FI121378B - Ksylanaasi, sitä tuottava mikro-organismi, DNA-molekyyli, menetelmä ksylanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö - Google Patents

Ksylanaasi, sitä tuottava mikro-organismi, DNA-molekyyli, menetelmä ksylanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI121378B
FI121378B FI953578A FI953578A FI121378B FI 121378 B FI121378 B FI 121378B FI 953578 A FI953578 A FI 953578A FI 953578 A FI953578 A FI 953578A FI 121378 B FI121378 B FI 121378B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
xylanase
sequence
bacillus
seq
strain
Prior art date
Application number
FI953578A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI953578A0 (fi
FI953578A (fi
Inventor
Pierre Ledoux
Buyl Eric De
Rene Detroz
Andree Lahaye
Original Assignee
Genencor Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25662903&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI121378(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from BE9400706A external-priority patent/BE1008570A3/fr
Application filed by Genencor Int filed Critical Genencor Int
Publication of FI953578A0 publication Critical patent/FI953578A0/fi
Publication of FI953578A publication Critical patent/FI953578A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI121378B publication Critical patent/FI121378B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/143—Cereal granules or flakes to be cooked and eaten hot, e.g. oatmeal; Reformed rice products
    • A23L7/148—Cereal granules or flakes to be cooked and eaten hot, e.g. oatmeal; Reformed rice products made from wholegrain or grain pieces without preparation of meal or dough
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D21H17/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its constitution; Paper-impregnating material characterised by its constitution
    • D21H17/20—Macromolecular organic compounds
    • D21H17/21—Macromolecular organic compounds of natural origin; Derivatives thereof
    • D21H17/22—Proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

Ksylanaasi, sitä tuottava mikro-organismi, DNÄ-molekyyli, menetelmiä ksylanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö
Keksintö koskee uutta ksylanaasia. Keksintö koskee 5 myös menetelmiä tämän ksylanaasin valmistamiseksi, sen käyttöä ja sitä sisältäviä valmisteita.
Keksintö koskee myös tätä ksylanaasia tuottavaa uutta mikro-oganismikantaa ja DNA-molekyyliä, joka sisältää tätä ksylanaasia koodaavan nukleotidisekvenssin. Kek-10 sintö koskee myös vektoreita, jotka sisältävät tämän DNA-molekyylin, ja näiden vektorien transformoimat kannat.
Keksintö koskee myös promoottoria, joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasia ja presekvenssiä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL 15 B12:n ksylanaasin signaalipeptidiä. Keksintö koskee myös vektoreita, jotka sisältävät tämän promoottorin ja tämän presekvenssin, ja myös DNA-molekyyliä, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodaa keksinnön ksylanaasin valmiin osan. Keksintö koskee myös näiden vektorien transfor-20 moimia kantoja.
Termostabiilit ksylanaasit, jotka ovat aktiivisia • · :.V laajalla pH-alueella, ovat tunnettuja, kuten etenkin alka- j lofiilisten bacillus-kantojen tuottamat ksylanaasit (Gupta : et ai., BIOTECHNOLOGY LETTERS, 1992, 14 (li), sivut 1045 - • · · · ·1·*. 25 1046 ja kansainvälinen hakemus WO-94/04 664). Kuitenkin • · : .·. näistä ominaisuuksista huolimatta nämä entsyymit ovat te- • · · · hottomia paperimassan valkaisussa.
*· 1 * Tämän takia nykyään tarvitaan ksylanaasia, joka ... olisi käyttökelpoinen paperimassan käsittelyn aikana, hy- • · ·“] 30 vin stabiili ja myös hyvin aktiivinen laajalla lämpötila na happamalla ja emäksisellä pH-alueella.
Tämän keksinnön tarkoitus on saada aikaan uutta • · :***: ksylanaasia, joka on aktiivinen laajalla pH-alueella, yhtä ··· *. hyvin alkalisessa kuin emäksisessä pHrssa.
• · · • · · ··· · 2 Tämän keksinnön tarkoitus on myös identifioida, eristää ja tarjota kanta, erityisesti Bacillus-kanta, joka tuottaa luonnostaan mainittua ksylanaasia.
Tämän keksinnön tarkoitus on myös eristää ja tuot-5 taa DNA-molekyyli, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodaa mainittua ksylanaasia.
Tämän keksinnön kohteena on myös valmistaa ja tuottaa ekspressiovektoria, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodaa mainittua ksylanaasia.
10 Tämän keksinnön tarkoitus on myös valmistaa ja tuottaa integraatiovektoria, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodaa mainittua ksylanaasia.
Tämän keksinnön tarkoitus on myös valmistaa ja tuottaa promoottoria, joka on peräisin geenistä, joka koo-15 daa Bacillus pumilus PRL Bl2:n ksylanaasia. Tämän keksinnön tarkoitus on myös valmistaa ja tuottaa presekvenssiä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasin signaa-lipeptidiä. Vektorit, jotka sisältävät tätä promoottoria ja/tai tätä presekvenssiä, sisältävät myös DNA-molekyylin, 20 joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodaa keksinnön ksylanaasin valmista osaa. Tämän vektorin transformoimat • · kannat tuottavat keksinnön ksylanaasia heterologisella tavalla.
• • ·*. Tämän keksinnön tarkoitus on myös valmistaa ja • · · · 25 tuottaa Bacillus-isäntä, joka on transformoitu ekspressio- • · ; vektorilla, joka sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää • · ·
Bacillus-kannan nukleotidisekvenssin, joka koodaa mainit- • · · • · · * tua ksylanaasia.
Tämän keksinnön tarkoitus on myös valmistaa ja • · *···* 30 tuottaa Bacillus-isäntä, joka on transformoitu integraa- * * tiovektorilla, joka sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää «
Bacillus-kannan nukleotidisekvenssin, joka koodaa mainit- * · .·**. tua ksylanaasia.
··· •# Tämän keksinnön tarkoitus on myös valmistaa ja • · · *·*·' 35 tuottaa valmistetta, joka sisältää tätä ksylanaasia.
• · 3 Tämän keksinnön tarkoitus on myös valmistaa ja tuottaa ksylanaasia, joka on käyttökelpoinen paperimassan käsittelyssä ja massojen käsittelyssä, joiden pH on emäksinen, neutraali tai hapan, ja etenkin käsiteltäessä mas-5 soja, joiden pH on erityisen emäksinen, ja paperimassoja, jotka ovat peräisin eri lähteistä, kuten havupuuperäiset massat, lehtipuuperäiset massat ja erityisesti eukalyptus-massat .
Siksi keksintö koskee ksylanaasia, joka on peräisin 10 Bacilluksesta ja erityisesti aerobisesta ja ei-termofiili-sestä mikro-organismista.
Käytetään mieluiten Bacillus sp. 720/1-kantaa tai tämän kannan mutanttia. Keksinnön ksylanaasi on peräisin (luonnollisesti tuotetusta) Bacillus sp. 720/1 -kannasta.
15 Ksylanaasi luokitellaan kansainvälisessä järjestelmässä numerolla E.C. 3.2.1.8. On kyse endo-1,4-beeta-ksylanaa-sista.
Puhdistettu ja eristetty ksylanaasi sisältää mieluiten vain yhtä polypeptidityyppiä, jonka molekyylipaino 20 on noin 25 kDa.
Keksintö koskee ksylanaasia, joka on eristetty ja • · · *.·.* puhdistettu ja joka sisältää 1 - 221 aminohapon aminohap- ·· • *·· posekvenssin (SEQ ID NO: 3) tai tästä sekvenssistä johdetun • · ·.· ; muunnelman. Aminohapposekvenssi ja valmista ksylanaasia :*·*: 25 koodaava nukletidisekvenssi (SEQ ID NO:l) sekä sen trans- • · • j*j laatio aminohapoiksi (SEQ IS NO:2) on annettu kuviossa 1 • · · · (kuviot la ja Ib) .
• · ·
Keksinnön mukainen ksylanaasi syntetisoidaan pre-kursorina. Prekursori sisältää 248 aminohappoa (SEQ ID ’**. 30 NO: 6). Identifioidaan nukleotidisekvenssi (SEQ ID NO: 5), *# * joka koodaa ksylanaasin prekursoria, sekä sen translaatio ί#ί#ί aminohapoiksi (SEQ ID NO:5).
:***; Prekursori sisältää valmiin ksylanaasin 221 amino- • · · hapon sekvenssin (SEQ ID NO:3) ja presekvenssin 27 amino- ***. 35 hapon sekvenssin (SEQ ID NO: 9).
• · 4
Valmiin ksylanaasin sekvenssiä edeltää presekvens-si. Se on 27 aminohapon lisäsekvenssi (SEQ ID N0:9). Identifioidaan vastaava nukletidisekvenssi (SEQ ID NO:7) sekä sen translaatio aminohapoiksi (SEQ ID N0:8). Tämä presek-5 venssi koodaa keksinnön ksylanaasin signaalipeptidiä.
Erityisen mielellään mainitulle ksylanaasille määritetty isoelektrinen piste on noin 9,5:n ja noin 9,7 välillä.
Keksinnön mukainen ksylanaasi on termostabiili ja 10 aktiivinen hyvin laajalla pH-alueella. Keksinnön ksylanaasi on mieluiten alkalinen.
Keksinnön mukaisella ksylanaasilla on lisäksi kaikki paperimassan entsymaattisen käsittelyn todellisten teollisten olosuhteiden kanssa sopivat vaadittavat ominai-15 suudet. Teollisesti käytettävän paperimassan monien erilaisten käsittelyvaiheiden mukaan näillä ominaisuuksilla on hyvä säilvyys pH:n ja lämpötilan suhteen, entsymaatti-nen aktiivisuus laajalla pH- ja lämpötila-alueella, kuten etenkin noin pH 5 - 10 ja 50 - 80 °C:n lämpötilassa.
20 Keksinnön mukainen ksylanaasi on aktiivinen pH- alueella, joka on noin 5 tai sen yläpuolella. Keksinnön « · ksylanaasi on aktiivinen pH-alueella, joka on noin 11 tai :*·.. sen alapuolella. Ksylanaasi kehittää yli 50 % maksimaali- • :*; sesta aktiivisuudesta, joka on mitattu noin 50 °C:ssa ja ··· · 25 ksylaanin läsnä ollessa pH-alueella, joka on yhtä suuri • · • ,·, tai suurempi kuin noin 5,0. Ksylanaasi kehittää yli 50 % • · · *11.* maksimaalisesta aktiivisuudesta, joka on mitattu noin • · · • · · * 50 °C:ssa ja ksylaanin läsnä ollessa pH-alueella, joka on noin 10,5:n alalpuolella.
• · *···* 30 Keksinnön ksylanaasi on aktiivinen lämpötilassa, * * joka on yli tai yhtä suuri kuin noin 50 °C. Keksinnön ksy- lanaasi on aktiivinen lämpötila-alueella, joka on alle tai * · .*·*. yhtä suuri kuin noin 80 °C. Ksylanaasi kehittää yli 50 % • · · ·. maksimaalisesta entsymaattisesta aktiivisuudesta, joka on • · · *··»! 35 mitattu noin pH 9: ssä ja ksylaanin läsnä ollessa lämpöti- • · 5 la-alueella, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin noin 50 °C. Ksylanaasi kehittää yli 50 % maksimaalisesta entsy-maattisesta aktiivisuudesta, joka on mitattu noin pH 9:ssä ja ksylaanin läsnä ollessa lämpötila-alueella, joka on 5 noin alle 80 °C.
Keksintö koskee myös modifioitua ksylanaasia eli entsyymiä, jonka aminohapposekvenssi eroaa villityypin entsyymistä ainakin yhden aminohapon verran. Näitä modifikaatioita voidaan saada aikaan klassisilla DNA:ta muta-10 toivilla tekniikoilla, kuten altistamalla ultraviolettisäteilylle, kemiallisille yhdisteille, kuten metaanisulfo-naatille (EMS), N-metyyli-N-nitro-N-nitrosoguanidiinille (MNNG), natriumnitriitille tai O-metyylihydroksyyliamii-nille tai geenitekniikalla, kuten esimerkiksi ohjatulla 15 mutageneesillä tai sattumanvaraisella mutageneesillä. Nämä tekniikat ovat alan ammattimiehen tuntemia ja niitä on kuvattu etenkin teoksessa MOLECULAR CLONING - a laboratory manual- SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS, toinen painos, 1989, kappale 15.
20 Keksintö koskee myös ksylanaasia, jolla on saman laiset tai osittain samanlaiset immunokemialliset ominai- • · suudet kuin Bacillus sp. 720/1 -kannan avulla valmistetul-la ksylanaasilla. Immunokemialliset ominaisuudet voidaan • määrittää immunologisesti identiteettitestillä käyttämällä ··· · 25 etenkin spesifisiä monoklonaalisia tai polyklonaalisia • · : .·, vasta-aineita. Identiteettitestit ovat alan ammattimiehen • · · tuntemia, kuten etenkin Ouchterlonyn immunodiffuusiomene- • ♦ · telmä tai immunoelektroforeesimenetelmä. Esimerkkejä täl-laisista menetelmistä on kuvattu N.H. Axelsenin kirjassa • · *··*! 30 Handbook of Immunoprecipitation Gel Techniques, Blackwell * * Scientific Publications, 1983, kappaleet 5 ja 14, termit :V: "antigeenisestä identtinen" ja "antigeenisesti osittain • · .*·*. identtinen" on kuvattu tämän teoksen kappaleissa 5, 19 ja ··· \ 20. Spesifisiä vasta-aineita sisältävää seerumia valmiste- • · · ’···* 35 taan kuvatulla menetelmällä immunisoimalla eläimiä (esi- • · 6 merkiksi hiirtä, kania tai vuohta) puhdistetulla ksylanaa-sipreparaatilla. Tätä preparaattia voidaan sekoittaa lisäaineeseen, kuten Freundin adjuvanttiin ja injektoida eläimiä tällä seoksella. Polyklonaalisia vasta-aineita saadaan 5 yhden tai useamman immunisoinnin jälkeen. Injektoidaan esimerkiksi subkutaanisesti kahden viikon välein neljällä annoksella, joista kukin sisältää 150 mikrogrammaa puhdistettua ksylanaasia, immunisointi kestää sitten 8 viikkoa. Seerumi otetaan immunisointijakson jälkeen ja immunoglobu-10 liinit voidaan eristää N.H. Axelsonin kuvaamalla menetelmällä (1983).
Tämä keksintö koskee myös uuden, eristetyn ja puhdistetun, aerobisen ja ksylanaasia tuottavan bakteerin identifiointia ja tuottamista. Yleisesti se kuuluu Bacil-15 laceae-heimoon. Se kuuluu mieluiten Bacillus-sukuun. Erityisesti mainittu Bacillus on Bacillus sp. kanta 720/1 tai tästä kannasta peräisin oleva mutanttikanta.
Tästä kannasta peräisin oleva tarkoittaa mitä tahansa bakteeria, joka on luonnollisesti modifioitu. Tämän 20 kannan johdannaisia voidaan saada tunnetuilla modifikaa-tiomenetelmillä, kuten viljelemällä erityisellä kasvatus- • · ί#ί#ί alustalla, ultraviolettisäteilyllä, röntgensäteilyllä.
Γ·.. Tämän kannan mutantilla tarkoitetaan mitä tahansa keinote- • • j*j koisesti modifioitua bakteeria. Tämän kannan mutantteja • · · « !*.*. 25 voidaan saada tunnetuilla modifikaatiotekniikoilla, kuten • · ; .·. mutageenisille aineille altistamalla ja geenitekniikalla.
• · 4 .1.* Nämä tekniikat ovat alan ammattimiesten tuntemia ja niitä • · · on kuvattu etenkin SAMSBROOK et ai. kirjassa, 1989, kappa-leessa 15.
*···* 30 Bacillus sp. kanta 720/1 on talletettu kokoelmaan,
joka on nimeltään BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF
·*·*: MICROORGANISMS (LMG culture collection, Universite de • · .·**. Gand, Laboratoire de Microbiologie - K.L. Ledeganckstraat • · · •# 35, B-9000 Gand, Belgia) Budapestin sopimuksen mukaan nu- *·:·* 35 merolla LMG P-14798 9. kesäkuuta 1994. Keksintö koskee • · 7
Bacillus sp. 720/1 -kannan eristettyä ja puhdistettua viljelmää ja tästä viljelmästä peräisin olevaa tai sen muta-toitua viljelmää.
Tämän keksinnön kanta on identifioitu biokemian i-5 silta ominaisuuksiltaan: Gram-positiivinen, aerobinen, sauvan muotoinen bakteeri, se muodostaa itiöitä. Se on oligosprogeeninen.
Keksintö koskee myös DNA-molekyylin eristämistä ja tuottamista, joka sisältää nukleotidisekvenssin (SEQ ID 10 NO:l), joka koodaa valmista Bacillus sp. 720/1:n (LMG P-14798) ksylanaasia, tai siitä peräisin olevan modifioidun sekvenssin. Tämä DNA-molekyyli sisältää mieluiten koko Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasin geenin. Ksylanaasin koko geenillä (SEQ ID NO:10) tarkoitetaan ainakin transkription 15 promoottoria tai promoottoreita, signaalisekvenssiä tai -sekvenssejä, nukleotidisekvenssiä, joka koodaa valmista ksylanaasia ja transkription terminaattoria tai terminaat-toreita.
DNA-molekyylistä peräisin olevalla modifioidulla 20 sekvenssillä tarkoitetaan kaikkia DNA-molekyylejä, jotka on saatu modifioimalla keksinnön ksylanaasia koodaavan • · • · · ·.1.* geenin yhtä tai useampaa nukleotidiä. Tällaisten sekvens- • Φ • 1·· sien valmistustekniikat ovat alan ammattimiehen tuntemia ί : : ja niitä on kuvattu etenkin teoksessa MOLECULAR CLONING - :*·1: 25 a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS, toinen • · • ·*· painos, 1989, kappale 15. Tavallisesti DNA-molekyylistä ··· · peräisin oleva modifioitu sekvenssi on ainakin 70-%:isesti homologinen keksinnön ksylanaasia koodaavan nukleotidisek-venssin (SEQ ID N0:1) kanssa eli siinä on ainakin 70 % • · ***. 30 identtisiä nukleotidejä samoissa sekvenssikohdissa. DNA- • » molekyylistä peräisin oleva modifioitu sekvenssi on mie- • · Σ^Σ luiten 80-%:isesti homologinen keksinnön ksylanaasia koo- :***: daavan nukleotidisekvenssin (SEQ ID N0:1) kanssa. Erityi- ··1 sen mielellään DNA-molekyylistä peräisin oleva modifioitu • » « ··· 8 sekvenssi on 90-%risesti homologinen keksinnön ksylanaasia koodaavan nukleotidisekvenssin (SEQ ID N0:1) kanssa.
Kokonaista ksylanaasia koodaava täydellinen nukleo-tidisekvenssi ja sen translaatio aminohappoina (SEQ ID 5 NO:2) on annettu kuviossa 1 (kuviot la ja Ib).
Tavallisesti keksinnön mukainen DNA-molekyyli sisältää ainakin nukleotidisekvenssin (SEQ ID N0:4), joka koodaa ksylanaasin prekursoria, tai tästä peräisin olevan modifioidun sekvenssin. Tämä nukleotidisekvenssi (SEQ ID 10 NO:4) sisältää nukleotidisekvenssin (SEQ ID N0:1), joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n (LMG P-14798) valmista ksylanaasia, ja sen signaalisekvenssin (presekvenssin) (SEQ ID NO:7). Mieluiten tämä DNA-molekyyli sisältää Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasin koko geenin ja aivan erityisesti nuk-15 leotidisekvenssin (SEQ ID NO:10). Nukleotidisekvenssi (SEQ ID NO:10) sisältää amino-karboksisuunnassa ja vasemmalta oikealle nukleotidisekvenssin (SEQ ID NO:12), joka sisältää ksylanaasin promoottorin, presekvenssin nukleotidisekvenssin (SEQ ID N0:7), valmiin ksylanaasin nukleotidisek-20 venssin (SEQ ID N0:1) ja nukleotidisekvenssin (SEQ ID NO:13), joka sisältää ksylanaasin terminaattorin. Kuvio 2 • ft ϊ.ί,ϊ (kuviot 2a ja 2b) esittää ksylanaasia koodaavan geenin nukleotidisekvenssin sekä sen translaation aminohappoina • j :*· (seq id no.-ii).
• · · · iV. 25 Eräässä muunnelmassa keksintö koskee myös DNA-mole- • · j .·. kyyliä, joka sisältää promoottorin, joka on peräisin gee- ··· * .···[ nistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasia, • · · presekvenssin ja nukleotidisekvenssin (SEQ ID N0:1), joka ... koodaa Bacillus sp. 720/1:n (SEQ ID NO:l) ksylanaasia tai • · ’···] 30 siitä peräisin olevaa modifioitua sekvenssiä. Toisessa * * muunnelmassa keksintö koskee myös DNA-molekyyliä, joka sisältää promoottorin, presekvenssin, joka koodaa Bacillus • · .**·. pumilus PRL B12:n ksylanaasin signaalipeptidiä, ja nukleo- • · · \ tidisekvenssin (SEQ ISD N0:1), joka koodaa Bacillus sp.
• · · *···] 35 720/1:n ksylanaasia, tai siitä peräisin olevan modifioidun • · 9 sekvenssin. Keksintö koskee mieluiten DNA-molekyyliä, joka sisältää promoottorin (SEQ ID NO:26), joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaa-sia, presekvenssin (SEQ ID NO:27), joka koodaa Bacillus 5 pumilus PRL Bl2:n ksylanaasin signaalipeptidiä, nukleo-tidisekvenssin (SEQ ID N0:1), joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasia, tai siitä peräisin olevan modifioidun sekvenssin.
Keksintö koskee myös promoottoria (SEQ ID NO:26), 10 joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasia. Promoottorin sekvenssi on kuvattu kuviossa 11.
Keksintö koskee myös presekvenssiä (SEQ ID NO:27), joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasin signaa-15 lipeptidiä. Vastaava 27 aminohapon sekvenssi on identifioitu (SEQ ID NO:29). Tämä nukleotidisekvenssi sekä sen translaatio aminohappoina (SEQ ID NO:28) on esitetty kuviossa 12.
Menetelmä promoottorin valmistamiseksi, joka on 20 peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasia, ja presekvenssin valmistamiseksi, joka sek- • · venssi koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasin sig- ·1 2·.. naalipeptidiä, on kuvattu esimerkissä 17 ja EP - hakemus j ui- • j .1. kaisun nro 0 634 490 kuviossa 1, joka liitetään viitteenä • · ♦ · 25 tähän hakemukseen.
♦ ♦ • ·
Bacillus pumilus PRL B12 -kanta on talletettu ATCC- • · · ’II.1 kokoelmaan (American Type Culture Collection, 12301 Park- • · · • lawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Yhdysvallat) Budapestin sopimuksen mukaan numerolla ATCC 55443 kesäkuun 24.
*...1 30 päivänä 1993.
• 1 Keksintö koskee myös mutatoitua DNA-molekyyliä ja :1j1. siitä peräisin olevaa mutatoitua ksylanaasia (jota muta- • · .·♦·. toitu DNA-molekyyli koodaa), joka on valmistettu modifioi- • φ 2 maila geenin nukleotidisekvenssiä, joka koodaa edellä mää- 35 riteltyä ksylanaasia. Tekniikat, joilla valmistetaan täi- 10 laisia mutatoituja ksylanaaseja, ovat alan ammattimiehen tuntemia ja etenkin teoksessa MOLECULAR CLONING - a laboratory manual- SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS, toinen painos, 1989, kappale 15.
5 Tämä keksintö koskee myös ekspressiovektoria tai kromosomista integraatiovektoria, joka sisältää DNA-mo-lekyylin, kuten edellä määriteltiin. Yleensä ekspressio-vektori tai kromosominen integraatiovektori sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää nukleotidisekvenssin (SEQ ID 10 NO:l), joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasia, tai siitä peräisin olevan modifioidun sekvenssin. Tavallisesti ekspressiovektori tai kromosominen integraatiovektori sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää geenin, joka koodaa ksylanaasia, tai siitä peräisin olevan modifioidun sek-15 venssin. Mieluiten ekspressiovektori tai kromosominen integraatiovektori sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää nukleotidisekvenssin (SEQ ID NO:10), joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasia, tai siitä peräisin olevan modifioidun sekvenssin. Aivan erityisesti tämä vektori on eks-20 pressiovektori pUBRD-720Xll. Hyviä tuloksia on saatu myös ekspressiovektorilla pUBR-720Xll.
• ·
Eräs keksinnön muunnelma koskee ekspressiovektoria tai kromosomista integraatiovektoria, joka sisältää DNA- • • j*; molekyylin, joka sisältää geenin, joka koodaa ksylanaasin • · · · 25 valmiin osan, tai siitä peräisin olevan modifioidun sek- • · • · ; .·. venssin. Yleensä ekspressiovektori tai kromosominen inte- • · · *11.* graatiovektori sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää nuk- • · · • leotidisekvenssin (SEQ ID N0:1), joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasia, tai siitä peräisin olevan modifioidun • · *···* 30 sekvenssin. Tavallisesti ekspressiovektori tai kromosomi- • * nen integraatiovektori sisältää DNA-molekyylin, joka si-
sältää promoottorin, joka on peräisin geenistä (SEQ ID
• · .···. NO: 26), joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaa- • · · * ·' siä, presekvenssin ja nukleotidisekvenssin (SEQ ID N0:1), • · · *·!·* 35 joka koodaa Bacillus sp. 720/1 :n ksylanaasia, tai siitä • · 11 peräisin olevan modifioidun sekvenssin. Tavanomaisessa muunnelmassa ekspressiovektori sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää promoottorin, presekvenssin (SEQ ID NO:27), joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasin signaa-5 lipeptidiä, ja nukleotidisekvenssin (SEQ ID N0:1), joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasia, tai siitä peräisin olevan modifioidun sekvenssin. Mieluiten ekspressio-vektori tai kromosominen integraatiovektori sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää promoottorin, joka on peräisin 10 geenistä (SEQ ID NO:26), joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasia, presekvenssin (SEQ ID NO:27), joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasin signaalipepti-diä, ja nukleotidisekvenssin (SEQ ID N0:1), joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasia, tai siitä peräisin ole-15 van modifioidun sekvenssin. Erityisen mielellään tämä eks-pressiovektori on ekspressiovektori pBPXD-PRE-720X. Hyviä tuloksia on saatu myös ekspressiovektorilla pC-BPX-PRE-720X.
Keksintö koskee myös ekspressiosysteemiä, joka on 20 käyttökelpoinen polypeptidin tuottamiseen.
Tämä ekspressiosysteemi sisältää: - promoottorisekvenssin (SEQ ID NO:26), joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n • • · 12
Yleensä ekspressiosysteemi sisältää terminaattori-sekvenssin.
Tavallisesti tämä systeemi sisältää: - promoottorisekvenssin (SEQ ID NO:26), joka on 5 peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasia, - presekvenssin (SEQ ID NO:27), joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasin signaalipeptidiä, - halutun polypeptidisekvenssin, ja 10 - terminaattorisekvenssin.
Haluttu polypeptidi on mieluiten entsyymi, kuten hydrolaasi. Erityisesti haluttu polypeptidi on proteaasi, lipaasi, ksylanaasi, sellulaasi, amylaasi, pullulanaasi. Hyviä tuloksia on saatu myös ksylanaasilla, jota Bacillus 15 sp. 720/1 -kanta luonnostaan tuottaa, eli kun ekspressio-systeemissä on polypeptidisekvenssi, joka vastaa nukleo-tidisekvenssiä (SEQ ID N0:1), joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasia.
Tämä keksintö koskee myös rekombinanttikantoja, 20 joissa ksylanaasia koodaava geeni on liitetty geenitekniikalla. Geeni voidaan liittää epäsuorasti replikaatiovek- • · torilla tai sisällyttää isännän kromosomiin yhtenä tai ·· : useampana kopiona integraatiovektorin välityksellä; ksyla- • ;*: naasia koodaava nukleotidisekvenssi voidaan liittää trans- • · · · !*.*. 25 formoimalla joko liittämällä kromosomiseen DNA: hän tai • · : .·. autoreplikaatiolla (plasmidi).
• · · • · · ·
Keksintö koskee myös mikro-organismikantoja, jotka • · · ovat erilaisia kuin alkuperäinen tuottajaorganismi, joissa ... ksylanaasia koodaava nukleotidisekvenssi liitetään trans- i · ···[ 30 formoimalla joko liittämällä kromosomiseen DNA: hän tai autoreplikaatiolla (plasmidi), ksylanaasia koodaava geeni voidaan lisätä replikaatiovektorin välityksellä tai liit- * · tää isännän kromosomiin yhtenä tai useampana kopiona inte- • · · *. graatiovektorin avulla.
• · · • · · ··· • · 13
Keksintö koskee myös transformoitua kantaa, joka sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää rakennegeenin, joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n valmista ksylanaasia. Yleensä transformoitu kanta on bakteerikanta. Tavallisesti trans-5 formoiduksi kannaksi valitaan Escherichia-, Pseudomonas-tai Bacillus-kanta. Mieluiten transformoitu kanta on Ba-cillus-kanta. Erityisen mielellään transformoitu Bacillus-kanta on Bacillus licheniformis -kanta, Bacillus pumilus -kanta, Bacillus alcalophilus -kanta tai Bacillus sp. 10 720/1 -kanta. Hyviä tuloksia on saatu Bacillus lichenifor mis -kannalla ja Bacillus pumilus -kannalla.
Keksintö koskee transformoitua Bacillus-kantaa, joka sisältää ekspressiovektorin tai kromosomisen in-tegraatiovektorin, joka sisältää tämän DNA-molekyylin. 15 Transformoitu Bacillus-kanta on mieluiten Bacillus licheniformis -kanta. Transformoitu Bacillus -kanta on myös mielellään Bacillus sp. 720/1 -kanta.
Tämä keksintö koskee myös ksylanaasia, jota tuottaa transformoitu kanta, kuten se edellä määriteltiin.
20 Tämä keksintö koskee myös menetelmää ksylanaasin tuottamiseksi, joka sisältää aerobisen bakteerin viljel- • · män, joka pystyy tuottamaan ksylanaasia sopivassa ravin-toalustassa, joka sisältää hiilen ja typen lähteitä ja • ·*; epäorgaanisia suoloja aerobioosiolosuhteissa ja näin tuo- • · · · Γ.·. 25 tetun ksylanaasin talteenoton. Tämä viljelyalusta voi olla • ♦ : .·. kiinteä tai nestemäinen. Viljelyalusta on mieluiten neste- • · · .*.* mäinen. Aerobinen bakteeri on mieluiten Bacillus-kanta tai • · · • · · tästä kannasta peräisin oleva kanta, joka pystyy tuottamaan ksylanaasia.
• · *···* 30 Tämä keksintö koskee myös menetelmää ksylanaasin * * tuottamiseksi, joka sisältää Bacillus sp. 720/1 -kannan ;*j': viljelyn tai tästä kannasta peräisin olevan kannan vilje- • · lyn, joka pystyy tuottamaan ksylanaasia sopivassa ravinto- • · · alustassa, joka sisältää hiilen ja typen lähteitä ja epä- • · · • · · ··· • · 14 orgaanisia suoloja aerobioosiolosuhteissa ja näin saadun ksylanaasin talteenoton.
Keksintö koskee myös menetelmää ksylanaasin valmistamiseksi rekombinanttiorganismista, menetelmää, joka si-5 sältää ksylanaasia koodaavan DNA-fragmentin eristämisen, tämän fragmentin sisällyttämisen DNA:hän sopivassa vektorissa, tämän vektorin liittämisen sopivaan isäntään tai tämän DNA-fragmentin liittämisen sopivan isännän kromosomiin, tämän isännän viljelemisen, ksylanaasin ekspressoin-10 nin ja ksylanaasin talteenottamisen. Sopiva isäntä valitaan yleensä ryhmästä, johon kuuluvat mikro-organismit, Escherichia coli, Bacillus tai Aspergillus. Tavallisesti isännäksi valitaan Bacillus. Mieluiten isäntä valitaan Bacillus-suvun (aerobisista) mikro-organismeista. Erityi-15 sen mielellään isäntä valitaan mikro-organismeista Bacillus subtilis, Bacillus lichenicformis, Bacillus alcalo-philus, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus amylo-liquefaciens tai Bacillus sp. 720/1. Hyviä tuloksia on saatu, kun ksylanaasin ekspressioisäntä on Bacillus liche-20 niformiksesta peräisin oleva rekombinanttikanta ja mieluiten Bacillus licheniformis SE2 delapl -kanta ja Bacillus :V: licheniformis SE2 delapö -kanta. Bacillus licheniformis ♦*·.. SE2 delapl -kanta ja Bacillus licheniformis SE2 delapö Ϊ -kanta on kuvattu EP-hakemuksjulkaisussa nro 0 634 490, • •t ♦ 25 joka liitetään viitteenä tähän hakemukseen.
• · ; Keksintö koskee myös Bacillus-suvun mikro-organis- • · · 'll.* millä heterologisesti tuotettua ksylanaasia. Tavallisesti • · ·
Bacillus-suvun mikro-organismi sisältää geenin, joka koo- #e# daa alkalista proteaasia, kun se on villityyppinä. Mielui- • · *···* 30 ten tämä mikro-organismi on Bacillus licheniformis -kanta, * * joka sisältää DNA-molekyylin, joka sisältää nukleotidisek- venssin, joka koodaa Bacillus sp. 720/1 -ksylanaasia. Eri- • · tyisen mielellään alkalista proteaasia koodaava geeni ··· ·. poistetaan deleetiolla tästä Bacillus-kannasta. Tämä kanta • · · • · · ··· • · 15 on mieluiten Bacillus licheniformis SE2 delapl -kanta tai Bacillus licheniformis SE2 delapö -kanta.
Heterologisesti tuotetulla tarkoitetaan tuottamista, joka ei tapahdu luonnollisella mikro-oganismilla eli 5 mikro-organismilla, joka sisältää villityyppinä geenin, joka koodaa ksylanaasia.
Näiden bakteerien viljelyolosuhteet, kuten ravintoalustan komponentit, viljelyparametrit, lämpötila, pH, ilmastus, sekoitus, ovat alan ammattimiehen hyvin tunte-10 mia. Esimerkkejä tällaisista tekniikoista on kuvattu etenkin ULLMANNin ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, 1987, 5. painos, osa A9, sivut 363 - 390.
Ksylanaasin talteenottotekniikat ovat alan ammattimiehen hyvin tuntemia ja ne valitaan ksylanaasin käyttö-15 tarkoitusten mukaan. Tavallisesti käytetään sentrifugoin-tia, suodatusta, ultrasuodatusta, haihdutusta, mikrosuoda-tusta, kiteytystä tai kahden yhdistelmää joistakin näistä tekniikoista, kuten sentrifugointia ja sitä seuraavaa ultrasuodatusta. Esimerkkejä tällaisista tekniikoista on ku-20 vannut etenkin R. SCRIBAN, Biotechnologie, (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, s. 267 - 276 ja ULLMANN'S :V: ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, 1987, 5. painos, osa ·*·.. A9, sivut 363 - 390.
• Ksylanaasi voidaan sitten puhdistaa tarvittaessa ja ··· · 25 halutun käytön mukaisesti. Entsyymien puhdistustekniikat • · ; #·# ovat alan ammattimiehen tuntemia, kuten saostus suolan • · · *11.* avulla, kuten ammoniumsulfaatilla tai liuottimena, kuten • · · ' • · · * asetonilla tai alkoholilla. Esimerkkejä tällaisista tekniikoista on kuvannut etenkin R. SCRIBAN, Biotechnologie, • · *···* 30 (Technique et Documentation Lavoisier), 1982, s. 267 - 276.
j*j*j Ksylanaasi voidaan kuivata sumuttamalla tai lyofi- • · .*··. lisoimalla. Esimerkkejä tällaisista tekniikoista on kuvan- ·«« nut etenkin R. Sriban, Biotechnologie, (Technique et Docu-
*·Σ·* 35 mentation Lavoisier), 1982, s. 267 - 276 ja ULLMANN'S
• · 16 ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, 1987, 5. painos, osa A9, sivut 363 - 390.
Tämä keksintö koskee myös entsymaattisia valmisteita, jotka sisältävät keksinnön mukaista ksylanaasia ja 5 ainakin yhtä lisäainetta. Nämä lisäaineet ovat alan ammattimiehen tuntemia ja ne valitaan valmisteen aiotun käytön mukaisesti. Niiden täytyy sopia ksylanaasille eivätkä ne saa vaikuttaa tai vain hieman ksylanaasin entsymaattiseen aktiivisuuteen. Tavallisesti nämä lisäaineet ovat entsyy-10 min stabilaattoreita, säilöntäaineita ja formulointiin tarvittavia aineita.
Tämän keksinnön ksylanaasia sisältäviä valmisteita voidaan käyttää kiinteinä tai nestemäisinä.
Ksylanaasi formuloidaan aiotun käytön mukaisesti. 15 Stabilisaattoreita ja säilöntäaineita voidaan myös lisätä entsymaattisiin valmisteisiin, jotka sisältävät keksinnön mukaista ksylanaasia. Voidaan esimerkiksi stabiloida ksylanaasia lisäämällä propyleeniglykolia, etyleeniglykolia, glyserolia, tärkkelystä, ksylaania, sokeria, kuten sorbi-20 tolia, suolaa, kuten natriumkloridia, kalsiumkloridia, ka-liumsorbaattia tai natriumbentsoaattia tai kahden tai • · ·.·.· useamman yhdistelmää. Hyviä tuloksia on saatu propyleeni- • · • *·· glykolilla. Hyviä tuloksia on saatu sorbitolilla.
: Keksinnön mukaisella ksylanaasilla on monia teolli- ··· · ·'·*: 25 siä markkina-alueita, kuten esimerkiksi elintarviketeolli- • · : suus, farmaseuttinen teollisuus tai kemian teollisuus.
• · · • · · ·
Ksylanaasia voidaan käyttää etenkin leipomoissa.
• · ·
Esimerkki ksylanaasin käytöstä leipomoissa on kuvattu eri-tyisesti kansainvälisessä WO-patenttihakemuksessa nro 94/ 30 04 664.
Ksylanaasia voidaan käyttää etenkin käsiteltäessä :V: paperimassaa. Esimerkkinä ksylanaasin käytöstä paperimas- :***: san käsittelyssä on kuvattu EP-hakemus julkaisussa nro • · · 0 634 490. Tämän keksinnön ksylanaasi tehoaa etenkin mas- • · · • · · ··· • · 17 saan, joka on peräisin eukalyptuspuista, kuten tämän patenttihakemuksen esimerkissä 13 kuvataan.
Ksylanaasia voidaan käyttää etenkin eläinten ruokinnassa. Esimerkkinä ksylanaasin käytöstä eläinten ruo-5 kinnassa on kuvattu erityisesti EP-hakemusjulkaisussa nro 0 507 723.
Kuvio 1 (kuviot la ja Ib) esittää nukleotidisek-venssiä (SEQ ID N0:2), joka koodaa valmista ksylanaasia, sekä sen translaatiota aminohappoina.
10 Kuvio 2 (kuviot 2a ja 2b) esittää geenin nukleoti- disekvenssin (SEQ ID NO:11), joka koodaa ksylanaasia, sekä sen translaatiota aminohappoina.
Kuvio 3 esittää pUBR2002-plasmidin restriktiokart- taa.
15 Kuvio 4 esittää pUBR-720Xl-plasmidin restriktio- karttaa.
Kuvio 5 esittää pUBR-720Xll-plasmidin restriktio-karttaa.
Kuvio 6 esittää pUBRD-720Xll-plasmidin restriktio-20 karttaa.
Kuvio 7 esittää pUBC2001-plasmidin restriktiokart- • · ·,·.· taa.
• *·· Kuvio 8 esittää pC-BPX-PRE-2003-plasmidin restrik- : tiokarttaa.
• t · · ;*·*: 25 Kuvio 9 esittää pC-BPX-PRE-720X-plasmidin restrik- • · ’ tiokarttaa.
• · · • · · ·
Kuvio 10 esittää pBPXD-PRE-720X-plasmidin restrik- • · · tiokarttaa.
... Kuvio 11 esittää promoottoria (SEQ ID NO: 26), joka • ·
*···’ 30 on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL
* * B12:n ksylanaasia.
·*.*. Kuvio 12 esittää presekvenssiä (SEQ ID NO:28), joka • 0 .···. koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasin signaalipep- • · • tidiä.
• · · • · · ··· • · 18 Näissä kuvioissa käytettyjen lyhenteiden ja symbolien merkitykset on koottu seuraavaan taulukkoon.
Symboli Merkitys 5 Lyhennys
OriEC replikaation aloituskohta E. colissa REP replikaatioon tarvittava proteiini Bacil- luksessa 10 Ori+ + -säikeen replikaation aloituskohta Bacil- luksessa
Ori- - -säikeen replikaation aloituskohta Bacil- luksessa
AmpR ampisilliiniresistenssin aiheuttava geeni 15 KmR kanamysiiniresistenssin aiheuttava geeni
BlmR bleomysiiniresistenssin aiheuttava geeni 5'720XYL 5'-sekvenssi, joka sijaitsee Bacillus sp.
720/1:n ksylanaasia koodaavan sekvenssin yläpuolella 20 3'720XYL 3'-sekvenssi, joka sijaitsee Bacillus sp.
720/1:n ksylanaasia koodaavan sekvenssin • · alapuolella 720XYL Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasin prekurso- • • j1 2 3j ria koodaava sekvenssi ··1 1 25 5'BPUXYL-PRE Bacillus pumilus B12:n ksylanaasin promoot- • · : .·. tori ja ribosomin sitoutumiskohta, jonka • · · *«.1 perässä on Bacillus pumilus Bl2:n ksylanaa- • · · * sin presekvenssi 720XYL-MAT sekvenssi, joka koodaa Bacillus sp.720/l:n • · *···1 30 ksylanaasin valmista osaa • · • · • · · • · « .···. Seuraavat esimerkit kuvaavat tätä keksintöä.
• · ··· * • · · · 2 • · · 3 19
Esimerkki 1
Bacillus sp. 720/1-kannan eristys ja karakterisointi
Bacillus sp. 720/1 -kanta eristettiin maaperänäyt-5 teestä, joka oli otettu Argentiinasta, agarravintoalustal-la ja selegoitiin kykynsä avulla hajottaa värillistä ksy-laania, joka tunnetaan nimellä AZCL-ksylaani, jota myy MEGAZYME-yhtiö.
Tätä kantaa viljeltiin 37 °C:ssa LBS/C-kasvatus-10 liuoksessa, jonka koostumus oli seuraava: 10 g/1 vehnä-lesettä, 10 g/1 TRYPTONEa (DIFCO), 5 g/1 hiivauutetta, 5,3 g/1 Na2C03:a, 4,2 g/1 NaHC03:a.
Natriumkarbonaatti ja -bikarbonaatti steriloitiin erikseen, lisättiin sitten aseptisesti muihin steriilin 15 alustan komponentteihin. Agaralusta sisälsi lisäksi 20 g/1 agaria. Tämän keksinnön kanta identifioitiin sen biokemiallisten ominaispiirteiden perusteella: aerobinen Gram-positiivinen bakteeri, joka esiintyy sauvamaisena, se muodostaa itiöitä. Se kuuluu siis Bacillus-sukuun.
20 Tämän kannan vegetatiiviset solut viljeltynä LBS/C- agaralustalla 37 °C:ssa ovat kooltaan 0,8 x 3,0 - 5 pm ja • ♦ basillin muotoisia. Vegetatiivisten solujen liikkuvuus on ·*·.. positiivinen.
j 13 päivän kasvatuksen jälkeen 37 °C:ssa TSA-agar- ··· ♦ 25 alustalla havaitaan mikroskooppisesti itiöiden olemassa- • · • .·. olo. TSA-agaralusta sisältää 15 g/1 TRYPTONEia (DIFCO), • · · "j/ 5 g/1 soijapeptonia, 5 g/1 NaCl:a ja 15 g/1 agaria.
• · ♦ • Kanta on oligosporogeeninen.
Katalaasitesti on positiivinen 10-%risen (v/v) ve- • · ’···* 30 typeroksidin läsnä ollessa. Oksidaasitesti on positiivinen • * l-%:isen (w/v) tetrametyyli-1,4-fenyleenidiamiinidihydro- kloridin läsnä ollessa.
• · · • · .···. Tämä kanta on aerobinen eli se kehittyy happea si- • · · • sältävissä olosuhteissa. Se ei kehity anaerobisissa olo- • · · *·:·* 35 suhteissa eli atmosfäärissä, jossa on 84 % (v/v) N?:ta, 8 % • · 20 (v/v) C02:ta, 8 % (v/v) H2:ta 37 °C:ssa. Lyhennys % (v/v) tarkoittaa esitettyä lukua tilavuusprosenttina.
Tämä kanta ei ole termofiilinen. Se kasvaa normaalisti LBS/C-agaralustalla inkuboitaessa 20 °C:n, 30 °C:n 5 ja 37 °C:n ja 45 °C:n lämpötiloissa, sitä vastoin se ei kasva 50 °C:ssa eikä 55 cC:ssa, ei myöskään 10 °C:ssa.
Se kasvaa normaalisti inkuboitaessa LBS/C-agaralustalla NaCl:n läsnä ollessa konsentraatioissa 2,0 % (w/v) ja 3,5 (w/v), se kasvaa heikosti, kun läsnä on 5,0 % 10 NaCl:a (w/v) ja 7,0 % (w/v). Lyhennys % (w/v) tarkoittaa painoprosenttia.
Bacillus sp. 720/1 -kanta ei muodosta happoa glukoosista.
Bacillus sp. 720/1 -kanta identifioitiin API 50 15 CHB- ja API 20 E -systeemillä valmistajan käyttöohjeiden mukaisesti (API SYSTEM, Ranska). Bacillus sp. 720/1 -kanta käyttää glyserolia, N-asetyyliglukosamiinia, arbutiinia, sitraattia, galaktoosia, amygdaliinia, melibioosia ja hydrolysoi gelatiinia. Nämä ominaispiirteet erottavat Bacil-20 lus sp. 720/1 -kannan selvästi Bacillus pumilus -kannasta. Itse asiassa Bacillus pumilus -kannalla ei ole yhtäkään • · ϊ.ί.ϊ näistä ominaispiirteistä.
Bacillus sp. 720/1 identifioitiin myös BI0L0G-sys- • teemillä (USA). Tuloslista, jossa on analysoitu tämän sys- • · · · 25 teemin antamia tuloksia, antaa luvun 0,564 Bacillus coagu- • .·. länsille, 0,097 Bacillus subtilikselle, 0,057 Bacillus • · · *11.1 licheniformikselle ja 0,00 Bacillus pumilukselle. Nämä • · · * ominaispiirteet erottavat selvästi Bacillus sp. 720/1:n Bacillus coagulans -kannasta, Bacillus subtilis -kannas- • · *··.1 30 ta, Bacillus licheniformis -kannasta ja Bacillus pumilus ’·2· -kannasta.
Eristetty bakteeri kuuluu siis Bacillus-sukuun, ♦ · .···. jonka yhteenkään lajiin kuuluvaksi sitä ei ole voitu mää- • · 1’ ritellä.
• · · • · · 2 • · · 21
Bacillus sp. 720/1 on talletettu kokoelmaan, joka on nimeltään BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collection) numerolla LMG P-14798.
Esimerkki 2 5 Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasin tuottaminen
Bacillus sp. 720/1 -kantaa viljellään Petri-maljalla, joka sisältää LBS/C-ravintoalustaa agarilla 37 °C:ssa 48 tuntia (viljelmä A).
Sitten viljelmästä A tehdään viljelmä nestemäiseen 10 LBS/C-ravintoalustaan, jonka koostumus on sama kuin LBS/C-viljelmän, mutta ilman vehnälesettä, 37 °C:ssa 24 tuntia tasosekoittajalla 250 kierrosta minuutissa (viljelmä B), noin 2,54 cm:n amplitudilla.
Sitten 500 ml viljelmää B siirretään 20 l:n fer-15 menttoriin, joka sisältää 14 1 LBS/C-ravintoliuosta. Sen pH:n annetaan muuttua vapaasti, sekoitusnopeus ja ferment-toriin puhalletun ilman nopeus on sellainen, että liuenneen hapen osapaine ravintoliuoksessa ei ole alle 30 % kyllästyksestä.
20 72 tunnin kuluttua 37 °C:ssa suoritetun viljelyn jälkeen ksylanaasi erotetaan ja solumassa sentrifugoidaan (BECKMAN J21, roottori JA10) 8 000 kierrosta minuutissa 30 minuutin ajan. Bacillus sp. 720/1 -kannan tuottama ksyla- • naasi on ekstrasellulaarista. Sitten jäljelle jääneet liu- M· · :1.·. 25 kenemattomat ainekset erotetaan ksylanaasista sentrifu- • ·
: .·. goinnista saadun supernatantin mikrosuodatuksella (KROS
• · · jlj/ FLOII patruuna, 0,2 pm huokoskoko, MICROGON-yhtiö).
• · ·
Mikrosuodatuksesta läpimenemätön aines pestään ... 1 1:11a tislattua vettä. Tämä pesu suoritetaan kolme ker- *···’ 30 taa.
* 1 Sitten läpi mennyt osa konsentroidaan noin 20 ker- taisesti uitrasuodatuksella käyttäen PALL MICROZA SIP 1013 • · .**·. -polysulfonipatruunaa, jonka cut-off on 6 kD (PALL-yhtiö).
··· •# Mitataan saadun ultrafiltraation läpi menemättömän • · · *···’ 35 liuoksen (preparaatti R) ja läpi menneen liuoksen (prepa- 1 raatti P) entsymaattinen aktiivisuus.
22
Ksylanaasin entsymaattisen aktiivuuden yksikkö (IU) määritellään määränä entsyymiä, joka pH 8,0:ssa ja 50 °C:n lämpötilassa ja ksylaanin läsnä ollessa katalysoi glukoo-siekvivalenttien vapautumista nopeudella 1 pmol glukoosia 5 minuutissa (pmol/min).
Ksylanaasin entsymaattinen aktiivisuus mitataan BAILEY, BIELY ja POUTANEN kuvaaman protokollan mukaisesti, BIOTECHNOLOGY, 1992, 23, sivut 257 - 270; paitsi että BAILEY et ai. käyttämä sitraatti-fosfaattipuskuri korva-10 taan 50 mM Tris(hydroksimetyyli)aminometaani-HCl-puskuril-la (pH 8,0).
Ultrafiltraatiossa läpi menemättömään liuokseen (tuotteeseen R) lisätään tarpeeksi polyetyleeniglykolia (Merckin polyetyleeniglykoli nro 807490), että saadaan 15 40-%:inen (w/w) konsentraatio. Kun polyetyleeniglykoli on liuennut, saatua liuosta inkuboidaan 30 minuuttia 25 °C;n lämpötilassa.
Sitten polyetyleeniglykolia ja ksylanaasia sisältävää liuosta sentrifugoidaan 10 minuuttia 8 000 kierrosta 20 minuutissa (BECKMANin sentrifuugi J21, roottori JA10). Sentrifugoinnista saatu supernatantti heitetään pois.
• · ϊ.ϊ.ϊ Sentrifugointisakkaan lisätään niin paljon NaCl-liuosta (0,9 % v/v), että saavutetaan käytetyn läpi menemättömän • liuoksen (preparaatti R) alkuperäinen tilavuus.
• · · · 25 Sitten tähän ksylanaasia ja NaCl:a sisältävään sus- • · : .·. pensioon lisätään riittävästi asetonia, jotta päästään • · · 40-%:iseen (v/v) konsentraatioon. Tätä asetonisuspensiota • · · inkuboidaan 45 minuuttia 4 °C:ssa.
... Tämän inkubaation jälkeen tätä asetonisuspensiota • · *···[ 30 sentrifugoidaan 10 minuuttia 8 000 kierrosta minuutissa (BECKMAN J21, roottori JA10).
Sentrifugoinnista saatu suspenatantti säästetään.
• · ;***; Tähän sentrifugointisupernatanttiin lisätään asetonia • · · 80-%:iseksi (v/v) konsentraatioksi. Tätä asetonisuspensio- • · · • · · **·. 35 ta inkuboidaan 45 minuuttia 4 °C:ssa.
• · 23 Tämän inkubaation jälkeen tätä asetonisuspensiota sentrifugoidaan 10 minuuttia 8 000 kierrosta minuutissa (BECKMAN J21, roottori JA10).
Sentrifugoinnista saatu sakka säästetään. Se sus-5 pendoidaan riittävään tilavuuteen 0,9-%:ista (v/v) NaCl-liuosta, että se liukenee (preparaatti N).
Esimerkki 3
Ksylanaasin puhdistaminen
Osa ultrafiltraatiossa saadusta läpi menemättömästä 10 liuoksesta (preparaatti N), joka saatiin esimerkissä 2, tasapainotetaan geelisuodatuskromatografiapylväällä (BIO-RAD EC0N0PAC 10DG), joka on tasapainotettu 20 mM Bis-Tris-(bis( 2-hydroksietyyli )imino-tris(hydroksimetyyli )metaani)-puskurilla pH 6,2 (puskuri A). Näin saadaan liuos, jota 15 kutsutaan preparaatiksi X.
1 ml preparaatin X liuosta pannaan sitten S SEPHA-ROSE HP 16/10 (PHARMACIA) -kationinvaihtopylvääseen, joka on tasapainotettu puskurilla A. Nopeus on 2,5 ml minuutissa, sitä eluoidaan isokraattisesti 10 minuuttia, sitten 20 NaCl-gradientilla (10:stä 50 minuuttiin NaCl-pitoisuus nousee 0:sta 0,7 M:seen). Gradientilla havaitaan vain yksi • · ϊ ϊ ϊ piikki, joka vastaa ksylanaasin eluoitumista.
Ksylanaasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot otetaan • • talteen (liuos A).
··« · 25 Todetaan, että fraktiot sisältävät ksylanaasia ot- • · : .·. tamalla 10 pl kustakin fraktiosta ksylaania sisältävälle • · · agarille (alusta, joka sisältää 0,5 g/1 AZCL-ksylaania, • · · * 50 mM TRIS-puskuria (pH = 8,0) ja 15 g/1 agaria). Ksylanaasia sisältävien fraktioiden ympärille muodostuu kirkas • · '···* 30 rengas.
***: Esimerkki 4 ;Vj Aminohapposekvenssi • · .*··. Tämän keksinnön ksylanaasin aminohapposekvenssi • · · •# määritetään epäsuorasti tätä ksylanaasia koodaavan geenin • · · *·"’ 35 nukleotidisekvenssillä (SEQ ID NO:10), jonka valmistus on • · 24 kuvattu esimerkissä 14. Se tehdään tietokoneohjelman avulla, joka on IntelliGenetics Inc.:n (USA) intelliGenetics Suite Software for Molecular Biology (versio #5.4). Kuvio 2 (kuviot 2a ja 2b) esittää ksylanaasia koodaavan gee-5 nin nukleotidisekvenssiä (SEQ ID NO:10) sekä sen translaatiota aminohappoina (SEQ ID NO:11).
Ksylanaasi syntetisoituu prekursorina. Ksylanaasin prekursori sisältää 248 aminohappoa (SEQ ID NO:6). Identifioidaan nukleotidisekvenssi (SEQ ID N0:4), joka koodaa 10 ksylanaasin prekursoria, sekä sen translaatio aminohapoiksi (SEQ ID NO:5).
Identifioidaan prekursorina syntetisoituvan ksylanaasin presekvenssi. Se on 27 aminohapon sekvenssi (SEQ ID N0:9). Identifioidaan vastaava nukleotidisekvenssi (SEQ ID 15 NO:7).
Sitten identifioidaan valmiin ksylanaasin aminohapposekvenssi. Valmis ksylanaasi sisältää 221 aminohappoa (SEQ ID NO:3 ).
Kuvio 1 (kuviot la ja Ib) esittää valmista ksyla-20 naasia koodaavaa nukleotidisekvenssiä (SEQ ID N0:1) sekä sen translaatiota aminohapoiksi (SEQ ID N0:2).
• · ! <’ ·' Esimerkki 5 • ♦
Aminohappokoostumus ; :1; Valmiin ksylanaasin aminohappokoostumus on määri- ··· 1 ·1.1. 25 tetty ksylanaasin (esimerkki 4) aminohapposekvenssistä • · : .·. (SEQ ID NO:3) ja se on koottu taulukkoon 1.
• · · ·♦· · ··· • · · • · · « • · · • · • · ·· · • · • · • · · • · · * · • · · • · • · • · · • · · · • · · • · · 25
Taulukko 1
Symboli Aminohappo Lukumäärä % (molekyylipainona) 5 _ N asparagiini 25 11,6 Y tyrosiini 13 8,6 T treoniini 18 7,4 S seriini 19 6,7 10 I isoleusiini 14 6,4 V väliini 14 5,6 G glysiini 24 5,5 W tryptofaani 7 5,3 K lysiini 10 5,2 15 R arginiini 8 5,1 Q glutamiini 9 4,7 D asparagiinihappo 10 4,7 L leusiini 10 4,6 E glutamiinihappo 8 4,2 20 F fenyylialaniini 7 4,2 P proliini 7 2,8 M metioniini 5 2,7 • · ·1·.. A alaniini 8 2,3 : H histidiini 4 2,2 • · · 25 C kysteiini 1 0,4 • · • 1' B asparagiinihappo/ • · · *11.1 asparagiini 0 0,0 • · · • X tuntematon 0 0,0 Z glutamiini • · ’··.1 30 glutamiinihappo 0 0,0 • · • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · · · • · · • · · 26
Esimerkki 6
Molekyylipainon arviointi
Arvioidaan laskemalla ksylanaasin molekyylipaino valmiin ksylanaasin aminohapposekvenssistä, kuten esimer-5 kissä 4 on kuvattu.
Päätellään laskemalla molekyylipainoksi 24698,61 Daltöniä.
Esimerkki 7
Molekyylipainon määritys 10 Ksylanaasia sisältävä liuos A, sellaisena kuin se saatiin esimerkissä 3, konsentroidaan CENTRICON 10 kD -laitteella (AMICON).
100 μΐ konsentroitua liuosta pannaan SUPERDEX 75 HR 10/30 (PHARMACIA) -geelisuodatuspylvääseen. Pylväs on sitä 15 ennen kalibroitu molekyylipainomarkkereilla (PHARMACIA) GEL FILTRATION LMW calibration kit code 17-0442-01. Eluu-tio tapahtuu 0,25 ml/min 25 mM CAPSO (3-(sykloheksyyliami-no-2-hydroksi-l-propaanisulfonihappo) -puskurilla, jonka pH on 9,2 ja joka sisältää 0,2 M NaCl:a.
20 Saadussa kromatogrammissa näkyy vain yksi piikki, joka vastaa ksylanaasiaktiivisuutta. Päätellään proteiinin • · ϊ#ί ϊ näennäiseksi molekyylipainoksi noin 13,5 kD.
Tästä yhdestä piikistä saadusta fraktiosta suori- • j1. tetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesi denaturoivissa ··· · 25 olosuhteissa (SDS-PAGE). Käytetty geelisysteemi on PHARMA- • · ; .·, CIA LKB BIOTECHNOLOGYn PHASTSYSTEM geeleillä, jotka sisäl- • · · “I.1 tävät 10 - 15-%:isen (v/v) polyakryyliamidigradientin.
• · · • · · ‘ Elektroforeesiolosuhteet ovat valmistajan ohjeiden mukai set. Kontrollina käytetään PHARMACIA LMW -molekyylipaino-*···' 30 markkereita (Low Molecular Weight), koodi 17-0446-01. Käy- *·1’· tetyt markkerit ovat fosforylaasi b (94 kD), albumiini (67 kD), ovalbumiini (43 kD), karboanhydraasi (30 kD), • · .···. trypsiinin inhibiittori (20,1 kD) ja alfa-laktalbumiini • · *·1 (14,4 kD).
• · · *·ί·1 35 Coomassie-sinisellä värjättäessä ilmestyy noin 1 25,7 kD:n molekyylipainoinen polypeptidi.
27
Esimerkki 8
Isoelektrisen pisteen arviointi
Ksylanaasin isoelektrinen piste arvioidaan valmiin ksylanaasin aminohapposekvenssistä, kuten se esimerkissä 4 5 kuvattiin.
Arvioitu isoelektrinen piste edustaa denaturoidun proteiinin nettovarausta.
Isoelektriseksi pisteeksi päätellään 7,46 denaturoidulle ksylanaasille.
10 Esimerkki 9
Isoelektrisen pisteen määrittäminen Pannaan osa liuoksesta A sellaisena kuin se esimerkissä 3 saatiin kromatofokusointipylvääseen Mono P 5/20 (PHARMACIA) noudattamalla valmistajan suosituksia ja tasa-15 painottamalla se etukäteen 25 mM dietanoliamiinipuskurilla pH 9,9.
Pylvästä eluoidaan amfolyyttiliuoksella POLYBUFFER 96 (PAHARMACIA), joka on laimennettu 10-kertaisesti tislatulla vedellä.
20 Ksylanaasiaktiivisuutta sisältävän fraktion pH on 9,5.
• ·
Todetaan, että tämä fraktio sisältää ksylanaasia ottamalla 10 μΐ siitä ksylaania sisältävälle agarille • :*j (alusta, joka sisältää 0,5 g/1 AZCL-ksylaania, 50 mM TRIS- • · · · {*.*. 25 puskuria (pH = 8,0) ja 15 g/1 agaria). Kirkas rengas, joka • · : .·, ilmestyy AZCL-ksylaanin hydrolyysivyöhykkeenä, muodostuu ### * ksylanaasia sisältävän fraktion ympärille.
• · ·
Osalle liuosta A, sellaisena kuin se saatiin esi- ttt merkissä 3, tehdään isoelektrinen fokusointi.
• ·
’···* 30 Tämän tekemiseksi hydratoidaan PHARMACIA DRYGEL
* * -seoksella, joka sisältää 2 ml tislattua vettä, 150 μΐ BIOLYTE 8 - 10 (BIORAD) ja 75 μΐ PHARMALYTE 8 - 10,5 • · .**·. (PHARMACIA). Pannaan noin 200 nanogrammaa proteiinia (osa ··· ·. liuoksesta A) geelille. Noudatetaan valmistajan kuvaamaa • · · *·:·* 35 protokollaa.
• · 28
Siitä päätellään ksylanaasin isoelektriseksi pisteeksi hieman yli 9,6, joka on markkerina käytettyjen proteiinien kaikkein korkein isoelektrinen piste.
Kokeellisesti havaittu isoelektrinen piste edustaa 5 proteiinin pintavarausta natiivissa muodossaan.
Esimerkki 10
Aktiivisuusprofiili pH:n funktiona luonnon kannan (Bacillus sp. 720/1) tuottamalla ksylanaasilla
Esimerkissä 2 kuvatulla menetelmällä mitataan ksy-10 lanaasin entsymaattinen aktiivisuus ksylaanin läsnä ollessa (ROTH, koodi 7500, koivun ksylaani) 50 °C:n lämpötilassa ja eri pHrissa (5,6 - 10,35) eri puskureissa, jotka on valittu halutun pH:n saamiseksi. Käytetään liuosta, joka sisältää ksylanaasia, kuten sitä valmistettiin esimerkis-15 sä 2 (preparaatti N).
Tulokset on koottu taulukkoon 2. On huomattava, että virhemarginaali arvioidaan noin 25 %:ksi tämäntyyppisissä mittauksissa.
Tämän kokeen aikana maksimaalinen entsymaattinen 20 aktiivisuus on mitattu näytteelle, jota pidettiin noin pHrssa 6,2 ja noin 50 °C:n lämpötilassa 15 minuutin ajan.
• · • ϊ Määritelmän mukaan tälle näytteelle annetaan suhteellinen ·*·.. entsymaattinen aktiivisuus 100 %.
• • ;*· Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukainen ·«« · 25 ksylanaasi kehittää huomattavan entsymaattisen aktiivisuu- • · • .·. den pH-alueella, joka on noin 5,6:sta noin 10:een.
i · · ·♦· · • · · • · · ·♦· • · • · ··♦ • · • · • · ♦ • · · • ♦ ··· ♦ · • · ·«· • · · ♦ ♦ ♦ «·· ♦ · 29
Taulukko 2 pH Käytetty puskuri Suhteellinen aktiivisuus (50 mM) % 5 _ 5,6 Tris-maleinaatti 85 6,2 Tris-maleinaatti 100 6,8 Tris-maleinaatti 96 7.5 Tris-amelinaatti/Tris1 88 10 8,7 Tris/Capso1 92 9.5 Capso/Caps1 76 10 Caps 50 10,35 Caps 19 15 Tris = tris(hydroksimetyyli)aminometaani
Tris-maleinaatti= puskuri, joka on muodostunut (50 mM) tris(hydroksimetyyli)aminometaanista ja (50 mM) maleiinihaposta, joiden osuus komponentteina määräytyy halutun pH:n mukaan, pH säädetään NaOH:lla (1 M).
20 Capso = 3-(sykloheksyyliamino)-2-hydroksi-l-pro- paanisulfonihappo • · ί#ϊ : Caps = 3-(sykloheksyyliamino)-1-propaanisulfoni- happo j Symboli 1 tarkoittaa, että saatu arvo on keskiarvo • · · · SV. 25 mittauksista, jotka on suoritettu samassa pHrssa, mutta • · t · • t·' kahdella eri puskurilla.
• i · IM · • · ·
I I I
• · · * Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukainen ksylanaasi saavuttaa suuren entsymaattisen aktiivisuuden • · *··.' 30 hyvin laajalla pH-alueella.
• · • · • · · • · · • · • · · • · • · ··· • · · · • · · »·· 30
Esimerkki 11 pH:n vaikutus Bacillus sp. 720/1 -kannan tuottaman ksylanaasin aktiivisuuteen havupuumassan valkaisun apuna 5 Valmistetaan kolme vesisuspensiota mäntymassasta (SCA-yhtiöstä), jonka koostumus on 2,5 % (kuivapainosta) ja kappaluku alussa on 17.
Säädetään näiden suspensioiden pH 5:een H2S04:llä. 1. vaihe: Entsyymivaihe (vaihe X) 10 Laimennetaan preparaatiksi N kutsuttu liuos, sel laisena kuin sitä valmistettiin esimerkissä 2, tislatulla vedellä niin, että saadaan entsyymiliuos, jonka entsymaat-tinen aktiivisuus on 25 IU/ml (kuten esimerkissä 2 kuvattiin).
15 Tämä entsyymiliuos, joka sisältää ksylanaasia, lisätään sitten mäntymassasuspensioon niin, että massasus-pensio tulee käsitellyksi keskimäärin 5 IU:lla/g kuivaa massaa.
Kahteen muuhun mäntymassasuspensioon lisätään tis-20 lattua vettä entsyymiliuoksen tilalle samoissa suhteissa.
Sitten näitä kolmea suspensiota inkuboidaan 2 tun- • · ::: tia 50 °C:ssa sekoittamatta.
• · ·*·., 2. vaihe: Kloorivaihe (vaihe C) Ϊ Sitten kullekin näin saadulle suspensiolle suori- ··· · j·,·. 25 tetaan valkaisukäsittely, jossa kloorataan klooratulla ve- • * • · • t·, dellä. Tämä käsittely tapahtuu massalle, jonka koostumus • · · *11.* on 3 % materiaalin kuivapainosta.
• · · * Siksi entsymaattisesti käsitellyn massan suspen sioon ja ilman entsyymiä käsitellyn massan suspensioon li-*···* 30 sätään klooria 2,89 (= 0,17 x 17) % (paino/massan kuiva- ***** paino). Toiseen ei entsymaattisesti käsitellyn massan sus- .*.*. pensioon lisätään klooria 3,40 (0,20 x 17) % (paino/pai- .*··. no).
• · *·* Näitä 3 suspensiota inkuboidaan 1 tunti huoneen- 35 lämpötilassa. Sitten massaa pestään 40 tilavuudella tis-"*** lattua vettä.
31 3. vaihe: Lipeävaihe (vaihe E)
Sitten suoritetaan alkalinen uutos, jossa lisätään 2 % (paino/massan kuivapaino) NaOH:ta kolmeen edellä saatuun suspensioon ja joiden koostumus on 5 % kuivapainosta.
5 Näitä kolmea suspensiota inkuboidaan 1 tunti 30 minuuttia 60 °C:ssa. Sitten massa pestään 40 tilavuudella tislattua vettä ja se otetaan talteen levyinä, joiden vaaleus on noin 45 ISO-astetta (± 3 ISO-astetta).
Mitataan saatujen kolmen levyn kappaluku.
10 Kappaluku on suhteellinen mittattaessa massassa olevan ligniinin määrää. Kappaluku on luku, joka esittää tilavuutta (millilitroina) kaliumpermanganaattiliuosta 0,1N (KMn04), joka on kulunut grammaa kohti kuivaa massaa tietyissä olosuhteissa ja TAPPI (Technical Commitee of the 15 Association of teh Pulp and Paper industry) normissa #T2-36cm-85 (1985) kuvatuilla toimenpiteillä.
ISO-aste on suhteellinen mitattaessa massasta saadun paperin vaaleutta. Tämä arvo on massasta saadun paperin reflektanssin tekijä tietyissä olosuhteissa ja IS0-20 normissa (The International Organization for Standardiz ation) #2469 kuvattujen toimenpiteiden mukaisesti, jotka on julkaistu #ISO-normissa 2470-1977 (F) normin #2470 ·**.. täydennyksenä.
j .1. Suoritetaan neljä samanlaista koetta, paitsi että • · · · 25 pH alussa on 5. Siksi suoritetaan neljä samanlaista koetta • · • · ; mäntymassasuspensiolla, jonka pH on säädetty vastaavasti • · · “!.1 6reen, 7:ään ja 8:aan, 9:ään pH 5:n asemasta.
• · ·
Tulokset on koottu taulukkoon 3.
• · · • · • · • · · • · • · • · · * · · • · ··» ♦ · ♦ · ··· ♦ · ♦ • · ♦ ··· ♦ 32
Taulukko 3 Käytetty entsyymimäärä 500 (IU/g) 5 _ Käytetty kloorimäärä (% paino/massan kuivapaino) 2,89 2,89 3,40 pH alussa Kappaluku 10 5 4,63 5,01 4,18 6 3,81 / 4,11 7 3,81 5,01 4,06 8 3,55 / 4,21 15 9 3,71 4,91 4,07
Symboli / tarkoittaa, että massan suspensiota ei ole testattu.
20 Nämä tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisel la ksylanaasilla voidaan kloorin määrää vähentää 15 - 20 % massalla, joka on valkaistu 45 ISO-asteeseen. Lisäksi nämä ·1·.. tulokset saadaan yhtä hyvin alkalisessa pH:ssa kuin happa- • massa pH:ssa. Hyviä tuloksia on saatu myös noin pH 9:ssä. ··· · 25 Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukaisella • · ; ksylanaasilla on aktiivisuutta laajalla pH-alueella. Siten • · · *11.1 keksinnön mukainen ksylanaasi on aktiivinen pH-alueella • ♦ · • · · * noin 5:stä noin 10:een. Se on erityisesti aktiivinen pH-arvoilla, jotka ovat suurempia tai yhtä suuria kuin 6. Se • · *···1 30 on erityisesti aktiivinen pH-alueilla, jotka ovat pienem- * 1 piä tai yhtä suuria kuin 9.
* · • · · • · · • « • · · • · • · ··· • · · • · ♦ ♦ · ♦ » 33
Esimerkki 12 Lämpötilan vaikutus Bacillus sp. 720/1 -kannan tuottaman ksylanaasin aktiivisuuteen havupuumassan valkaisun apuna 5 Toistetaan esimerkki 11 viidellä havupuumassasus- pensiolla, joiden pH on 8. Entsymaattinen käsittelyvaihe suoritetaan pH 8:ssa ja eri lämpötiloissa (55, 60 ja 65 °C).
Tulokset on koottu taulukkoon 4.
10
Taulukko 4 Käytetty entsyymimäärä (IU/g) 5 0 0 15 Käytetty kloorimäärä (% paino/massan kuivapaino) 2,89 2,89 3,40 Lämpötila °C Kappaluku 20 55 3,89 / / 60 3,64 4,77 4,09 :Y: 65 3,49 / / • · • · • · • ·· -.........- : .·. Symboli / tarkoittaa, että massan suspensiota ei ♦ · · · 25 ole testattu.
• ♦ • · Havaitaan, että massa on valkaistu noin 45 ISO- • · · ' • · · 'II.* asteeseen.
• · · * Nämä tulokset osoittavat, että entsymaattisesti käsiteltyjen massanäytteiden kappaluku pysyy jotakuinkin • · 30 pienempänä kuin ei-entsymaattisesti käsitellyn näytteen ***** kappaluku.
.*.*. Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön ksylanaasi • · .···. on aktiivinen laajalla lämpötila-alueella. Se on aktiivi- • · ·* nen noin 65 °C:n lämpötilassa.
• · · • · · • · · • · 34 Tämä esimerkki osoittaa myös, että keksinnön ksy-lanaasi on säilyy noin 60 °C:ssa.
Esimerkki 13
Bacillus sp. 720/1 -kannan tuottaman ksylanaasin 5 aktiivisuus eukalyptusmassan valkaisun aikana ECF- vaiheessa Tässä esimerkissä käytetään eukalyptuspuun massaa, joka tulee CEASA MILL -yhtiöstä (Espanja). Massa käsitellään ECF (Elemental Chlorine Free) -vaiheiden mukaan eli 10 peräkkäin vaiheissa, joissa ei käytetä elementaarista klooria.
1. vaihe: Happivaihe (vaihe 0)
Massaa käsitellään mentelmällä, jossa käytetään happea, kuten US-patentissa nro 4 462 864 kuvattiin niin, 15 että saadaan massaa, jonka kappaluku alussa on 12,3 ja ISO-aste alussa 33,4.
Tästä massasta, jota on käsitely hapella ja jonka koostumus on 4 % kuivapainosta, valmistetaan kaksi vesi-suspensiota.
20 Näiden suspensioiden pH säädetään 9:ään HCl:llä.
2. vaihe: Entsyymivaihe (vaihe X)
Preparaatiksi N nimitetty liuos, jota on valmis- • · tettu esimerkissä 2, laimennetaan tislatulla vedellä niin, • · · : .·. että saadaan entsyymiliuosta, jonka entsymaattinen aktii- • · · jlV 25 visuus on 25 IU/ml.
• · ’ * Tämä entsyymiliuos, joka sisältää ksylanaasia, li- • · · **·/ sätään eukalyptusmassasuspensioon niin, että massasuspen- • · · *·* * sio tulee käsitellyksi 10 IU/g:lla kuivaa massaa.
Kahteen muuhun eukalyptussuspensioon lisätään tis- ··· 30 lattua vettä entsyymiliuoksen tilalle.
*ί**ί Sitten kolmea suspensiota inkuboidaan 1 tunti 30 minuuttia 50 °C:ssa sekoittamatta.
♦ · · Ι.Γ 3. vaihe: Klooridioksidivaihe (vaihe D) • · *1' Sitten kukin näin saatu massasuspensio käy läpi 35 valkaisuvaiheen, jossa kloorataan klooridioksidilla. Tämä • · 35 käsittely tapahtuu massalla, jonka koostumus on 3 % kuiva-massan painosta.
Tätä varten entsymaattisesti käsiteltyyn massasus-pensioon ja ei-entsymaattisesti käsiteltyyn massasuspen-5 sioon lisätään 0,6 % klooridioksidia (paino/massan kuiva-paino). Toiseen ei-entsymaattisesti käsiteltyyn massasus-pensioon lisätään 1 % klooridioksida (paino/paino).
Näitä kolmea suspensiota inkuboidaan 30 minuuttia 50 °C:ssa. Sitten massa pestään 40 tilavuudella tislattua 10 vettä.
4. vaihe: Lipeävaihe ja vetyperoksidivaihe (vaihe E/P)
Sitten suoritetaan alkalinen uutos, jossa lisätään 1,8 % (paino/massan kuivapaino) Na0H:ta ja 0,5 % (paino/ 15 massan kuivapaino) vetyperoksidia kolmeen edellä saatuun suspensioon, joiden koostumus on 12 % kuivapainosta.
Näitä kolmea suspensiota inkuboidaan 1 tunti 30 minuuttia 70 °C:n lämpötilassa. Sitten massa pestään 40 tilavuudella tislattua vettä.
20 5. vaihe: Klooridioksidivaihe (vaihe D)
Sitten kukin näin saatu massasuspensio käy läpi : uudelleen valkaisukäsittelyn, joka sisältää kloorauksen ·*·.. klooridioksidilla. Tämä käsittely tapahtuu massalla, jonka : koostumus on 12 %.
• · · # · · · 25 Näihin kolmeen suspensioon lisätään klooridioksi- • · ; dia 0,5 % (paino/massan kuivapaino).
• · · *11.* Inkuboidaan näitä kolmea suspensiota 2 tuntia • · · • · · * 75 °C:ssa. Sitten massa pestään 40 tilavuudella tislattua vettä.
··· • · 30 6. vaihe: Lipeä- ja vetyperoksidivaihe (vaihe E/P) *·*’· Sitten suoritetaan alkalinen uutos, jossa lisätään 0,6 % (paino/massan kuivapaino) NaOH:ta ja 0,3 % (paino/ • · .···. massan kuivapaino) vetyperoksidia kolmeen edellä saatuun • · • suspensioon ja jonka koostumus on 12 % massan kuivapainos- 35 ta.
• · 36 Näitä kolmea suspensiota inkuboidaan 1 tunti 30 minuuttia 70 °C:ssa. Sitten massa pestään 40 tilavuudella tislattua vettä.
7. vaihe: Klooridioksidivaihe (vaihe D) 5 Sitten kukin näin saatu massasuspensio käy läpi valkaisukäsittelyn, joka sisältää kloorauksen klooridiok-sidilla. Tämä käsittely tapahtuu massalla, jonka koostumus on 12 %.
Näihin kolmeen suspensioon lisätään klooridioksi-10 dia 0,3 % (paino/massan kuivapaino).
Inkuboidaan näitä 3 suspensiota 2 tuntia 30 minuuttia 75 °C:ssa. Sitten massa pestään 40 tilavuudella tislattua vettä ja se otetaan talteen levyinä.
Mitataan saatujen kolmen levyn ISO-asteet.
15 Tulokset on koottu taulukkoon 5.
Taulukko 5
Vaiheessa 2 käytetty 20 enstyymimäärä IU/g 10 0 0
Vaiheessa 3 käytetty • · klooridioksidimäärä j prosentteina (paino/ 0,6 0,6 1,0 ··· · 25 kuivamassan paino) • · • · • · • · · .........
• · · *11.1 ISO-astetta 88,5 85,5 87,9 • · · ' r • · ·
• M
• · *···1 30 Tämä esimerkki osoittaa, että keksinnön mukainen • 1 ksylanaasi tehoaa eukalyptusmassaan. Lisäksi siinä ei tar- vita minkäänlaista pH:n säätöä, sillä sen etuna on, että • · .1··. se on aktiivinen massan pH:ssa eli noin pH 9:ssä. Tämä • · • · · esimerkki osoittaa, että keksinnön mukainen ksylanaasi on • · · ’·'··’ 35 alkalinen ksylanaasi.
· 37 Tämä esimerkki osoittaa myös, että verrattuna siihen, mitä saadaan ilman ksylanaasia, keksinnön ksylanaasin käyttö lisää vaaleutta ainakin 3 ISO-astetta tietyllä C102-määrällä.
5 Tämä esimerkki osoittaa myös, että keksinnön ksyla naasia käyttämällä voidaan vähentää C102:n määrää noin 4 -5 kg/tonni massaa, mikä vastaa noin 25 - 30 % tarvittavan C102:n kokonaismäärästä.
Esimerkki 14 10 Bacillus sp. 720/1:n nukleotidi- ja proteiinin ami nohapposekvenssin määrittäminen 1. Kromosomisen DNA:n uuttaminen Bacillus sp. 720/1 -kannasta
Viljelmästä B, kuten se esimerkissä 2 valmistet-15 tiin, viljellään 200 ml Bacillus sp. 720/1 -kantaa LB/C alustalla 16 tunnin ajan 37 °C:ssa. Alusta LB/C on sama kuin alusta LBS/C, joka on kuvattu esimerkissä 1, mutta ilman vehnälesettä.
Kun tämä viljely on tehty ja kun se on stationääri-20 sessä kasvuvaiheessa, sitä sentrifugoidaan (BECKMAN J21, roottori JA10) 5 000 rpm minuutissa 10 minuutin ajan. Näin • · ί.ί.ί saatu sentrifugointisakka liuotetaan 9 ml:aan TRIS-HC1- puskuria (tris(hydroksimetyyli)aminometaani, joka on tehty • ·*· happamaksi 0,1 M HClrllä), jonka pH on 8,0 ja jossa on ··· · !*.·. 25 0,1 M EDTA:ta, 0,15 M NaClra, ja 18 mg lysotsyymiä, näin • · : saatua suspensiota inkuboidaan 15 minuuttia 37 °C:ssa.
• · · Näin saatua lysaattia käsitellään sitten 200 pl:lla • · · 10 mg/ml RNAasi-liuoksella 20 minuuttia 50 °C:ssa. Sitten ... tähän lysaattiin lisätään 1 ml 10-%:ista SDS:ää (natrium- • · *···] 30 dodekyylisulfaattiliuosta). Sitten tätä lysaattia inkuboi- * * daan 30 minuuttia 70 °C:ssa.
Sitten lysaatti jäähdytetään noin 45 °C:seen, sii- • ·
.·*·. hen lisätään sitten 0,5 ml proteinaasi K:ta (BOEHRINGER
• · · •m Mannheimin myymä) 20 mg/ml (valmistettu juuri ennen käyt- *·!·* 35 töä).
• · 38 Tätä lysaattia inkuboidaan 45 °C:ssa sekoittaen, kunnes saadaan läpinäkyvä liuos.
Tästä läpinäkyvästä liuoksesta tehdään useita fe-noliuutoksia olosuhteissa ja menetelmillä, joita on ku-5 vattu teoksessa MOLECULAR CLONING - a laboratory manual -SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS, toinen painos, 1989, sivulla E.3, kunnes saadaan oikea rajapinta, kuten se tässä kirjassa kuvataan.
DNA saostetaan 20 ml:11a etanolia. Sakka otetaan 10 talteen sentrifugoimalla 5 000 kierrosta minuutissa (BECKMAN J21, roottori JA10) 5 minuutin ajan, sitten suspendoi-daan 2 ml:aan TE-puskuria pH 8,0 (10 mM TRIS-HC1, 1 mM EDTA pH 8,0). Tämä suspensio sisältää kromosomisen DNA:n.
2. pUBR2002-vektorin konstruointi 15 pUBR2002-vektoria (E. Coli - Bacillus subtilis) saadaan pBR322 plasmidista, jota yhtiö BIOLABS (CLONTECH LABORATORIES, kataloginumero 6210-1) myy, ja pUBl31-vek-torista.
Konstruoidaan kaksi synteettistä oligonukleotidiä 20 BEAUCAGE et ai. (1981) kuvaamalla tekniikalla. Tetrahedron Letters, 22, sivut 1859 - 1882 ja käyttämällä β-syaani-V.*! etyylifosforamidiittia BIOSEARCH CYCLONE SYNTHESIZER
-laitteistossa.
i Näiden kahden oligonukleotidin sekvenssit ovat seu- • · · · IV. 25 raavanlaiset: • · I I SEQ ID NO: 14 "I/ 5 - CCCCCCTACGTAGCGGCCGCCCCGGCCGGTAACCTAGGAAGTCAGCGCCCTGCACC - 3’ • · · • · · ja ... SEQ ID NO: 15 • ♦ **··* 30 5’ - CCCCCCTACGTAGGCCGGGGCGGCCGCOGTTACCTAGGGCCTCGTGATACGCCTAT - 3’ Näitä kahta oligonukleotidiä käytetään PCR-monis-tuksen suorittamiseksi pBR322-plasmidista tekniikalla, • · ·***· joka on kuvattu teoksessa MOLECULAR CLONING - a laboratory ··· *. Manual -SAMBROOK et ai., toinen painos, 1989, s. 14.18 - *·:·** 35 14.19.
• · 39 PCRtllä monistettu fragmentti sisältää E. colin replikonin, jota rajoittaa molemmista päistä restriktio-kohdat AvrII, BstEII, NotI, Sfil, Snabl.
Fragmentti Snabl-Snabl, joka on noin 2,8 kbp (kbp = 5 1 000 emäsparia) on liitetty pUB131-vektoriin, joka on sitä ennen digeroitu Snabl:llä. pUB131-vektorin konstruointi on kuvattu US-patentin nro 5 352 603 esimerkissä 10 ja kuviossa 7 (EP-hakemusjulkaisu nro 0 415 296), joka liitetään viitteenä tähän kuvaukseen.
10 Tämä ligaatiotekniikka on kuvattu SAMBR00K et ai.
kirjassa (s. 1.68 - 1.69). Kaikki suoritetut ligaatiot tässä hakemuksessa on suoritettu tällä tekniikalla.
Näin saatu ligaatio transformoidaan E. coli MC1061 -soluissa [CL0NITECH LABORATORIES, kataloginumero C-10701-15 1] elektroporaatiolla (SAMBROOK et ai., s. 1,75 - 1,81).
Transformoituja soluja viljellään Petri-maljalla, joka sisältää LB-agaria, 100 pg/ml ampisilliiniä ja 10 pg/ml kanamysiiniä, 37 °C:ssa noin 18 tuntia.
Plasmidit uutetaan eristetyistä pesäkkeistä emäksi-20 sellä hajotuksella (SAMBROOK et ai., s. 1.25 - 1.28) ja suoritetaan restriktioanalyysi, joka on kuvattu teoksessa • · ϊ,ί.Σ Molecular Cloning, a laboratory Manual, MANIATIS et al., 1982, Cold Spring Harbour Laboratory, sivut 374 - 379.
• ;*j Saadaan kanta, josta uutetaan vektori, jota kutsu- • · · · 25 taan pUBR2002:ksi (kuvio 3.) • · : .·. 3. Bacillus sp. 720/l:n geenikokoelman valmistus • · ·
Kromosomista DNA: ta sisältävästä suspensiosta DNA
• · · lohkaistaan osittain restriktioentsyymillä Sau3AI. Res-triktio-olosuhteet ovat samat kuin SAMBROOKin kuvaamat • · *···* 30 (sivut 5.28 - 5.32), paitsi että näitä restriktio-olosuh- * * teitä lisätään 10-kertaisesti riittävän DNA-määrän saarni- seksi seuraaviin puhdistusvaiheisiin.
• · .***. Käytetyn DNA- ja entsyymimäärän välinen suhde sää- ··· *. detään niin, että saadaan maksimaalisesti fragmenttikokoa • · · *···] 35 4 - 7 kpb (kbp: 103 emäsparia).
• · 40 Näin saadut fragmentit ajetaan agaroosigeelielekt-roforeesilla (0,8 % w/v), kuten SAMBROOK et ai. ovat kuvanneet, sivut 6.01 - 6.19, ja 4 - 7 kbp:n kokoiset fragmentit eristetään ja puhdistetaan suodatusmenetelmällä ja 5 sen jälkeen sentrifugoimalla, kuten ZHU et ai. ovat kuvanneet, Bio/Technology 3, 1985, sivut 1014 - 106.
Näin puhdistetut DNA-fragmentit yhdistetään sitten (SAMBROOK et ai. kuvaamalla menetelmällä (s. 1.68 - 1.69) pUBR2002-plasmidin kanssa (E. coli - Bacillus bubtilis), 10 joka on sitä ennen katkaistu BamHI-kohdasta ja defosfory-loitu, kuten SAMBROOK el. ovat kuvanneet (s. 1.60 - 1.61).
Näin saatua ligaatiota käytetään E. coli MC1061 -solujen transformoimiseksi elektroporaatiolla (SAMBROOK et ai., sivut 1.75 - 1.81).
15 4. Geenikokoelman seulonta
Transformoituja E. coli -soluja viljellään Petri-maljalla, joka sisältää LB-agaria, 0,8 g/1 AZCL-ksylaania ja 100 pg/ml ampisilliiniä, noin 24 tuntia 37 °C:ssa. Eristetään pesäke, joka aiheuttaa hydrolyysivyöhykkeen.
20 Tässä pesäkkeessä oleva plasmidi uutetaan ja eris tetään emäksisellä hajotustekniikalla, jonka ovat kuvan-ϊ · ! neet SAMBROOK et ai., sivut 1.25 - 1.28.
Suoritetaan restriktioanalyysi (SAMBROOK et ai., • sivu 1.85). Tämä analyysi osoittaa, että saatu DNA-frag-··· · 25 mentti, joka sisältää ksylanaasin geenin, on kooltaan noin • · : 3,5 kbp (kbp = 1 000 emäsparia). Se on tuotu pUBR2002-vek- • · 1 .···[ torin mukana, joka liitettiin siihen.
• · · Näin saadaan pUBR-720Xl-plasmidia (kuvio 4).
5. Ksylanaasigeenin sisältämän kromosomi fragmentin • · *···’ 30 kloonaaminen * 1 pUBR-720Xl-plasmidi digeroidaan restriktioentsyy- ;1;1· meillä Swal- ja Spel-kohdista. Ksylanaasin geeni saadaan • · .···. näin noin 1,5 kbp:n DNA-fragmentissa Swal-Spel.
•# Tätä DNA-fragmenttia Swal-Spel käsitellään DNA-po- • · · *·:·1 35 lymeraasin Klenowin fragmentilla (SAMBROOK et ai., sivut :**: F. 2 - F. 3).
41 Näin saatu DNA-preparaatti liitetään pUBR2002-vek-toriin, joka on sitä ennen digeroitu EcoRVrllä ja defos-foryloitu.
Sitten ligaatio transformoidaan E. coli MC1061 -so-5 luihin elektroporaatiolla.
Transformoidut kannat valitaan Petri-maljoilta, jotka sisältävät LB-agaralustaa (Luria-Bertani), 0,8 g/1 AZCL-ksylaania (MEGAZYME) ja 100 pg/ml ampisilliiniä 37 °C:ssa noin 24 tunnin ajan tapahtuneen kasvatuksen jäl-10 keen.
Pesäkkeet, joiden ympärillä on hydrolyysivyöhyke, eristetään. Plasmidit uutetaan eristetyistä pesäkkeistä emäksisellä hajotustekniikalla (SAMBROOK et ai., sivut 1.25 - 1.28) ja tehdään restriktioanalyysi (MANIATIS et 15 ai., 1982, sivut 374 - 379). Tämä restriktioanalyysi osoittaa, että eristetty plasmidi pUBR-720Xll (kuvio 5) sisältää ksylanaasin geenin Bacillus sp. 720/1, kromosomisen DNA:n fragmentissa, joka on noin 1,5 kbp.
pUBR-720Xll-plasmidia käytetään sitten E. coli 20 JM109 -solujen (CL0NTECH LABORATORIES kataloginumero C1005-1) transformoimiseksi CaCl2-tekniikalla (SAMBROOK et :V: ai., sivut 1.82 - 1.84).
E. colin transformoituja soluja kasvatetaan Petri- • ·*: maljalla, joka sisältää LB-agaralustaa, 0,8 g/1 AZCL-ksy- • · · · jV. 25 laania ja 100 pg/ml ampisilliiniä. 37 °C:ssa noin 24 tun-• · j .·. nin ajan tapahtuneen kasvatuksen jälkeen havaitaan, että • · · ··· · .···. pesäkkeiden ympärille muodostuu hydrolyysivyöhyke. Tämä ♦ · · osoittaa, että transformoidut E. coli -solut ekspressoivat ... hyvin ksylanaasia.
• · 30 Tekniikan, jolla voidaan fosforyloida DNA-fragmen- tit tai linearisoida vektorit, on kuvannut SAMBROOK et ai., (sivut 1.60 -1.61) • « ;**’j Eristetään pesäke, joka muodostaa hydrolyysivyöhyk- ··· *. keen. Tässä pesäkkeessä oleva plasmidi uutetaan ja eriste- • · · •**# 35 tään alkalisella hajotustekniikalla.
• « 42
Ksylanaasin sekvenssi määritetään SAMBROOK et ai. kuvaamalla menetelmällä, sivuilla 13.15 ja 13.17 (kuvio 13.3B) käyttämällä pUBR-720Xll-plasmidia matriisina.
Sekvenssin määrittämisen aloittamiseksi valmiste-5 taan synteettisiä oligonukleotidejä pUBR2002-plasmidin kanssa hydbridisointia varten. Synteettisten oligonukleo-tidien sekvenssit ovat seuraavat: SEQ ID NO: 16 5’ - ACGAGGAAAOATGCTGTTCTTGTAAATGAGT - 3’ 10 ja SEQ ID NO: 17 5’ - TACCTTGTCT AC A AACCCC - 3’
Sekvenssin loppuosa määritettiin käyttämällä muita synteettisiä oligonukleotidejä, jotka perustuivat uudel-15 leenmääriteltyjen sekvenssien osiin.
Näin saadaan täydellinen ksylanaasia (SEQ ID NO:10) koodaavan geenin nukleotidisekvenssi (kuvio 2). Ksylanaasin geeni on saatu noin 1,5 kbp:n fragmenttina.
Esimerkki 15 20 pUBRD-720Xll-ekspressiovektorin konstruktio pUBRD-720Xll ekspressiovektori (kuvio 6) on pUBR- • · 720Xll-plasmidista peräisin oleva plasmidi, josta on pois-tettu E. colin replikoni.
• • ;*· pUBRD-720Xll-plasmidin konstruktio pUBR-720Xll- • · · · 25 plasmidista, kuten sitä esimerkissä 14 valmistetaan, kuva- • · • · • · taan alla.
• ♦ · ♦ · ♦ pUBR-720Xll-plasmidia digeroidaan restriktioentsyy- • · · * millä SnaBI-kohdista E. colin replikaatiokohdan poistamiseksi esimerkissä 14 kuvatun tekniikan mukaisesti. Näin • · *···* 30 saadaan noin 5 kbp:n fragmentti, se yhdistyy itseensä * * käyttämällä esimerkissä 14 kuvattua tekniikkaa, jolloin saadaan pUBRD-720Xll-plasmidia.
* · ;***. Näin saatua ligaatiota käytetään kompetenttien Ba- • · · *. cillus subtilis SE3 solujen transformoimiseksi tekniikal- • · · • · · • · · • · 43 la, joka on kuvattu teoksessa DNA Cloning, voi II, ED. Glover, D.M., IRL Press Oxford, 1985, sivut 9-11.
Bacillus substilis SE3 -kanta on talletettu 21. kesäkuuta 1993 kokoelmaan, jota kutsutaan nimellä BELGIAN 5 COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS (LMG culture collection, Gand, Belgia) Budapestin sopimuksen mukaisesti numerolla LMG P-14035.
Transformoituja soluja viljellään Petri-maljalla, joka sisältää LB-agaralustaa, 0,8 g/1 AZCL-ksylaania ja 10 25 pg/ml kanamysiiniä 37 °C:ssa noin 18 tunnin ajan. Kas vatuksen jälkeen pesäkkeet, joiden ympärillä on hydrolyy-sivyöhyke, eristetään.
Eristetyille vyöhykkeille tehdään plasmidianalyysi restriktioentsyymeillä oikean plasmidikonstruktion osoit-15 tamiseksi käyttämällä esimerkissä 14 kuvattua tekniikkaa.
Näin saadaan kanta, josta vektori voidaan eristää ja jota nimitetään pUBRD-720Xll:ksi.
Esimerkki 16
Bacillus licheniformis SE2 delap6 -kannan tranfor-20 mointi pUBRD-720Xll-ekspressiovektorilla
Esimerkissä 15 kuvattu plasmidi pUBRD-720Xll uute-: taan isännästään, eristetään ja puhdistetaan (SAMBROOK et ai., 1989, sivut 1.25 - 1.28).
• Valmistetaan Bacillus licheniformis SE2 delap6 • · · · 25 -kannan viljelmä. Bacillus licheniformis SE2 delapö -kanta • φ ; ja sen viljelmä on kuvattu EP-hakemusjulkaisun 0 634 490 • · · esimerkeissä 27 ja 28, joka liitetään tähän viitteenä.
• · · • · · * Bacillus licheniformis SE2 delapö on valmistettu
Bacillus licheniformis SE2 -kannasta, joka on talletettu ··· ' ° • · ’···* 30 21. kesäkuuta 1993 kokoelmaan, jota kutsutaan nimellä BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS (LM G culture collection, Gand, Belgia) Budapestin sopimuksen • · .···. mukaisesti numerolla LMG P-14034.
• · *·’ Sitten Bacillus licheniformis SE2 delapö -kanta 35 transformoidaan pUBRD-720Xll-plasmidilla protoplastitek-nilkalla (MANIATIS et ai., s. 150 - 151).
44
Transformoitu kanta [Bacillus licheniformis SE2 delapö (pUBRD-720Xll)] valitaan Petri-maljalla, joka sisältää LB-agaralustaa, 0,8 g/1 AZCL-ksylaania ja 25 pg/ml kanamysiiniä. Sitten se eristetään ja puhdistetaan seulo-5 maila eli laittamalla ja levittämällä vähenevinä siirros-tuksina LB-agaralustan (Luria Bertani) pinnalle, joka on kuvattu teoksessa Molecular Cloning - Laboratory Manual (Sambrook et ai., ), 1989, s. A.4.
Esimerkki 17 10 Ksylanaasin tuottaminen Bacillus licheniformis SE2 delapö (pUBRD-720Xll):n avulla
Bacillus licheniformis SE2 delapö -kantaa, joka on transformoitu pUBRD-720Xll-plasmidilla, kuten sitä esimerkissä 16 valmistettiin, viljellään 17 tuntia 37 °C:ssa LB-15 kasvatusalustalla, johon on lisätty 0,5 % (w/v) glukoosia ja 20 pg/ml kanamysiiniä.
Tämä viljelmä (5 % v/v) siirretään 50 ml:aan M2-viljelmää, johon on lisätty 20 pg/ml kanamysiiniä.
Alusta M2 sisältää 30 g soijajauhoa, 75 g liukoista 20 tärkkelystä, 2 g natriumsulfaattia, 5 mg magnesiumklori-dia, 3 g NaH2P04:a, 0,2 g CaCl2*H20:ta ja 1 000 ml vettä. Tämän M2-alustan pH säädetään 5,8:aan 10 N NaOHrlla ennen • · ·'· sterilointia.
• · · : Viljelmää inkuboidaan sekoittaen tasosekoittajalla • · · · 25 250 kierrosta minuutissa noin 2,54 cm:n amplitudilla 80 • · | I tuntia 37 °C:ssa. 80 tunnin kuluttua biomassa poistetaan ***.* sentrifugoimalla (BECKMAN J21, roottori JA10) 5 000 kier- • · · • * rosta minuutissa 10 minuutin ajan. Sentrifugoinnista saatu supernatantti säästetään. Tämän supernatantin entsymaatti- • · 30 nen aktiivisuus mitataan esimerkissä 2 kuvatulla menetel-mällä ja havaitaan ksylanaasiaktiivisuuden läsnäolo.
Esimerkki 18 • ♦ · • · .···. pUBC2001-vektorin konstruointi • · *** pUBC2001-vektori (E. coli-Bacillus) (kuvio 7) on 35 plasmidi, joka on peräisin pUBC131-plasmidista, joka eroaa • · 45 ainoastaan kahdella muulla restriktiokohdalla: BstElI ja Pad. pUBC131-vektorin konstruktio on kuvattu US-patentin nro 5 352 603 esimerkissä 11 ja kuviossa 8 (EP-hakemusjul-kaisu nro 0 415 296), joka liitetään tähän viitteenä.
5 Tämän plasmidin konstruktio on kuvattu alla.
Tehdään neljä synteettistä oligonukeotidiä esimerkissä 14 kuvatulla tekniikalla.
Näiden neljän oligonukleotidin sekvenssit ovat seu- raavat: 10 SEQ ID NO: 18 5’- CGGTCGCCGC ATAC ACT A - 3’ SEQ ID NO: 19 5’- CCCCCCCCCGGTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAA - 3’ SEQ ID NO: 20 15 5’- CCCCCCCCCGGTTACCGTATTTATTAACTTCTCCTAGTA - 3’ SEQ ID NO: 21 5’- CCCCCCTCTAOATTAATTAACCAAGCTTGGGATCCGTCGACCTGCAGATC - 3’
Kahta oligonukleotidiä, joiden sekvenssit ovat SEQ
ID NO:18 ja 19, käytetään PCR-monistuksen suorittamiseksi 20 pUBC131-vektorista esimerkissä 14 kuvatun PCR-tekniikan mukaisesti. PCR:llä monistettu fragmentti, joka sisältää osan ampisilliiniresistenssin geenistä ja E. colin repli- koitumiseen tarvittavat funktiot, katkaistaan restriktio- I kohdista Scalrlla ja BstEII:lla, jolloin saadaan noin ··* · 25 1,5-1,6 kbp:n fragmentti.
; .·. Toinen PCR-monistus tehdään pUBC131-vektorilie • · · "j/ käyttämällä oligonukleotidejä, joiden sekvenssit ovat * SEQ ID NO:20 ja 21 ja käyttämällä esimerkin 14 mukaista tekniikkaa. PCR:llä monistettu fragmentti sisältää osan • · *···* 30 pUBC131-vektorista. Tämä fragmentti katkaistaan restrik- tiokohdista BstEII:lla ja EcoRI:llä, jolloin saadaan noin 1,4 - 1,5 kbp:n fragmentti.
• · .···. Näin saadut kaksi fragmenttia liitetään yhteen esi- • · · ·. merkissä 14 kuvatulla tavalla pUBC131-vektoriin, jolle • · · • · · • · · • · 46 sitä ennen on tehty kaksoisdigestio EcoRIrlla ja Scaltllä esimerkissä 14 kuvatulla tekniikalla.
Näin saatua ligaatiota käytetään transformoimaan E. coli MC1061 -soluja elektroporaatiolla esimerkissä 14 ku-5 vatulla tavalla. Transformoituja soluja kasvatetaan Petri- maljalla, joka sisältää LB-agaralustaa, 100 pg/ml ampisil-liiniä ja 10 pg/ml kanamysiiniä, 37 °C:ssa noin 18 tuntia.
Kasvatuksen jälkeen eristetyille pesäkkeille tehdään plasmidianalyysi restriktioentsyymeillä esimerkissä 10 14 kuvatulla tavalla.
Saadaan kantaa, josta voidaan uuttaa vektori, jota kutsutaan pUBC2001:ksi.
Esimerkki 19
Ekspressiovektorin pC-BPX-PRE-2003 konstruointi 15 Ekspressiovektori pC-BPX-PRE-2003 (E. coli-Bacil-
lus) (kuvio 8) on ekspressiovektori, joka on peräisin pUBC2001-plasmidista. Se sisältää promoottorin, joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL Bl2:n ksylanaasia, ja presekvenssin, joka koodaa Bacillus pumi-20 lus PRL B12:n ksylanaasin signaalipeptidiä. Menetelmä promoottorin valmistamiseksi ja saamiseksi, joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaa-siä ja presekvenssiä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL
• j"j B12:n ksylanaasin signaalipeptidiä, on kuvattu esimerkissä • · * * 25 17 ja EP-hakemusjulkaisun nro 0 634 490 kuviossa 1, joka • · : .·. liitetään viitteenä tähän hakemukseen.
• · · ”1/ Promoottorin sekvenssi, joka on peräisin geenistä, • · · joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n ksylanaasia, kuvataan tässä hakemuksessa numerolla SEQ ID NO:26. Presek- ··· • · *···* 30 venssin sekvenssi, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12:n * * ksylanaasin signaalipeptidiä, kuvataan tässä hakemuksessa numerolla SEQ ID NO:27.
• · · • · .···. pC-BPX-PRE-2003-plasmidin konstruktio on kuvattu ··· • alla.
• · · • · · ··· • · 47
Valmistetaan synteettisiä oligonukleotidejä esimerkissä 14 kuvatulla tavalla.
Näiden kahden oligonukleotidin sekvenssit ovat seu- raavat: 5 SEQ ID NO: 22 5’- CCCCCCTGAAATCAGCTGGACTAAAAGGGATGCAATTTC - 3’ SEQ ID NO: 23 5’- CCCCCCGTCGACCGCATGCGCCGGCACAGC - 3’ Näitä kahta oligonukleotidiä käytetään PCR-monis-10 tuksen suorittamiseksi pUB-BPX12-plasmidista esimerkissä 14 kuvatulla tavalla. Plasmidin pUB-BPXl2 valmistus on kuvattu esimerkissä 17 ja EP-hakemusjulkaisun 0 634 490 kuviossa 4, joka liitetään viitteenä tähän hakemukseen.
Käyttämällä oligonukleotidiä, jonka sekvenssi on 15 SEQ ID NO:22, saadaan nukleotidiä vaihtamalla poistettua B. pumilus PRL B12:n ksylanaasin promoottorin yläpuolelta restriktiokohta Sphl, joka sijaitsee noin 5,5 kbp:n kohdalla ja jota on normaalisti pUBC2001:ssä. Nukleotidin vaihto on esitetty alleviivatulla nukleotidillä edellä 20 esitetyssä sekvenssissä SEQ ID NO:22 ja se koskee C:n korvaamista G:llä SphI-kohdassa (Sphl = GCATGC).
• · I ϊ I Sekvenssin SEQ ID NO:23:n avulla voidaan luoda uusi • · ·*·.. Sphl-kohta presekvenssin loppuun, joka koodaa B. pumilus j PRL Bl2:n ksylanaasin signaalipeptidiä, vaihtamalla vain • · · ·
25 Ala [25] kodonin yksi nukleotidi eli vaihtamalla GCG
• · • · GCT:ksi.
• · · • · · '11.' PCR:llä monistettu fragmentti, joka sisältää pro- • · · moottorin geenistä, joka koodaa B. pumilus PRL B12:n ksy-
... lanaasia, ja presekvenssin, joka koodaa B. pumilus PRL
• · ’···* 30 B12:n ksylanaasin signaalipeptidiä, pilkotaan restriktio- * * kohdista PvuII:lla ja Sphlrllä, jolloin saadaan fragment- ti, joka on noin 0,7 kbp, käyttämällä esimerkissä 14 ku- • · .***. vattua tekniikkaa.
• · ·. PvuII-SphI-fragmentti, joka on noin 0,7 kbp, liite- • · · *···[ 35 tään pUBC2001-vektoriin, jolle on sitä ennen tehty kak- • · 48 soisdigestio Pvull:lla ja Sphltllä käyttämällä esimerkissä 14 kuvattuja tekniikoita.
Näin saatua ligaatiota käytetään E. coli MC1061 -solujen transformoimiseen elektroporaatiolla noudattamal-5 la esimerkissä 14 kuvattua tekniikkaa. Transformoituja soluja kasvatetaan Petri-maljalla, joka sisältää LB-aga-ria, 100 pg/ml ampisilliiniä, 37 °C:ssa 18 tuntia.
Kasvatuksen jälkeen eristetyille pesäkkeille tehdään plasmidianalyysi restriktioentsyymeillä esimerkissä 10 14 kuvatulla tekniikalla.
Näin saadaan kanta, josta voidaan uuttaa vektori, jota kutsutaan pC-BPX-PRE-2003:ksi.
Esimerkki 20
Ekspressiovektorin pC-BPX-PRE-720X konstruointi 15 Ekspressiovektori pC-BPX-PRE-720X (E. coli-Bacil- lus) (kuvio 9) on ekspressiovektori, joka sisältää promoottorin, joka on peräisin geenistä, joka koodaa B. pumi-lus PRL Bl2:n ksylanaasia, ja presenkvenssin, joka koodaa B. pumilus PRL B12:n ksylanaasin signaalipeptidiä, ja gee-20 nin sekvenssin, joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasin valmista osaa.
Ekspressiovektori pC-BPX-PRE-720X sisältää sekvens- • · sin SEQ ID NO:l, geenin nukleotidisekvenssin, joka koodaa : .·. Bacillus sp. 720/l:n ksylanaasin valmista osaa.
• · · 25 pC-BPX-PRE-720X-plasmidin konstruktio on kuvattu I f alla.
• · » *·*.* Valmistetaan kaksi synteettistä oligonukleotidia • · · *·’ ' esimerkissä 14 kuvatulla tekniikalla.
Näiden kahden oligonukleotidin sekvenssit ovat seu- ··· 30 raavat: "**i SEQ ID NO: 24 .V. 5’- CCCCCCGCATGCGCAAATCGTCACCGACAATTCCATTGG - 3’ • · · .*♦*. SEQ ID NO: 25 • » ’.** 5’- TACCTTGTCTACAAACCCC - 3’ • · · • · · • · · • · 49 Näitä kahta nukleotidisekvenssiä käytetään PCR-mo-nistuksen suorittamiseksi plasmidista pUBR-720xll, kuten ne esimerkissä 14 valmistettiin, ja esimerkissä 14 kuvatulla tekniikalla.
5 PCRrllä monistettua fragmenttia, joka sisältää gee nin sekvenssin, joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaa-sin valmista osaa, käsitellään restriktioentsyymeillä kohdista Sphl ja Sacl, jolloin saadaan noin 0,8 kbp:n fragmentti esimerkissä 14 kuvatulla tekniikalla.
10 Fragmentti SphI-SacI on liitetty pC-BPX-PRE-2003- vektoriin, jolle on sitä ennen tehty kaksoisdigestio Sphl:een ja Saclteen esimerkissä 14 kuvatuilla tavoilla. Restriktiokohdan Sphl tasolla tapahtuvan liitoksen avulla voidaan luoda signaalisekvenssin translaatiofuusio gee- 15 niin, joka koodaa B. pumilus PRL B12:n ksylanaasia, geenin sekvenssillä, joka koodaa Bacillus sp. 720/1 tn ksylanaasin valmista osaa.
Näin saatua ligaatiota käytetään transformoimaan E. coli MClOöltn soluja elektroporaatiolla esimerkissä 14 20 kuvatulla tekniikalla. Transformoituja soluja viljellään
Petri-maljalla, joka sisältää LB-agaralustaa, 0,8 g/1 :V: AZCL-ksylaania ja 100 pg/ml ampisilliiniä, 37 “Ctssa noin ·*·.. 18 tuntia. Eristetään pesäkkeet, jotka aiheuttavat hydro- : lyysivyöhykkeen.
• · · · 25 Kasvatuksen jälkeen eristetyille pesäkkeille teh- • · . dään plasmidianalyysi restriktioentsyymeillä esimerkissä 14 kuvatulla tavalla.
• · · • · · • Näin saadaan kantaa, josta voidaan uuttaa vektori, jota kutsutaan pC-BPX-PRE-720X:ksi.
30 Esimerkki 21 *·**· pBPXD-PRE-720X-vektorin konstruktio
Vektori pBPXD-PRE-720X (Bacillus) (kuvio 10) on • · .···. ekspressiovektori, joka on peräisin pUB131-pasmidista. Se • ·
’·* sisältää promoottorin geenistä, joka koodaa B. pumilus PRL
• · · 35 B12:n ksylanaasia, ja presekvenssin, joka koodaa B. pumi- • · 50 lus PRL B12:n ksylanaasin signaalipeptidiä, ja geenin sekvenssin, joka koodaa Bacillus sp. 720/1:n ksylanaasin valmista osaa.
pBPXD-PRE-720X:n plasmidin konstruktio on kuvattu 5 alla.
pBPXD-PRE-720X-plasmidia, jota on valmistettu esimerkissä 20, käsitellään restriktiokohdista PvuII ja EcoRI, jolloin saadaan noin 1,5 kbp:n fragmenttia esimerkissä 14 kuvatulla tavalla.
10 Noin 1,5 kbp:n fragmentti liitetään pUB131-vekto riin, jolle on sitä ennen tehty kaksoisdigestio PvuII:n ja EcoRI:n kohdalta esimerkissä 14 kuvatulla tavalla.
Näin saatua ligaatiota käytetään B. subtilis SE3:n solujen transformoimiseksi elektroporaatiotekniikalla, jo- 15 ka on kuvattu esimerkissä 14. Transformoituja soluja vil jellään Petri-maljalla, joka sisältää LB-agaralustaa, 0,8 g/1 AZCL-ksylaania ja 25 pg/ml kanamysiiniä 37 °C:ssa noin 18 tuntia. Eristetään pesäkkeet, jotka aiheuttavat suuren hydrolyysivyöhykkeen.
20 Kasvatuksen jälkeen eristetyille pesäkkeille teh dään plasmidianalyysi restriktioentsyymeillä esimerkissä 14 kuvatulla tekniikalla.
• · · Näin saadaan kanta, josta voidaan uuttaa vektori, • ♦♦ | . jota kutsutaan pBPXD-PRE-720X:ksi.
**V 25 Esimerkki 22 • · · | ·* Bacillus licheniformis SE2 delap6:n transformointi
Σ·ί : ekspressiovektorilla pBPXD-PRE-720X
··· V* pBPXD-PRE-720X-plasmidi (kuvio 10), joka on kuvattu esimerkissä 21, uutetaan isännästään, eristetään ja puh- i : 30 distetaan.
··· ·:··· Viljellään B. licheniformis SE2 delapö -kantaa esi- merkissä 16 kuvatulla tavalla. Sitten tämä kanta transfor- • · · * « t 1,1 moidaan tällä plasmidilla esimerkissä 16 kuvatulla proto- • · plastitekniikalla.
• · · • · · ··· • · 51
Transformoitu kanta [B. licheniformis SE2 delapö (pBPXD-PRE-720X)] selegoidaan Petri-maljalta, joka sisältää LB-agaralustaa, 0,8 g/1 AZCL-ksylaania ja 25 pg/ml kanamysiiniä. Kanta eristetäänja puhdistetaan seulomalla 5 esimerkissä 16 kuvatulla tekniikalla.
Esimerkki 23
Ksylanaasin tuottaminen B. licheniformis SE2 delapö (pBPXD-PRE-720X):n avulla
Suoritetaan samanlainen koe kuin esimerkissä 17, 10 mutta B. licheniformis SE2 delap6 -kannalla, joka on transformoitu pBPXD-PRE-720X-plasmidilla, jota on valmistettu esimerkin 22 mukaisesti.
Mitataan esimerkissä 2 kuvatulla tekniikalla saadun supernatantin entsymaattinen aktiivisuus ja huomataan ksy-15 lanaasiaktiivisuuden läsnäolo.
Esimerkki 24 B. licheniformis SE2 delapö (pBPXD-PRE-720X):n tuottaman ksylanaasin valmistus ja eristäminen p(BPXD-PRE-720X:n transformoiman B. licheniformis 20 SE2 delapö:n, joita on valmistettu esimerkin 22 mukaisesti, tuottama ksylanaasi eristetään ja puhdistetaan. Tätä :V: kantaa viljellään käyttäen esimerkissä 23 kuvattua proto- ·1 2 3·.. kollaa.
j Saatu ksylanaasi eristetään ja puhdistetaan EP-ha- • · · · 25 kemusjulkaisun nro 0 634 490 esimerkissä 3 kuvatun proto- • · '· kollan mukaisesti, joka liitetään viitteenä tähän hakemuk- 2
• · · r sJ
• · » • · · · _ 3 seen1 • · · • ’ Esimerkki 25 B. licheniformis SE2 delapö (pBPXD-PRE-720X):n • · *...1 30 tuottaman ksylanaasin aminohapposekvenssi ***" B. licheniformis SE2 delapö (pBPXD-PRE-720X) -kan- nan tuottaman ksylanaasin ensimmäisten 50 aminohapon • ·
.···, sekvenssi on määritetty käyttämällä sekvenaattoria (HP
• · G1000A, HEWLETT-PACKARD) ja seuraamalla tämän laitteen ’♦J·1 35 käyttöohjetta.
• · 52 Käytetään eristettyä ja puhdistettua ksylanaasia, kuten se esimerkissä 24 on kuvattu.
Todetaan, että saatu sekvenssi on identtinen esimerkissä 4 kuvatun ksylanaasin sekvenssin kanssa, jota 5 Bacillus sp. 720/1 -kanta on tuottanut.
Esimerkki 26 B. licheniformis SE2 delap6 (pBPXD-PRE-720X) -kannan tuottaman ksylanaasin molekyylipainon määritys B. licheniformis SE2 delapö (pBPXD-PRE-720X) -kan-10 nan tuottaman ksylanaasin molekyylipaino määritetään esimerkissä 7 kuvatun tekniikan mukaisesti ja käyttämällä eristettyä ja puhdistettua ksylanaasia sellaisena kuin se esimerkissä 24 kuvattiin.
Coomassie Bluella suoritettu värjäys tuottaa nä-15 kyviin polypeptidiketjun, jonka molekyylipaino on 25 - 26 kD, mikä on sama kuin Bacillus sp. 720/1 -kannan tuottaman ksylanaasin molekyylipaino.
♦ · • ♦ · • · · • · ·· • ♦ • ·· • · • · · ♦ · · ··· · ♦ · · • · · • · • · « · • · · • > I ··· · • · · ♦ · · • · · ··· • · • · ··· • · • · • · · • · · • · ··« • · • · ··· • · 53
Sekvenssilleta (1) INFORMATIONS GENERALES : (i) DEPOSANT : (A) NOM : SOLVAY (Soci6t<§ Anonyme) (B) RUE : rue du Prince Albert, 33 (C) VILLE : Bruxelles (E) PAYS : Belgique (F) CODE POSTAL : 1050 (G) TELEPHONE : (02) 509.61.11 (ii) TITRE DE L'INVENTION : xylanase, microorganismes la produisant, moldcules d'ADN, procddds de preparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 29 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR : (A) TYPE DE SUPPORT : Floppy disk (B) ORDINATEUR : IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS:MS-DOS
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 663 paires de bases (B) TYPE : acide nucldique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linöaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN g<§nomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:l: CAAATCGTCA CCGACAATTC CATTGGCAAC CACGATGGCT ATGATTATGA ATTTTGGAAA 60 54 GATAGCGGTG GCTCTGGGAC AATGATTCTC AATCATGGCG GTACGTTCAG TGCCCAATGG 120 AACAATGTTA ACAACATATT ATTCCGTAAA GGTAAAAAAT TCAATGAAAC ACAAACACAC 180 CAACAAGTTG GTAACATGTC CATAAACTAC GGAGCCAACT TCCAACCAAA TGGTAATGCG 240 TATTTATGCG TCTATGGTTG GACTGTTGAC CCTCTTGTCG AATATTATAT TGTCGACAGT 300 TGGGGCAACT GGCGTCCACC AGGAGCAACG CCTAAGGGGA CCATCACTGT TGATGGAGGA 360 ACATATGATA TCTACGAGAC TCTTAGAGTC AATCAACCCT CCATTAAGGG GATTGCCACA 420 TTTAAAGAAT ATTGGAGTGT TCGAAGATCG AAACGCACGA GTGGCACGAT TTCTGTCAGC 480 AACCACTTTA GAGCGTGGGA AAACTTAGGG ATGAATATGG GGAAAATGTA TGAAGTCGCG 540 CTTACTGTAG AAGGCTATCA AAGTAGCGGA AGTGCTAATG TATATAGCAA TACACTAAGA 600 ATTAACGGTA ACCCTCTCTC AACTATTAGT AATGACGAGA GCATAACTTT GGATAAAAAC 660 AAT 663 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 663 paires de bases (B) TYPE : acide nucl^ique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lindaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN ggnomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:2: 55 CAA ATC GTC ACC GAC AAT TCC ATT GGC AAC CAC GAT GGC TAT GAT TAT 4 8
Gin Ile Val Thr Asp Asn Ser lie Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr 15 10 15 GAA TTT TGG AAA GAT AGC GGT GGC TCT GGG ACA ATG ATT CTC AAT CAT 96
Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met lie Leu Asn His 20 25 30 GGC GGT ACG TTC AGT GCC CAA TGG AAC AAT GTT AAC AAC ΑΤΑ TTA TTC 144
Gly Gly Thr Phe Ser Ala Gin Trp Asn Asn Val Asn Asn lie Leu Phe 35 40 45 CGT AAA GGT AAA AAA TTC AAT GAA ACA CAA ACA CAC CAA CAA GTT GGT 192
Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gin Thr His Gin Gin Val Gly 50 55 60 AAC ATG TCC ATA AAC TAC GGA GCC AAC TTC CAA CCA AAT GGT AAT GCG 240
Asn Met Ser He Asn Tyr Gly Ala Asn Phe Gin Pro Asn Gly Asn Ala 65 70 75 80 TAT TTA TGC GTC TAT GGT TGG ACT GTT GAC CCT CTT GTC GAA TAT TAT 288
Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr 85 90 95 ATT GTC GAC AGT TGG GGC AAC TGG CGT CCA CCA GGA GCA ACG CCT AAG 336
He Val Asp Ser Trp Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys 100 105 110 GGG ACC ATC ACT GTT GAT GGA GGA ACA TAT GAT ATC TAC GAG ACT CTT 3 84
Gly Thr He Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp He Tyr Glu Thr Leu 115 120 125 AGA GTC AAT CAA CCC TCC ATT AAG GGG ATT GCC ACA TTT AAA CAA TAT 432
Arg Val Asn Gin Pro Ser He Lys Gly He Ala Thr Phe Lys Gin Tyr 130 135 140 56 TGG AGT GTT CGA AGA TCG AAA CGC ACG AGT GGC ACG ATT TCT GTC AGC 4 80
Trp Ser Vai Arg Arg Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser 145 150 155 160 AAC CAC TTT AGA GCG TGG GAA AAC TTA GGG ATG AAT ATG GGG AAA ATG 52 8
Asn His Phe Arg Ala Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met 165 170 175 TAT GAA GTC GCG CTT ACT GTA GAA GGC TAT CAA AGT AGC GGA AGT GCT 576
Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala 180 185 190 AAT GTA TAT AGC AAT ACA CTA AGA ATT AAC GGT AAC CCT CTC TCA ACT 624
Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Arg lie Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr 195 200 205 ATT AGT AAT GAC GAG AGC ATA ACT TTG GAT AAA AAC AAT 663 lie Ser Asn Asp Glu Ser lie Thr Leu Asp Lys Asn Asn 210 215 220 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 221 acides amines (B) TYPE : acide äitiini (D) CONFIGURATION : liniaire (ii) TYPE DE MOLECULE : protgine (v) TYPE DE FRAGMENT : fragment interne (vi) ORIGINE : (A) ORGANISME : Bacillus (B) SOUCHE : 720/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:3: 57
Gin Ile Vai Thr Asp Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr 15 10 15
Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met Ile Leu Asn His 20 25 30
Gly Gly Thr Phe Ser Ala Gin Trp Asn Asn Vai Asn Asn Ile Leu Phe 35 40 45
Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gin Thr His Gin Gin Vai Gly 50 55 60
Asn Met Ser Ile Asn Tyr Gly Ala Asn Phe Gin Pro Asn Gly Asn Ala 65 70 75 80
Tyr Leu Cys Vai Tyr Gly Trp Thr Vai Asp Pro Leu Vai Glu Tyr Tyr 85 90 95
Ile Vai Asp Ser Trp Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys 100 105 110
Gly Thr Ile Thr Vai Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Leu 115 120 125
Arg Vai Asn Gin Pro Ser Ile Lys Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gin Tyr 130 135 140
Trp Ser Vai Arg Arg Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Vai Ser 145 150 155 160
Asn His Phe Arg Ala Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met 165 170 175
Tyr Glu Vai Ala Leu Thr Vai Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala 180 185 190 58
Asn Vai Tyr Ser Asn Thr Leu Arg lie Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr 195 200 205 lie Ser Asn Asp Glu Ser lie Thr Leu Asp Lys Asn Asn 210 215 220 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 744 paires de bases (B) TYPE : acide nuclöique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin<§aire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN gdnomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:4: ATGAGACAAA AGAAATTGAC GTTGATTTTA GCCTTTTTAG TTTGTTTTGC ACTAACCTTA 60 CCTGCAGAAA TAATTCAGGC ACAAATCGTC ACCGACAATT CCATTGGCAA CCACGATGGC 120 TATGATTATG AATTTTGGAA AGATAGCGGT GGCTCTGGGA CAATGATTCT CAATCATGGC 180 GGTACGTTCA GTGCCCAATG GAACAATGTT AACAACATAT TATTCCGTAA AGGTAAAAAA 240 TTCAATGAAA CACAAACACA CCAACAAGTT GGTAACATGT CCATAAACTA CGGAGCCAAC 300 TTCCAACCAA ATGGTAATGC GTATTTATGC GTCTATGGTT GGACTGTTGA CCCTCTTGTC 360 GAATATTATA TTGTCGACAG TTGGGGCAAC TGGCGTCCAC CAGGAGCAAC GCCTAAGGGG 420 ACCATCACTG TTGATGGAGG AACATATGAT ATCTACGAGA CTCTTAGAGT CAATCAACCC 480 TCCATTAAGG GGATTGCCAC ATTTAAACAA TATTGGAGTG TTCGAAGATC GAAACGCACG 540 59 AGTGGCACGA TTTCTGTCAG CAACGACTTT AGAGCGTGGG AAAACTTAGG GATGAATATG 600 GGGAAAATGT ATGAAGTCGC GCTTACTGTA GAAGGCTATC AkAGTAGCGG AAGTGCTAAT 660 GTATATAGCA ATACACTAAG AATTAACGGT AACCCTCTCT CAACTATTAG TAATGACGAG 720 AGCATAACTT TGGATAAAÄA GAAT 744 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 744 paires de bases (B) TYPE : acide nuclSique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lindaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN ggnomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:5: ATG AGA CAA AAG AAA TTG ACG TTG ATT TTA GCC TTT TTA GTT TGT TTT 48
Met Arg Gin Lys Lys Leu Thr Leu lie Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe -25 -20 -15 GCA CTA ACC TTA CCT GCA GAA ATA ATT CAG GCA CAA ATC GTC ACC GAC 96
Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu lie lie Gin Ala Gin lie Val Thr Asp -10 -5 -11 5 AAT TCC ATT GGC AAC CAC GAT GGC TAT GAT TAT GAA TTT TGG AAA GAT 144
Asn Ser lie Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Phe Trp Lys Asp 10 15 20 AGC GGT GGC TCT GGG ACA ATG ATT CTC AAT CAT GGC GGT ACG TTC AGT1 92
Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met lie Leu Asn His Gly Gly Thr Phe Ser 25 30 35 60 GCC CAA TGG AAC AAT GTT AAC AAC ΑΤΑ TTA TTC CGT AAA GGT AAA AAA 240
Ala Gin Trp Asn Asn Val Asn Asn lie Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys 40 45 50 TTC AAT GAA ACA CAA ACA CAC CAA CAA GTT GGT AAC ATG TCC ATA AAC 288
Phe Asn Glu Thr Gin Thr His Gin Gin Val Gly Asn Met Ser He Asn 55 60 65 TAC GGA GCC AAC TTC CAA CCA AAT GGT AAT GCG TAT TTA TGC GTC TAT 336
Tyr Gly Ala Asn Phe Gin Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Cys Val Tyr 70 75 80 85 GGT TGG ACT GTT GAC CCT CTT GTC GAA TAT TAT ATT GTC GAC AGT TGG 384
Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Vai Glu Tyr Tyr He Val Asp Ser Trp 90 95 100 GGC AAC TGG CGT CCA CCA GGA GCA ACG CCT AAG GGG ACC ATC ACT GTT 432
Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys Gly Thr He Thr Val 105 110 115 GAT GGA GGA ACA TAT GAT ATC TAC GAG ACT CTT AGA GTC AAT CAA CCC 4 80
Asp Gly Gly Thr Tyr Asp He Tyr Glu Thr Leu Arg Val Asn Gin Pro 120 125 130 TCC ATT AAG GGG ATT GCC ACA TTT AAA CAA TAT TGG AGT GTT CGA AGA 528
Ser He Lys Gly He Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Val Arg Arg 135 140 145 TCG AAA CGC ACG AGT GGC ACG ATT TCT GTC AGC AAC CAC TTT AGA GCG 576
Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr He Ser Val Ser Asn His Phe Arg Ala 150 155 160 165 TGG GAA AAC TTA GGG ATG AAT ATG GGG AAA ATG TAT GAA GTC GCG CTT 624
Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met Tyr Glu Val Ala Leu 170 175 180 61 ACT GTA GAA GGC TAT CAA AGT AGC GGA AGT GCT AAT GTA TAT AGC AAT 672
Thr Vai Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn - 185 190 195 ACA CTA AGA ATT AAC GGT AAC CCT CTC TCA ACT ATT AGT AAT GAC GAG 72 0
Thr Leu Arg lie Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr lie Ser Asn Asp Glu 200 205 210 AGC ATA ACT TTG GAT AAA AAC AAT 744
Ser lie Thr Leu Asp Lys Asn Asn 215 220 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 248 acides amines (B) TYPE : acide axnin6 (D) CONFIGURATION : lin6aire (ii) TYPE DE MOLECULE : protöine (v) TYPE DE FRAGMENT : fragment interne (vi) ORIGINE : (A) ORGANISME : Bacillus (B) SOUCHE : 720/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:6:
Met Arg Gin Lys Lys Leu Thr Leu lie Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe -25 -20 -15
Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu lie lie Gin Ala Gin He Val Thr Asp -10 -5 -11 5 62
Asn Ser Ile Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Phe Trp Lys Asp 10 15 20
Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met He Leu Asn His Gly Gly Thr Phe Ser 25 30 35
Ala Gin Trp Asn Asn Vai Asn Asn He Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys 40 45 50
Phe Asn Glu Thr Gin Thr His Gin Gin Val Gly Asn Met Ser He Asn 55 60 65
Tyr Gly Ala Asn Phe Gin Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Cys Val Tyr 70 75 80 85
Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr He Val Asp Ser Trp 90 95 100
Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys Gly Thr He Thr Val 105 110 115
Asp Gly Gly Thr Tyr Asp He Tyr Glu Thr Leu Arg Val Asn Gin Pro 120 125 130
Ser He Lys Gly He Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Val Arg Arg 135 140 145
Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr He Ser Val Ser Asn His Phe Arg Ala 150 155 160 165
Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met Tyr Glu Val Ala Leu 170 175 180
Thr Val Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn 185 190 195 63
Thr Leu Arg lie Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr lie Ser Asn Asp Glu 200 205 210
Ser lie Thr Leu Asp Lys Asn Asn 215 220 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 81 paires de bases (B) TYPE : acide nucl£ique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin#aire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN g<§nomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:7: ATGAGACAAA AGAAATTGAC GTTGATTTTA GCCTTTTTAG TTTGTTTTGC ACTAACCTTA 60 CCTGCAGAAA TAATTCAGGC A 81 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 81 paires de bases (B) TYPE : acide nucl#ique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin^aire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN gSnomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:8: 64 ATG AGA CAA AAG AAA TTG ACG TTG ATT TTA GCC TTT TTA GTT TGT TTT 4 8
Met Arg Gin Lys Lys Leu Thr Leu lie Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe 15 10 15 GCA CTA ACC TTA CCT GCA GAA ATA ATT CAG GCA 81
Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu lie lie Gin Ala 20 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:9: (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 27 acides aminds (B) TYPE : acide aminö (D) CONFIGURATION : lin<§aire (ii) TYPE DE MOLECULE : peptide (v) TYPE DE FRAGMENT : fragment interne (vi) ORIGINE : (A) ORGANISMS : Bacillus (B) SOUCHE : 720/1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:9:
Met Arg Gin Lys Lys Leu Thr Leu lie Leu Ala Phe Leu Val Cys Phe 15 10 15
Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu lie lie Gin Ala 20 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO :10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 1513 paires de bases (B) TYPE : acide nucl^ique 65 (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin^aire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN ggnomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:10: AAATTGAATT GTGTATATCT AATGATAACG ACAAATCGTC ACTGTTTTTA AACTAATCTC 60 AAACCAATAC TTCTTTATTT AACGCTAACC ACTTGCAATC TTATCACAAG AACATTCTTT 120 ATAGGAACTT TCCCATTTGC AAGACGATAA AAAATCTTTT TCCCCTATTT TATCTTATCG 1Θ0 CCTTGATCGG TTTAATTTGT AAACTTTATT TTAGTTTACG TGATGTTCCC TCATTCATAC 240 CATTAATCAC AGTTAACGCT AGAGTCATCT TTTTTCGGTT CTCAAAAATA CCTGAAGAAC 300 ATTTATGTCA TATTTTCTCA CGCCGCTCCA TAATGGAATA TATATACTCT TTTATACATA 360 TTAAGTAAAT TAGTATATAC TTGCGTTATC AAAATGTGAG ATAATCTAAT TGATCAAACA 420 AGCAGCTATC CAAAAAACAC TGATGTTGAC CTCTTAAAGA AGTGTCACTA TCTATGAAAA 480 GATAATTATC CAGTTTCAAA ATTTGAAATA GTGTGTATGG AATAGTTTGA ATGTCAACTG 540 CTGTGAAAGG AGGGTAGGTA GTACCGTAGA CTTCATTACC AAAAATTAGT TGTAAAAAAA 600 TTAAAAGGAG GAATGCCTAA TGAGACAAAA GAAATTGACG TTGATTTTAG CCTTTTTAGT 660 TTGTTTTGCA CTAACCTTAC CTGCAGAAAT AATTCAGGCA CAAATCGTCA CCGACAATTC 720 CATTGGCAAC CACGATGGCT ATGATTATGA ATTTTGGAAA GATAGCGGTG GCTCTGGGAC 780 AATGATTCTC AATCATGGCG GTACGTTCAG TGCCCAATGG AACAATGTTA ACAACATATT 840 ATTCCGTAAA GGTAAAAAAT TCAATGAAAC ACAAACACAC CAACAAGTTG GTAACATGTC 900 66 CATAAACTAC GGAGCCAACT TCCAACCAAA TGGTAATGCG TATTTATGCG TCTATGGTTG 960 GACTGTTGAC CCTCTTGTCG AATATTATAT TGTCGACAGT TGGGGCAACT GGCGTCCACC 1020 AGGAGCAACG CCTAAGGGGA CCATCACTGT TGATGGAGGA ACATATGATA TCTACGAGAC 1080 TCTTAGAGTC AATCAACCCT CCATTAAGGG GATTGCCACA TTTAAACAAT ATTGGAGTGT 1140 TCGAAGATCG AAACGCACGA GTGGCACGAT TTCTGTCAGC AACCACTTTA GAGCGTGGGA 1200 AAACTTAGGG ATGAATATGG GGAAAATGTA TGAAGTCGCG CTTACTGTAG AAGGCTATCA 1260 AAGTAGCGGA AGTGCTAATG TATATAGCAA TACACTAAGA ATTAACGGTA ACCCTCTCTC 1320 AACTATTAGT AATGACGAGA GCATAACTTT GGATAAAAAC ΑΑΊΤΑΑΑΑΑΤ CCTTATCTCT 1380 TTCGGTTCAG TTCTCATTAT TTTCAAATAA CCTCCCGGTT GGATCTTTTC CAACGGGAGG 1440 TTTTATTGGA AAGGTTAAGT ATAGTATACT CCGATTCCAT CCAGAGGAAT GCTTGAAACA 1500 CCTCCGTCAC TAG 1513 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO :11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 1513 paires de bases (B) TYPE : acide nuclöique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin^aire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN gdnomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:11: AAATTGAATT GTGTATATCT AATGATAACG ACAAATCGTC ACTGTTTTTA AACTAATCTC 60 67 AAACCAATAC TTCTTTATTT AACGCTAACC ACTTGCAATC TTATCACAAG AACATTCTTT 120 ATAGGAACTT TCCCATTTGC AAGACGATAA AAAATCTTTT TCCCCTATTT TATCTTATCG 180 CCTTGATCGG TTTAATTTGT AAACTTTATT TTAGTTTACG TGATGTTCCC T CATT CAT AC 240 CATTAATCAC AGTTAACGCT AGAGTCATCT TTTTTCGGTT CTCAAAAATA CCTGAAGAAC 300 ATTTATGTCA TATTTTCTCA CGCCGCTCCA TAATGGAATA TATATACTCT TTTATACATA 360 TTAAGTAAAT TAGTATATAC TTGCGTTATC AAAATGTGAG ATAATCTAAT TGATCAAACA 420 AGCAGCTATC CAAAAAACAC TGATGTTGAC CTCTTAAAGA AGTGTCACTA TCTATGAAAA 480 GATAATTATC CAGTTTCAAA ATTTGAAATA GTGTGTATGG AATAGTTTGA ATGTCAACTG 540 CTGTGAAAGG AGGGTAGGTA GTACCGTAGA CTTCATTACC AAAAATTAGT TGTAAAAAAA 600 TTAAAAGGAG GAATGCCTA ATG AGA CAA AAG AAA TTG ACG TTG ATT TTA GCC 652
Met Arg Gin Lys Lys Leu Thr Leu lie Leu Ala -25 -20 TTT TTA GTT TGT TTT GCA CTA ACC TTA CCT GCA GAA ATA ATT CAG GCA 700
Phe Leu Val Cys Phe Ala Leu Thr Leu Pro Ala Glu lie lie Gin Ala -15 -10 -5 -1 CAA ATC GTC ACC GAC AAT TCC ATT GGC AAC CAC GAT GGC TAT GAT TAT 748
Gin lie Val Thr Asp Asn Ser lie Gly Asn His Asp Gly Tyr Asp Tyr 15 10 15 GAA TTT TGG AAA GAT AGC GGT GGC TCT GGG ACA ATG ATT CTC AAT CAT 796
Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Thr Met lie Leu Asn His 20 25 30 68 GGC GGT ACG TTC AGT GCC CAA TGG AAC AAT GTT AAC AAC ΑΤΑ TTA TTC 844
Gly Gly Thr Phe Ser Ala Gin Trp Asn Asn Val Asn Asn lie Leu Phe 35 40 45 CGT AAA GGT AAA AAA TTC AAT GAA ACA CAA ACA CAC CAA CAA GTT GGT 892
Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gin Thr His Gin Gin Val Gly 50 55 60 AAC ATG TCC ATA AAC TAC GGA GCC AAC TTC CAA CCA AAT GGT AAT GCG 940
Asn Met Ser lie Asn Tyr Gly Ala Asn Phe Gin Pro Asn Gly Asn Ala 65 70 75 80 TAT TTA TGC GTC TAT GGT TGG ACT GTT GAC CCT CTT GTC GAA TAT TAT 988
Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr 85 90 95 ATT GTC GAC AGT TGG GGC AAC TGG CGT CCA CCA GGA GCA ACG CCT AAG 1036 lie Val Asp Ser Trp Gly Asn Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys 100 105 110 GGG ACC ATC ACT GTT GAT GGA GGA ACA TAT GAT ATC TAC GAG ACT CTT 1084
Gly Thr lie Thr Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp lie Tyr Glu Thr Leu 115 120 125 AGA GTC AAT CAA CCC TCC ATT AAG GGG ATT GCC ACA TTT AAA CAA TAT 1132
Arg Val Asn Gin Pro Ser lie Lys Gly lie Ala Thr Phe Lys Gin Tyr 130 135 140 TGG AGT GTT CGA AGA TCG AAA CGC ACG AGT GGC ACG ATT TCT GTC AGC 1180
Trp Ser Val Arg Arg Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr lie Ser Val Ser 145 150 155 160 AAC CAC TTT AGA GCG TGG GAA AAC TTA GGG ATG AAT ATG GGG AAA ATG 1228
Asn His Phe Arg Ala Trp Glu Asn Leu Gly Met Asn Met Gly Lys Met 165 170 175 69 TAT GAA GTC GCG CTT ACT GTA GAA GGC TAT CAA AGT AGC GGA AGT GCT 1276
Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala 180 185 190 AAT GTA TAT AGC AAT ACA CTA AGA ATT AAC GGT AAC CCT CTC TCA ACT 1324
Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Arg lie Asn Gly Asn Pro Leu Ser Thr 195 200 205 ATT AGT AAT GAC GAG AGC ATA ACT TTG GAT AAA AAC AAT TAAAAATCCT 1373 lie Ser Asn Asp Glu Ser lie Thr Leu Asp Lys Asn Asn 210 215 220 TATCTCTTTC GGTTCAGTTC TCATTATTTT CAAATAACCT CCCGGTTGGA TCTTTTCCAA 1433 CGGGAGGTTT TATTGGAAAG GTTAAGTATA GTATACTCCG ATTCCATCCA GAGGAATGCT 1493 TGAAACACCT CCGTCACTAG 1513 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 619 paires de bases (B) TYPE : acide nucl€ique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin6aire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN gönomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO :12: AAATTGAATT GTGTATATCT AATGATAACG ACAAATCGTC ACTGTTTTTA AACTAATCTC 60 AAACCAATAC TTCTTTATTT AACGCTAACC ACTTGCAATC TTATCACAAG AACATTCTTT 120 ATAGGAACTT TCCCATTTGC AAGACGATAA AAAATCTTTT TCCCCTATTT TATCTTATCG 180 70 CCTTGATCGG TTTAATTTGT AAACTTTATT TTAGTTTACG TGATGTTCCC TCATTCATAC 240 CATTAATCAC AGTTAACGCT AGAGTCATCT TTTTTCGGTT CTCAAAAATA CCTGAAGAAC 300 ATTTATGTCA TATTTTCTCA CGCCGCTCCA TAATGGAATA TATATACTCT TTTATACATA 360 TTAAGTAAAT TAGTATATAC TTGCGTTATC AAAATGTGAG ATAATCTAAT TGATCAAACA 420 AGCAGCTATC CAAAAAACAC TGATGTTGAC CTCTTAAAGA AGTGTCACTA TCTATGAAAA 480 GATAATTATC CAGTTTCÄAA ATTTGAAATA GTGTGTATGG AATAGTTTGA ATGTCAACTG 540 CTGTGAAAGG AGGGTAGGTA GTACCGTAGA CTTCATTACC AAAAATTAGT TGTAAAAAAA 600 TTAAAAGGAG GAATGCCTA 619 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO :13: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 150 paires de bases (B) TYPE : acide nucl^ique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : liniaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN g£nomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:13: TAAAAATCCT TATCTCTTTC GGTTCAGTTC TCATTATTTT CAAATAACCT CCCGGTTGGA 60 TCTTTTCCAA CGGGAGGTTT TATTGGAAAG GTTAAGTATA GTATACTCCG ATTCCATCCA 120 GAGGAATGCT TGAAACACCT CCGTCACTAG 150 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:14: 71 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 56 paires de bases (B) TYPE : acide nucieique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lindaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucldique (oligonucleotide synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0:14: CCCCCCTACG TAGCGGCCGC CCCGGCCGGT AACCTAGGAA GTCAGCGCCC TGCACC 56 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 56 paires de bases (B) TYPE : acide nucldique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : liniaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nuclöique (oligonucleotide synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:15: CCCCCCTACG TAGGCCGGGG CGGCCGCGGT TACCTAGGGC CTCGTGATAC GCCTAT 56 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 31 paires de bases (B) TYPE : acide nuclSique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lindaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucieique (oligonucleotide 72 synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:16: ACGAGGAAAG ATGCTGTTCT TGTAAATGAG T 31 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 19 paires de bases (B) TYPE : acide nucieique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linöaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucieique (oligonucleotide synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:17: TACCTTGTCT ACAAACCCC 19 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 18 paires de bases (B) TYPE : acide nucieique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin#aire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucieique (oligonucleotide synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:18: CGGTCGCCGC ATACACTA 18 73 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 36 paires de bases (B) TYPE : acide nucieique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin<§aire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucieique (oligonucleotide synthötique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:19: CCCCCCCCCG GTAACCTGCA TTAATGAATC GGCCAA 36 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 39 paires de bases (B) TYPE : acide nucldique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin£aire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucl£ique (oligonucleotide synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:20: CCCCCCCCCG GTTACCGTAT TTATTAACTT CTCCTAGTA 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO :21: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 50 paires de bases (B) TYPE : acide nuclöique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucieique (oligonucleotide 74 (D) CONFIGURATION : lingaire synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:21: CCCCCCTCTA GATTAATTAA CCAAGCTTGG GATCCGTCGA CCTGCAGATC 50 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 39 paires de bases (B) TYPE : acide nucieique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lingaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucieique (oligonucleotide synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:22: CCCCCCTGAA ATCAGCTGGA CTAAAAGGGA TGCAATTTC 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 30 paires de bases (B) TYPE : acide nucieique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucieique (oligonucleotide synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO :23: 75 CCCCCCGTCG ACCGCATGCG CCGGCACAGC 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 39 paires de bases (B) TYPE : acide nucldique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : liniaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucldique (oligonucleotide synthdtique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO :24: CCCCCCGCAT GCGCAAATCG TCACCGACAA TTCCATTGG 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO :25: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 19 paires de bases (B) TYPE : acide nucieique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : linearre (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucieique (oligonucleotide synthetique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:25: TACCTTGTCT ACAAACCCC 19 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:26: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : 76 (A) LONGUEUR : 185 paires de bases (B) TYPE : acide nucldique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION .- lindaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN gdnomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:26: TCATGTAACT CGCCTTGATC TATTTCATTT GTATCAAAGG ATTTATACAC AAACAAGAGA 60 CATCCATGCC GGGTTAAAGC AGTATCGTTC CATCTAACAG AGAAGGNCTG CATGAAAGGA 120 GGTGATGGGT TTTTCATCTT AGGGATGACA GAACAATACG GATGAAAAAA GGAGAGGGAT 180
GGAAA
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:27: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 81 paires de bases (B) TYPE : acide nuclSique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lindaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN gdnomique (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:27: ATGAATTTGA AAAGATTGAG GCTGTTGTTT GTGATGTGTA TTGGATTTGT GCTGACACTG 60 ACGGCTGTGC CGGCTCATGC G 81 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:28: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 81 paires de bases (B) TYPE : acide nuclSique (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lindaire (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN ggnomique 77 .(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:28: ATG AAT TTG AAA AGA TTG AGG CTG TTG TTT GTG ATG TGT ATT GGA TTT 48
Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys lie Gly Phe 1 5 10 15 GTG CTG ACA CTG ACG GCT GTG CCG GCT CAT GCG 81
Val Leu Thr Leu Thr Ala Val Pro Ala His Ala 20 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ. ID NO :29: (1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 27 acides amines (B) TYPE : acide aminö (C) NOMBRE DE BRINS : simple (D) CONFIGURATION : lin<§aire (ii) TYPE DE MOLECULE : peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:29:
Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys lie Gly Phe 1 5 10 15
Val Leu Thr Leu Thr Ala Val Pro Ala His Ala 20 25

Claims (24)

1. Eristetty ja puhdistettu ksylanaasi, tunnettu siitä, että se sisältää aminohapot 1 - 221 5 aminohapposekvenssistä SEQ ID NO:3.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ksylanaasi, tunnettu siitä, että se on prekursori, joka sisältää 248 aminohappoa sekvenssistä SEQ ID NO:6.
3. Eristetty ja puhdistettu Bacillus sp. 720/1 10 (LMG P-14798) -viljelmä.
4. DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää nukleotidisekvenssin SEQ ID NO:l, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 mukaista valmista Bacillus sp. 720/1 (LMG P-14798):n ksylanaasia.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää nukleotidisekvenssin SEQ ID NO:4, joka koodaa Bacillus sp. 720/1 (LMG P-14798) :n ksylanaasin prekursoria.
6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen DNA- 20 molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää Bacillus sp. 720/1 (LMG P-14798):n ksylanaasin koko geenin SEQ ID NO:10.
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää promoottorin SEQ ID
25 NO:26, joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pu-milus PRL B12 ATCC 55443:n ksylanaasia
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää presekvenssin SEQ ID NO:27, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12 ATCC 55443:n 30 ksylanaasin signaalipeptidiä.
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää promoottorin SEQ ID NO:26, joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12 ATCC 55443:n ksylanaasia, 35 presekvenssin SEQ ID NO:27, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12 ATCC 55443:n ksylanaasin signaalipeptidiä ja nukleotidisekvenssin SEQ ID NO:l, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista Bacillus sp. 720/1 (LMG P-14798):n ksylanaasia.
10. Ekspressiovektori tai kromosominen integraatio-5 vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 4, 5, 6 tai 9 mukaisen DNA-molekyylin.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se on pUBRD-720Xll, jonka kartta on esitetty kuviossa 6.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen ekspressiovek tori, tunnettu siitä, että se on pBPXD-PRE-720X, jonka kartta on esitetty kuviossa 10.
13. Transformoitu kanta, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 4, 5, 6 tai 9 mukaisen
14. Transformoitu kanta, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 10, 11 tai 12 mukaisen ekspressiovektorin tai kromosomisen integraatiovektorin.
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen trans- 20 formoitu kanta, tunnettu siitä, että se on Bacillus- kannasta.
15 DNA-molekyylin.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen transformoitu kanta, tunnettu siitä, että se on Bacillus licheniformis- tai Bacillus pumilus -kanta.
17. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen ksylanaasin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää jonkin patenttivaatimuksen 13 - 16 mukaisen kannan viljelyn sopivassa ravintoalustassa, joka sisältää hiili- ja typpilähteet ja epäorgaanisia suoloja, aerobi-30 sissa olosuhteissa, ja näin saadun ksylanaasin talteenoton.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen ksylanaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää ksylanaasia koodaavan DNA-fragmentin eristämisen, tämän fragmentin 35 insertoimisen sopivaan vektoriin, tämän vektorin lisäämisen sopivaan isäntään tai tämän DNA-fragmentin lisäämisen sopi- van isännän kromosomiin, tämän isännän viljelemisen, ksylanaasin ekspressoinnin ja ksylanaasin talteenoton.
19. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen ksylanaasin käyttö paperimassan käsittelyssä.
20. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen ksylanaa sin käyttö eläinten rehussa.
21. Entsyymikoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista ksylanaasia ja ainakin yhtä lisäainetta.
22. Ekspressiosysteemi, joka on käyttökelpoinen polypeptidin tuottamiseen, tunnettu siitä, että se sisältää: promoottorisekvenssin SEQ ID NO:26, joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12 15 ATCC 55443:n ksylanaasia, - sekvenssin, joka koodaa signaalipeptidiä, ja nukleotidisekvenssin SEQ ID NO:l, joka koodaa Bacillus sp. 720/1 (LMG P-14798):n ksylanaasia.
23. Ekspressiosysteemi, joka on käyttökelpoinen po-20 lypeptidin tuottamiseen, tunnettu siitä, että se sisältää : - promoottorisekvenssin - presekvenssin SEQ ID NO:27, joka kooda Bacillus pumilus PRL B12 ATCC 55443:n ksylanaasin signaalipeptidiä, 25 ja - nukleotidisekvenssin SEQ ID NO:l, joka koodaa Bacillus sp. 720/1 (LMG P-14798):n ksylanaasia.
24. Ekspressiosysteemi, joka on käyttökelpoinen polypeptidin tuottamiseen, tunnettu siitä, että se 30 sisältää: promoottorisekvenssin SEQ ID NO:26, joka on peräisin geenistä, joka koodaa Bacillus pumilus PRL B12 ATCC 55443:n ksylanaasia - presekvenssin SEQ ID NO:27, joka koodaa Bacillus 35 pumilus PRL B12 ATCC 55443:n ksylanaasin signaalipeptidiä, - nukleotidisekvenssin SEQ ID NO:l, joka koodaa Bacillus sp. 720/1 (LMG P-14798) :n ksylanaasia, ja - terminaattorisekvenssin.
FI953578A 1994-07-26 1995-07-26 Ksylanaasi, sitä tuottava mikro-organismi, DNA-molekyyli, menetelmä ksylanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö FI121378B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9400706A BE1008570A3 (fr) 1994-07-26 1994-07-26 Xylanase, microorganismes la produisant, molecule d'adn, procedes de preparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci.
BE9400706 1994-07-26
BE9500448 1995-05-17
BE9500448A BE1008751A3 (fr) 1994-07-26 1995-05-17 Xylanase, microorganismes la produisant, molecules d'adn, procedes de preparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI953578A0 FI953578A0 (fi) 1995-07-26
FI953578A FI953578A (fi) 1996-01-27
FI121378B true FI121378B (fi) 2010-10-29

Family

ID=25662903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI953578A FI121378B (fi) 1994-07-26 1995-07-26 Ksylanaasi, sitä tuottava mikro-organismi, DNA-molekyyli, menetelmä ksylanaasin valmistamiseksi ja sen käyttö

Country Status (12)

Country Link
US (4) US6346407B1 (fi)
EP (1) EP0698667B1 (fi)
JP (1) JPH0892284A (fi)
AT (1) ATE269408T1 (fi)
AU (1) AU711105B2 (fi)
BE (1) BE1008751A3 (fi)
BR (1) BR9503454A (fi)
CA (1) CA2154628C (fi)
DE (1) DE69533152T2 (fi)
DK (1) DK0698667T3 (fi)
FI (1) FI121378B (fi)
NZ (1) NZ272637A (fi)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5770424A (en) * 1994-11-30 1998-06-23 Novonordisk A/S DNA constructs and methods of producing xylanolytic enzymes
US20050079573A1 (en) * 1998-12-23 2005-04-14 Danisco A/S Proteins
GB2392159B (en) * 1998-12-23 2004-04-28 Danisco Endo-ß-1, 4, xylanase and uses thereof
CN1206352C (zh) * 1998-12-23 2005-06-15 丹尼斯科有限公司 木聚糖酶在制备食品中的用途
US7504120B2 (en) 2002-06-14 2009-03-17 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
BRPI0314435B1 (pt) * 2002-09-11 2016-07-19 Puratos Nv composição de melhoramento de pão, método para preparar um produto de padaria, método para aumentar o volume da carcaça de um produto de padaria e produto de padaria
ES2401795T3 (es) * 2003-07-02 2013-04-24 Syngenta Participations Ag Glucanasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para eleborarlas y utilizarlas
EP1668113B1 (en) 2003-08-11 2013-06-19 Verenium Corporation Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP3406621A1 (en) 2006-02-14 2018-11-28 BP Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
KR100784168B1 (ko) 2006-08-02 2007-12-10 건국대학교 산학협력단 열안정성이 증대된 신규 자일란 분해효소
CN106222185B (zh) 2006-08-04 2021-12-03 维莱尼姆公司 葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
EP2218773A1 (en) 2009-02-17 2010-08-18 Deinove Compositions and methods for degrading lignocellulosic biomass
KR101594995B1 (ko) * 2012-12-26 2016-02-25 대한민국 흰코뿔소 유래 바실러스 푸밀러스 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제
US8759041B1 (en) * 2013-02-12 2014-06-24 Novozymes Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1151363A (en) 1979-04-17 1983-08-09 Henri Lemoyne Process for the delignification of unbleached chemical pulp
US4462884A (en) 1983-07-25 1984-07-31 Ppg Industries, Inc. Low reflectance, low emissivity sputtered film
US5352603A (en) 1989-08-31 1994-10-04 Kali-Chemie Ag Highly alkaline proteases
EP0507723A1 (en) 1991-04-02 1992-10-07 Novo Nordisk A/S Xylanase, corresponding recombinant DNA sequence, xylanase containing agent, and use of the agent
EP0825254B1 (en) * 1992-07-02 2001-10-04 Novozymes A/S Alkalophilic Bacillus sp. AC13 and xylanase obtainable therefrom
DE4226528A1 (de) * 1992-08-11 1994-02-17 Roehm Gmbh Batterien-Xylanase, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie dafür geeigneter Bakterienstamm, Plasmid mit zugehörigem Strukturgen, sowie Backmittel und Backverfahren zur Herstellung von Brot und Backwaren unter Verwendung der Xylanase
DK105592D0 (da) * 1992-08-26 1992-08-26 Novo Nordisk As Nyt enzym
GB2279955B (en) * 1993-07-15 1998-02-18 Solvay Xylanase derived from a Bacillus species, expression vectors for such xylanase and other proteins, host organisms therefor and use thereof
CA2156048C (en) * 1993-12-24 2010-11-16 Pieter Van Solingen Alkali-tolerant xylanases
US5770424A (en) * 1994-11-30 1998-06-23 Novonordisk A/S DNA constructs and methods of producing xylanolytic enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
US7022827B2 (en) 2006-04-04
FI953578A0 (fi) 1995-07-26
US8148104B2 (en) 2012-04-03
AU711105B2 (en) 1999-10-07
NZ272637A (en) 1998-04-27
JPH0892284A (ja) 1996-04-09
BR9503454A (pt) 1996-03-05
US7638613B2 (en) 2009-12-29
US20020115181A1 (en) 2002-08-22
EP0698667B1 (fr) 2004-06-16
DE69533152T2 (de) 2005-08-25
US20060020122A1 (en) 2006-01-26
US6346407B1 (en) 2002-02-12
BE1008751A3 (fr) 1996-07-02
DE69533152D1 (de) 2004-07-22
CA2154628A1 (fr) 1996-01-27
ATE269408T1 (de) 2004-07-15
CA2154628C (fr) 2009-01-06
US20090041896A1 (en) 2009-02-12
FI953578A (fi) 1996-01-27
AU2508695A (en) 1996-02-08
EP0698667A1 (fr) 1996-02-28
DK0698667T3 (da) 2004-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7638613B2 (en) Xylanase, microorganisms producing it, DNA molecules, methods for preparing this xylanase and uses of the latter
US6423523B1 (en) Xylanase derived from a bacillus species, expression vectors for such xylanase and other proteins, host organisms therefor and use thereof
CN103261409B (zh) 甘露聚糖酶、其编码基因及其生产
JPH08224081A (ja) 耐熱性キシラナーゼ
JPH0387187A (ja) 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
JPH08507695A (ja) Ｅｇ ▲ｉｉｉ▼セルラーゼの精製及び分子クローニング
US5434071A (en) α-L-arabinofuranosidase and xylanase from Bacillus stearothermophilus NCIMB 40221, NCIMB 40222 or mutant thereof for delignification
WO1994004664A1 (en) New xylanases having high activity and stability at alkaline conditions and high temperatures
CA2203905C (en) Bacterial protein with xylanase activity
US5922586A (en) DNA constructs and methods of producing cellulytic enzymes
JP3769655B2 (ja) 耐熱性キシラナーゼ
BE1008570A3 (fr) Xylanase, microorganismes la produisant, molecule d&#39;adn, procedes de preparation de cette xylanase et utilisations de celle-ci.
US5677161A (en) Preparation exhibiting enzymatic activity, a method of producing the same, and applications thereof
US5945327A (en) DNA constructs and methods of producing cellulytic enzymes
JP2627587B2 (ja) 組換えｄｎａ、組換えベクター、細胞及びｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法
JP3880318B2 (ja) 耐熱性キシラナーゼ
JP3475930B2 (ja) 耐熱性キシラナーゼを有効成分として含む漂白剤
BRPI0705573A2 (pt) linhagem recombinante geneticamente modificada penicillium griseoroseum t20 com maior produção de pectina liase e poligalacturonase, cassetes de expressão para a construção da linhagem recombinante, preparação enzimática e processo para a produção da preparação enzimática
JP2002095470A (ja) 耐熱性キシラナーゼ
JPS59175882A (ja) 好熱性アミラ−ゼの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: GENENCOR INTERNATIONAL, INC.

FG Patent granted

Ref document number: 121378

Country of ref document: FI

MA Patent expired