity (Simmons AD et al., 12 Cancer Immunol. -70). Therefore, the effectiveness of the approach can be further enhanced by a multimodal approach using conventional cancer therapies, e.g., irradiation + chemotherapy, vaccines, e.g., GM-CSF or / and T-Reg reductions, e.g., cyclophosphamide. This is the first time that it has been shown that full length mAb can be produced from an oncolytic adenovirus. In addition, it is the first fully human anti-CTLA4 mAb expressed in a tumor-replicating model. No side effects were seen in the mouse study performed. The results of PBMCs in cancer patients justify the conversion of Ad5 / 3-A24aCTLA4 into a clinically oncolytic viral vector for the treatment of patients with advanced cancer. Because the p16-Rb pathway is deficient in many, if not all, solid tumors (Sherr CJ., Science 1996; 274: 1672-724), Ad5 / 3-A24aCTLA4 and other A24-deficient adenoviruses of the invention are suitable for most types of cancer-responsive treatment. Embodiments of the invention which include, in addition to Δ24: η, hTERT or E2F promoters extend the utility of the present invention to virtually all cancers. In addition, the addition of a promoter may allow higher therapeutic doses, fewer side effects, and enhanced systemic use. Importantly, the addition of CpG residues to the viral genome may increase the anti-tumor immune response.
Seuraavat esimerkiksi havainnollistavat esillä olevaa keksintöä, mutta niitä ei ole tarkoitettu mitenkään rajoittaviksi.The following, for example, illustrate the present invention, but are not intended to be limiting in any way.
EsimerkiteXAMPLES
EläimetAnimals
Helsingin yliopiston koe-eläintoimikunta ja Etelä-Suomen lääninhallitus tarkasti ja hyväksyi kaikki eläinprotokollat. C57Black-hiiret ja NMRI-kar-vattomat hiiret saatiin yhtiöstä Taconic (Ejby, Tanska) 4-5-viikon ikäisinä ja niitä pidettiin karanteenissa vähintään yhden viikon ajan ennen tutkimusta. Hiirten terveydentilaa monitoroitiin usein, ja niin pian kuin ilmeni minkäänlainen merkki kivusta tai tuskasta, ne tapettiin.All animal protocols were reviewed and approved by the Experimental Animal Committee of the University of Helsinki and the Provincial Office of Southern Finland. C57Black mice and NMRI nude mice were obtained from Taconic (Ejby, Denmark) at 4-5 weeks of age and were quarantined for at least one week prior to study. The mice were frequently monitored for their health, and as soon as any sign of pain or pain appeared, they were killed.
Soluviljelycell culture
Ihmisen pään ja kaulan alueen okasolukarsinoman (HNSCC) alhaisen kasvatuksen kasvainsoluviljelmää UT-SCC8 (ääniraon yläpuolinen kur-kunpää) (27) kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen alustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10 %:lla FCS:ää (PromoCell GmbH, Heidelberg, Saksa), 1 %:lla ei-välttämättömiä aminohappoja (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia) 2 mmol/l glutamiinilla, 100 yksikköllä/ml penisilliiniä ja 100 yksiköllä/ml strepto mysiiniä (kaikki Sigmalta, St. Louis, MO). UT-SCC-soluja käytettiin alhaisessa kasvatuksessa, tyypillisesti 15-30 kasvatuksessa.Low-growth tumor cell culture of human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) UT-SCC8 (27) was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% FCS (PromoCell GmbH, Heidberg). Germany), 1% non-essential amino acids (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, California) with 2 mmol / l glutamine, 100 units / ml penicillin and 100 units / ml strepto-mycine (all from Sigma, St. Louis, MO). UT-SCC cells were used in low culture, typically 15-30 culture.
Ihmisen transformoitu alkion munuaissolulinja 293, ihmisen keuh-kosyöpäsolulinja A549, ihmisen munasarjasolulinja SKOV3-ip1 ja ihmisen etu-rauhassyöpäsolulinja PC-3MM2 sekä Jurkat- (klooni E6-1) ihmisen leukeemi-set T-solulymfoblastisolut saatiin ATCC:stä (American Type Culture Collecti-on, Manassas, VA, USA). Kaikkia soluja ylläpidettiin suositelluissa olosuhteissa.Transformed human embryonic kidney cell line 293, human lung cancer cell line A549, human ovarian cell line SKOV3-ip1 and human prostate cancer cell line PC-3MM2, and Jurkat (clone E6-1) human leukemic T-cell lymphoblastic cell strain -on, Manassas, VA, USA). All cells were maintained under the recommended conditions.
Ihmisnäytteethuman samples
Terveiden yksilöiden ja potilaiden, joilla oli tavanomaisiin hoitoihin vastaamattomia, pitkälle edenneitä metastaattisia kasvaimia, perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC) saatiin kirjallinen suostumuksella.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in healthy subjects and patients with advanced metastatic tumors unresponsive to conventional treatments were obtained by written consent.
Statistinen analyysiStatistical analysis
Kaksisuuntaista Studentin t-testiä käytettiin ja p-arvoa <0,05 pidettiin merkitsevänä.A two-tailed Student's t test was used and a p value <0.05 was considered significant.
Esimerkki 1. Adenovirusten muodostaminenExample 1. Formation of adenoviruses
Kimeeriset adenovirukset, jotka kantavat cDNA-sekvenssiä, joka koodaa lgG2-tyyppistä anti-CTLA4-mAb:tta, muodostettiin (kuvio 1). Anti-CTLA4-mAb:n koodaava sekvenssi vietiin adenoviruksen E3A:n 6.7K/gp19K-deleetioon replikoitumiskykyisten adenovirusten Ad5/3-A24aCTLA4 (SEQ ID. NO:1), Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4 (SEQ ID. NO:2), Ad5/3-hTERT- A24aCTLA4-CpG (SEQ ID. NO:3), Ad5/3-E2F-A24aCTLA4 (SEQ ID. NO:4) ja Ad5/3-E2F-A24aCTLA4-CpG (SEQ ID. NO:5) muodostamiseksi tai CMV-promoottorin ohjaamaan deletoituun E1:een replikoitumiskyvyttömän adenoviruksen Ad5/3-aCTLA4 (SEQ ID. NO:6) muodostamiseksi.Chimeric adenoviruses carrying a cDNA sequence encoding an IgG2-type anti-CTLA4 mAb were generated (Figure 1). The coding sequence for the anti-CTLA4 mAb was introduced into the 6.7K / gp19K deletion of adenovirus E3A by Ad5 / 3-A24aCTLA4 (SEQ ID. NO: 1), Ad5 / 3-hTERT-A24aCTLA4 (SEQ ID NO: 2). ), Ad5 / 3-hTERT-A24aCTLA4-CpG (SEQ ID NO: 3), Ad5 / 3-E2F-A24aCTLA4 (SEQ ID NO: 4), and Ad5 / 3-E2F-A24aCTLA4-CpG (SEQ ID NO: 3). : 5), or to generate a replication-defective adenovirus Ad5 / 3-aCTLA4 (SEQ ID NO: 6) into the deleted E1 driven by the CMV promoter.
Onkolyyttiset adenovirukset muodostettiin ja monistettiin käyttäen standardeja adenoviruksen valmistusmenetelmiä (Kanerva A, et ai., Mol Ther 2002;5:695-704; Bauerschmitz GJ, et ai., Mol Ther 2006;14:164-74; Kanerva A ja Hemminki A, Int J Cancer 2004;110:475-80; Volk AL, et ai., Cancer Biol Ther 2003;2:511-5). Lyhyesti kuvattuna joko E1- tai E3-sukkulavektori, jossa oli siirtogeeni ja muut ryhmät (promoottorit, CpG, poly-A) muodostettiin ensin ja yhdistettiin resque-plasmidiin bakteerisoluissa, joissa oli ihmisen rekombinaa-seja. Virusten tärkeimmät ominaisuudet mukaan lukien kontrollivirusten Ad5Luc1 (Kanerva A et ai., Clin Cancer Res 2002;8:275-80) ja Ad5/3-A24 (Kanerva A et ai., Mol Ther 2003;8:449-58) tärkeimmät ominaisuudet kuvataan kuviossa 1.Oncolytic adenoviruses were generated and amplified using standard adenovirus production methods (Kanerva A, et al., Mol Ther 2002; 5: 695-704; Bauerschmitz GJ, et al., Mol Ther 2006; 14: 164-74; Kanerva A and Hemminki A, Int J Cancer 2004; 110: 475-80; Volk AL et al., Cancer Biol Ther 2003; 2: 511-5). Briefly, either the E1 or E3 shuttle vector carrying the transgene and other groups (promoters, CpG, poly-A) were first generated and linked to the resque plasmid in bacterial cells containing human recombinases. Key Viral Properties Including Key Features of Control Viruses Ad5Luc1 (Kanerva A et al., Clin Cancer Res 2002; 8: 275-80) and Ad5 / 3-A24 (Kanerva A et al., Mol Ther 2003; 8: 449-58) is illustrated in Figure 1.
Ad5/3-Ä24aCTLA4:n muodostamiseksi muodostettiin plasmidi pTHSN-aCTLA4. pTHSN-aCTLA4 sisältää lgG2-tyypin anti-CTLA4-mAb:n raskaat ja kevyet ketjut adenoviruksen genomista, josta on poistettu 6.7K/gp19K, E3-alueella. Ekvimolaarisuus raskaiden ja kevyiden ketjujen välillä saavutetaan sisäisen ribosomin sisääntulopaikan (IRES) avulla ketjujen välillä. pAdEasy-1,5/3-A24-aCTLA4 muodostettiin homologisella rekombinaatiolla Escherichia coli BJ5183 -soluissa (Qbiogene Inc., Irvine, CA, USA) FspUlä linearisoidun pTHSN-aCTLA4 ja S/fl:lla linearisoidun pAdEasy-1.5/3-A24:n välillä (Kanerva A et ai., Clin Cancer Res 2002;8:275-80), resque-plasmidi, joka sisältää sero-tyypin 3 ulokkeen ja 24 emäsparin deleetion E1A:ssa. Ad5/3-A24aCTLA4:n genomi vapautettiin Pacl-digestiolla ja sitä seuraavalla transfektiolla A549-soluihin. Virusta lisättiin A549-soluilla ja puhdistettiin cesiumkloridigradienteilla. Viruspartikkelipitoisuus määritettiin aallonpituudella 260 nm, ja standardi TCID50 (median tissue culture infective dose) -määritys 293-soluilla suoritettiin infektoivien partikkelien tiitterin määrittämiseksi.Plasmid pTHSN-aCTLA4 was constructed to generate Ad5 / 3-Ä24aCTLA4. pTHSN-aCTLA4 contains the heavy and light chains of the IgG2 type anti-CTLA4 mAb from the 6.7K / gp19K deleted genome in the E3 region. Equimolarity between heavy and light chains is achieved by an internal ribosome entry site (IRES) between the chains. pAdEasy-1.5 / 3-A24-aCTLA4 was generated by homologous recombination in Escherichia coli BJ5183 cells (Qbiogene Inc., Irvine, CA, USA) with FspU linearized pTHSN-aCTLA4 and pAdEasy-1.5 / 3-A24 linearized with S / fl: (Kanerva A et al., Clin Cancer Res 2002; 8: 275-80), a resque plasmid containing a serotype 3 protrusion and a 24 bp deletion in E1A. The Ad5 / 3-A24aCTLA4 genome was released by Pacl digestion and subsequent transfection into A549 cells. The virus was added with A549 cells and purified with cesium chloride gradients. Viral particle concentration was determined at 260 nm and standard TCID50 (Medium Tissue Culture Infective Dose) assay on 293 cells was performed to determine the titer of the infecting particles.
Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4:n, Ad5/3-hTERT-A24aCTLA4-CpG:n, Ad5/3-E2F-A24aCTLA4:n ja Ad5/3-E2F-A24aCTLA4-CpG:n muodostamiseksi anti-CTLA-monistustuote jatkokloonattiin ensin pTFISN:ään tai pTHSN-CpG:hen ja rekombinoitiin sen jälkeen pAd5/3-hTERT-E1A:n tai pAd5/3-E2F-E1A:n kanssa (Bauerschmitz GJ, et ai., Cancer Res 2008;68:5533-9. Hakkarainen T, et ai. Clin Cancer Res. 2009; 15(17):5396-403.) Saatu plasmidi li-nearisoitiin PacMIä ja transfektoitiin A549-soluihin monistusta ja kiinniottoa. Viruksia lisättiin A549-soluissa ja puhdistettiin cesiumkloridigradienteilla. Viruspartikkelipitoisuus määritettiin aallonpituudella 260 nm, ja standardi TCID50 (median tissue culture infective dose) -määritys 293-soluilla suoritettiin infektoivien partikkelien tiitterin määrittämiseksi.To form Ad5 / 3-hTERT-A24aCTLA4, Ad5 / 3-hTERT-A24aCTLA4-CpG, Ad5 / 3-E2F-A24aCTLA4 and Ad5 / 3-E2F-A24aCTLA4-CpG, the anti-CTLA amplification product was extended. first to pTFISN or pTHSN-CpG and then recombined with pAd5 / 3-hTERT-E1A or pAd5 / 3-E2F-E1A (Bauerschmitz GJ, et al., Cancer Res 2008; 68: 5533- 9. Hakkarainen T, et al. Clin Cancer Res 2009; 15 (17): 5396-403.) The resulting plasmid was linearized with PacMI and transfected into A549 cells for amplification and capture. Viruses were added in A549 cells and purified with cesium chloride gradients. Viral particle concentration was determined at 260 nm and standard TCID50 (Medium Tissue Culture Infective Dose) assay on 293 cells was performed to determine the titer of the infecting particles.
Kaikki kloonausvaiheet varmistettiin PCR:Mä ja useilla restriktiodi-gestioilla. pTHSN-aCTLA4-sukkulaplasmidi sekvensoitiin. Villityypin E1 poissaolo varmistettiin PCR:llä. E1-alue, siirtogeeni ja säie tarkistettiin lopullisesta viruksesta sekvensoimalla ja PCR:llä. Virustuotannon, mukaan lukien transfek-tio, kaikki vaiheet tehtiin A549-soluilla villityypin rekombinaation riskin välttämiseksi, kuten aikaisemmin on kuvattu (Kanerva A. et ai. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Baeurschmitz G. J. et ai. 2006, Mol Ther 14, 164-74). aCTLA4 on E3-promoottorin alainen (erityisesti endogeenisten viruksen E3A-geeniekspres- sion kontrollielementtien alainen), mikä johtaa replikaatioon assosioituvaan siirtogeenien ilmentymiseen, joka alkaa noin 8 h infektion jälkeen. E3 on koskematon lukuun ottamatta 6.7K/gp19K\n deleetiota.All cloning steps were confirmed by PCR and several restriction di gestures. The pTHSN-αCTLA4 shuttle plasmid was sequenced. The absence of wild type E1 was confirmed by PCR. The E1 region, the transgene and the strand were checked for final virus by sequencing and PCR. All steps of virus production, including transfection, were performed on A549 cells to avoid the risk of wild-type recombination as previously described (Kanerva A. et al. 2003, Mol Ther 8, 449-58; Baeurschmitz GJ et al. 2006, Mol Ther 14 , 164-74). aCTLA4 is under the E3 promoter (especially under the control of endogenous viral E3A gene expression control elements), leading to replication-associated transgene expression starting about 8 h after infection. E3 is intact except for the 6.7K / gp19K \ n deletion.
Ei-replikoituvan E1-puutteisen kontrolliviruksen Ad5/3-aCTLA4 muodostamiseksi anti-CTLA4-mAb-cDNA:n molemmat ketjut ligatoitiin pShuttle-CMV:hen. Homologinen rekombinaatio suoritettiin pAdEasy-1.5/3-plasmidin (Krasnykh VN, et ai., J Virol 1996;70:6839-46), joka kantaa kokonaista adeno-viruksen genomia, ja Pmel:Mä linearisoidun pShuttle-CMV-aCTLA4:n välillä pAdEasy-1.5/3-aCTLA4:n muodostamiseksi. Ad5/3-aCTLA4:n genomi vapautettiin Pacl:llä ja transfektoitiin 29. Virusta lisättiin A549-soluissa ja puhdistettiin cesiumkloridigradienteilla. Viruspartikkelipitoisuus määritettiin aallonpituudella 260 nm, ja plakkimääritys 293-soluilla suoritettiin infektoivien partikkelien määrittämiseksi.To generate the non-replicating E1-deficient control virus Ad5 / 3-aCTLA4, both strands of the anti-CTLA4 mAb cDNA were ligated into pShuttle-CMV. Homologous recombination was performed between pAdEasy-1.5 / 3 plasmid (Krasnykh VN, et al., J Virol 1996; 70: 6839-46) carrying the entire adeno-virus genome and Pmel linearized pShuttle-CMV-aCTLA4. pAdEasy-1.5 / 3-aCTLA4. The Ad5 / 3-αCTLA4 genome was released with Pac1 and transfected with 29. The virus was added to A549 cells and purified with cesium chloride gradients. The viral particle concentration was determined at 260 nm and a plaque assay on 293 cells was performed to determine the infectious particles.
Esimerkki 2. Muodostettujen adenovirusten ilmentäminen ja funktionaalisuus in vitroExample 2. Expression and Functionality of Adenoviruses Generated in vitro
Western blot -analyysiä käytettiin sen varmistamiseksi, että muodostetut adenovirukset ilmentävät anti-CTLA4-mAb:tta. A549- tai PC3-MM2-kasvainsolut infektoitiin muodostetulla Ad5/3-A24aCTLA4:lla tai Ad5/3-aCTLA4:lla pitoisuudella 10 viruspartikkelia (VP) solua kohti. 48 tunnin kuluttua viruksella infektoitujen solujen supernatantit suodatetiin 0,02 pm:n suodattimil-la (Anotop, Whatman, Englanti), 15 pl ajettiin 7,5-%:isessa SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesi (PAGE) -geelissä pelkistävissä tai natiiveissa olosuhteissa ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kalvoa inkuboitiin vuohen anti-ihmis-lgG:n (raskaat ja kevyet ketjut) (AbD serotec, MorphoSys, Saksa), pestiin ja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa, johon oli kytketty piparjuuripe-roksidaasi, (Dako, Tanska). Signaalin toteaminen tehtiin vahvistetulla kemilu-minesenssillä (GE Healthcare, Amersham, UK).Western blot analysis was used to confirm that the adenoviruses formed expressed anti-CTLA4 mAb. A549 or PC3-MM2 tumor cells were infected with Ad5 / 3-A24aCTLA4 or Ad5 / 3-aCTLA4 formed at a concentration of 10 viral particles (VP) per cell. After 48 hours, supernatants of virus-infected cells were filtered on 0.02 µm filters (Anotop, Whatman, England), 15 µl were run on 7.5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under reducing or native conditions and was transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was incubated with goat anti-human IgG (heavy and light chains) (AbD Serotec, MorphoSys, Germany), washed and incubated with a secondary antibody coupled with horseradish peroxidase (Dako, Denmark). Signal detection was performed by confirmed chemiluminescence (GE Healthcare, Amersham, UK).
Western blot -analyysissä Ad5/3-A24aCTLA4 ja Ad5/3-aCTLA4 ilmensivät odotettuja noin 150 kDa:n anti-CTLA4-mAb:tta natiiveissa olosuhteissa ja noin 50 kDa:n raskaita ketjuja ja noin 25 kDa:n kevyitä ketjuja denaturoivissa olosuhteissa (kuvio 2A) supernatanteissa 48 tuntia infektion jälkeen.In Western blot analysis, Ad5 / 3-A24aCTLA4 and Ad5 / 3-aCTLA4 expressed the expected about 150 kDa anti-CTLA4 mAb under native conditions and about 50 kDa heavy chains and about 25 kDa light chains under denaturing conditions ( Figure 2A) in supernatants 48 hours after infection.
Onkolyyttisen viruksen Ad5/3-A24aCTLA4 tai replikoitumiskyvyttö-män Ad5/3-aCTLA4:n ilmentämän Anti-CTLA4-mAb:n vertaamiseksi PC3-MM2-soluja laitettiin pitoisuutena 20 000 solua kuoppaa kohti ja infektoitiin pitoisuudella 10 VP solua kohti vastaavilla viruksilla. 24 h, 48 h ja 72 h infektion jälkeen supernatantit otettiin talteen ja analysoitiin ELISAJIa ihmisen lgG:n määrän suhteen (kuvioi 0).To compare the oncolytic virus Ad5 / 3-A24aCTLA4 or the anti-CTLA4 mAb expressed in replication-defective Ad5 / 3-aCTLA4, PC3-MM2 cells were plated at 20,000 cells per well and infected at 10 VP per cell, respectively. 24 h, 48 h and 72 h after infection, supernatants were harvested and analyzed by ELISAs for the amount of human IgG (Figure 0).
Sen varmistamiseksi, että Ad5/3-Ä24aCTLA4 ja Ad5/3-aCTLA4 ilmentävät funktionaalista anti-CTLA4-mAb:ia, stimuloitujen Jurkat-solujen lisääntynyt IL-2-tuotanto tutkittiin, kuten aikaisemmin on kuvattu (Lee KM et ai., Science 1998;282:2263-68).To ensure that Ad5 / 3-Ä24aCTLA4 and Ad5 / 3-aCTLA4 express functional anti-CTLA4 mAb, increased IL-2 production by stimulated Jurkat cells was examined as previously described (Lee KM et al., Science 1998 ; 282: 2263-68).
Jurkat-solut (klooni 6.1) stimuloitiin 0,3 pg/ml:Ma ionomysiiniä (Sig-ma-AIdrich Co.), 0,03 pg/ml:Ma forbolimyristyyliasetaattia (PMA) (Sigma-AIdrich Co.) ja 1 pg/ml:lla rekombinattia ihmisen B7-Fc-kimeeriä (R&D systems) ja käsiteltiin viruksella infektoitujen PC3-MM2-solujen supernatanteilla, jotka oli suodatettu 0,02 pm:n suodattimena (Anotop, VVhatman, Englanti). Neljäkymmen-täkahdeksantuntia Jurkat-solujen stimulation jälkeen interleukiini-2 (IL-2) -pitoisuudet kasvualustoissa analysoitiin BD Cytometric Bead Array Human Solu-ble Protein Flex Set -pakkauksella (Becton Dickinson) valmistajan ohjeiden mukaan. Käytettiin kymmentä viruspartikkelia (VP) solua kohti ja 48 tuntia myöhemmin supernatantit otettiin talteen. Hiiren anti-ihmis-CTLA-4 (=CD152) -mAb:ia (BD Pharmingen™, Eurooppa) käytettiin positiivisena kontrollina. FCAP Array v.1.0.2 (Soft Flow) -ohjelmistoa käytettiin analysointiin. Kuviossa 7 esitetään kaaviot funktionaalisuusmäärityksistä.Jurkat cells (clone 6.1) were stimulated with 0.3 pg / ml ionomycin (Sigma-Aldrich Co.), 0.03 pg / ml phorbol myristyl acetate (PMA) (Sigma-Aldrich Co.) and 1 pg / ml. ml of recombinant human B7-Fc chimera (R&D systems) and treated with virus-infected PC3-MM2 cell supernatants filtered as a 0.02 µm filter (Anotop, Whatman, England). Forty-eight to eight hours after stimulation of Jurkat cells, the concentrations of interleukin-2 (IL-2) in the media were analyzed with a BD Cytometric Bead Array Human Cell Blood Protein Flex Set (Becton Dickinson) according to the manufacturer's instructions. Ten viral particles (VP) were used per cell and supernatants were collected 48 hours later. Mouse anti-human CTLA-4 (= CD152) mAb (BD Pharmingen ™, Europe) was used as a positive control. FCAP Array v.1.0.2 (Soft Flow) software was used for analysis. Figure 7 shows diagrams of functionality assays.
Anti-CTLA4-mAb sitoo solun pinnan CTLA-4:ää estäen immunosup-pressiivisen interaktion rekombinantin B7:n (rB7) kanssa. Tämä analyysi osoittaa, että mAb:n anti-CTLA4-aktiivisuutta löydettiin Ad5/3-A24aCTLA4:llä ja Ad5/3-aCTLA4:llä infektoitujen solujen supernatanteista verrattuna vastaaviin isogeenisiin kontrolleihin, Ad5/3-A24- ja Ad5/3Luc1-infektoituihin soluihin (kuvio 2B). Rekombinanttia anti-CTLA4-mAb:ta käytettiin positiivisena kontrollina ja se oli potentimpi kuin Jurkat-soluista kerätty supernatantti.The anti-CTLA4 mAb binds to cell surface CTLA-4, preventing immunosuppressive interaction with recombinant B7 (rB7). This analysis indicates that the anti-CTLA4 activity of the mAb was found in supernatants of cells infected with Ad5 / 3-A24aCTLA4 and Ad5 / 3-aCTLA4 compared to the corresponding isogenic controls, Ad5 / 3-A24 and Ad5 / 3Luc1-infected cells. (Figure 2B). Recombinant anti-CTLA4 mAb was used as a positive control and was more potent than the supernatant collected from Jurkat cells.
Jotta voitiin vielä varmistaa, että viruksen ilmentämä anti-CTLA4-mAb kykenee estämään signaloinnin CTLA-4:n kautta, suoritettiin loss-of-func-tion -määritys. Jurkat-solut aktivoitiin kuten edellä mutta 0,1 pg/ml rekombinanttia ihmisen CTLA-4/Fc-kimeeraa (R&D Systems) (rCTLA-4) lisättiin iono-mysiiniin, PMA:han ja rekombinanttiin B7:ään. rCTLA-4 sitoutuu anti-CTLA4-mAb:een kasvualustassa vapauttaen solun pinnalla olevaa CTLA-4:ää olemaan vuorovaikutuksessa rB7:n kanssa ja torjumaan T-solujen aktivaation, joka nähdään vähenemisenä IL-2:n tuotannossa. Anti-CTLA4-mAb-funktion menetys havaittiin supernatantilla soluista, jotka oli infektoitu Ad5/3-A24aCTLA4:lla ja Ad5/3-aCTLA4:lla verrattuna vastaaviin isogeenisiin, aseis tamattomiin kontrolleihin Ad5/3-A24 tai Ad5/3Luc1 (kuvio 2C). Lisäksi korkein toiminnon menetys havaittiin supernatantilla Ad5/3-Ä24aCTLA4:n infektoimista kasvainsoluista, jopa korkeampi kuin positiivinen kontrolli. Yhdessä tarkasteltuna nämä tulokset osoittavat, että syöpäsolujen infektointi Ad5/3-A24aCTLA4:lla johtaa funktionaalisen, ihmisen CTLA-4-vastaisen, täysin ihmisen mAb:n korkeaan ilmentymiseen, mikä johtaa T-soluaktiivisuuden vähenemiseen mitattuna IL-2:n avulla.To further verify that the virus-expressed anti-CTLA4 mAb is capable of blocking signaling via CTLA-4, a loss-of-function assay was performed. Jurkat cells were activated as above but 0.1 µg / ml recombinant human CTLA-4 / Fc chimera (R&D Systems) (rCTLA-4) was added to ionomycin, PMA and recombinant B7. rCTLA-4 binds to anti-CTLA4 mAb in culture medium, releasing cell surface CTLA-4 to interact with rB7 and to counteract T cell activation, which is seen as a decrease in IL-2 production. Loss of anti-CTLA4 mAb function was observed in the supernatant from cells infected with Ad5 / 3-A24aCTLA4 and Ad5 / 3-aCTLA4 compared to their respective isogenic unarmed controls Ad5 / 3-A24 or Ad5 / 3Luc1 (Fig. 2C). . In addition, supernatant was found to have the highest loss of function in Ad5 / 3-Ä24aCTLA4-infected tumor cells, even higher than the positive control. Taken together, these results indicate that infection of cancer cells with Ad5 / 3-A24aCTLA4 results in high expression of a functional, fully anti-human CTLA-4 mAb, leading to a decrease in T cell activity as measured by IL-2.
Esimerkki 3. Kasvainsolulinjojen ja alhaisen kasvun kasvaineksplanttien CTLA-4:n ilmentäminenExample 3. Expression of CTLA-4 tumor cell lines and low growth tumor implants
Koska on raportoitu, että melkein 90 % kasvainsolulinjoista ilmentää CTLA-4:ää ja että anti-CTLA-4-mAb:lla voisi olla suoraa kasvaimenvastaista aktiivisuutta (13), tutkittiin, olisiko tämä totta myös kasvainsolulinjoissa mukaan lukien käytetyt alhaisen kasvun HNSCC-kasvaineksplantit.Since it has been reported that almost 90% of tumor cell lines express CTLA-4 and that anti-CTLA-4 mAb could have direct antitumor activity (13), it was investigated whether this would also be true in tumor cell lines including the low-growth HNSCC tumor implants used. .
Epäsuora immunofluoresenssi suoritettiin alhaisen kasvun UT-SCC8-kasvainsoluviljelmässä tai kasvainsolulinjoissa A549, SKOV3-ip1 ja PC3-MM2 pinnalla olevan CTLA-4:n analysoimiseksi. Lyhyesti kuvattuna solu-pellettiä inkuboitiin 30 min 4 °C:ssa hiiren anti-ihmisen CTLA-4-mAb:n kanssa (BD Pharmingen™, Eurooppa) primäärisenä vasta-aineena, mitä seurasi vielä 30 m in: n inkubointi 4 °C:ssa Alexa Fluor® 488 -aasin anti-hiiren lgG:n kanssa (Invitrogen) sekundaarisena vasta-aineena. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin LSR-virtaussytometrillä (BD Pharmingen™, Eurooppa). Vähintään 40 000 so-lua/näyte laskettiin. Clontech Discovery Labvvare -immunosytometriajärjes-telmiä (BD Pharmingen™, Eurooppa) ja FlovvJo 7.6.1-ohjelmistoa käytettiin analysointiin. A549-, SKOV3-ip1- ja PC3-MM2-kasvainsolulinjat ilmensivät 99,5 %, 96,6 % ja vastaavasti 96,6 % CTLA-4:ää, kun taas alhaisen kasvun kasvaimen UT-SCC8-eksplantit ilmensivät 90,3 % CTLA-4:ää (kuvio 2D).Indirect immunofluorescence was performed to analyze CTLA-4 on low-growth UT-SCC8 tumor cell culture or tumor cell lines A549, SKOV3-ip1 and PC3-MM2. Briefly, the cell pellet was incubated for 30 min at 4 ° C with mouse anti-human CTLA-4 mAb (BD Pharmingen ™, Europe) as the primary antibody followed by a further 30 min incubation at 4 ° C: Alexa Fluor® 488 asase secondary anti-mouse IgG (Invitrogen). Fluorescence intensity was measured on an LSR flow cytometer (BD Pharmingen ™, Europe). At least 40,000 cells / sample were counted. Clontech Discovery Labvvare Immunocytometry Systems (BD Pharmingen ™, Europe) and FlovvJo 7.6.1 software were used for analysis. The A549, SKOV3-ip1 and PC3-MM2 tumor cell lines expressed 99.5%, 96.6% and 96.6% CTLA-4, respectively, whereas low-growth tumor UT-SCC8 explants expressed 90.3%. CTLA-4 (Figure 2D).
Esimerkki 4. Muodostettujen adenovirusten onkolyyttisen tehon määritys in vitro ja in vivoExample 4. In vitro and in vivo assay for oncolytic efficacy of formed adenoviruses
Ad5/3-A24aCTLA4:n onkolyyttinen teho (eli solutappo) eri kasvainsolu-linjoihin ja HNSCC:n alhaisen kasvun kasvainsoluviljelmään arvioitiin. HNSCC:n aAlhaisen kasvun kasvainasoluviljelmä tai kasvainsolulin-jat PC3-MM2, SKOV3-ip1 tai A549 laitettiin pitoisuutena 1,5*104 tai 1,0*104 solua/kuoppa 96-kuoppaisille levyille. Seuraavana päivänä virukset laimennettiin DMEM:ään, jossa oli 2 % FCS:ää, eri pitoisuuksina (1, 10, 100, 1000 VP/- solu), soluja infektoitiin yksi tunti 37 °C:ssa, pestiin ja inkuboitiin DMEM:ssä, jossa oli 5 % FCS:ää. Solujen elinkyky määritettiin valmistajan protokollan mukaisesti (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Prome-ga). Tulokset esitetään kuviossa 3.The oncolytic potency (i.e., cell killing) of Ad5 / 3-A24aCTLA4 on different tumor cell lines and low growth tumor cell culture of HNSCC was evaluated. Low growth tumor cell culture or PC3-MM2, SKOV3-ip1 or A549 tumor cell culture of HNSCC was plated at 1.5 * 10 4 or 1.0 * 10 4 cells / well in 96-well plates. The next day, the viruses were diluted in DMEM containing 2% FCS at various concentrations (1, 10, 100, 1000 VP / cell), the cells were infected for one hour at 37 ° C, washed and incubated in DMEM with was 5% FCS. Cell viability was determined according to the manufacturer's protocol (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Prome). The results are shown in Figure 3.
Ad5/3-A24aCTLA4:n onkolyyttinen teho oli samanlainen kuin positiivisen kontrolliviruksen Ad5/3-A24 kaikissa solulinjoissa. Myös replikoitumisky-vyttömällä Ad5/3-aCTLA4:lla oli kasvaimenvastaista aktiivisuutta, koska kas-vainsolut ilmentävät CTLA4:ää.The oncolytic potency of Ad5 / 3-A24aCTLA4 was similar to that of the positive control virus Ad5 / 3-A24 in all cell lines. Also, replication-deficient Ad5 / 3-aCTLA4 had antitumor activity because tumor cells express CTLA4.
Ad5/3-A24aCTLA4:n onkolyyttinen vaikutus johti 97,6 %:n, 78,2 %:n, 69,1 %:n ja 57,3 %:n solutappoon PC3-MM2:llä, SKOV3-ip1:lla, A549:llä ja vastaavasti UT-SCC8:llä (kuvio 3). Tilastollista eroa ei esiintynyt Ad5/3-A24aCTLA4:llä ja sen vastineella ilman siirtogeeniä E3:ssa (Ad5/3-A24) syto-toksisuudessa missään analysoiduista kasvainsolulinjoista.The oncolytic effect of Ad5 / 3-A24aCTLA4 resulted in 97.6%, 78.2%, 69.1% and 57.3% cell death by PC3-MM2, SKOV3-ip1, A549 and UT-SCC8, respectively (Figure 3). There was no statistical difference in the cytotoxicity of Ad5 / 3-A24aCTLA4 and its counterpart without transgene in E3 (Ad5 / 3-A24) in any of the tumor cell lines analyzed.
Ei-replikoituvalla Ad5/3-aCTLA4:lla ei havaittu sytotoksisuutta alhaisilla virusannoksilla (kuvio 3). Kuitenkin sytotoksisuutta havaittiin korkeimmilla Ad5/3-aCTLA4-arvoilla maksimaalisten solutappolukujen ollessa 96,2 %, 74,3 %, 49,1 % ja 56,15 % PC3-MM2:lla, SKOV3-ip1:llä, A549:llä ja vastaavasti UT-SCC8:lla (kuvio 3). Tämä tulos on yhdenmukainen aikaisemmin osoitetun anti-CTLA-4:n suoran sitoutumisen syöpäsolujen pinnalla ilmentyvän CTLA:han kanssa, mikä aiheuttaa solukuoleman (Contardi E et ai., Int J Cancer 2005;117:538-50).Non-replicating Ad5 / 3-aCTLA4 showed no cytotoxicity at low virus doses (Figure 3). However, cytotoxicity was observed at the highest Ad5 / 3 αCTLA4 values with maximal cell death rates of 96.2%, 74.3%, 49.1% and 56.15% for PC3-MM2, SKOV3-ip1, A549 and respectively. UT-SCC8 (Figure 3). This result is consistent with previously demonstrated direct binding of anti-CTLA-4 to CTLA expressed on the surface of cancer cells, leading to cell death (Contardi E et al., Int J Cancer 2005; 117: 538-50).
Esimerkki 5. Ad5/3-A24aCTLA4:n kasvaimenvastaisen aktiivisuuden määritysExample 5. Assay for antitumor activity of Ad5 / 3-A24aCTLA4
Adenovirusten kasvaimen kasvun suppressio ja apoptoosi määritettiin immuunipuutteisilla karvattomilla hiirillä, joilla oli ihmisen eturauhassyövän ksenografteja, käsittelemällä hiiriä monoklonaalista anti-CTLA-4-vasta-ainetta ilmentävillä onkolyyttisillä adenoviruksilla.Adenovirus tumor growth suppression and apoptosis were determined in immune-deficient nude mice bearing human prostate cancer xenografts by treatment of mice with oncolytic adenoviruses expressing anti-CTLA-4 monoclonal antibody.
Ihmisen eturauhaseksplanttiksenograftit muodostettiin injektoimalla 5x106 PC3-MM2-solua 5-6 viikkoa vanhojen naaraspuolisten NMRI/karvatto-mien hiirten (Taconic, Ejby, Tanska) kylkiin. Seitsemän päivän kuluttua kasvaimet (n = 8/ryhmä, 5-8 mm halkaisijaltaan) injektoitiin käyttäen tilavuutta 50 pl kolme kertaa joka toinen päivä annoksella 1x108 VP (päivinä 0, 2 ja 4) ja kontrollikasvaimet injektoitiin vain DMEM:llä. Kaavaa (pituus x leveys2 x 0,5) käytettiin kasvaimen tilavuuden laskemiseksi. Päivänä 5 kasvainten kryoleikkeet värjättiin anti-CTLA4:n ilmentämisen (ihmisen IgG) tai apoptoosin (aktiivinen kaspaasi-3) suhteen immunohis- tokemialla. Tissue Tek OCT -tuotteeseen (Sakura, Torrance, CA, USA) valettujen jäätyneiden kasvainten 4-5 pm:n kryoleikkeet valmistettiin ja kiinnitettiin asetonilla 10 min:n ajan -20 °C:ssa. Primaarisina vasta-aineina käytettiin vuohen anti-ihmis-lgG:tä (raskaat ja kevyet ketjut) (AbD serotec, MorphoSys) ja kanin monoklonaalista vasta-ainetta aktiivista kaspaasi-3:a vastaan laimennoksena 1:200 yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa (BD Pharmingen Tm, AB559565). Lisäksi leikkeitä inkuboitiin valmistajan ohjeiden mukaan käyttäen LSAB2 System-HRP -pakkausta (K0673, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Sitoutuneet vasta-aineet tehtiin näkyviksi käyttäen 3,3’-diaminobentsi-diinia (DAB, Sigma, St Louis, MO, USA). Lopuksi leikkeet vastavärjättiin hema-toksyliinillä ja vesi poistettiin etanolissa, kirkastettiin ksyleenissä ja suljettiin kanadanbalsamilla. Edustavat kuvat otettiin suurennuksella 40 käyttäen Leica DM LB -mikroskoopilla varustettua Olympus DP50 -värikameraa. Päivänä 7 ihmisen lgG:n pitoisuudet Ad5/3-A24aCTLA4:llä tai Ad5/3-aCTLA4:llä käsiteltyjen hiirten kasvaimissa ja plasmassa mitattiin (kuvio 4C). Ad5/3-A24aCTLA4:llä käsitellyissä kasvaimissa havaittiin 81 kertaa enemmän anti-CTLA4-mAb:tta verrattuna Ad5/3-aCTLA4:llä käsiteltyihin kasvaimiin (p<0,05). Lisäksi 43,3 kertaa enemmän anti-CTLA4-mAb:tta havaittiin Ad5/3-A24aCTLA4:llä käsitellyissä kasvaimissa kuin samojen eläinten plasmassa (p<0,05). Keskimääräinen plasmapitoisuus oli 392,6 pg/g (SE 312,0), joka on alle pitoisuuksien, jotka on raportoitu siedetyiksi ihmisillä, jotka on käsitelty ipilimumabilla (561 pg/ml) ja vastaavasti tremelimumabilla 450 pg/ml (Weber JS, et ai. J Clin Oncol 2008;26:5950-6; Ribas A, et ai. J Clin Oncol 2005;23:8968-77; Tarhini AA, Iqbal F, Oncol Targets Ther 2010;3:15-25) (1 ml plasma painaa noin 1 g). Ad5/3-Ä24aCTLA4-kasvaimissa mAb-pitoisuus oli 16 977 pg/g ja siten paljon korkeampi kuin plasmassa.Human prostate implant xenografts were made by injecting 5x106 PC3-MM2 cells into the flanks of 5-6 weeks old female NMRI / nude mice (Taconic, Ejby, Denmark). After seven days, tumors (n = 8 / group, 5-8 mm in diameter) were injected using a volume of 50 µl three times every other day at a dose of 1x108 VP (days 0, 2 and 4) and control tumors were injected with DMEM alone. The formula (length x width2 x 0.5) was used to calculate tumor volume. On day 5, tumor cryosections were stained for anti-CTLA4 expression (human IgG) or apoptosis (active caspase-3) by immunohistochemistry. 4-5 µm cryosections of frozen tumors cast on Tissue Tek OCT (Sakura, Torrance, CA, USA) were prepared and fixed with acetone for 10 min at -20 ° C. Primary antibodies used were goat anti-human IgG (heavy and light chains) (AbD Serotec, MorphoSys) and rabbit monoclonal antibody against active caspase-3 at a dilution of 1: 200 for one hour at room temperature (BD Pharmingen Tm, AB559565). In addition, sections were incubated according to the manufacturer's instructions using the LSAB2 System-HRP kit (K0673, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA). Bound antibodies were visualized using 3,3'-diaminobenzidine (DAB, Sigma, St Louis, MO, USA). Finally, the sections were counterstained with hematoxylin and the water was removed in ethanol, clarified in xylene and sealed with Canadian balsam. Representative images were taken at 40 magnification using an Olympus DP50 color camera equipped with a Leica DM LB microscope. On day 7, human IgG levels in tumors and plasma of Ad5 / 3-A24aCTLA4 or Ad5 / 3-aCTLA4 treated mice were measured (Figure 4C). 81-fold more anti-CTLA4 mAb was detected in Ad5 / 3-A24aCTLA4-treated tumors compared to Ad5 / 3-aCTLA4-treated tumors (p <0.05). In addition, 43.3-fold more anti-CTLA4 mAb was detected in Ad5 / 3-A24aCTLA4-treated tumors than in the plasma of the same animals (p <0.05). The mean plasma concentration was 392.6 pg / g (SE 312.0), which is below the levels reported to be tolerated in humans treated with ipilimumab (561 pg / ml) and tremelimumab 450 pg / ml, respectively (Weber JS, et al. .J Clin Oncol 2008; 26: 5950-6; Ribas A, et al. J Clin Oncol 2005; 23: 8968-77; Tarhini AA, Iqbal F, Oncol Targets Ther 2010; 3: 15-25) (1 mL plasma weighs about 1 g). In Ad5 / 3-Ä24aCTLA4 tumors, the mAb concentration was 16,977 pg / g and thus much higher than in plasma.
Ihmisen anti-CTLA-4-mAb ei sitoudu hiiren CTLA-4:ään, ja kseno-graftikokeet tarvitsevat T-solupuutteisia karvattomia hiiriä. Siten tämä malli määrittää vain onkolyyttisiä ja proapoptoottisia vaikutuksia. Kuitenkin Ad5/3-Ä24aCTLA4 osoitti merkittävää kasvaimenvastaista aktiivisuutta verrattuna mock-kontrolliin (p < 0,01; kuvio 4A) tässä aggressiivisessa ihonalaisessa eturauhassyövän ksenograftimallissa. Mikään muu käsitelty ryhmä ei osoittanut merkittävää vaikutusta mock-kontrolliin verrattuna. Ad5/3-Ä24aCTLA4:n ja Ad5/3-Ä24:n välillä ei havaittu tilastollista eroa (p=0,43), mikä varmistaa in vitro -tulokset, joiden mukaan anti-CTLA4-mAb:n ilmentäminen ei vähennä viruksen kasvaimenvastaista tehoa.Human anti-CTLA-4 mAb does not bind to murine CTLA-4 and xenograft assays require T-cell deficient nude mice. Thus, this model only measures oncolytic and proapoptotic effects. However, Ad5 / 3-Ä24aCTLA4 showed significant antitumor activity compared to mock control (p <0.01; Fig. 4A) in this aggressive subcutaneous xenograft model of prostate cancer. No other treated group showed a significant effect compared to mock control. No statistical difference (p = 0.43) was observed between Ad5 / 3-Ä24aCTLA4 and Ad5 / 3-Ä24, confirming in vitro results that expression of anti-CTLA4 mAb does not reduce viral antitumor efficacy .
Koska tiedetään, että CTLA-4:ää estävät vasta-aineet indusoivat kasvainsolujen suoraa tappoa käynnistämällä apoptoosin, määritettiin, liittyikö kasvaimenvastainen teho ihmisen anti-CTLA4-mAb-tuotantoon ja sen jälkeen lisääntyneeseen apoptoosiin. Ihmisen mAb:n värjäys Ad5/3-A24aCTLA4:llä ja Ad5/3-aCTLA4:llä käsitellyissä kasvaimissa havaittiin, mutta ei Ad5/3-A24:llä tai Ad5/3-Luc1:Ma (kuvio 4B). Ihmisen mAb:n ilmentäminen vaikuttaa korreloivan lisääntyneeseen apoptoosiin (kuvio 4B). Siten Ad5/3-Ä24aCTLA4:llä käsitellyt kasvaimet ilmentävät anti-CTLA-4-mAb:a mikä johtaa lisääntyneeseen apoptoosiin.Because CTLA-4 inhibiting antibodies are known to induce direct killing of tumor cells by initiating apoptosis, it was determined whether anti-tumor efficacy was associated with human anti-CTLA4 mAb production and subsequent increased apoptosis. Staining of human mAb with Ad5 / 3-A24aCTLA4 and Ad5 / 3-aCTLA4-treated tumors was observed but not with Ad5 / 3-A24 or Ad5 / 3-Luc1 (Fig. 4B). Expression of human mAb appears to correlate with increased apoptosis (Figure 4B). Thus, Ad5 / 3-Ä24aCTLA4-treated tumors express anti-CTLA-4 mAb leading to increased apoptosis.
Esimerki 6. Syöpäpotilaiden T-solujen immunomodulaatio anti-CTLA4-mAb:a ilmentävillä onkolyyttisillä adenoviruksillaExample 6. Immunomodulation of T Cells in Cancer Patients by Oncolytic Adenoviruses Expressing Anti-CTLA4 mAb
Prekliinisten havaintojen laajentamiseksi ihmisiin, tutkittiin PBMC:ita potilailta, joilla oli pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia, jotka reagoivat huonosti kemoterapiaan. Syöpäpotilaiden (potilas I244, joka sairastaa kondroideaalis-ta melanoomaa, potilas C26, joka sairastaa paskusuolisyöpää, potilas M158, joka sairastaa mesotelioomaa tai potilas X258, joka sairastaa kohdunkaulansyöpää) PBMC:t stimuloitiin 0,3 pg/ml:lla ionomysiiniä (Sigma-AIdrich Co.), 0,03 pg/ml:llaforbolimyristyyliasetaattia (PMA) (Sigma-AIdrich Co.) ja 1 pg/ml:lla rekombinanttia ihmisen B7-Fc-kimeraa (R&D Systems) kasvaimen aiheuttaman immunosuppression matkimiseksi. Stimulaation jälkeen PBMC:itä käsiteltiin Ad5/3-A24aCTLA4:lla, Ad5/3-A24:lla, Ad5/3-aCTLA4:lla tai Ad5/3-Luc1:llä in-fektoitujen PC3-MM2-solujen 0,02 pm:n suodattimena (Anotop, VVhatman, England) suodatetuilla supernatanteilla.To extend preclinical findings to humans, PBMCs were studied in patients with advanced solid tumors that responded poorly to chemotherapy. PBMCs of cancer patients (patient I244 with chondroid melanoma, patient C26 with sputum cancer, patient M158 with mesothelioma, or patient X258 with cervical cancer) were stimulated with 0.3 pg / ml of ionomycin ( Co.), 0.03 pg / ml of phorbol myristyl acetate (PMA) (Sigma-Aldrich Co.) and 1 pg / ml of recombinant human B7-Fc chimeras (R&D Systems) to mimic tumor-induced immunosuppression. After stimulation, PBMCs were treated with 0.02 µM of PC3-MM2 cells infected with Ad5 / 3-A24aCTLA4, Ad5 / 3-A24, Ad5 / 3-aCTLA4 or Ad5 / 3-Luc1: n filter (Anotop, Whatman, England) with filtered supernatants.
Loss of function -määrityksessä 0,1 pg/ml rekombinanttia ihmisen CTLA-4/Fc-kimeraa (R&D Systems) lisättiin ionomysiiniin, PMA:jan ja rekom-binanttiin B7:ään. Kaksikymmentäneljä tuntia PBMC-stimulaation jälkeen inter-leukiini-2- (IL-2) tai interferoni-y (IFN-γ) -pitoisuudet kasvatusalustoissa analysoitiin BD Cytometric Bead Array Human Soluble Protein Flex Set -pakkauksella (Becton Dickinson) valmistajan ohjeiden mukaan. Käytettiin kymmentä vi-ruspartikkelia (VP) solua kohti ja 48 tuntia myöhemmin supernatantit otettiin talteen. Hiiren monoklonaalista anti-ihmis-CTI_A-4 (=CD152) -vasta-ainetta (BD Pharmingen™, Eurooppa) käytettiin positiivisena kontrollina. FCAP Array v. 1.0.2 (Soft Flow) -ohjelmistoa käytettiin analyysiin.In the Loss of function assay, 0.1 pg / ml recombinant human CTLA-4 / Fc chimeras (R&D Systems) was added to ionomycin, PMA and recombinant B7. Twenty-four hours after PBMC stimulation, concentrations of interleukin-2 (IL-2) or interferon-γ (IFN-γ) in media were analyzed with BD Cytometric Bead Array Human Soluble Protein Flex Set (Becton Dickinson) according to the manufacturer's instructions. Ten viral particles (VP) were used per cell and supernatants were harvested 48 hours later. A mouse monoclonal anti-human CTI_A-4 (= CD152) antibody (BD Pharmingen ™, Europe) was used as a positive control. FCAP Array v. 1.0.2 (Soft Flow) software was used for analysis.
Kaikissa neljässä potilasnäytteessä supernatantti anti-CTLA4-mAb:tta ilmentävistä onkolyyttisistä adenoviruksista kykeni lisäämään T-soluaktiivi-suutta mitattuna IL-2:lla ja gamma-interferonilla (kuvio 5). Kokeen periaate esi tetään kuviossa 7. On mielenkiintoista, että, vaikka rekombinantti mAb oli tehokkaampi Jurkat-soluissa, joka on immortalisoitu T-solulinja, potilasnäytteillä virussupernatantit olivat tehokkaampia. Samanlaisia tuloksia saatiin loss of function -määrityksessä (kuvio 8), periaate kuvioissa 7E-F.In all four patient samples, the supernatant from oncolytic adenoviruses expressing anti-CTLA4 mAb was able to increase T cell activity as measured by IL-2 and interferon gamma (Figure 5). The principle of the assay is shown in Figure 7. Interestingly, although recombinant mAb was more potent in Jurkat cells, an immortalized T cell line, virus supernatants were more potent in patient samples. Similar results were obtained in the loss of function assay (Figure 8), the principle in Figures 7E-F.
Esimerkki 7. Anti-CTLA4-mAb:n vaikutus terveiltä yksilöiltä otettuihin PBMC:ihin.Example 7. Effect of anti-CTLA4 mAb on PBMCs from healthy individuals.
Esimerkissä 6 kuvatut kokeet suoritettiin käyttäen myös käyttäen terveiden yksilöiden PBMC:itä. Päinvastoin kuin syöpäpotilailla, supernatantti Ad5/3-A24aCTLA4:llä infektoiduista soluista ei lisännyt IL-2:n tai gamma-interferonin tuotantoa. Merkittäviä muutoksia ei nähty myöskään loss of function -määrityksessä. Kuitenkin, koska positiivinen kontrolli, rekombinantti mAb, oli tehokas molemmissa tapauksissa (lisäsi IL-2:ta ja-gamma-interferonia kuviossa 6 ja vähensi niitä kuviossa 8; lisääntynyt IL-2 p<0,05 ja p=0,206, lisääntynyt INF-γ p<0,05 ja vastaavasti p=0,120, luovuttajassa 1 ja luovuttajassa 2 kuviossa 6; vähentynyt IL-2 p<0,001 ja p<0,05; ja vähentynyt INF-γ p<0,001 ja vastaavasti p<0,05 vastaavasti luovuttajassa 1 ja luovuttajassa 2 kuviossa 8; verrattuna rB7:ään, rCTLA4. lonomysiini ja PMA vain käsitellyt solut), otaksuttiin, että tämä on annosvaikutus. Tätä tukee ei-merkittävä trendi, joka nähdään Ad5/3-A24aCTLA4:ssä loss-of-function -määrityksessä (kuvio 8) ja useissa tapauksissa merkittävä vaikutus supernatantilla Ad5/3-aCTLA4:llä infektoiduissa soluissa (kuviot 6 ja 8). Kuitenkin anti-CTLA-4-mAb:n vaikutus on huomattava syöpäpotilailla, ehkä koska niillä on korkeampi käynnissä olevien immunosup-pressiivisten prosessien aste läsnä olevan edenneen kasvaimen takia.The experiments described in Example 6 were also performed using PBMCs from healthy individuals. In contrast to cancer patients, supernatant from cells infected with Ad5 / 3-A24aCTLA4 did not increase the production of IL-2 or interferon-gamma. No significant changes were seen in the loss of function assay either. However, since the positive control, the recombinant mAb, was effective in both cases (increased and decreased IL-2 and gamma interferon in Figure 6; increased IL-2 p <0.05 and p = 0.206, increased INF- γ p <0.05 and p = 0.120, respectively, in donor 1 and donor 2 in Figure 6; decreased IL-2 p <0.001 and p <0.05, and decreased INF-γ p <0.001 and p <0.05, respectively. donor 1 and donor 2 in Figure 8; compared to rB7, rCTLA4. lonomycin and PMA only treated cells), this was assumed to be a dose effect. This is supported by the non-significant trend seen in Ad5 / 3-A24aCTLA4 in the loss-of-function assay (Fig. 8) and, in many cases, by a significant effect in the supernatant in Ad5 / 3-aCTLA4-infected cells (Figs. 6 and 8). However, the effect of anti-CTLA-4 mAb is significant in cancer patients, perhaps because they have a higher degree of ongoing immunosuppressive processes due to the presence of advanced tumor.
Esimerkki 8: Replikoitumiskykyisen mallin käyttökelpoisuus anti-CTLA4 mAb:n ilmentymisen lisäämisessäExample 8: Utility of a replicable template to increase expression of anti-CTLA4 mAb
Replikoitumiskykyisen mallin käyttö anti-CTLA4-mAb:n ilmentymisen lisäämisessä verrattuna replikoitumiskyvyttömään virukseen analysoitiin. PC3-MM2-solut laitettiin pitoisuutena 20 000 solua kuoppaa kohti ja infektoitiin pitoisuudella 10 VP solua kohti Ad5/3-A24aCTLA4:lla ja vastaavasti Ad5/3-aCTLA4:lla. 24 h, 48 h ja 72 h infektion jälkeen supernatantit kerättiin ja analysoitiin ELISA:lla ihmisen lgG:n määrän suhteen. Kolminkertainen lisäys havaittiin onkolyyttisellä viruksella Ad5/3-A24aCTLA4 verrattuna replikoitumiskyvyttömään Ad5/3-aCTLA4:iin. Ad5/3-aCTLA4 (kuvio 10).The use of a replicable template to increase expression of anti-CTLA4 mAb compared to non replication-free virus was analyzed. PC3-MM2 cells were plated at a concentration of 20,000 cells per well and infected at 10 VP per cell with Ad5 / 3-A24aCTLA4 and Ad5 / 3-aCTLA4, respectively. At 24 h, 48 h and 72 h after infection, supernatants were harvested and analyzed by ELISA for the amount of human IgG. A threefold increase was observed with the oncolytic Ad5 / 3-A24aCTLA4 compared to the non-replicating Ad5 / 3-aCTLA4. Ad5 / 3-aCTLA4 (Figure 10).
Yksi onkolyyttisen mallin hyöty siirtogeenin ilmentymisen saatu korkeampi taso. Varhaisvaiheen geenien ilmentämisen jälkeen viruksen genomi monistuu ja jopa 10 000 kopiota virus-DNA:ta tuotetaan. Tämä johtaa paljon useampiin kopioihin, jotka voivat tuottaa siirtogeeniä (kuvio 10).One benefit of the oncolytic model is the higher level of transgene expression obtained. After expression of early genes, the viral genome is amplified and up to 10,000 copies of viral DNA are produced. This results in many more copies that can produce the transgene (Figure 10).
Esimerkki 9: Onkolyyttiset adenovirusvektorit, joilla on lisääntynyt immuunivasteExample 9: Oncolytic adenoviral vectors with enhanced immune response
Immuunivasteen lisäämiseksi edelleen tutkittiin onkolyyttisiä adeno-virusta, jotka sisältävät TLR-9:a (toll-like receptor 9) stimuloivia CpG-molekyylejä viruksen rungossa (kuvio 1), käyttäen keuhkosyövän ksenografti-hiirimallia. Karvattomiin NMRI-hiiriin (5 hiirtä ryhmää kohti, kaksi kasvainta hiirtä kohti) istutettiin A549-soluja ja käsiteltiin 1x108 VP:llä CpG-rikkaalla onko-lyyttisellä adenoviruksella Ad5-A24CpG, onkolyyttisellä adenoviruksella, joka sisältää A24-deleetion, onkolyyttisellä adenoviruksella + CpG:tä sisältävillä re-kombinanteilla oligoilla (ODN 2395, InvivoGen, USA). Kasvaimen kasvua mitattiin kahden päivän välein 12 päivää, kuten aikaisemmin on kuvattu. CpG-rikas virus Ad5-A24CpG oli tehokkain kasvaimenvastaisen immuniteetin välittämisessä (kuvio 11).To further increase the immune response, oncolytic adeno virus containing TLR-9 (toll-like receptor 9) stimulating CpG molecules in the viral backbone (Figure 1) was studied using a mouse model of lung cancer xenograft. Hairless NMRI mice (5 mice per group, two tumors per mouse) were implanted with A549 cells and treated with 1x108 VP of CpG-rich oncolyte adenovirus Ad5-A24CpG, oncolytic adenovirus containing A24 deletion, oncolytic adenovirus containing recombinant oligos (ODN 2395, InvivoGen, USA). Tumor growth was measured every two days for 12 days as previously described. The CpG-rich virus Ad5-A24CpG was most effective in transmitting anti-tumor immunity (Figure 11).
Pernasoluja, jotka oli otettu talteen samoilta hiiriltä, stimuloitiin UV-inaktivoidulla viruksella ja keraviljeltiin suhteessa 1:1 ja 10:1 A549-solujen kanssa. MTS-solutappomääritys suoritettiin ajanhetkenä 72 tuntia. Annetaan prosenttiosuus A549-soluista, jotka ovat vielä elossa annettuna ajankohtana. Kuviossa 12 esitetty tulos osoittaa, että CpG-modifioitu virus kykeni stimuloimaan antigeeniä esitteleviä soluja ja tämä johti lisääntyneeseen kasvaimen-vastaiseen immuunivasteeseen. Vaste oli niin voimakas, että se voitiin nähdä jopa karvattomissa hiirissä, joilta T-solut puuttuvat. Niinpä jopa parempia tuloksia odotetaan immuunikompotenteissa eläimissä ja ihmisissä. TLR-9-stimulaa-tion käyttö (joka indusoi kasvaimenvastaisen immuniteetin) on todennäköisesti merkittävin samanaikaisen suppressiivisten signaalien vähentämisen kanssa aCTLA-4:lla.Spleen cells harvested from the same mice were stimulated with UV-inactivated virus and co-cultured in a ratio of 1: 1 and 10: 1 with A549 cells. The MTS cell kill assay was performed at 72 hours. The percentage of A549 cells still alive at the given time is given. The result shown in Figure 12 shows that the CpG-modified virus was able to stimulate antigen-presenting cells and this resulted in an increased anti-tumor immune response. The response was so strong that it could be seen even in nude mice lacking T cells. Thus, even better results are expected in immunocompetent animals and humans. The use of TLR-9 stimulation (which induces anti-tumor immunity) is likely to be most significant with concomitant suppression of suppressive signals by aCTLA-4.
Esimerkki 10. Monoklonaalisia anti-CTLA-4-vasta-aineita sisältävien on-colyyttisten adenovirusvektoreiden turvallisuus ja teho ihmisten syövässä 1. PotilaatExample 10. Safety and Efficacy of Oncolytic Adenovirus Vectors Containing Anti-CTLA-4 Monoclonal Antibodies in Human Cancer 1. Patients
Potilaita, joilla on pitkälle kehittyneitä ja vaikeasti hoidettavia kiinteitä kasvaimia, pyydetään osallistumaan Suomen Lääkealan turvallisuus ja kehittä miskeskuksen (FIMEA) hyväksymään Advanced Therapy Access Program (ATAP) -ohjelmaan.Patients with advanced and difficult-to-treat solid tumors are invited to participate in the Advanced Therapy Access Program (ATAP) approved by the Finnish Center for Pharmaceutical Safety and Development (FIMEA).
Potilaat valitaan syöpäpotilaista, joilla oli pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia, jotka vastasivat huonosti standardihoitoihin. Mukaanottokriteerit olivat kiinteät kasvaimet, jotka reagoivat huonosti tavanomaisiin hoitoihin, WHO:n suoritusarvo 3 tai alle, eikä suuria elinten toimintojen puutteita. Hylkäyskriteerit olivat elinsiirto, HIV, vaikea sydänverisuoni-, metabolinen tai keuhkosairaus tai muut oireet, löydökset tai taudit, jotka estivät onkolyyttisen virushoidon. Kirjallinen suostumusasiakirja saatiin ja hoidot hallinnoitiin hyvän kliinisen tutkimustavan ja Helsingin julistuksen mukaisesti. Hoidot annetaan kasvaimensisäises-ti, suonensisäisesti tai intraperitoneaalisesti, kulloinkin sopivasti. II. Hoidot aCTLA-4 mAb:tta:ää koodaavalla adenovirusvektorillaPatients are selected from cancer patients with advanced solid tumors that did not respond well to standard treatments. Inclusion criteria were solid tumors that responded poorly to conventional treatments, a WHO performance score of 3 or less, and no major organ dysfunction. The criteria for rejection were transplantation, HIV, severe cardiovascular, metabolic or pulmonary disease, or other symptoms, findings, or diseases that prevented oncolytic viral therapy. Written informed consent was obtained and treatments were administered in accordance with good clinical practice and the Helsinki Declaration. The treatments are administered intravenously, intravenously or intraperitoneally, as appropriate. II. Treatments with an adenoviral vector encoding aCTLA-4 mAb
Onkolyyttiset adenovirukset tuotetaan kliinisen laatuluokan mukaisesti ja potilaiden hoito aloitetaan.Oncolytic adenoviruses are produced according to clinical grade and patient treatment is initiated.
Hoito annetaan kasvaimensisäisinä injektioina. Hoitojen kokonaislukumäärä on kolme joka kolmas viikko. Virusannokset valitaan perustuen keksijöiden aikaisempiin tietoihin muilla onkolyyttisillä viruksilla. Kuitenkin voidaan käyttää muita anto-ohjelmia kulloinkin sopivasti. Esimerkiksi sarjahoitojen ensimmäisellä kierroksella potilaat saavat osan annoksesta, esim. neljä viidesosaa tai kaksi viidesosaa annoksesta kasvaimensisäisesti tai intraperionaali-sesti ja lopun annoksen suonensisäisestiTreatment is given by intravenous injection. The total number of treatments is three to three weeks. The doses of the virus are selected based on the inventors' prior knowledge of other oncolytic viruses. However, other administration programs may be used as appropriate. For example, in the first round of serial therapy, patients receive a portion of the dose, e.g., four-fifths or two-fifths of the dose intravenously or intraperitoneally, and the remainder of the dose intravenously.
Virus laimennetaan steriilillä suolaliuoksella antoajankohtana asianmukaisissa olosuhteissa. Viruksen antamisen jälkeen kaikkia potilaita tarkkaillaan yön yli sairaalassa ja tämän jälkeen avohoitopotilaina. Fyysinen tarkastelu ja sairauskertomus tehtiin jokaisella käynnillä ja kliinisesti relevantteja laborato-rioarvoja seurattiin.The virus is diluted in sterile saline at the time of administration under appropriate conditions. After the virus is administered, all patients are monitored overnight in hospital and then as outpatient patients. Physical examination and medical report were performed at each visit and clinically relevant laboratory values were monitored.
Hoidon sivuvaikutukset kirjataan ja pisteytetään CTCAE:n (Common Terminology Criteria for Adverse Events) version 3.0 mukaisesti. Koska monilla syöpäpotilailla on taudista johtuvia oireita, aikaisemmin esiintyville oireille ei anneta numeroa, jos ne eivät pahene. Kuitenkin jos oire tuli vakavammaksi, esim. Jos ennen hoitoa oleva aste 1 muuttui asteeksi 2 hoidon jälkeen, sille annetaan numero asteena 2.Treatment side effects are recorded and scored according to CTCAE (Common Terminology Criteria for Adverse Events) version 3.0. Because many cancer patients have symptoms due to the disease, the symptoms that occur earlier are not numbered unless they worsen. However, if the symptom became more severe, for example, if pre-treatment grade 1 changed to grade 2 after treatment, it will be numbered as grade 2.
Kasvaimen koko määritetään varjoainetehosteisella tietokonetomografia (CT) -skannauksella. Saadaan maksimaaliset kasvaimen halkaisijat. RECIST1.1 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) -kriteerejä sovelletaan koko tautiin, mukaan lukien injektoidut ja injektoimattomat leesiot. Nämä kriteerit ovat: osittainen vaste PR (>30 %:n väheneminen kasvaimen halkaisijoiden summassa), stabiili tauti SD (ei vähenemistä/lisääntymistä), etenevä tauti PD (>20 %:n lisääntyminen). Selville kasvaimen pienenemisille, jotka eivät täytä PR:ää, annetaan numero vähäisinä vasteina (MR). Seerumin kas-vainmerkit määritettiin myös, kun ne nousivat perusarvosta, ja samoja prosenttiosuuksia käytettiin.Tumor size is determined by contrast-enhanced computed tomography (CT) scanning. Maximum tumor diameters are obtained. The Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST1.1) applies to the entire disease, including injected and non-injected lesions. These criteria are: partial response PR (> 30% reduction in sum of tumor diameters), stable disease SD (no reduction / increase), progressive disease PD (> 20% increase). The number of non-PR-related tumor suppressors is assigned a number as low response (MR). Serum brand names were also determined as they rose from baseline, and the same percentages were used.
Potilaiden seeruminäytteet analysoidaan immunologisten ja virologisten parametrien suhteen, kuten esimerkiksi viruksen kopiolukumäärä veressä ajan mittaan, virusvastaisten neutraloivien vasta-aineiden indusointi, muutokset virusvastaisissa ja kasvaimenvastaisissa T-soluissa, muut immunologiset solutyypit ja muutokset kasvaimenvastaisissa vasta-aineissa. Lisäksi haittavaikutukset asteistetaan Common Terminology for Adverse Events v3.0 (CTCAE) -käytännön mukaan, neutraloivien vasta-aineiden tiitterit mitataan ja teho ar-voidaan RECIST-kriteereiden mukaan tietokonetomografialle (CT) (Therasse P et ai. 2000, J Natl Cancer Inst 92, 205-16PERCIST-kriteerien mukaan (VVahl et ai 2009 J Nucl Med 50 Suppl 1:122S-50S) positroniemissiotomografia-tietokonetomografialle (PET-CT). Kaikilla potilailla oli ollut eteneviä kasvaimia ennen hoitoa ja he ovat taudin eri tiloissa.Patient serum samples are analyzed for immunological and virological parameters such as viral copy number over time in blood, induction of antiviral neutralizing antibodies, changes in antiviral and antitumor T cells, other immunological cell types, and changes in antitumor antibodies. In addition, adverse reactions are graded according to Common Terminology for Adverse Events v3.0 (CTCAE), neutralizing antibody titers are measured, and efficacy is evaluated using RECIST criteria for computed tomography (CT) (Therasse P et al. 2000, J Natl Cancer Inst 92 , 205-16PERCIST Criteria (Wahl et al. 2009 J Nucl Med 50 Suppl 1: 122S-50S) for positron emission computed tomography (PET-CT) All patients had progressive tumors prior to treatment and are in different states of the disease.
Claims (34)
Priority Applications (13)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI20105991A FI124927B (en) | 2010-09-24 | 2010-09-24 | Adenovirus vectors and methods and uses thereof |
BR112013006699A BR112013006699A2 (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | oncolytic adenoviral vector encoding monoclonal anti-ct4-4 antibodies, cell and pharmaceutical composition comprising the same, method of producing ctla-4 specific human monoclonal antibody in a cell and use of said adenoviral vector |
EP11770846.1A EP2619312A1 (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - ctla - 4 antibodies |
PCT/FI2011/050822 WO2012038606A1 (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - ctla - 4 antibodies |
CA2812093A CA2812093A1 (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - ctla - 4 antibodies |
CN2011800533195A CN103221544A (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti-CTLA-4 antibodies |
SG2013019120A SG189001A1 (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - ctla - 4 antibodies |
JP2013529691A JP2014500004A (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | Oncolytic adenoviral vector encoding anti-CTLA-4 monoclonal antibody |
US13/825,852 US20130243731A1 (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti-ctla-4 antibodies |
RU2013118723/10A RU2013118723A (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | ONCOLITIC Adenovirus VECTORS CODING MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST CTLA-4 |
KR1020137010377A KR20130108371A (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti-ctla-4 antibodies |
AU2011306845A AU2011306845C1 (en) | 2010-09-24 | 2011-09-23 | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - CTLA - 4 antibodies |
ZA2013/02429A ZA201302429B (en) | 2010-09-24 | 2013-04-04 | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti-ctla-4 antibodies |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI20105991 | 2010-09-24 | ||
FI20105991A FI124927B (en) | 2010-09-24 | 2010-09-24 | Adenovirus vectors and methods and uses thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI20105991A0 FI20105991A0 (en) | 2010-09-24 |
FI20105991A FI20105991A (en) | 2012-03-25 |
FI124927B true FI124927B (en) | 2015-03-31 |
Family
ID=42829720
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI20105991A FI124927B (en) | 2010-09-24 | 2010-09-24 | Adenovirus vectors and methods and uses thereof |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI124927B (en) |
-
2010
- 2010-09-24 FI FI20105991A patent/FI124927B/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI20105991A0 (en) | 2010-09-24 |
FI20105991A (en) | 2012-03-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2011306845B2 (en) | Oncolytic adenoviral vectors coding for monoclonal anti - CTLA - 4 antibodies | |
Zhao et al. | Oncolytic adenovirus: prospects for cancer immunotherapy | |
FI123955B (en) | Oncolytic adenovirus | |
JP6639412B2 (en) | Adenovirus comprising an albumin binding moiety | |
AU2011306846B2 (en) | Oncolytic adenoviral vectors and methods and uses related thereto | |
SM Wold et al. | Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy | |
RU2520823C2 (en) | Adenoviral vectors and related methods and applications | |
Cerullo et al. | Oncolytic adenoviruses for cancer immunotherapy: data from mice, hamsters, and humans | |
JP2015523412A (en) | Live in vivo tumor-specific cancer vaccine system made by co-administration of at least two or all three components such as tumor cells, oncolytic viral vectors with transgenic expression of GM-CSF, and immune checkpoint modulators | |
EP4148126A1 (en) | Immunoevasive anti-tumor adenovirus | |
KR20180015113A (en) | Therapeutic compositions and methods of use for treating cancer | |
Tuve et al. | In situ adenovirus vaccination engages T effector cells against cancer | |
FI124927B (en) | Adenovirus vectors and methods and uses thereof | |
FI124926B (en) | Adenovirus vectors and related methods and uses | |
FI121508B (en) | Adenovirus vectors and related methods and uses | |
Murdaugh | Intrinsic and extrinsic brain activity in children with autism before and after a visualization language intervention |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG | Patent granted |
Ref document number: 124927 Country of ref document: FI Kind code of ref document: B |
|
MM | Patent lapsed |