FI120697B - Kohonneen termofiilisyyden ja alkalofiilisyyden sisältävät modifioidut ryhmä 11 -ksylanaasit - Google Patents

Description

>

Kohonneen termofiilisyyden ja alkalofiilisyyden sisältävät modifioidut ryhmä 11 -ksylanaasit - Modifierade grupp 11 -xylanaser uppvisande förhöjd termo-filicitet och alkalofilicitet 5 Esillä oleva keksintö koskee modifioituja ksylanaaseja. Erikoisemmin keksintö koskee modifioituja ksylanaaseja, joiden suorituskyky on parantunut korkeassa lämpötilassa ja pH:ssa.

Keksinnön tausta

Ksylanaasit ovat ryhmä entsyymejä, joilla on laajaa kaupallista käyttöä. Ksylanaasi-10 en pääasiallinen sovellus on sellun biovalkaisu paperin tuotossa. Lisäksi ksylanaaseja on käytetty kirkastusaineina mehuissa ja viineissä, entsymaattisina aineina tark-kuuslaitteiden ja puolijohteiden puhdistuksessa (esim. US-patentti nro 5 078 802) ja niitä käytetään myös siipikarjan ja sian rehun sulamisen parantamiseksi.

Valmistettaessa sellua paperin tuottoa varten kuitumateriaali altistetaan korkeille 15 lämpötiloille ja paineille kemikaalien läsnä ollessa. Tämä käsittely muuttaa kuidut selluksi ja se tunnetaan nimellä kuidutus. Kuidutuksen jälkeen sellu valkaistaan. Ksylanaasientsyymejä käytetään sellun valkaisun tehostamiseksi. Ksylanaasikäsitte-ly sallii sen, että seuraavaksi käytettävät valkaisukemikaalit, kuten kloori, klooridi- ··· oksidi, vetyperoksidi tai näiden kemikaalien yhdistelmät, valkaisevat sellua tehok- : 20 kaammin. Sellun esikäsittely ksylanaasilla parantaa lopullisen paperituotteen val- ·:··: koisuutta ja laatua ja vähentää sitä kloorikemikaalien määrää, jota käytetään sellun :*·.· valkaisuun. Tämä puolestaan alentaa sellaisissa prosesseissa tuotetun kloorijäte- • · .·. : veden määrää.

• · · • · • ·· Tärkein selluntuottoprosessi on sulfaattiselluloosan tuotto. Sulfaattiselluloosan ta-25 pauksessa kuidutuksen jälkeen ja ennen sellun käsittelyä ksylanaasilla sellun lämpö- • · · · tila on noin 55 - 70 °C ja sen pH on erittäin emäksinen (esim. Nissen et ai., 1992).

:[[[: Huono puoli monilla kaupallisesti saatavilla villityypin ksylanaaseilla on se, että näillä entsyymeillä on hapan pH-optimi ja lämpötilaoptimi on noin 55 °C. Jotta ksy- • · · LI lanaaseja voidaan käyttää tehokkaasti hyväksi valkaisusovelluksissa, täytyy sellu 30 sen vuoksi tehdä happamaksi sellaiseen pH-arvoon, joka on suunnilleen käytetyn • · spesifisen ksylanaasin optimaalinen pH. Lisäksi kuuma sellu täytyy jäähdyttää läm-*:·*: potilaan, joka on lähellä valitun ksylanaasin entsymaattisen aktiivisuuden optimi- lämpötilaa. Sellun lämpötilojen alentaminen ksylanaasikäsittelyä varten alentaa seu-raavan kemiallisen valkaisun tehokkuutta. Sellun happamoittaminen vaatii suurten 2 happomäärien käyttöä. Lisäksi, happojen lisäys johtaa korroosioon, joka vähentää prosessilaitteiston elinikää. Näin ollen ksylanaasit, jotka ovat optimaalisesti aktiivisia sellaisissa lämpötiloissa ja pH-olosuhteissa, jotka ovat suunnilleen sellun olosuhteita vastaavia, olisivat käyttökelpoisia ja hyödyllisiä sellun valmistuksessa.

5 Ksylanaaseja, joilla on suurempi aktiivisuus korkeammissa lämpötiloissa, voitaisiin käyttää sellun käsittelyyn heti kuidutusprosessin jälkeen ilman tarvetta jäähdyttää sellua. Samalla tavalla sellaisten ksylanaasien kanssa, joilla on suurempi aktiivisuus korkeammissa pH-olosuhteissa, sellun neutraloimiseksi ei tarvittaisi ollenkaan happoa tai sitä tarvittaisiin ainoastaan vähän. Sellaisten ksylanaasien eristys tai geeni-10 manipulaatio saisi aikaan useita etuja ja taloudellisia hyötyjä erilaisissa teollisuusprosesseissa.

Useat alalla aiemmin käytetyt lähestymistavat, jotka koskevat ksylanaasin parantamista sellun valkaisuun käytettäväksi, sisältävät termostabiilien ksylanaasien eristyksen ääritermofiileistä, jotka kasvavat 80 - 100 °C:ssa, kuten Caldocellum sacc-15 harolyticumista, Thermatoga maritimasta ja Thermatoga sp. FJSS-B.l -kannasta (Liithi et ai., 1990; Winterhalter et ai., 1995; Simpson et ai., 1991). Nämä termosta-biilit ksylanaasientsyymit ovat kuitenkin suuria niiden molekyylimassojen vaihdellessa välillä 35 - 120 kDa (320 - 1100 jäännöstä) ja niillä on alentunut kyky tunkeutua sellumassaan verrattuna muihin pienempiin ksylanaaseihin, jotka pääsevät 20 paremmin sellumassakuituihin. Lisäksi jotkin ääritermofiilisista ksylanaaseista, ku- ··· ten Caldocellum saccharolyticum -ksylanaasi A, sisältävät sekä ksylanaasi- että sel-s\j lulaasiaktiivisuutta (Liithi et ai., 1990). Tämä sellulolyyttinen lisäaktiivisuus ei ole :··· toivottava sellun valkaisussa johtuen sen tuhoisasta vaikutuksesta selluloosaan, joka on paperin päämateriaali. Lisäksi, hypertermostabiileilla ksylanaasientsyymeillä, • · : 25 jotka toimivat normaalisti erittäin korkeissa lämpötiloissa, on matalat spesifiset ak- .···[ tiivisuudet lämpötiloissa, jotka ovat sellun optimaalisen valkaisun rajoissa (Simpson et ai., 1991).

• · · L·’ ·* Useita ksylanaaseja on modifioitu proteiinimuokkauksella niiden ominaisuuksien f”: parantamiseksi teollisuussovelluksiin. Esimerkiksi julkaisut US 5 759 840 (Sung et 30 ai.) ja US 5 866 408 (Sung et ai.) kuvaavat mutaatiot Trichoderma reesei ksylanaasi II:n (TrX) N-pään alueella (jäännökset 1 - 29). Kolmen mutaation TrX-entsyymis- • · *·;·* sä, jäännöksissä 10, 27 ja 29, havaittiin kohottavan ksylanaasientsyymin entsymaat- : V: tista aktiivisuutta kohotetuissa lämpötiloissa ja emäksisissä pH-olosuhteissa.

• ·

Julkaisu 5 405 769 (Campbell et ai.) kuvaa Bacillus circulans -ksylanaasin (BcX) 35 modifikaation käyttäen kohdennettua mutageneesia entsyymin termostabiiliuden pa- 3 rantamiseksi. Kohdennetut mutaatiot sisältävät kahden aminohapon korvaamisen Cys-jäännöksillä molekyylin sisäisten disulfidisidosten muodostamiseksi. Lisäksi mutatoitiin entsyymin N-päässä spesifiset jäännökset, joiden havaittiin myöskin edelleen parantavan entsyymin termostabiilisuutta. In vitro -testeissä disulfidimu-5 tantit olivat termostabiileja 62 °C:ssa, jossa oli 7 °C parantuminen natiivin BcX-ksy-lanaasientsyymin termostabiilisuuteen. Nämä termostabiilit disulfidimutantit eivät kuitenkaan osoittaneet mitään lisäystä termofiilisyydessä laboratoriotesteissä myöhemmissä tutkimuksissa (Wakarchuck et ai., 1994). Mutaatiot T3G (se on, treoniini kohdassa 3 on korvattu Glydlä; BcX-ksylanaasin aminohapponumerointi), D4Y(F) 10 ja N8Y(F) lähellä BcX-ksylanaasientsyymin N-päätä saivat aikaan termostabiiliu-den 57 °C:ssa, jossa oli 2 °C:n kohoaminen natiiviin BcX:ään verrattuna (US 5 405 769). Näiden entsyymien käyttö teollisuussovelluksissa vaatii kuitenkin vielä sellun jäähdytyksen ja happamoittamisen esikäsittelyn jälkeen ennen entsyymin lisäystä. Sen vuoksi on tarve saada aikaan vielä suurempi kohoaminen termo-15 stabiiliudessa, termofiilisyydessä j a pH-optimissa.

Alalla on olemassa tarve saada aikaan uusia teollisuuskäyttöön sopivia ksyla-naaseja, joilla on kohonnut entsymaattinen aktiivisuus kohotetuissa lämpötiloissa ja pH-olosuhteissa. Tämän keksinnön aiheena on ratkaista alan aiemmat ongelmat.

Yllä oleva aihe tyydytetään päävaatimuksen ominaisuuksien yhdistämisellä, jatko-20 vaatimukset kuvaavat keksinnön edullisia lisäsuoritusmuotoja.

• · · • · • · • · · .·. : Keksinnön yhteenveto • » * : Esillä oleva keksintö koskee modifioituja ksylanaaseja. Erikoisemmin keksintö kos- • · kee modifioituja ksylanaaseja, joilla on parantunut suorituskyky korkeassa lämpöti- • · ·.1·· lassajapH:ssa.

• · · ♦ « • · 25 Tämä keksintö koskee modifioitua ryhmä 11 -ksylanaasia, joka käsittää ainakin yh- ... den substituoidun aminohappojäännöksen kohdassa, joka on valittu ryhmästä, joka *·]/ koostuu aminohapoista 75, 104, 105,125, 129, 132, 135, 144, 157, 161, 162 ja 165, ♦ · *··** kohdan ollessa määritetty modifioidun ksylanaasin sekvenssivertailulla Trichoder- ma reesei ksylanaasi II:n aminohapposekvenssiin, joka on määritelty sekvenssissä .1·1. 30 nro 16. Modifioidulla ksylanaasilla on edullisesti parantunut termofiilisyys, alkalo- • · · .1. fiilisyys tai niiden yhdistelmä verrattuna vastaavaan natiiviin ksylanaasiin. Täsmäl- • ♦ · lisemmin sanoen keksinnön kohteena on itsenäisen patenttivaatimuksen 1 mukainen 1 ryhmä 11 -ksylanaasi.

4

Esillä oleva keksintö saa myös aikaan yllä määritellyn modifioidun ksylanaasin, jossa ainakin yksi substituoitu aminohappojäännös on kohdassa 75. Substituoitu aminohappo on edullisesti valittu ryhmästä, jonka muodostavat Ala, Cys, Gly ja Thr.

5 Esillä oleva keksintö käsittää myös yllä määritellyn modifioidun ksylanaasin, joka edelleen käsittää His:n kohdassa 10, Met:n kohdassa 27 ja Leu:n kohdassa 29.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti on myös saatu aikaan modifioitu ksylanaasi, joka käsittää substituoidun aminohappoj äännöksen kohdassa 105, kohdan ollessa määritetty sekvenssi vertailulla Trichoderma reesei ksylanaasi II :n aminohapposek-10 venssiin, joka on määritelty sekvenssissä nro 16. Substituoitu aminohappo on edullisesti valittu ryhmästä, jonka muodostavat His, Lys ja Arg. Esillä oleva keksintö koskee myös juuri määriteltyä modifioitua ksylanaasia, joka edelleen käsittää His.n kohdassa 10, Met:n kohdassa 27 ja Leu:n kohdassa 29. Keksintö sisältää myös juuri määritellyn ksylanaasin, joka edelleen käsittää substituoidun aminohappojäännök-15 sen kohdassa 75.

Tämä keksintö sisältää myös modifioidun ksylanaasin, joka käsittää His:n kohdassa 10, Met:n kohdassa 27, Leu:n kohdassa 29, ei-polaarisen aminohapon kohdissa 75 ja 125, ei-polaarisen aminohapon kohdassa 104, polaarisen aminohapon kohdassa 105 ja happaman aminohapon kohdassa 129. Aminohappo kohdassa 75 on edulli- :]**: 20 sesti Ala, aminohappo kohdassa 125 on valittu ryhmästä, jonka muodostavat Ala, :*·.· Cys, Gly ja Thr, aminohappo kohdassa 125 on Glu. Aminohappo kohdassa 105 on • · valittu ryhmästä, jonka muodostavat His, Lys ja Arg, ja aminohappoj äännös koh- : dassa 104 on Pro.

• 0 · • · • t Tämä keksintö sisältää edelleen modifioidun ksylanaasin, joka käsittää His:n koh-25 dassa 10, Met:n kohdassa 27, Leu:n kohdassa 29, ei-polaarisen aminohapon kohdissa 75 ja 125, polaarisen aminohapon kohdissa 105, 132 ja 135 ja happaman amino-:*·*: hapon kohdassa 129. Lisäksi juuri määritelty modifioitu ksylanaasi voi sisältää po- ; * * *. laarisen aminohapon kohdassa 144.

• · · ϊ.ϊ,: Tämä keksintö sisältää modifioidun ksylanaasin, joka käsittää His:n kohdassa 10, :***: 30 Met:n kohdassa 27, Leu:n kohdassa 29, ei-polaarisen aminohapon kohdissa 75 ja • · · 125, polaarisen aminohapon kohdissa 105, 132, 135, 144, 157, 161, 162 ja 165 ja • · · * happaman aminohapon kohdassa 129.

• · Tämä keksintö pitää sisällään modifioidun ksylanaasin, joka käsittää His:n kohdassa 10, Met:n kohdassa 27, Leu:n kohdassa 29, ei-polaarisen aminohapon kohdissa 75 5 ja 125, polaarisen aminohapon kohdissa 105,132,135, 157, 161, 162 ja 165 ja happaman aminohapon kohdassa 129.

Tämä keksintö koskee myös modifioitua ksylanaasia, joka käsittää His:n kohdassa 10, Met:n kohdassa 27, Leu:n kohdassa 29, ei-polaarisen aminohapon kohdissa 75 5 ja 125 ja polaarisen aminohapon kohdissa 105, 135, 144, 157, 161, 162 ja 165.

Esillä oleva keksintö koskee myös yllä määriteltyjä modifioituja ksylanaaseja, joissa modifioidut ksylanaasit ovat peräisin ryhmä 11 -ksylanaasista, edullisesti Tricho-derma rees ei -ksylanaasista.

Esillä oleva keksintö koskee modifioitua ksylanaasia, joka käsittää ainakin yhden 10 substituoidun aminohappojäännöksen, jossa modifioidulle ksylanaasille on ominais ta, että sen maksimitehokkuuslämpötila (MET) on välillä, joka on noin 69 °C - noin 78 °C, ja jossa modifioitu ksylanaasi on ryhmä 11 -ksylanaasi, joka on peräisin Trichoderma sp:stä. MET on edullisesti välillä, joka on noin 70 °C - noin 75 °C.

Tämä keksintö sisältää myös modifioidun ksylanaasin, joka käsittää ainakin yhden 15 substituoidun aminohappoj äännöksen, jossa modifioidulle ksylanaasille on ominais ta, että sen maksimitehokkuuden pH-arvo (MEP) on välillä, joka on noin 5,8 - noin 7,6, ja jossa modifioitu ksylanaasi on ryhmä 11 -ksylanaasi, joka on peräisin Trichoderma sp:stä. MEP on edullisesti välillä, joka on noin 6,5 - noin 7,4.

• · ·

Esillä oleva keksintö koskee modifioitua ksylanaasia, joka käsittää ainakin yhden • · 20 substituoidun aminohappojäännöksen, jossa modifioidulle ksylanaasille on ominais- *:**; ta, että sen maksimitehokkuuslämpötila (MET) on välillä, joka on noin 69 °C - noin 78 °C, ja maksimitehokkuuden pH-arvo (MEP) on välillä, joka on noin 5,8 - noin :*·.· 7,6. MET on edullisesti välillä, joka on noin 70 °C - noin 75 °C, ja MEP on edulli- • · .**·. sesti välillä, joka on noin 6,5 - noin 7,4.

·♦ · 25 Esillä oleva keksintö koskee myös modifioitua ksylanaasia, joka on valittu ryhmäs-: tä, joka koostuu entsyymeistä: • · · « · • · Λ TrX-75A;

TrX-157D-161R-162H-165H;

TrX-HML-75A; :V: 30 TrX-HML-105H;

TrX-HML-105R;

TrX-HML-105K;

TrX-HML-75 A-105H; 6

TrX-HML-75 A-105R;

TrX-HML-75C-l 05R;

TrX-HML-7 5G-105R;

TrX-HML-75T-105R; 5 TrX-HML-125A;

TrX-HML-12 5 A-129E;

TrX-HML-75G-105R-125A-129E (TrX-HML-GRAE);

TrX-HML-75 A-105H-125 A-129E (TrX-HML-AH AE);

TrX-HML-75G-105H-125 A-129E (TrX-HML-GHAE); 10 TrX-HML-75 A-105R-125 A-129E (TrX-HML-ARAE);

TrX-HML-75G-104P-105R-125A-129E (TrX-HML-GPRAE);

TrX-HML-75G-104P-105H-125A-129E (TrX-HML-GPHAE);

TrX-HML-AHAE-RR;

TrX-HML- AHAE-RRR; 15 TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH;

TrX-HML- AHA-RR-DRHH; ja TrX-HML-AHAE-RR-DRHH.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti on saatu aikaan modifioitu ksylanaasi, joka käsittää ainakin yhden substituoidun aminohappojäännöksen ja jolle on ominaista, että 20 sen maksimitehokkuuslämpötila (MET) on välillä, joka on noin 69 °C - noin 78 °C, ... jossa modifioitu ksylanaasi on ryhmä 11 -ksylanaasi, joka on peräisin Trichoderma • · Γ*. sp:stä. Lisäksi esillä oleva keksintö koskee Trichoderma sp:stä peräisin olevaa mo- • · · *· *| difioitua ryhmä 11 -ksylanaasia, jolle on ominaista, että MET on välillä, joka on noin 70 °C - noin 75 °C. Esillä oleva keksintö koskee myös Trichoderma sp:stä pe-

\**: 25 räisin olevaa modifioitua ryhmä 11 -ksylanaasia, jolle on ominaista, että sen MET

• · on välillä, joka on noin 69 °C - noin 78 °C, ja maksimitehokkuuden pH-arvo (MEP) • · · on välillä, joka on noin 5,8 - noin 7,6. Tämä keksintö koskee myös juuri määriteltyä modifioitua ksylanaasia, jossa MEP on välillä, joka on noin 6,5 - noin 7,4.

··· • · ·

Esillä oleva keksintö koskee yllä määritellyn modifioidun ksylanaasin käyttöä teol- • · *·♦·* 30 lisuusprosessissa. Myös sellainen teollisuusprosessi on sisällytetty, joka käsittää sel- : V: lun valkaisun, tarkkuuslaitteiden prosessoinnin tai siipikarjan ja sian rehun sulavuu- : * “: den parantamisen.

··» • · Tämä keksinnön yhteenveto ei välttämättä kuvaa kaikkia keksinnön tarpeellisia ·:**: ominaisuuksia vaan keksintö voi myös sisältyä kuvattujen ominaisuuksien muihin 35 yhdistelmiin.

7

Piirustusten lyhyt kuvaus Nämä ja keksinnön muut ominaisuudet tulevat selvemmiksi seuraavasta kuvauksesta, jossa viitataan lisättyihin piirustuksiin, joissa:

Kuvio 1 esittää ryhmä 11 -ksylanaasien ryhmän aminohapposekvenssivertailun. 5 Aminohapponumerointia verrataan Trichoderma reesei ksylanaasi II:n (Tr2) numerointiin, joka on kuvattu sekvenssien yläpuolella. Jäännökset kohdilla 75 ja 105 (suhteessa Tr2-sekvenssiin) on merkitty kursiivilla ja osoitettu tähdellä. Aminohapot, jotka ovat yhteisiä ainakin 75 prosentille luetelluista ryhmä 11 -ksylanaaseista, on osoitettu lihavoituina. Jäännökset, jotka ovat yhteisiä kaikille ryhmä 11 -ksyla-10 naaseille, on alleviivattu. Ksylanaaseille, joilla on selluloosaa sitova domeeni, on esitetty ainoastaan katalyyttiset ydinsekvenssit.

Kuvio 2 esittää TrX-ksylanaasin nukleotidisekvenssin (sekvenssi nro 39) ja ne synteettiset oligonukleotidit, joita käytettiin rakennettaessa sekvenssi, joka koodittaa Trichoderma reesei ksylanaasi II -entsyymiä (TrX) plasmidissa pTrX.

15 Kuvio 3 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioidun TrX-75A-ksylanaasin entsy- maattiseen aktiivisuuteen verrattuna TrX-entsyymiin pH:ssa 5,5 30 minuutin inku- baatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka havai- ·***. taan 40 °C:ssa.

• · • · · • · • · · *· *j Kuvio 4 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioitujen TrX-HML-, TrX-HML-75A-, 20 TrX-HML-105H- ja TrX-HML-75A-105H-ksylanaasien entsymaattiseen aktiivisuu- • · teen pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan 40 °C:ssa.

··· • · • ·

Kuvio 5 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioitujen TrX-HML-, TrX-HML-105K-, TrX-HML-105R-, TrX-HML-105H-, TrX-HML-75A-105R- ja TrX-HML- • · · 25 75A-105H-ksylanaasien entsymaattiseen aktiivisuuteen pH:ssa 5,5 30 minuutin in- • · *···* kubaatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka ha- ·:··· vaitaan 40 °C:ssa.

• · · • · *;·* Kuvio 6 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioitujen TrX-HML-, TrX-HML- •J: 105R-, TrX-HML-75T-105R-, TrX-HML-75G-105R-, TrX-HML-75A-105R- ja 30 TrX-HML-75C-105R-ksylanaasien entsymaattiseen aktiivisuuteen pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan 40 °C:ssa.

8

Kuvio 7 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioitujen TrX-HML-, TrX-HML-125A-, TrX-HML-125A129E- ja TrX-HML-75G-105R-125A129E-ksylanaasien (TrX-HML-GRAE) entsymaattiseen aktiivisuuteen pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaa-tioiden aikana. Tulokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan 5 40 °C:ssa.

Kuvio 8 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioitujen ksylanaasientsyymien

TrX-HML;

TrX-HML-105H;

TrX-HML-75A-105H-125A129E (TrX-HML-AHAE); 10 TrX-HML-75G-105H-125A129E (TrX-HML-GHAE); ja

TrX-HML-7 5A-105R-125A129E (TrX-HML-ARAE) entsymaattiseen aktiivisuuteen pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan 40 °C:ssa.

Kuvio 9 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioitujen ksylanaasientsyymien 15 TrX-HML-7 5G-104P-105R-125 A129E (TrX-HML-GPRAE);

TrX-HML-75G-104P-105H-125 A129E (TrX-HML-GPHARE); ja TrX-HML-75G-105R-125A129E (TrX-HML-GRAE) • · • · ··« J/.j entsymaattiseen aktiivisuuteen pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tu- *:*·: lokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan 40 °C:ssa.

• · • · · l l 20 Kuvio 10 esittää modifioidun TrX-75A-ksylanaasientsyymin pH-profiilin verrattuna • · · ; " natiivin TrX-entsyymin vastaavaan pH:ssa 4,0 - 6,5 55 °C:ssa 30 minuutin inkubaa- • · '···’ tion aikana. Tulokset on normalisoitu kullekin entsyymille sen pH:n suhteen, jossa sen aktiivisuus on optimaalinen.

• · · • · · • · .···. Kuvio 11 esittää modifioitujen TrX-HML-, TrX-HML-75A-, TrX-HML-105H-ja 25 TrX-HML-75A-105H-ksylanaasien pH-profiilit pH:ssa 4 - 7 65 °C:ssa 30 minuutin * * inkubaation aikana. Tulokset on normalisoitu kullekin entsyymille sen pH:n suh- • · · ·...· teen, jossa sen aktiivisuus on optimaalinen.

• ·· V* ; Kuvio 12 esittää modifioitujen TrX-HML-, TrX-HML-105K-, TrX-HML-105R-, *· " TrX-HML-105H- ja TrX-HML-75A-105H-ksylanaasien pH-profiilin pH:ssa 4-7 30 65 °C:ssa 30 minuutin inkubaation aikana. Tulokset on normalisoitu kullekin ent syymille sen pH:n suhteen, jossa sen aktiivisuus on optimaalinen.

Kuvio 13 esittää modifioitujen ksylanaasien 9

TrX-HML;

TrX-HML-105R;

TrX-HML-75T-105R, TrX-HML-75G-105R; 5 TrX-HML-75A-105R; ja

TrX-HML-75C-105R

pH-profiilin pH:ssa 4 - 7 65 °C:ssa 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu kullekin entsyymille sen pH:n suhteen, jossa sen aktiivisuus on optimaalinen.

10 Kuvio 14 esittää modifioitujen ksylanaasien

TrX-HML;

TrX-HML-105H;

TrX-HML-75 A-105H;

TrX-HML-75 A-105H-125 A129E (TrX-HML-AHAE); ja 15 T rX-HML-7 5 G-105H-125 A129E (TrX-HML-GHAE) pH-profiilin pH:ssa 4 - 7 65 °C:ssa 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu kullekin entsyymille sen pH:n suhteen, jossa sen aktiivisuus on opti- • · Γ*. maalinen.

• · · • ·· • · ·:**: Kuvio 15 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioidun TrX-157D-161R-162H-165H- 20 ksylanaasin entsymaattiseen aktiivisuuteen verrattuna TrX:iin pH:ssa 5,5 30 minuu- • · ;‘. j tin inkubaatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka • · .···, havaitaan 40 °C:ssa.

• · • · ·

Kuvio 16 esittää modifioidun TrX-157D-161R-162H-165H-ksylanaasientsyymin • · · : ’.· pH-profiilin verrattuna natiivin TrX:n vastaavaan pH:ssa 4,0 - 6,5 55 °C:ssa 30 mi- 25 nuutin inkubaation aikana. Tulokset on normalisoitu kullekin entsyymille sen pH:n suhteen, jossa sen aktiivisuus on optimaalinen.

···

Kuvio 17 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioitujen ksylanaasien ···

Vi TrX-HML-AHAE-RR; ja

:·’*ί TrX-HML-AHAE-RRR

30 entsymaattiseen aktiivisuuteen pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan 40 °C:ssa.

Kuvio 18 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioitujen ksylanaasien 10

TrX-HML-AHA-RR-DRHH;

TrX-HML-AHAE-RR-DRHH; ja TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH

5 entsymaattiseen aktiivisuuteen pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tulokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan 40 °C:ssa.

Kuvio 19 esittää lämpötilan vaikutuksen modifioitujen ksylanaasien

TrX;

TrX-HML; 10 TrX-HML-AHAE;

TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH;

TrX-HML-AHA-RR-DRHH; ja TrX-HML-AHAE-RR-DRHH

entsymaattiseen aktiivisuuteen pH:ssa 5,5 30 minuutin inkubaatioiden aikana. Tu-15 lokset on normalisoitu sen aktiivisuuden suhteen, joka havaitaan 40 °C:ssa.

Kuvio 20 esittää usean esillä olevan keksinnön mukaisen modifioidun entsyymin maksimitehokkuuslämpötilan (MET) ja maksimitehokkuuden pH-arvon (MEP).

:*·.· MET ja MEP on se korkein lämpötila ja pH, vastaavasti, jossa ksylanaasilla on ai- • · nakin 80 % sen optimaalisesta aktiivisuudesta (käytettäessä ksylaania substraattina; .·. : 20 katso kohta, jossa testimenetelmien yksityiskohdat kuvataan täydellisesti). Nämä tu- • · · j lospisteet saatiin tuloksista, jotka on esitetty kuvioissa 5 - 14.

• ·· • · ···

Edullisen suoritusmuodon kuvaus

Esillä oleva keksintö koskee modifioituja ksylanaaseja. Erikoisemmin keksintö kos- • · kee modifioituja ksylanaaseja, joilla on parantunut suorituskyky korkeassa lämpöti-*" 25 lassa ja pH:ssa.

• · .···. Seuraava kuvaus edullisesta suoritusmuodosta on annettu ainoastaan esimerkin va- • · [j] lossa eikä se rajoita niiden ominaisuuksien yhdistelmää, joka on tarpeen keksinnön v : suorittamiseksi.

• · • » · • ·· • ♦

Sitä mekanismia, jolla ksylanaasit tehostavat sellun valkaisua, ei ole täysin ymmär-30 retty. On oletettu, että värillinen ligniini on sitoutunut kiteiseen selluloosaan ksylaa-nin välityksellä ja että ksylanaasientsyymit tehostavat sellun valkaisua hydrolysoi- 11 maila ksylaania vapauttaen värillisen ligniinin sellussa. Modifioituja ksylanaaseja, kuten tässä on kuvattu, voidaan käyttää sellun valkaisuun tai muihin sovelluksiin, joissa tarvitaan aktiivisuuksia sellaisissa lämpötiloissa ja pH:ssa, jotka ovat korkeampia kuin mitä villityypin entsyymi kestää. Sellun biovalkaisua varten edullinen 5 ksylanaasi on peräisin ksylanaasista, jonka luokitellaan kuuluvan ryhmä 11 -ksyla-naaseihin (katso taulukko 1), tässä kuvattujen modifikaatioiden ei kuitenkaan tarvitse olla rajoittuneita ainoastaan ryhmä 11 -ksylanaaseihin ja ne voivat sisältää muitakin ksylanaasientsyymeitä.

Ryhmä 11 -ksylanaasientsyymit ovat ryhmä pieniä entsyymeitä, joiden molekyyli-10 massa on suhteellisen matala (noin 20 kDa ja noin 200 aminohappojäännöstä. Ryhmä 11 -ksylanaasien pieni koko sallii niiden helpon tunkeutumisen sellumassaan. Lisäksi ryhmä 11 -ksylanaasit eivät sisällä sellulaasiaktiivisuutta.

Eräs esillä olevan keksinnön näkökohta koskee modifioitua ryhmä 11 -ksylanaasia, joka on peräisin Trichoderma sp:stä, joka entsyymi sisältää ainakin yhden substitu-15 oidun aminohappojäännöksen ja jolle entsyymille on ominaista se, että sen maksi-mitehokkuuslämpötila (MET) on välillä, joka on noin 69 °C - noin 78 °C. Modifioidulle ksylanaasille on edullisesti ominaista se, että sen MET on välillä, joka on noin 70 °C - noin 75 °C. Tämä keksintö sisältää myös sellaisen modifioidun ksylanaasin, joka käsittää ainakin yhden substituoidun aminohappojäännöksen ja jolle on omi- • · *···’ 20 naista se, että sen maksimitehokkuuden pH-arvo (MEP) on välillä, joka on noin 5,8 \ - noin 7,6. MEP on edullisesti välillä, joka on noin 6,5 - noin 7,4.

• · : Tämä keksintö koskee myös sellaista Trichoderma:sta peräisin olevaa modifioitua .·. j ksylanaasia, joka käsittää ainakin yhden substituoidun aminohapon ja jolle on omi- • · · L/ naista, että sen maksimitehokkuuslämpötila (MET) on välillä, joka on noin 69 °C - **** 25 noin 78 °C, ja maksimitehokkuuden pH-arvo (MEP) on välillä, joka on noin 5,8 - noin 7,6. MET on edullisesti välillä, joka on noin 70 °C - noin 75 °C, ja MEP on • · · • ·* edullisesti välillä, joka on noin 6,5 - noin 7,4.

··· J

• * • · • · · • . Termillä “maksimitehokkuuslämpötila” tai “MET” tarkoitetaan sitä korkeinta läm- [..* pötilaa, jossa ksylanaasilla on ainakin 80 % sen optimiaktiivisuudesta. Tämä testi • · *·;·* 30 suoritetaan tyypillisesti käyttäen ksylaania substraattina pH:ssa 5,5 30 minuutin :T: ajan. Tulokset testeistä, joissa karakterisoitiin modifioituja ksylanaaseja, on esitetty :*·.· kuvioissa 3 - 9, ja niissä käytettiin inkubaatiota pH:ssa 5,5 30 minuutin ajan. Yh- • · teenveto useiden esillä olevan keksinnön entsyymien MET-arvoista, jotka on määritetty kuvioista 3 - 9, on esitetty kuviossa 20. Kokeet osoittavat, että ksylanaasin 35 MET-arvo eroaa eri substraateilla. Sen vuoksi on ymmärrettävä, että eri substraa- 12 teillä saadaan erilaiset MET-arvot (tuloksia ei esitetty). Esillä olevan keksinnön ksy-lanaasien arvioimiseksi on käytetty ksylaanisubstraattia (katso esimerkit 3 ja 4).

Termillä “maksimitehokkuuden pH-arvo” tai “MEP” tarkoitetaan sitä korkeinta pH:ta, jossa ksylanaasilla on ainakin 80 % sen optimiaktiivisuudesta. Tämä testi 5 suoritetaan tyypillisesti käyttäen ksylaania substraattina 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. Tulokset testeistä, joissa karakterisoitiin modifioituja ksylanaaseja, on esitetty kuvioissa 10 - 14 ja 16 - 19, ja niissä käytettiin inkubaatiota 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. Yhteenveto useiden esillä olevan keksinnön entsyymien MEP-arvoista on esitetty kuviossa 20. Kokeet osoittavat, että ksylanaasin MEP-arvo eroaa eri substraateilla. 10 Esimerkiksi sulfaattiselluloosalla, joka on valmistettu pehmeästä puusta tai kovasta puusta, on havaittu MEP-arvo 8,5 (tuloksia ei esitetty). Sen vuoksi on ymmärrettävä, että eri substraateilla saadaan erilaiset MEP-arvot. Esillä olevan keksinnön ksy-lanaasien arvioimiseksi on käytetty ksylaanisubstraattia (katso esimerkit 4 ja 5).

• · · • · • · • · · • · • · · • · · • · • · • · • · · • · · • · • · # · · • · · • · • » t • · • · • · · • · · • 1 · • · • · • · · • · • · • · · • · • · · • · • · • · · • ·· • · · • · · t • · · • · · • ·

Taulukko 1 Ryhmä 11 -ksylanaasientsyymit 13

Mikrobi__Ksylanaasi Sekvenssi nro_

Aspergillus niger__Xyn A__Sekvenssi nro 1_

Aspergillus awamori var. kawachi Xyn B__Sekvenssi nro 19_

Aspergillus kawachii__Xyn C__-_

Aspergillus tubigensis__Xyn A__Sekvenssi nro 2_

Bacillus circulans__Xyn A__Sekvenssi nro 3_

Bacillus pumilus__Xyn A__Sekvenssi nro 4_

Bacillus subtilis__Xyn A__Sekvenssi nro 5_

Cellulomonas fim__Xyn D__-_

Chainia spp.__Xyn__:_

Clostridium acetobutylicum__Xyn B__Sekvenssi nro 6_

Clostridium stercorarium__Xyn A__Sekvenssi nro 7_

Fibrobacter succinognees__Xyn II__Sekvenssi nro 18_

Neocallimasterix patriciarum__Xyn A__-_

Nocardiopsis dassonvillei__Xyn II__-_

Ruminococcus flavefaciens__Xyn A__Sekvenssi nro 8_

Schizophyllum cimmune__Xyn__Sekvenssi nro 9_

Streptomyces lividans__Xyn B__Sekvenssi nro 10_

Streptomyces lividans XynC Sekvenssi nro 11 • ·

Streptomyces sp. No 36a__Xyn__Sekvenssi nro 12_

Streptomyces thermoviolaceus__Xyn II__-_

Thermomonospora/usea__Xyn A__Sekvenssi nro 13_

Thermomyces lanuginosus__Xyn__Sekvenssi nro 20_

Trichoderma harzianum Xyn Sekvenssi nro 14 • · ·

Trichoderma reesei__Xyn I__Sekvenssi nro 15_

Trichoderma reesei__Xyn II__Sekvenssi nro 16_ .···. Trichoderma viride Xyn Sekvenssi nro 17 • · ------- -* ··· * : Ryhmä 11 -ksylanaasit ovat aminohapposekvenssiltään hyvin samankaltaisia (kuvio ··· 1). Useiden ryhmä 11 -ksylanaasien rakennetutkimukset osoittavat, että bakteereista 5 ja sienistä peräisin olevilla ryhmä 11 -ksylanaaseilla on samanlainen yleinen mole- .·. : kyylirakenne (US 5 405 769; Arase et ai., 1993). Lisäksi, useilla tähän asti tunniste- • ·· tuilla ryhmä 11 -ksylanaaseilla on kolme sekundaarirakennetyyppiä, jotka sisältävät beetalaskoksia, käännöksiä ja yksittäisen alfaheliksin. Trichoderma reesei ksylanaa- 14 si II -entsyymin heliksi käsittää alueen aminohaposta 151 aminohappoon 162 (Törrönen et ai., 1995).

Ksylanaasi luokitellaan kuuluvan ryhmä 11 -ksylanaasiksi, jos se käsittää aminohappoja, jotka ovat yhteisiä muille ryhmä 11 -ksylanaaseille sisältäen kaksi gluta-5 miinihappojäännöstä (E), jotka voivat toimia katalyyttisinä jäännöksinä. Gluta-miinihappojäännökset ovat kohdissa 86 ja 177 [katso kuvio 1; perustuen Tr2:n (Trichoderma reesei ksylanaasi II -entsyymi) aminohapposekvenssin numerointiin].

Useimmat tähän asti tunnistetut ryhmä 11 -ksylanaasit ovat mesofiilisia ja niillä on pieni molekyylimassa (20 kDa). Tämä ryhmä sisältää kuitenkin myös ainakin kaksi 10 termostabiilia ksylanaasia, joilla on suurempi molekyylimassa, Thermomonospora fusca ksylanaasi A:n (TfX-A), joka on pituudeltaan 296 aminohappoa ja molekyy-limassaltaan noin 32 kDa [(Irwin et ai., 1994); Wilson et ai., 1994, WO 95/12668] ja Clostridium stercorarium ksylanaasi A:n, joka on pituudeltaan 511 aminohappoa ja molekyylimassaltaan noin 56 kDa. Clostridium stercorarium ksylanaasi A -ent-15 syymin maksimiaktiivisuus on lämpötilassa 70 °C (Sakka et ai., 1993).

Suuret termostabiilit ryhmä 11 -ksylanaasit eroavat pienistä mesofiilisistä entsyymeistä niin, että niillä on hydrofobinen selluloosaa sitova domeeni (CBD) entsyymin pidentyneessä C-päässä. TfX-A-entsyymi koostuu katalyyttisestä 189 jäännök- • · · sen pituisesta ydinsekvenssistä, joka on yhteinen ryhmä 11 -ksylanaaseille, ja sellu-20 loosaa sitovasta 107 jäännöksen pituisesta domeenista. Pidemmällä C. stercorarium ·:··· ksylanaasi Ailia on kaksi selluloosaa sitovan domeenin kopiota.

• · • · · 'l ’! Kohdennettua mutageneesia on käytetty esillä olevassa keksinnössä muodostamaan • · · ’· '· sellaisia mutaatioita ksylanaaseihin, jotka tekevät entsyymin termofiilisemmaksi ja • · · alkalofiilisemmaksi kuin natiivi entsyymi. Mutanttiksylanaasi on edullisesti sellai-25 nen, joka on peräisin ryhmä 11 -ksylanaasista. Esillä olevan keksinnön mutanttiksy-i*\: lanaasi käsittää edullisemmin Trichoderma reesei ksylanaasi II -mutanttientsyymin.

φ · · • · • · T Sen vuoksi esillä olevan keksinnön piirissä on mietitty, että ksylanaaseja sisältäen ryhmä 11 -ksylanaasit, esimerkiksi, mutta ei rajoittuen, Trichoderma reesei ksyla- ··· naasi II:n, Trichoderma reesei ksylanaasi I:n, Trichoderma viride -ksylanaasin, .···. 30 Streptomyces lividans ksylanaasi B:n ja Streptomyces lividans ksylanaasi C:n, voi- • · · ^ . daan modifioida tässä kuvatulla yleisellä lähestymistavalla ja menetelmällä. Esillä • · · * * olevassa keksinnössä on myös mietitty, että muitakin kuin ryhmä 11 -ksylanaaseja voidaan modifioida tässä kuvattujen yleisten periaatteiden mukaisesti sellaisen ksy-lanaasientsyymin aikaan saamiseksi, joka on termofiilinen ja alkalofiilinen.

15

Termillä “termofiilisyys” tarkoitetaan, että entsyymi on aktiivinen tai aktiivisempi korkeammassa lämpötilassa verrattuna toisen entsyymin aktiivisuuteen silloin, kun kaikki muut olosuhteet ovat vakioita. Esimerkiksi ksylanaasi 1 :llä on kohonnut ter-mofiilisyys verrattuna ksylanaasi 2:een, jos ksylanaasi 1 kykenee, tai on aktiivisem-5 pi, hydrolysoimaan ksylaania korkeammassa lämpötilassa kuin ksylanaasi 2 identtisissä olosuhteissa samaa substraattia käyttäen. Koska useimmat ksylanaasit ovat tehokkaita korkeammassa lämpötilassa hydrolysoidessaan puhdasta ksylaania kuin sellua, on vertailuanalyysi tehtävä käyttäen samaa substraattia. Tässä viitatuissa termofiilisyyden kvantitatiivisissa mittauksissa käytetään puhtaita ksylaanisubstraat-10 teja jollei toisin ole osoitettu.

Termillä “termostabiilius” tarkoitetaan, että entsyymiä kyetään säilyttämään tai in-kuboimaan korkeissa lämpötilaolosuhteissa tyypillisesti substraatin poissa ollessa ja että on sitten aktiivinen, kun se palautetaan standarditestiolosuhteisiin. Esimerkiksi ksylanaasi l:llä sanotaan olevan kohonnut termostabiilius verrattuna ksylanaasi 15 2:een, jos ksylanaasi l:llä säilyy korkeampi aktiivisuus kuin ksylanaasi 2:11a sen jälkeen, kun niitä on pidetty tietyssä lämpötilassa (tyypillisesti korkeammassa lämpötilassa), esimerkiksi, mutta ei rajoittuen, 70 °C:ssa 24 tuntia, jonka jälkeen testi suoritetaan matalammassa lämpötilassa. Päinvastoin kuin termofiilisyydessä, termostabiilius koskee jäljellä olevaa entsyymiaktiivisuutta sen jälkeen, kun on inkuboitu 20 substraatin poissa ollessa.

··· • i • · · Näiden kahden termin (termofiilisyys ja termostabiilius) mainittuja käyttöjä on se-***** ·»«· • · koittanut alalla aiemmin se, että niitä on käytetty vaihtovuoroisesti. Kuitenkin, ter- • · mien käyttö tässä määritellyllä tavalla on yhdenmukaista termien käytölle alalla ·/·· (Mathrani ja Ahring, 1992).

··· * · • · 25 Termillä “alkalofiilisyys” tarkoitetaan, että entsyymi on aktiivinen tai aktiivisempi .. . korkeammassa pH:ssa verrattuna toisen entsyymin aktiivisuuteen silloin, kun kaikki * · · \ muut olosuhteet ovat vakioita. Esimerkiksi ksylanaasi l:llä on kohonnut alkalofiili- • · ’···* syys verrattuna ksylanaasi 2:een, jos ksylanaasi 1 kykenee hydrolysoimaan ksylaa- ·:··· nia korkeammassa pH:ssa kuin ksylanaasi 2. Alkalofiilisyys koskee tyypillisesti 30 entsyymiaktiivisuutta ksylaanisubstraatin läsnä ollessa.

»«· • · · ·.: : Termillä “TrX-numerointi” tarkoitetaan sitä numerointia, joka liittyy aminohappo- kohtiin perustuen TrX:n aminohapposekvenssiin (Xyn II - taulukko 1; Tr2 - kuvio 1; sekvenssi nro 16). Kuten alla on kuvattuja kuviosta 1 ilmenee, ryhmä 11 -ksyla-naaseilla on huomattava sekvenssien samankaltaisuustaso. Sen vuoksi, vertaamalla 35 aminohappoja alekkain ksylanaasientsyymien välisen sekvenssien samankaltaisuu- 16 den optimoimiseksi ja käyttämällä TrX:n aminohapponumerointia numeroinnin perustana, voidaan muiden ksylanaasientsyymien aminohappokohdat määrittää suhteessa TrX:ään.

Modifioidulla ksylanaasilla tarkoitetaan ksylanaasimolekyylin muuttamista käyttäen 5 menetelmiä, jotka ovat alan ammattimiehen tuntemia. Nämä menetelmät sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, kohdennetun mutageneesin, kasettimutageneesin, sa-tunnaismutageneesin, synteettisten oligonukleotidien rakentamisen, kloonausmenetelmät ja muut geenitekniset menetelmät.

Kuten tässä on kuvattu yksityiskohtaisemmin, on valmistettu useita mutanttiksy-10 lanaaseja, joilla on kohonnut termofiilisyys, alkalofiilisyys ja termostabiilius verrattuna natiiviin ksylanaasiin. Luettelo useista mutanteista, jota ei tule pitää millään tavoin rajoittavana, on esitetty taulukossa 2.

Lisäksi esillä oleva keksintö koskee modifioitua ryhmä 11 -ksylanaasia, joka on peräisin Trichoderma sp:stä, joka entsyymi sisältää ainakin yhden substituoidun ami-15 nohappojäännöksen ja jolle entsyymille on ominaista se, että sen maksimitehok- kuuslämpötila (MET) on välillä, joka on noin 69 °C - noin 78 °C. Modifioidulle ksylanaasille on edullisesti ominaista se, että sen MET on välillä, joka on noin 70 °C - noin 75 °C. Tämä keksintö koskee myös sellaista Trichodermasia peräisin L.: olevaa modifioitua ksylanaasia, joka käsittää ainakin yhden substituoidun aminoha- 20 pon ja jolle on ominaista se, että sen maksimitehokkuuden pH-arvo (MEP) on välil-♦:··· lä, joka on noin 5,8 - noin 7,6. MEP on edullisesti välillä, joka on noin 6,5 - noin : 7,4. Tämä keksintö koskee myös sellaista Trichodermasta peräisin olevaa modifioi- .·. : tua ksylanaasia, joka käsittää ainakin yhden substituoidun aminohapon ja jolle on ♦ *« .L.] ominaista, että sen maksimitehokkuuslämpötila (MET) on välillä, joka on noin • # *** 25 69 °C - noin 78 °C, ja maksimitehokkuuden pH-arvo (MEP) on välillä, joka on noin

.. . 5,8 - noin 7,6. MET on edullisesti välillä, joka on noin 70 °C - noin 75 °C, ja MEP

♦ · » : on edullisesti välillä, joka on noin 6,5 - noin 7,4.

• · • « ··♦

Ksylanaasin MET- ja MEP-arvojen määritys voidaan suorittaa seuraavasti: • · ··« i) mitataan ksylanaasin lämpötilaprofiili, kuten on kuvattu esimerkissä 3. Määrite- .·♦·. 30 tään lämpötilat, joissa saadaan ainakin 80 % optimaalisesta (maksimaalisesta) aktii- • · · ^ . visuudesta, ja korkein lämpötila on MET; • · ♦ • · ii) mitataan ksylanaasin pH-profiili, kuten on kuvattu esimerkissä 4. Määritetään pH, jossa saadaan ainakin 80 % optimaalisesta (maksimaalisesta) aktiivisuudesta, ja korkein pH on MEP; 17 Nämä arvot voidaan sitten esittää graafisesti, kuten on esitetty kuviossa 20. Taulukko 2 Modifioidut ksylanaasit

Ksylanaasi__Kuvaus_

TrX-75A__TrX, jossa Ser kohdassa 75 on korvattu Ala:lla (S75A)

Trx-105H TrX, jossa Leu kohdassa 105 on korvattu His:llä __(L105H)_

TrX-HML TrX, jossa on N10H, Y27M ja N29L (katso US 5 759 __840)_

TrX-HML-105H__TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L ja L105H_

TrX-HML-105K__TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L ja L105K_

TrX-HML- 105R__TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L ja L105R_

TrX-HML-75A__TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L ja S75A_

TrX-HML-75A-105H TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A ja L105H

TrX-HML-75A-105R TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A ja L105R

TrX-HML-75C-105R TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75C ja L105R

TrX-HML-75G-105R TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75G ja L105R

TrX-HML-75T-105R TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75T ja L105R

TrX-HML-125A_ TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L ja Q125A_

TrX-HML-125A129E TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, Q125A ja I129E TrX-HML-GRAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75G, L105R, __Q125A jaI129E_ : TrX-HML-AHAE TrX, jossa onNIOH, Y27M, N29L, S75A, L105H, V!__Q125A jaI129E_

TrX-HML-GHAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75G, L105H, __Q125A jaI129E_

TrX-HML-ARAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A, L105R, : V__Q125A jaI129E_

TrX-HML-GPRAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75G, K104P, ·:·*.: _ L105R, Q125A ja I129E_

TrX-HML-GPHAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75G, K104P, __L105H, Q125A ja I129E_ V* ; TrX-HML-AHAE-RR TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, V·: _Q125A, I129E, A132R ja Y135R_ 18

Taulukko 2 (jatkuu) Modifioidut ksylanaasit

Ksylanaasi__Kuvaus_

TrX-HML-GRAE TrX, jossa on N1 OH, Y27M, N29L, S75G, __L105R, Q125A ja I129E_

TrX-HML-AHAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A, __L105H, Q125A ja I129E_

TrX-HML-GHAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75G, __L105H, Q125A ja I129E_

TrX-HML-ARAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A, __L105R, Q125A ja I129E_

TrX-HML-GPRAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75G, __K104P, L105R, Q125A ja I129E_

TrX-HML-GPHAE TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75G, __K104P, L105H, Q125A ja I129E_

TrX-HML-AHAE-RR TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A,

_ L105H, Q125A, I129E, A132R ja Y135R

TrX-HML-AHAE-RRR TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, I129E, A132R, Y135R ja __H144R_ O TrX-157D-161R-162H-165H TrX, jossa on N157D, Q161R, Q162H ja T165H _ ·:··: TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, I129E, A132R, Y135R,

;\j__H144R, N157D, Q161R, Q162H ja T165H

TrX-HML-AHA-RR-DRHH TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, Y135R, H144R, N157D, .. .__Q161R, Q162H jaT165H_

TrX-HML-AHAE-RR-DRHH TrX, jossa on N10H, Y27M, N29L, S75A, L105H, Q125A, I129E, Y135R, H144R, ·:··: _N157D, Q161R, Q162H jaT165H_ • · · • · • · ··· y..' Substituutio kohdassa 75 tai 105 ei muuta ksylanaasientsyymin spesifistä aktiivi- • · · * . suutta verrattuna natiivin ksylanaasin vastaavaan (katso taulukko 4, esimerkki 3).

• · · *· 5 Samalla tavalla mutaatiot kohdissa 157, 161, 162 ja 165 eivät muuta modifioidun ksylanaasin spesifistä aktiivisuutta.

19

Ksylanaasin termofiilisyyden kohottaminen

Mutantti TrX-75A, jossa on yksi S75A-mutaatio, osoitti suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin natiivi TrX-ksylanaasi 50, 55, 60 ja 65 °C:ssa (kuvio 3). Lisäksi, S75A-mutaatio TrX-HML-75A-mutanttiksylanaasissa osoitti suuremman entsy-5 maattisen aktiivisuuden kuin TrX-HML-emoksylanaasi 70 °C:ssa ja 75 °C:ssa (kuvio 4). Nämä tulokset vihjaavat, että S75A-mutaatio parantaa TrX- ja TrX-HML-ksylanaasien termofiilisyyttä.

Ser —1 Ala -mutaatio kohdassa 75 (S75A) parantaa sekä TrX-75A- että TrX-HML-75A-ksylanaasien termofiihsyyttä verrattuna niiden natiiveihin vastineisiin. S75A-10 mutaatio edustaa muutosta Ser-aminohaposta, jossa on suhteellisen polaarinen ja hydrofiilinen sivuketju, Ala-jäännökseksi, jossa on pieni ja suhteellisen ei-polaa-rinen sivuketju. Teoriaan sitoutumatta on mahdollista, että polaarisen seriiniami-nohapon korvaaminen pienemmällä ei-polaarisella Ala-jäännöksellä tehostaa ksylanaasin molekyylinsisäistä pakkautumista. Ksylanaasin tertiaarirakenteen tehostunut 15 molekyylinsisäinen pakkautuminen voi puolestaan parantaa van der Waals -interaktioita lähekkäin sijaitsevien apolaaristen substituenttien välillä. Tulos sellaisesta parantuneesta molekyylinsisäisestä pakkautumisesta on entsyymin termofiilisyyden kohoaminen. Sellaisissa tapauksissa tarvitaan korkeampia lämpötiloja mutantti- ... ksylanaasin denaturoimiseksi ja inakti voimiseksi.

• · • · • · · 20 Substituoimalla kohta 157 happamalla aminohapolla ja kohdat 161, 162 ja 165 *:··· emäksisellä aminohapolla, esimerkiksi, mutta ei rajoittuen, korvaamalla Asn koh- dassa 157 Aspilla (N157D), Ala kohdassa 161 Argilla (A161R), Gin kohdassa 162 .·. : Hisillä (Q162H) ja Thr kohdassa 165 His:llä (T165H) TrX-157D-161R-162H- .···) 165H:n tuottamiseksi, voi johtaa pieneen kohoamiseen tämän entsyymin termo- • · 25 fiilisyydessä verrattuna TrX-emoentsyymiin (kuvio 15).

' Samalla tavalla Leu 105:n mutaatio Hisrksi (L105H) TrX-HML-ksylanaasissa TrX- HML-105H-mutanttiksylanaasin tuottamiseksi sisältää kohonneen entsymaattisen . aktiivisuuden verrattuna TrX-HML-emoksylanaasiin 70 ja 75 °C:ssa (kuvio 4).

9 9

Leu —> His -mutaatio kohdassa 105 (L105H) parantaa TrX-HML-105H:n termofiili-30 syyttä verrattuna TrX-HML-ksylanaasiin. L105H-mutaatio edustaa muutosta ,·. ; Leuista, joka on hydrofobinen haarautuneen ketjun sisältävä aminohappo, Hisiksi, • · · jossa on suhteellisen tilaa vievä polaarinen imidatsolisivuketju. Teoriaan sitoutumatta, L105H-mutaatio lisää suhteellisesti tilaa vievän planaarisen aminohapon, joka kykenee sitoutumaan vetysidoksin molekyylin lähiympäristössä olevien muiden 20 aminohappojen kanssa, joka mahdollisesti tehostaa entsyymin atomien molekyy-linsisäistä pakkautumista ja näin stabiloi entsyymin tertiääristä rakennetta. Lisäksi, imidatsolisivuketju voi olla protonoitu testiolosuhteissa, joka saa aikaan imidatsoli-konjugaattihapon. Protonoitu imidatsoliryhmä voi ottaa osaa attraktiivisiin elektro-5 staattisiin interaktioihin ksylanaasin kolmiulotteisessa tertiaarirakenteessa ja näin stabiloida sen tertiaarirakennetta.

Ksylanaasin yhdistelmämutantti TrX-HML-75A-105H sisälsi maksimaalisen ent-symaattisen aktiivisuuden 70 °C:ssa ja osoitti lisäksi suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin kumpikaan ksylanaasin yksittäismutantti TrX-HML-75A- tai TrX-10 HML-105H 70 °C:ssa (kuvio 4). Nämä tulokset osoittavat, että S75A- ja L105H-mutaatioiden vaikutukset mutanttiksylanaasin termofiilisyyteen ovat additiivisia tai täydentäviä.

Rakennettiin sarja TrX-HML-ksylanaaseja, joissa oli mutaatiot kohdassa 105 niiden aminohappoj äännösten määrittämiseksi, jotka tehostavat TrX-HML-emoentsyymin 15 termofiilisyyttä (kuvio 5). Kolme kohdan 105 suhteen mutatoitua entsyymiä, TrX-HML-105H, TrX-HML-105R ja TrX-HML-105K, osoittivat suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin TrX-HML-esiaste-entsyymi lämpötilassa, joka oli noin 60 °C tai korkeampi. Natiivi ksylanaasi käsittää kohdassa 105 Leu:n, joka on suh-... teellisen hydrofobinen haarautuneen ketjun sisältävä aminohappo. Mutanttiksyla- 20 naasit, joissa kohta 105 on substituoitu hydrofiilisellä positiivisesti varatulla tai • · · *· *j emäksisellä aminohapolla, esimerkiksi His:llä, Arg:lla tai Lys:llä, sisälsivät tehos- ’ ' tuneen termofiilisyyden.

• · · • · · • ·

TrX-HML-75A-105R-yhdistelmämutanttiksylanaasi osoitti samanlaisen lämpötila- • · .···. aktiivisuusprofiilin kuin TrX-HML-75A-105H-ksylanaasi, joka vihjaa, että S75A- 25 ja L105R-mutaatiot, kuten S75A- ja L105H-mutaatioiden tapauksessa, ovat additii-.. . visia tai täydentäviä. Nämä tulokset vihjaavat lisäksi, että emäksiset jäännökset kohdassa 105 tehostavat ksylanaasien termofiilisyyttä.

• · • · • · ·

Johtuen kohdan 75 mutaatioihin liittyvästä havaitusta termofiilisyyden kohoamises- • · ... ta tutkittiin myös yhdistelmämutaatioita, joissa oli erilaiset substituutiot kohdassa • · T 30 75 yhdessä L105R-mutaation kanssa. Kolme geneettisesti modifioitua ksylanaasi- 0’· mutanttia, TrX-HML-75C-105R, TrX-HML-75A-105R ja TrX-HML-75G-105R, osoittivat suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin esiasteksylanaasi TrX-HML-105R tai TrX-HML-ksylanaasi lämpötiloissa, jotka olivat korkeampia kuin noin 60 °C (kuvio 6). Neljäs mutantti, TrX-HML-75T-105R-ksylanaasi, ei sisältänyt 35 mitään termofiilisyyden tehostumista verrattuna TrX-HML-105R-esiasteksylanaa- 21 siin, jossa on luonnollinen Ser-jäännös kohdassa 75. Mutanttitreoniinijäännös kohdassa 75 on, kuten TrX- ja TrX-HML-emoksylanaaseissa oleva luonnollinen Ser 75 -jäännöskin, hydrofiilinen aminohappo. Yhteenvetona mutaatiot, joissa suoritetaan kohdassa 75 olevan Ser:n korvaaminen pienillä ei-polaarisilla aminohapoilla, kuten, 5 mutta ei rajoittuen, Ala.lla, Gly.llä tai Cysrllä, johtavat ksylanaasin termofiilisyyden kohoamiseen.

Rakennettiin myös sarja mutanttiksylanaaseja, joissa oli mutaatiot Gln-125 —► Ala ja Ile-129 —► Glu. Näillä uusilla mutanteilla entsyymiaktiivisuus oli kohonnut korkeammissa lämpötiloissa verrattuna niiden esiasteksylanaaseihin (katso kuviot 7 -10 9). Nämä sisältävät entsyymit (katso taulukko 2 modifioitujen entsyymien täydelli sen kuvauksen suhteen):

TrX-HML-125A;

TrX-HML-125 A129E;

TrX-HML-GRAE; 15 TrX-HML-AHAE;

TrX-HML-GHAE;

TrX-HML-ARAE;

TrX-HML-GPHAE; ja TrX-HML-GPRAE

• · • · ··· • · 20 Joissain organismeissa näiden modifioitujen ksylanaasien ekspressio ja saanto voi *:**: alentua tai ei ole ollenkaan mahdollista johtuen sellaisten proteiinissa olevien kohti- en syntymisestä, jotka alentavat modifioidun ksylanaasin ekspressiota tai saantoa.

:'. j Tämä alentunut saanto voi vaihdella riippuen isännästä, jossa modifioitua entsyymiä • · .···. ekspressoidaan. Esimerkiksi, mutta ei rajoittaen, muutokset aminohapposekvenssis- 25 sä voivat tuottaa proteolyyttisen katkaisukohdan, jonka proteaasi tunnistaa tietyissä, .. . mutta ei kaikissa isännissä. Tämän ongelman ratkaisemiseksi vierekkäiset aminoha- *,,·* pot halutun mutaatiokohdan toisella tai molemmilla puolilla voidaan modifioida • · *·;·* modifioidun ksylanaasin minkä tahansa isäntäspesifisen ekspressiovaikeuden ja *:··: saantovaikeuden hoitamiseksi. Ne lisäaminohapot, joita muutetaan, eivät edullisesti :***: 30 kumoa alunperin substituoidun aminohapon vaikutusta entsyymin termofiilisyyden ··· tai alkalofiilisyyden tai sekä termofiilisyyden että alkalofiilisyyden kohoamiseen.

V \ Esimerkiksi, mutta ei rajoittaen millään tavalla, substituution L105R käsittävä mo- • · · *· *: difioitu ksylanaasi voidaan tuottaa E. colissa, tämän entsyymin saanto on kuitenkin alentunut Trichodermassa ja Aspergillusissa johtuen endogeenisesta KEX-proteaa-35 siaktiivisuudesta, joka tunnistaa aminohappoyhdistelmän “Lys-Arg” kohdissa 104 ja 105, vastaavasti. Tässä tapauksessa aminohappo kohdassa 104 voidaan substi- 22 tuoida vaihtoehtoisella aminohapolla, esimerkiksi ei-polaarisella aminohapolla, kuten modifioiduissa TrX-HML-GPHAE- tai TrX-HML-GPRAE-ksylanaaseissa. Kuten kuviossa 14 on esitetty, kohdan 104 Lys:n substituutio Pro:lla ei vaikuta näiden modifioitujen ksylanaasien termofiilisyyteen tai alkalofiilisyyteen. On ymmärrettä-5 vä, että muut proteaasit voivat tunnistaa muita aminohappoyhdistelmiä, joita voidaan tuottaa, kun valmistetaan tässä kuvattuja modifioituja ksylanaaseja. Sen vuoksi esillä oleva keksintö koskee myös modifioitua ksylanaasia, joka käsittää yhden tai useamman substituoidun aminohapon tässä kuvattujen aminohappojen vieressä.

Sen vuoksi tämä keksintö sisältää modifioidun ksylanaasin, joka käsittää His:n koh-10 dassa 10, Met:n kohdassa 27, Leu:n kohdassa 29 ja ainakin yhden seuraavista: ei-polaarisen aminohapon kohdassa 75, 104 tai 125 tai niiden yhdistelmän; polaarisen aminohapon kohdassa 105; ja happaman aminohapon kohdassa 129.

Edullisesti, aminohappo kohdassa 75 on Ala, aminohappo kohdassa 125 on valittu 15 ryhmästä, jonka muodostavat Ala, Cys, Gly ja Thr, aminohappo kohdassa 125 on Glu, aminohappo kohdassa 105 on valittu ryhmästä, jonka muodostavat His, Lys ja Arg ja aminohappojäännös kohdassa 104 on Pro.

, · · ·, Ksylanaasin alkalofiilisyyden kohottaminen • > · • · •V·: Kuviossa 10 on esitetty pH-olosuhteiden vaikutus TrX-75A-yksittäismutantti- *"*: 20 ksylanaasin entsymaattiseen aktiivisuuteen. TrX-75A-mutanttiksylanaasi sisältää 55 °C:ssa kohoneen aktiivisuuden pH:ssa, joka on yli 5,5 verrattuna natiiviin TrX- :*·.· entsyymiin samoilla pH-alueilla. Samanlainen parantunut vaikutus alkalofiili- • · .**·. syyteen havaittiin myös TrX-HML-75A:lla, jossa Ser-jäännös kohdassa 75 oli sub- • · · stituoitu Ala-jäännöksellä (TrX-75A), verrattuna TrX-HML-emoksylanaasiin pH- ... 25 olosuhteissa välillä 6,5 ja 7 (kuvio 11).

• · • * • · ·

Alkalofiilisyyden kohoaminen yhdessä aktiivisuuden kohoamisen kanssa pH:ssa, joka oli noin 5,2 - noin 6,5, havaittiin myös TrX-157D-161R-162H-165H:lla, kun .···, sitä verrattiin natiivin TrX:n vastaavaan samalla pH-alueella (kuvio 16).

• · • · · :*·*: L105H-mutaatio TrX-HML-105H-mutanttiksylanaasissa kohotti myös entsymaatti- .‘. j 30 sen aktiivisuuden suuremmaksi kuin TrX-HML-emoksylanaasin vastaava pH:ssa 6,5 ja 7,0 (kuvio 11). Mielenkiintoista on, että TrX-HML-75A-105H-yhdistelmä-mutanttiksylanaasi osoitti suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin TrX-HML-75A- tai TrX-HML-105H-yksittäismutanttiksylanaasit pH:ssa 6,5 ja 7,0 (ku- 23 vio 11), joka vihjaa, että S75A-mutaation ja L105H-mutaation vaikutukset ksyla-naasin alkalofiilisyyteen ovat additiivisia tai täydentäviä.

Rakennettiin geneettisesti sarja kohtaan 105 modifioituja ksylanaaseja niiden ami-nohappojäännösten määrittämiseksi, jotka edistävät modifioitujen ksylanaasien al-5 kalofiilisyyden kohoamista (kuvio 12). Kolme kohdan 75 suhteen mutatoitua ksy-lanaasia, TrX-HML-105H, TrX-HML-105R ja TrX-HML-105K, osoittivat suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin TrX-HML-esiasteksylanaasi pH-olosuh-teissa 6,5 - 7,0. Yhteenvetona mutaatiot, jotka johtavat alkalofiilisyyden kohoamiseen, edustavat muutosta haarautuneen ketjun sisältävästä suhteellisen hydrofobi-10 sesta Leu-jäännöksestä jäännökseksi, joka on hydrofiilinen, positiivisesti varattu tai emäksinen.

Sitoutumatta teoriaan, hydrofiiliset, positiivisesti varatut tai emäksiset jäännökset voivat tehostaa molekyylinsisäistä pakkautumista muiden atomien kanssa, jotka sijaitsevat vierekkäin samalla alueella ksylanaasin tertiaarirakenteessa. Nämä jään-15 nökset voivat stabiloida entsyymin kolmiulotteista rakennetta sellaisia rakenteellisia häiriöitä vastaan, jotka voivat syntyä molekyylissä molekyylin muiden alueiden useiden aminohappojen ionisoituvien sivuketjujen titrauksen välityksellä. Jälleen sitoutumatta teoriaan, sivuketjun emäksinen ionisoitunut muoto voi olla tärkeä muu- ... tettaessa entsyymin pH-aktiivisuusprofiilia, koska pH:ssa välillä 6-7 Arg- ja Lys- • · ";··[ 20 jäännöksillä on sivuketjut, jotka todennäköisesti jäävät protonoituneiksi. Tälle päin- • · · *· *: vastaisesti His-jäännökset, joiden pKa-arvo imidatsoliryhmän suhteen on liuoksessa *·*’*·* noin 6, voivat olla läsnä joko protonoituneena tai protonoitumattomana muotona.

« · ·’.*·: Alan ammattimiehet kuitenkin tietävät, että aminohapposivuketjua ympäröivien substituenttien polaarisuus voi vaikuttaa sen pKa-arvoon. Esimerkiksi His-jäännök-25 sen sivuketjun pKa-arvo voi proteiinin polaarisella tai hydrofobisella alueella olla 6, • · · kun taas saman sivuketjun pKa-arvo voi hydrofobisessa tai apolaarisessa ympäris- : ·. ·. tössä olla 7 tai suurempi.

• ·

«M

* Toisessa tutkimuksessa rakennettiin mutaatiot TrX-HML:n kohtaan 75 sen määrittä- ·:··· miseksi, mitkä jäännökset edistävät alkalofiilisyyden kohoamista modifioiduissa .*··. 30 ksylanaaseissa (kuvio 13). Neljä ksylanaasia, joissa oli mutaatiot kohdassa 75, TrX- X HML-75C-105R, TrX-HML-75A-105R, TrX-HML-75G-105R ja TrX-HML-75T- • · · Y 105R, osoittivat suuremman entsymaattisen aktiivisuuden pH-olosuhteissa 6,0, 6,5 ja 7,0 kuin TrX-HML- ja TrX-HML-105R-esiasteksylanaasit.

Mutaatiot Q125A ja I29E, jotka tehostivat ksylanaasien termofiilisyyttä, ovat yhteen 35 sopivia yllä kuvattujen kohtien 75 ja 105 mutaatioiden kanssa, koska yhdistelmä- mutantit, kuten TrX-HML-75G-105H-125A129E, joka sisältää nämä kaksi mutaa tiota, säilyttivät yleensä TrX-HML-75G-105H-esiasteksylanaasin pH/aktiivisuus- profiilin (kuvio 14).

24

Rakennettiin myös sarja mutanttiksylanaaseja, joissa oli mutaatiot Gin-125 —> Ala 5 ja Ile-129 —> Glu. Näillä uusilla mutanteilla entsyymiaktiivisuus oli kohonnut korkeammassa pH:ssa verrattuna niiden esiasteksylanaaseihin (katso kuviot 11 - 14 ja 17 - 19). Nämä sisältävät entsyymit (katso taulukko 2 modifioitujen entsyymien täydellisen kuvauksen suhteen):

TrX-HML-125A; 10 TrX-HML-125A129E;

TrX-HML-GRAE;

TrX-HML-AHAE;

TrX-HML-GHAE;

TrX-HML-ARAE; 15 TrX-HML-GPHAE;

TrX-HML-GPRAE;

TrX-HML-AHAE-RR;

TrX-HML-AHAE-RRR;

TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH;

20 TrX-HML-AHA-RR-DRHH; ja OI TrX-HML-AHAE-RR-DRHH

• · .·. : Mutanttiksylanaasit, jotka käsittävät emäksisen aminohapon kohdassa 132 ja 135 | yllä kuvattujen substituutioiden lisäksi, sisältäen HML-75A-105H-125A-129E:n, # »· I./ osoittivat kohoamisen alkalofiilisyydessä. Samalla tavalla mutantti, joka käsittää *·’·* 25 emäksisen aminohapon kohdissa 132, 135 ja 144, osoitti myös kohoamisen alkalo fiilisyydessä. Esimerkit modifioiduista ksylanaaseista, joissa on nämä mutaatiot, si- : V sältävät TrX-HML-AHAE-RR:n ja TrX-HML-AHAE-RRR:n (kuvio 17).

• ·· • · f · i·· * , Ksylanaaseihin tehtiin lisämodifikaatioita entsyymin alkalofiilisyyden kohottami- seksi. Esimerkiksi happaman aminohapon substituutio kohdassa 157, emäksisen • · *···* 30 aminohapon substituutio kohdissa 161, 162 ja 165 niin, että läsnä oli emäksiset aminohapposubstituutiot kohdissa 132, 135 ja 144 tai ilman niitä, kohotti myös al- ;\j kalofiilisyyttä. Esimerkiksi TrX-HML-AHAE-RR-DRHH tai TrX-HML-AHAE- • · RRR-DRRH kumpikin osoitti alkalofiilisyyden kohoamisen (kuviot 18, 19) ja niiden MEP oli noin 7,0 (kuvio 20), kun niitä verrattiin TrX-HML-AHAE:hen, jonka 35 MEP on noin 6,5, tai TrX:ään, jonka MEP on noin 5,6.

25

Lisäkohoaminen alkalofiilisyyteen verrattuna yllä kuvattuihin saatiin myös substi-tuoimalla hapan aminohappo kohdassa 157 ja substituoimalla emäksinen aminohappo kohdissa 135, 144, 161, 162, 165, ja jättämällä aminohapot kohdissa 129 ja 132 niiden luonnollisiksi aminohapoiksi, esimerkkinä TrX-HML-AHA-RR-DRHH 5 (kuviot 18 ja 19). Tämän entsyymin MEP on noin 7,4.

TrX-HML-AHAE:n pH-optimin laajuus on paljon suurempi kuin TrX:n pH-profiili (katso esim. kuvio 19). Useiden esillä olevan keksinnön mukaisten modifioitujen ksylanaasien pH-optimin laajuus on sellainen, joka lähentelee natiivin TrX:n pH-optimin laajuutta, näiden modifioitujen ksylanaasien pH-optimi on kuitenkin siirty-10 nyt niin, että kohoaminen on ainakin noin yksi pH-yksikkö (kuvio 19) verrattuna TrX:n vastaavaan. TrX:llä on 80 % sen optimaalisesta aktiivisuudesta pH:ssa, joka on noin 4,8 - noin 5,6 (pH-optimi 80 % aktiivisuudella 0,8 pH-yksikön alueella). TrX-HML-AHAE:llä pH-alue, jossa sillä on 80 % sen optimaalisesta aktiivisuudesta, on paljon leveämpi sen ollessa noin 4,8 - noin 6,5 (noin 1,7 pH-yksikköä). TrX-15 HML-AHAE-RR:n ja TrX-HML-AHAE-RRR:n pH-alue, jossa niillä on 80 % optimaalisesta aktiivisuudesta, on noin 5,4 - noin 6,6 (noin 1,2 pH-yksikköä, kuvio 17), TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH:lla ja TrX-HML-AHAE-RR-DRHH:lla tämä pH-alue on noin 5,8 - 7,0 (noin 1,2 pH-yksikköä) ja TrX-HML-AHA-RR-DRHH:lla se on noin 5,9 - noin 7,4 (noin 1,5 pH-yksikköä; katso kuviot 18 ja 19).

« · · • · ';··] 20 Sen vuoksi tämä keksintö koskee myös modifioitua ksylanaasia, joka käsittää His:n • · · *· '· kohdassa 10, Met:n kohdassa 27, Leu:n kohdassa 29 ja ainakin yhden seuraavista: « · ei-polaarisen aminohapon kohdassa 75, 104 tai 125 tai niiden yhdistelmän; • · .·. : polaarisen aminohapon kohdassa 105; ,··♦[ happaman aminohapon kohdissa 129 ja 157; ja • ♦ 25 emäksisen aminohapon kohdissa 132, 135, 144, 161, 162 tai 165 tai niiden yhdis- .. . telmän.

♦ ♦ ♦ • ♦ • · f **; Edullisesti, aminohappo kohdassa 75 on Ala, aminohappo kohdassa 125 on valittu ‘ . ryhmästä, jonka muodostavat Ala, Cys, Gly ja Thr, aminohappo kohdassa 125 on ... Glu. Aminohappo kohdassa 105 on valittu ryhmästä, jonka muodostavat His, Lys ja ’*;** 30 Arg, aminohappojäännös kohdassa 104 on Pro, aminohappo kohdassa 132, 135,144 ja 161 on Arg, aminohappo kohdassa 157 on Asp ja aminohappo kohdassa 162 ja 165 on His.

Yhteenvetona, TrX-mutanttiksylanaasit, joilla on parantunut alkalofiilisyys, voidaan rakentaa: 26 i) mutatoimalla Ser75 pieneksi ei-polaariseksi jäännökseksi, esimerkiksi, mutta ei rajoittuen, Ala:ksi. Lisäksi, kohta 75 voidaan substituoida polaarisilla jäännöksillä, esimerkiksi, mutta ei niihin rajoittuen, Gly:llä, Cysillä ja Thr:llä; ii) mutatoimalla Leul05 emäksiseksi jäännökseksi, kuten, mutta ei niihin rajoittuen, 5 Arg:ksi, Lys:ksi tai His:ksi; iii) mutatoimalla Glnl25 Ala:ksi; iv) mutatoimalla Ilel29 Glu:ksi; v) mutatoimalla Alal32, Tyrl35, Hisl44, Glnl61, Glnl62, Thrl65 tai niiden yhdistelmä emäksiseksi aminohapoksi, esimerkiksi Arg:ksi, Lys:ksi tai His:ksi; 10 vi) mutatoimalla Asnl57 happamaksi aminohapoksi, esimerkiksi Aspiksi tai Gluiksi; vii) yhdistämällä kohdassa i) kuvatut mutaatiot kohdassa ii) mainittujen kanssa kohdan iii) mukaisen entsyymin muodostamiseksi termofiilisyyden ja alkalofiilisyy-den parantamiseksi; tai 15 viii) yhdistämällä yllä olevissa kohdissa i) - vi) kuvatut mutaatiot HML-saijan mu- .···. taatioiden kanssa, kuten yllä on kuvattu (katso myös US 5 759 840).

• « * · · • · *.*·: Edellä olevan kuvauksen ei ole tarkoitettu rajoittavan vaadittua keksintöä millään tavalla, lisäksi, keskustellut ominaisuuksien yhdistelmät eivät välttämättä ole täysin tarpeellisia keksinnön suorittamiseksi.

• · * · · • ·· 20 Esimerkit • · • · ·*·

Esillä olevaa keksintöä kuvataan edelleen seuraavissa esimerkeissä. On kuitenkin ymmärrettävä, että nämä esimerkit on annettu ainoastaan kuvaavia tarkoituksia var-ten eikä niitä tule pitää millään tavalla esillä olevan keksinnön piiriä rajoittavina.

* · · m

Esimerkki 1 Trichoderma reesei -mutanttiksylanaasien rakentaminen • · · • · • · ]·* 25 Yhdistelmä-DNA-perusmenetelmät, kuten plasmidin valmistus, restriktioentsyymi- * digestio, polymeraasiketjureaktio, oligonukleotidifosforylaatio, ligaatio, transfor- • · ·.**: maatio ja DNA-hybridisaatio, suoritettiin alan ammattimiesten hyvin tuntemien me netelmien mukaisesti (esim. Sung et ai., 1986) tai entsyymien ja käyttöpakkausten valmistajan ohjeiden mukaisesti. Monien entsyymien puskurit hankittiin käyttöpak-30 kausten mukana tai ne valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Restriktioent- 27 syymit, T4 polynukleotidikinaasi ja T4 DNA ligaasi hankittiin New England Bio-Labs Ltd. -valmistajalta, Mississauga, Ont. GeneAmp PCR -reagenssikäyttöpakkaus hankittiin Perkin-Elmer-valmistajalta. Esiasteplasmidi pXYbc, joka on pUC-tyypin plasmidi, johon on insertoitu Bacillus circulans -ksylanaasigeeni, on valmistettu ja 5 julkaistu aiemmin (Sung et ai., 1993; Campbell et ai., US-patentti nro 5 405 769). Yleisesti käytettyä E. coli -kantaa HB 101 (Clonetech Lab, Palo Alto, CA) käytettiin kaikkien geenirakenteiden transformaatio- ja ekspressioisäntänä. Koivun ksylaani ja Remazol Brilliant Blue R-D -ksylaani hankittiin Sigma-valmistajalta (St. Louis, Mo). Hydroksibentsoehappohydratsidi (HBAH) hankittiin Aldrich-valmistajalta. 10 Oligonukleotidit valmistettiin APPLIED BIOSYSTEM DNA -syntetisaattorilla (malli 380B). Kaikki ksylanaasin entsymaattiset testit suoritettiin peitetyssä kierto-vesihauteessa (Haake tyyppi F4391) ja sen lämpötilat pidettiin rajoissa ±0,1 °C.

1-1: Synteettisen TrX-sekvenssin (sekvenssi nro 39) sisältävän esiasteplasmidin pTrX rakentaminen 15 Esiasteplasmidi pTrX, jossa on alla kuvatut mutaatiot, on julkaistu aiemmin (Sung et ai., 1995). Tämä plasmidi on peräisin pUC119-plasmidista, jossa on synteettinen nukleotidisekvenssi, joka koodittaa Trichoderma reesei -ksylanaasia (TrX; kuvio 2). Tämän ksylanaasin ja muiden seuraavaksi kuvattujen mutanttiksylanaasien ekspres-sio on pUC-plasmidin lac Z -promoottorin säätelyn alaisuudessa. Trichoderma-ksy- • · ’···] 20 lanaasigeenin täydellinen rakentaminen vaati kaksi vaihetta, ensin alueen (92 - 190; *.**: Tr2-numerointi) lisäyksen, sitten alueen (1 - 92; Tr2-numerointi) lisäyksen. Mene- telmä tämän geenin rakentamiseksi on rutiinia ja identtinen monien muiden geenien /·· rakentamiseksi julkaistun standardimenetelmän kanssa. Menetelmässä tarvitaan päällekkäin menevien ksylanaasia koodittavien synteettisten oligonukleotidien ent- :***: 25 symaattinen fosforylaatio. Tämän jälkeen suoritetaan niiden ligoiminen sopivasti • * · katkaistuun plasmidiin.

• * · • · · : ·* TrX (92 - 190) -aluetta varten suunniteltiin kymmenen päällekkäin menevää oligo- :’ nukleotidia (katso kuvio 2): • ..." XyTv-101, sekvenssi nro 29; *·;·* 30 XyTv-102, sekvenssi nro 30; :T: TrX-103, sekvenssi nro 31; • :*·.· XyTv-104, sekvenssi nro 32; • ·

XyTv-105, sekvenssi nro 33;

XyTv-106, sekvenssi nro 38; 35 XyTv-107, sekvenssi nro 37; 28

TrX-108, sekvenssi nro 36;

XyTv-109, sekvenssi nro 35; ja XyTv-110, sekvenssi nro 34 niin, että niiden kodonikäyttöfrekvenssi matki E. colin vastaavaa. Kahden päissä si-5 jaitsevan oligonukleotidin kohesiiviset Sali- ja Bglll-päät sallivat näiden kymmenen fragmentin entsymaattisen ligoimisen linearisoituun plasmidiin pXYbc. Nämä kymmenen oligonukleotidia (50 pmol, 1 μΐ kutakin), jotka koodittivat Trichoderma-ksylanaasin aluetta TrX (92 - 190), fosforyloitiin seoksessa, joka sisälsi 10X kinaa-sistandardipuskuria (0,4 μΐ), 1 mM ATP:tä (4 μΐ), T4 DNA -kinaasia (5 yksikköä) ja 10 vettä (3 μΐ). Fosforylaatioreaktiot suoritettiin yhden tunnin ajan 37 °C:ssa. Sitten liuokset yhdistettiin ja kuumennettiin 70 °C:seen 10 minuutiksi. Kun yhdistettyjen liuosten oli annettu hitaasti jäähtyä huoneenlämpötilaan, ne lisättiin seokseen, jossa oli 4 mM ATP:tä (3,5 μΐ), EcoRI-Hindlll-linearisoitua plasmidia pUC119 (0,1 pmol) ja T4 DNA -ligaasia (3,5 μΐ), ja niitä inkuboitiin 12 °C:ssa 20 tuntia. Pienet 15 määrät ligaatioseosta käytettiin transformoimaan E. coli HB 101 YT-maljoilla (8 g hiivauutetta, 5 g bacto-tryptonia, 5 g NaCl:ia, 15 g agaria 1 litrassa vettä), joka sisälsi ampisilliinia (100 mg/1).

Hybridisaatiokoettimen valmistamiseksi yksi oligonukleotideista, esimerkiksi

XyTv-110 (10 pmol, 1 μΐ), fosforyloitiin 32P-ATP:llä (10 pmol, 3 μΐ) käyttäen T4 ’.**** 20 DNA -kinaasia (1 μΐ), 10X kinaasipuskuria (1 μΐ) ja vettä (4 μΐ), 37 °C:ssa yhden • · · *· *| tunnin ajan.

• ·

Transformantit valittiin satunnaisesti hybridisaatioanalyysiin. Pesäkkeet kasvatettiin • · ;*. j YT-maljoilla ampisilliinin kanssa yli yön ja ne siirrettiin nailonfilttereille. Sitten ne

.···[ denaturoitiin 0,5 N NaOH - 1,5 M NaCl -liuoksella (10 min) ja neutraloitiin 0,5 N

25 Tris-HCl (pH 7,0) - 1,5 M NaCl -liuoksella (10 min). Kun oli suoritettu ultraviolet-.. . tisäteilytys 254 nm:ssa kahdeksan minuuttia, filtterit pestiin 6X SSC - 0,05 % Tri- ton X-100 -liuoksella 30 minuutin ajan. Soluroskat pyyhittiin pois täydellisesti. Kun • · *·;·' oli pidetty toiset 30 minuuttia tuoreessa liuoksessa, rinnakkaisfiltterit siirrettiin erik- ·:··: seen eri seoksiin, jotka olivat 6X SSC - 1 % dekstraanisulfaatti - 0,05 % Triton X- :***: 30 100 - IX Denhardt-hybridisaatioliuos. Filtterille lisättiin 32P-leimattu koetin. Kun • · · oli pidetty 16 tuntia 45 °C:ssa, filtteri pestiin kaksi kertaa viisi minuuttia 6X SSC - • · · Y ] 0,05 % Triton X-100 -liuoksella huoneenlämpötilassa ja sitten 65 °C:ssa 30 minuut- • · · *· “ tia. Välimuotoplasmidin pBcX-TrX positiivisesti hybridisoituvat kloonit tunnistet tiin autoradiografialla.

29

Edellä olevaa menetelmää, joka sisältää synteettisten päällekkäin menevien oligo-nukleotidien fosforylaation ja niiden ligoimisen linearisoituun plasmidiin, käytettiin TrX (1-92) -alueen kokoamiseksi ja sen jälkeen kasettimutageneesissa, jolla muodostettiin tämän keksinnön muut mutanttiksylanaasit.

5 Alueen TrX (1 - 92; Tr2-numerointi) kokoamiseksi täyspitkän Trichoderma reesei -ksylanaasi II -geenin (TrX) valmistamiseksi välimuotoplasmidi pBcX-TrX lineari-soitiin Nhel- ja Kpnl-endonukleaaseilla BcX (1 - 83) -DNA-insertin vapauttamiseksi. Kohesiivisten Nhel- ja Kpnl-päiden avulla ligoitiin kahdeksan päällekkäin menevää oligonukleotidia: 10 TrX-1, sekvenssi nro 21;

XyTv-2, sekvenssi nro 22;

TrX-3, sekvenssi nro 23;

XyTv-4, sekvenssi nro 24;

XyTv-5, sekvenssi nro 28; 15 TrX-6, sekvenssi nro 27;

XyTv-7, sekvenssi nro 26; ja

TrX-8, sekvenssi nro 25 jotka koodittavat sekvenssiä TrX (1 - 92), linearisoituun plasmidiin pBcX-TrX (ku- ·«« :...· vio 2) yllä kuvatulla menetelmällä. Uusi plasmidi pTrX sisälsi näin ollen synteetti- 20 sen TrX-geenin (sekvenssi nro 39).

• · . . Kaikki alla kuvatut mutanttiksylanaasigeenit on rakennettu kasettimutageneesime- *; *| netelmällä. Kasettimutageneesimenetelmä oli identtinen yllä kuvatun geenikokoa- • · · mismenetelmän kanssa. Yleisesti, kasettimutageneesi sisälsi vaiheet, joissa (i) fosfo-ryloitiin päällekkäin menevät synteettiset oligonukleotidit entsymaattisesti, (ii) li-25 goitiin synteettiset oligonukleotidit linearisoidun plasmidin kanssa, (iii) transfor- • · · • \· moitiin plasmidi kompetentteihin E. coli HB 101 -soluihin, (iv) tunnistettiin mutant- : titransformantit hybridisoiden leimatulla oligonukleotidilla ja (v) varmistettiin mu- • # #. taatio dideoksinukleotidisekvensoinnilla.

··· 1-2: Esiasteplasmidin pTrX-HML rakentaminen • · · • · · Y [ 30 Esiasteplasmidin pTrX-HML rakentaminen on kuvattu yksityiskohtaisesti US- *· *: patentissa nro 5 759 840 (katso esimerkki IN, johon tässä viitataan; plasmidin nimi pNl-TX13). TrX-HML käsittää natiivin TrX-ksylanaasin, jossa on kolme mutaatiota, N10H (Asn kohdassa 10 on korvattu His:llä), Y27M ja N29L. Ensimmäiset 30 aminohappoa, jotka käsittävät mutaatiot N10H, Y27M ja N29L, on esitetty alla.

30

TrX 12345678

aminohappo QTIQPGTG

5' -CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA ACC GGT 3 1 -G ATT CCT CC GAC GTC TAC GTT TGT TAT GTT GGT CCT TGG CCA Nhel PinAI

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

YHNGYFYSYWNDGHGG TAC CAC AAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GAT GGC CAT GGA GGC

ATG GTG TTG CCA ATG AAA ATG TCG ATA ACC TTG CTA CCG GTA CCT CCG

25 26 27 28 29 30

V T M T L G

GTC ACA ATG ACT CTG GGG

CAG TGT TAC TGA GAC CCC

1-3: Deleetioplasmidin pTrX (1-113) rakentaminen

Plasmidi pTrX (1 - 113) käsittää sekvenssin nro 39 nukleotidit 1-113 (TrX-sek-venssin nukleotidit 1 - 113) eikä pysty ekspressoimaan aktiivista ksylanaasia. Sel-5 laiset transformantit varmistetaan sillä, että niiltä puuttuu kirkas vyöhyke tai kehä transformanttipesäkkeiden ympäriltä Blue-ksylaanimaljoilla.

• · ·

Uusi plasmidi pTrX (1-113) rakennettiin (i) poistamalla pTrX-plasmidin kooditta- va TrX (114 - 190) -sekvenssi katkaisemalla BamHI- ja Bglll-restriktioentsyy- ·:··· meillä, (ii) ligoimalla linearisoidun plasmidin identtiset kohesiiviset päät yhteen, j 10 (iii) transformoimalla kompetentteihin E. coli HB101 -soluihin maljaamalla sen jäi-• · .·. : keen YT-maljalle (joka sisälsi 5 g hiivauutetta, 3 g bacto-tryptonia, 5 g NaCl:ia, 15 • ♦· 1.·[ g agaria 1 litrassa vettä, 1 g Remazol Brilliant Blue R-D -ksylaania ja ampisilliinia • · *** 100 mg/1), (iv) tunnistamalla mutanttitransformantit ksylanaasiaktiivisuuden häviä- .. . misen avulla (pesäkkeiden ympärillä ei ollut kirkasta vyöhykettä tai kehää Blue- • · · 15 ksylaanimaljalla, kun oli kasvatettu yli yön 40 °C:ssa) ja (v) varmistamalla mutaatio dideoksinukleotidisekvensoinnilla. Menetelmä näille kullekin vaiheelle oli saman- •: · · · lainen kuin yllä kuvatulle geenikokoamiselle.

··» • · *·;·* 1-4: Deleetioplasmidin pTrX-HML (1-113) rakentaminen ··· • · · * · · . Plasmidi pTrX-HML (1-113) on samanlainen kuin plasmidi pTrX (1 - 113), mutta • · * * * 20 se sisältää kolme mutaatiota kohdilla 10, 27 ja 29 (Tr2-numerointi), jotka ovat N10H, Y27M ja N29L (kuten yllä on kuvattu). Plasmidi rakennettiin samalla menetelmällä kuin on kuvattu plasmidin pTrX (1-113) rakentamiseksi (katso yllä) niin, 31 että aluetta TrX (114 - 190) koodittava sekvenssi deletoitiin. Plasmidi pTrX-HML (1 - 113) ei ekspressoi aktiivista ksylanaasia.

1-5: Plasmidien pTrX-75A ja pTrX-105H rakentaminen

Kaikki seuraavat mutanttiksylanaasigeenit, jotka perustuvat pTrX-plasmidista peräi-5 sin oleviin plasmideihin pTrX (1 - 113)(katso esimerkki 1-3) ja pTrX-HML (1 -113) (katso esimerkki 1-4), rakennettiin käyttäen kasettimutageneesia. Spesifisiä mutaatioita sisältäviä PCR-alukkeita käytettiin PCR-tuotteiden muodostamiseksi. Näitä PCR-tuotteita käytettiin täyspitkien ksylanaasigeenien C-pään sekvenssin valmistamiseksi (jäännökset 114 - 190; Tr2-numerointi). Kirkkaiden vyöhykkeiden 10 tai kehien ilmestyminen Blue-ksylaania sisältäville maljoille maljattujen transfor-manttipesäkkeiden ympärillä osoitti, että nämä pesäkkeet ekspressoivat natiivia ksylanaasia ja näin se muodostaa markkerin klooneille, jotka ekspressoivat toimivaa TrX-mutanttientsyymiä.

Menetelmä näiden plasmidien rakentamiseksi on samanlainen kuin aiemmin kuvat-15 tu menetelmä geeninkokoamiselle (yllä). Menetelmä sisälsi vaiheet, joissa: i) suoritettiin PCR-reaktio alukeoligonukleotideilla, joissa oli spesifiset mutaatiot kohdassa 75 (plasmidin pTrX-75A tapauksessa) tai kohdassa 105 (plasmidin pTrX-105H tapauksessa), ·« · • · · *· *j ii) katkaistiin PCR-tuote toisesta päästä Hindlll-restriktioentsyymillä ja toisesta 20 päästä Kasi- tai EcoRI-restriktioentsyymillä,

• · S

• · · • · iii) ligoitiin restriktiofragmentit Hindlll/KasI- tai EcoRI-linearisoituun deleetioplas- • » .···. midiin, • · • · · iv) transformoitiin kompetentteihin E. coli HB 101 -soluihin, ·· « • · · • · • · .··*. v) tunnistettiin ksylanaasiaktiivisuutta ekspressoivat mutanttitransformantit (jonka •\ 25 osoitti kirkkaan vyöhykkeen tai kehän ilmestyminen sellaisten pesäkkeiden ympä- ' * rille, jotka oli maljattu Blue-ksylaania sisältävälle ravintoalustalle), ja • · • · ··· •I. vi) varmistettiin mutaatio dideoksinukleotidisekvensoinnilla.

• · · • · · • :.*·· Nämä kaksi ksylanaasimutanttia, TrX-75A ja TrX-105H, käsittävät TrX-sekvenssin sillä poikkeuksella, että Ser kohdassa 75 korvattiin Ala-jäännöksellä (S75A) plas-30 midissa TrX-75A ja Leu kohdassa 105 korvattiin His-jäännöksellä (L105H) plasmi-dissaTrX-105H.

32 PCR-alukkeet, joita käytettiin näiden geneettisesti modifioitujen ksylanaasien muodostamiseksi (spesifinen mutaatio on esitetty lihavoituna), ovat: PCR-oligonukleotidialukkeet: TX-75A-1 (sekvenssi nro 40) 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81

NGNSYLAVYGWSR 5' -T GGG AAT TCA TAC TTA GCC GTC TAT GGC TGG TCT AG EcoRI

TX-105H-1 (sekvenssi nro 41) 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 TGATKHGEVTSDGS5' -ACC GGC GCC ACA AAA CAC GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCC Kasi 5 PCR-käänteisaluke TX-C1 oli: TX-Cl (sekvenssi nro 42)

183 184 IBS 186 187 188 189 190 ter GSAS1TVS

CCA AGG CGA TCA TAA TGT CAC TCG ATT TCT AGA ACT TCG AAC CC-5'

Bgll HindiII

• · • · ·· · :*·.· Sopiva PCR-templaatti, sopivat oligonukleotidialukkeet ja PCR-tuotteiden päät kat- • · kaisevat restriktioentsyymit on lueteltu alla olevassa taulukossa 3 - 1.

• · *· " Taulukko 3-1 • · • · · • ·· • · I ..... I I I 1 PCR-tuote Ylävirran PCR- PCR- Restriktioentsyy- ·»· PCR-aluke käänteisaluke templaatti mit PCR-tuotteelle ·♦ «---—.... .....

: V (a) TX-75A-1 TX-Cl pTrX EcoRI/ffindlll ·♦· • · • · (b) TX-105H-1 TX-Cl pTrX Kasl/Hindlll • · • · · : : 10 • · · .···. PCR-tuotteen (a) valmistamiseksi plasmidia pTrX käytettiin PCR-templaattina. Re- • t · . aktioliuos sisälsi plasmidin pTrX DNA:ta (50 ng, 15 μΐ), 5 μΐ 10X puskuria (100 ’ * mM KC1, 100 mM ammoniumsulfaatti, 200 mM Tris-HCl, pH 8,8, 40 mM magne siumsulfaatti, 1 % Triton X-100, 100 mg/ml BSA), 5 μΐ 5 mM dNTP-nukleotideja, 33 PCR-aluketta TX-75A (25 pmol, 2,5 μΐ) ja PCR-käänteisaluketta TX-C1 (25 pmol, 2,5 μΐ) ja vettä (19 μΐ).

Reaktio peitettiin paraffiiniöljyllä (50 μΐ) haihtumisen estämiseksi. Reaktioseos esi-lämmitettiin 94 °C:seen ilman entsyymiä 5 minuutiksi, sitten reaktioseos jäähdytet-5 tiin 72 °C:seen. Sen jälkeen reaktioseokseen lisättiin DNA-polymeraasia (1 μΐ, 1 U). Reaktioseosta inkuboitiin PCR-laitteessa 30 sykliä, jotka olivat 94 °C, 1 minuutti, 55 °C, 2 minuuttia ja sitten 72 °C, 2 minuuttia. PCR-tuotteen saanto oli noin 1 pg 400 bp pituista fragmenttia. Tämä fragmentti puhdistettiin agaroosigeelistä.

EcoRI/Hindlll-linearisoitu PCR-tuote (a) (taulukko 3-1) ligoitiin EcoRI/Hindlll-10 linearisoituun pTrX-plasmidiin muodostaen plasmidi pTrX-75A, joka käsittää täys-pitkän ksylanaasin, jossa Ser kohdassa 75 on korvattu Alarlla (S75A).

Samalla tavalla valmistettiin PCR-tuote (b) (taulukko 3-1) ja se linearisoitiin KasI-ja Hindlll-restriktionukleaaseilla. Linearisoitu tuote (b) ligoitiin Kasl/Hindlll-linearisoituun plasmidiin pTrX plasmidin pTrX-105H muodostamiseksi, joka plas-15 midi käsittää täyspitkän ksylanaasin, jossa Leu kohdassa 105 on korvattu His:llä (L105H).

1 - 6: pTrX-HML-105H:n, pTrX-HML-105K:n ja pTrX-HML-105R:n rakentami- :1··; nen • · · • · *· Kolme mutanttiksylanaasia, TrX-HML-105H, pTrX-HML-105K ja pTrX-HML- * 1 20 105R, ovat samanlaisia kuin TrX-HML paitsi, että niissä Leu kohdassa 105 on kor- • · vattu His:llä (L105H), Lys:llä (L105K) ja Arg:lla (L105R), vastaavasti. Kuten aiem- • · :.2i min on osoitettu, TrX-HML-ksylanaasi on samanlainen kuin TrX-ksylanaasi paitsi, että Asn kohdassa 10 on korvattu His:llä (N10H), Tyr kohdassa 27 on korvattu Met:llä (Y27M) ja Asn kohdassa 29 on korvattu Leu:lla (N29L).

• · · • · · 25 Plasmidin pTrX-HML-105H rakentamiseksi käytettiin samanlaista PCR-tuotetta (b) • · *·;·1 kuin käytettiin plasmidin pTrX-105H syntetisoimiseksi. Plasmidien pTrX-HML- *:··: 105K ja pTrX-HML-105R rakentamiseksi käytetyt mutaation (lihavoituna) sisältä- : 1 “: vät PCR-alukkeet on esitetty alla.

··· • · · i · i • · · · • · · • · · 2 • · 34 PCR-mutaatio-oligonukleotidialukkeet: TX-105K-1 (sekvenssi nro 43) 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 TGATKKGEVTSDGS 5' - ACC GGC GCC ACA AAA AAA GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCC Kasi TX-105R-1 (sekvenssi nro 44) 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 TGATKKGEVTSDGS 5' -ACC GGC GCC ACA AAA AGA GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCC Kasi

Sopiva PCR-templaatti ja sopivat alukkeet ja PCR-tuotteiden päät katkaisevat re-striktioentsyymit on lueteltu alla (taulukko 3-2).

5 Taulukko 3-2 PCR-tuote Ylävirran PCR- PCR- Restriktioentsyy- PCR-aluke käänteisaluke templaatti mit PCR-tuotteelle (c) TX-105K-1 TX-C1 pTrX Kasl/Hindlll • ee • e *:*·; (d) TX-105R-1 TX-C1 pTrX Kasl/Hindlll e e e • ee e e 11 | Il e e e .·. : PCR-tuotteet (b) (taulukko 3 - 1), (c) ja (d) (taulukko 3-2) valmistettiin ja katkais- e ee J tiin Kasi- ja Hindlll-restriktionukleaaseilla. Restriktiodigestioiden (b), (c) ja (d) tuotteet ligoitiin KasI/Hindlll-linearisoituun plasmidiin pTrX-HML (1 - 113) plas-*···* midien pTrX-HML-105H, pTrX-HML-105K ja pTrX-HML-105R muodostamisek- 10 si, vastaavasti.

e e e e e e e e .***. 1-7: Plasmidien pTrX-HML-75A ja pTrX-HML-75A-105H rakentaminen eee e

Kaksi mutanttiksylanaasia, TrX-HML-75 A ja TrX-HML-75A-105H, ovat samanlai-Γ": siä kuin TrX-HML paitsi, että niissä Ser kohdassa 75 on korvattu Ala: 11a (S75A) ra- .1. kenteessa TrX-HML-75A ja rakenteessa TrX-HML-75A-105H Ser kohdassa 75 on I . 15 korvattu Ala:lla (S75A) ja Leu kohdassa 105 on korvattu His:llä (L105H).

eee e ee e e

Sopiva PCR-templaatti ja sopivat alukkeet ja PCR-tuotteiden päät katkaisevat re-striktioentsyymit on lueteltu alla (taulukko 3 - 3).

35

Taulukko 3-3 PCR-tuote Ylävirran PCR- PCR- Restriktioentsyy- PCR-aluke käänteisaluke templaatti mit PCR-tuotteelle (e) TX-75A-1 TX-C1 pTrX-105H EcoRI/Hindlll

EcoRI/Hindlll-katkaistut PCR-tuotteet (a) ja (e) (taulukot 3 - 1 ja 3 - 3, vastaavasti) valmistettiin ja ligoitiin KasI/Hindlll-linearisoituun plasmidiin pTrX-HML (1 -5 113) plasmidien pTrX-HML-75A ja pTrX-HML-75A-105H muodostamiseksi, vas taavasti.

1 - 8: pTrX-HML-75A-105R:n, pTrX-HML-75C-105R:n, pTrX-HML-75G-105R:n ja pTrX-HML-75T-105R:n rakentaminen

Ksylanaasimutantit TrX-HML-75A-105R, TrX-HML-75C-105R, TrX-HML-75G-10 105R ja TrX-HML-75T-105R ovat samanlaisia kuin TrX-HML-105R (joka käsittää mutaatiot N10H, Y27M, N29L ja L105R) paitsi, että niissä kussakin on lisäksi yk-sittäismutaatio S75A, S75C, S75G ja S75T, vastaavasti.

... PCR-alukkeet, joissa on mutaatiot S75C (TX-75C-1; sekvenssi nro 45), S75G (TX- • · *;··[ 75G-1; sekvenssi nro 46) ja S75T (TX-75T-1; sekvenssi nro 47), on esitetty alla.

• · · • ·· • · ·:··· 15 PCR-mutaatio-oligonukleotidialukkeet: ϊ#*.ί TX-75C-1 (sekvenssi nro 45) 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81

NGNSYLCVYGWSR

• ·

*** 5' -T GGG AAT TCA TAC TTA TGC GTC TAT GGC TGG TCT AG

EcoRI

• · · • · · • · • · TX-75G-1 (sekvenssi nro 46) • · · • . 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81

*:**· NGNSYLGVYGWSR

5' -T GGG AAT TCA TAC TTA GGC GTC TAT GGC TGG TCT AG EcoRI

• · · • · · • · ·.*·· TX-75T-1 (sekvenssi nro 47) 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81

NGNSYLTVYGWSR 5' -T GGG AAT TCA TAC TTA ACC GTC TAT GGC TGG TCT AG EcoRI

Sopiva PCR-templaatti ja sopivat alukkeet ja PCR-tuotteiden päät katkaisevat restriktioentsyymit on lueteltu alla (taulukko 3-4).

36

Taulukko 3-4 PCR- Ylävirran PCR- PCR-templaatti Restriktioentsyy- tuote PCR-aluke käänteisaluke___mit PCR-tuotteelle (f) TX-75A-1 TX-C1 pTrX-HML-105R EcoRI/Hindlll (g) TX-75C-1 TX-C1 pTrX-HML-105R EcoRI/Hindlll (h) TX-75G-1 TX-C1 pTrX-HML-105R EcoRI/Hindlll (i) TX-75T-1 |tX-C1 pTrX-HML-105R EcoRI/Hindlll 5 EcoRI/Hindlll-katkaistut PCR-tuotteet (f), (g), (h) ja (i) (katso taulukko 3-4) valmistettiin ja ligoitiin EcoRI/Hindlll-linearisoituun plasmidiin pTrX-HML (1 - 113) plasmidien pTrX-HML-75A-105R, pTrX-HML-75C-105R, pTrX-HML-75G-105R ja pTrX-HML-75T-105R muodostamiseksi, vastaavasti.

1-9: Plasmidien pTrX-HML-125A ja pTrX-HML-125A129E rakentaminen 10 Mutantit TrX-HML-125A ja TrX-HML-125A129E olivat identtisiä rakenteen TrX-HML kanssa paitsi, että niissä oli ylimääräiset mutaatiot Q125A ja I129E.

• · · • · • ·

Intaktit mutanttigeenit koottiin ligoimalla yhteen kaksi DNA-sekvenssiä, jotka koo- * l dittivat alueita 1 - 121 ja 122 - 190. Aluetta 1 - 121 koodittava DNA-sekvenssi [ [ muodostettiin deletoimalla plasmidi pTrX-HML Nhel- ja Mlul-nukleaaseilla. Aluet- *· 1: 15 ta 122 - 190 koodittava DNA-sekvenssi muodostettiin PCR-reaktiolla. PCR-aluk- • · keet, joissa oli mutaatio Q125A tai Q125A/I129E (lihavoituna), on esitetty alla.

··· • · • · • · · ·· · • · · • · • · ··♦ • · • · • · ··· • · • · ··· «M • · · • · · · • · · • ·· • · 37 TX-125A-1 (sekvenssi nro 48)

120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 QRVNAPSI IQTAT 5' -C CAA CGC GTT AAT GCG CCA TCG ATC ATT GGA ACC GCC ACC

MluI

TX-125A129E-1 (sekvenssi nro 49)

120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 QRVNAPSIEGTAT 5' -C CAA CGC GTT AAT GCG CCA TCG ATC GAG GGA ACC GCC ACC MluI

Sopiva PCR-templaatti ja sopivat alukkeet ja PCR-tuotteen, joka on sekvenssi 122 -190, päät katkaisevat restriktioentsyymit on lueteltu alla (taulukko 3-5).

5 Taulukko 3-5 PCR- Ylävirran PCR- PCR-kään- PCR-templaatti Restriktioentsyymit tuote aluke teisaluke PCR-tuotteelle ··· ... ---- . — (j) TX-125A-1 TX-C1 pTrX Mlul/Hindlll :N (k) TX-125A129E-1 TX-C1 pTrX Mlul/Hindlll • · ί.*.! Nämä kaksi katkaistua DNA-sekvenssiä, 1 - 121 ja 122 - 190, jotka yhdessä muo- dostavat intaktin ksylanaasisekvenssin, ligoitiin Nhel/Hindlll-linearisoituun plas-

:***: midiin pTrX (1 - 113) plasmidien pTrX-HML-125A ja pTrX-HML-125A129E

« * · 10 muodostamiseksi.

• s · : ·* 1 - 10: Plasmidin pTrX-HML-75G-105R-125A129E rakentaminen ··· • · • ·

Mutantti TrX-HML-75G-105R-125A129E oli identtinen rakenteen TrX-HML-75G- ],.* 105R kanssa paitsi, että siinä oli ylimääräiset mutaatiot Q125A ja I129E.

• · • · • · · .···. Intaktit mutanttigeenit koottiin ligoimalla yhteen kaksi DNA-sekvenssiä, jotka koo- . 15 dittivat alueita 1 - 121 ja 122 - 190. Aluetta 1-121 koodittava DNA-sekvenssi * : valmistettiin deletoimalla plasmidi pTrX-HML-75G-105R alla luetelluilla restrik- tionukleaaseilla (taulukko 3-6).

38

Taulukko 3-6

Deleetiosekvenssi Esiasteplasmidi Restriktioentsyymit PCR- tuotteelle

(A) pTrX-HML-75G-105R Nhel/MluI

Aluetta 122 - 190 koodittava DNA-sekvenssi oli sama MluI/Hindlll-katkaistu PCR-tuote (k) kuin esimerkissä 1.9 (yllä).

5 Katkaistu PCR-tuote (k) ja deleetiosekvenssi (A) ligoitiin yhteen Nhel/Hindlll-linearisoituun plasmidiin pTrX (1 - 113) uusien alla lueteltujen plasmidien muodostamiseksi (taulukko 3 - 7).

Taulukko 3-7

Deleetiotuote PCR-tuote Uusi plasmidi

(A) (k) pTrX-HML-75G-105R-125 A129E

10 1.11: Plasmidien pTrX-HML-75G-105H-125A129E, pTrX-HML-75A-105H- 125A129E ja pTrX-HML-75A-105R-125A129E rakentaminen • · · * · · • · ·:··: Mutantit TrX-HML-75G-105H-125A129E, pTrX-HML-75A-105H-125A129E ja : pTrX-HML-75A-105R-125A129E olivat identtisiä rakenteen TrX-HML-75G-

.·. · 105R-125A129E kanssa paitsi, että niissä oli sopivat mutaatiot kohdissa 75 (S75A

15 tai S75G) ja 105 (L105H tai L105R).

• · • · ·

Intaktit mutanttigeenit koottiin ligoimalla yhteen kaksi DNA-sekvenssiä, jotka koo- • dittivat alueita 1 - 101 ja 102 - 190.

«·· • · • · T Aluetta 1 - 101 koodittavan DNA-sekvenssin valmistamiseksi sopivan plasmidin deleetiossa käytetyt restriktionukleaasit on lueteltu alla (taulukko 3-8).

··· • ♦ • ♦ 20 Taulukko 3-8 • · ♦ • · · • Deleetiosekvenssi Esiasteplasmidi Restriktioentsyymit PCR- ___tuotteelle_

(B) PTrX-HML-75G-105R Nhel/KasI

(C) _pTrX-HML-75 A-105R Nhel/KasI_ 39

Aluetta 102- 190 koodittavan DNA-sekvenssin valmistamiseksi käytettiin polymeraasiketjureaktiota. Sopivat PCR-alukkeet, joissa oli mutaatiot kohdassa 105, ja PCR-tuotteen pään katkaisemiseen käytetyt restriktioentsyymit on lueteltu alla (taulukko 3-9).

5 Taulukko 3-9 Plasmidi pTrX-HML-75G-105R-125A129E PCR-templaat- tina PCR-tuote Ylävirran PCR- PCR-käänteisaluke Restriktioentsyymit __aluke___PCR-tuotteelle (l) TX-105H-1 TX-C1 Kasl/Hindlll (m) _TX-105R-1_TX-C1_Kasl/Hindlll

Katkaistu PCR-tuote [(1) tai (m)] ja yksi deleetiosekvensseistä [(B) tai (C)] ligoitiin Nhel/Hindlll-linearisoituun plasmidiin pTrX (1 - 113) alla lueteltujen uusien plas-10 midien muodostamiseksi (taulukko 3-10).

Taulukko 3-10

Deleetiotuote PCR-tuote Uusi plasmidi_

(B) (1) pTrX-HML-75G-105H-125A129E

. (C) (1) pTrX-HML-75A-105H- 125A129E

(C) (m) pTrX-HML-75 A-105R-125 A129E

t · ! 1.12: Plasmidien pTrX-HML-75G-104P105H-125A129E ja pTrX-HML-75G- 1 104P105R-125A129E rakentaminen • · · • · · • · Γ*: 15 Mutantit TrX-HML-75G-104P105H-125A129E ja pTrX-HML-75G-104P105R- 125A129E olivat identtisiä rakenteiden TrX-HML-75G-105H-125A129E ja TrX- HML-75G-105R-125A129E kanssa vastaavasti paitsi, että niissä oli lisämutaatio . · · ·. Lys-104 —► proliini (K 104P).

« · · ·:·*: Intaktit mutanttigeenit koottiin ligoimalla yhteen kaksi DNA-sekvenssiä, jotka koo- 20 dittivat alueita 1 - 101 ja 102 - 190.

• · » ··· : Aluetta 1-101 koodittava DNA-sekvenssi näillä kolmella uudella mutantilla oh sama deleetiosekvenssi (B) kuin esimerkissä 1.11 käytetty (yllä), joka valmistettiin katkaisemalla plasmidi pTrX-HML-75G-105R Nhel- ja Kasl-nukleaaseilla.

Aluetta 102-190 koodittavan DNA-sekvenssin valmistamiseksi käytettiin polyme raasiketjureaktiota. Syntetisoitiin PCR-alukkeet, joissa oli mutaatiot jäännöksissä 104 ja 105 (lihavoitu).

40 PCR-mutaatio-oligonukleotidialukkeet: TX-104P-105H-1 (sekvenssi nro 50) 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 TGATPHGEVTSD 5'ACC GGC GCC ACA CCA CAC GGC GAA GTC ACT ACT GAT GG Kasi TX-104P-105R-1 (sekvenssi nro 51)

100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 TGATPHGEVTSD 5'ACC GGC GCC ACA CCA ASA GGC GAA GTC ACT AGT GAT GG

5 Kasi

Suoritettiin polymeraasiketjureaktio. Sopivat alukkeet ja PCR-tuotteen pään katkaisuun käytetyt restriktioentsyymit on lueteltu alla (taulukko 1-11).

: Taulukko 1-11 Plasmidi pTrX-HML-75G-105R-125A129E PCR-templaattina ··· • · _ __ ’· *; PCR-tuote Ylävirran PCR- PCR- Restriktioentsyymit * *__aluke__käänteisaluke PCR-tuotteelle_ (n) TX-104P-105H-1 TX-C1 Kasl/Hindlll V·; l_(o)_1 TX-104P-105R-1 |TX-C1_Kasl/Hindlll_ • · · • · • · • · · 10 Katkaistu PCR-tuote (n tai o) ja deleetiosekvenssi (B) ligoitiin Nhel/Hindlll-lineari- :*·*: soituun plasmidiin pTrX (1 - 113) alla lueteltujen uusien plasmidien muodostami- • · . * * *. seksi (taulukko 3-12).

···

Taulukko 3-12 ··· • ·

• · I

T Deleetiotuote PCR-tuote Uusi plasmidi_

:X: (B) (n) pTrX-HML-75G-104P-105H-125 A129E

V-| |_(B)_Leo)_pTrX-HML-75G-104P-105R-125 A129E

41 1.13: Plasmidien pTrX-157D-161R-162H-165H, pTrX-HML-75A-105H-125 A-129E-132R-135R, pTrX-HML-75 A-105H-125 A-129E-132R-135R-144R, pTrX-HML-75A-105H-125 A-129E-132R-135R-144R-157D-161R-162H-165H, pTrX- HML-75A-105H-125A-135R-144R-157D-161R-162H-165H ja pTrX-HML-75A-5 105H-125A-129E-135R-144R-157D-161R-162H-165H rakentaminen

Mutantit pTrX-157D-161R-162H-165H, pTrX-HML-75 A- 105H-125 A- 129E-132R-135R, pTrX-HML-75 A-105H-125 A-129E-132R-135R-144R, pTrX-HML-75A-105H-125 A-129E-132R-135R-144R-157D-161R-162H-165H, pTrX-HML-75A- 105H-125 A-135R-144R-157D-161R-162H-165H ja pTrX-HML-75 A- 105H-125 A-10 129E-135R-157D-144R-161R-162H-165H valmistettiin oleellisesti, kuten edellä on kuvattu, käyttäen sopivia alukkeita ja templaatteja. Intaktit mutanttigeenit koottiin ligoimalla yhteen kaksi DNA-sekvenssiä, jotka koodittavat alueita 1 - 101 ja 102 -190.

Esimerkki 2 Mutanttiksylanaasien karakterisointi 15 2-1: Ksylanaasien tuotto

Viljelyssä käytettiin 5 ml viljelmäymppiä, jota oli kasvatettu yli yön 2YT-alustassa (16 g bacto-tryptonia, 10 g hiivauutetta, 5 g NaChia 1 litrassa vettä), joka sisälsi ampisilliinia (100 mg/1), joka ymppi lisättiin 2YT-alustaan (1 1), jossa oli ampisillii- ·♦· .·, : nia. Viljelmiä kasvatettiin ravistellen (200 kierrosta minuutissa) 37 C:ssa. Kuuden- .!..: 20 toista tunnin kuluttua solut kerättiin.

• « « · *·· 2-2: Mutanttiksylanaasien puhdistus • · * · · « ♦· .···] Soluista valmistettiin proteiininäytteet tekemällä soluista ensin uute jauhamalla 10 g ♦ · solutahnaa 25 g kanssa alumiinipulveria. Kun oli jauhettu tasaiseksi seokseksi, lisät- .. . tiin pienet määrät (5 ml) jääkylmää puskuria A (10 mM natriumasetaatti, pH 5,5, • · · 25 BcX-mutanteille) tai puskuria B (10 mM natriumasetaatti, pH 4,6, TX-mutanteille) • · ’···* ja seosta jauhettiin voimakkaasti lisäysten välillä. Alumiini ja soluroskat poistettiin ·;··· sentrifugoimalla seosta voimalla 8000 x g 30 minuuttia.

• · · • · *:*’ Ennen pylväskromatografiaa supematantin pH-arvoksi säädettiin 4,6 etikkahapolla V : ja se sentrifugoitiin kaiken sakan poistamiseksi. Seuraava pylväskromatografiame- 30 netelmä oli identtinen kaikille mutanttiksylanaaseille.

Happamoittamisen ja sentrifugoinnin jälkeen ksylanaasinäyte lisättiin 50 ml resiini-tilavuuden sisältävään CM-Sepharose Fast Flow -kationinvaihtopylvääseen (Phar- 42 macia Biotech, Uppsala), joka oli tasapainotettu 10 mM natriumasetaatilla (pH 4,6). Ksylanaasi eluoitiin 250 ml lineaarisella gradientilla (0 - 0,6 M NaCl 10 mM natri-umasetaatissa, pH 4,6) virtausnopeudella 1 ml/min. Ksylanaasit eluoituivat gradientin kohdalla 150 - 200 ml. Kerättyjen fraktioiden näytteet tutkittiin SDS-PAGE:lla 5 ja ne fraktiot, joissa oli suurin osa ksylanaasista, yhdistettiin. Puhdistettu ksylanaasi kvantitoitiin spektrofotometrillä 280 nm:ssa käyttäen ekstinktiokerrointa, joka oli 54 600 - 53 400 M'1 useimmille TrX-mutanttiksylanaaseille. Tyypillisessä puhdistuksessa 10 g:sta soluja saatiin 25 mg ksylanaasia.

2-3: Standarditesti entsymaattisen aktiivisuuden mittaamiseksi 10 Kvantitatiivisessa testissä mitattiin niiden pelkistyvien sokeripäiden määrää, joka muodostui liukoisesta ksylaanista. Tämän testin substraatti oli koivuksylaanin fraktio, joka liuotettiin veteen 5 % koivunksylaanin suspensiosta (Sigma Chemical Co.). Kun liukenematon fraktio oli poistettu, supematantti jäädytyskuivattiin ja sitä säilytettiin desikkaattorissa. Spesifisen aktiivisuuden mittaus suoritettiin seuraavasti: re-15 aktioseoksia, jotka sisälsivät 100 μΐ ksylaania, joka oli aiemmin laimennettu testi-puskuriin (50 mM natriumsitraatti, pH 5,5, tai testatun ksylanaasin optimi-pH) kon-sentraatioksi 30 mg/ml, 150 μΐ testipuskuria ja 50 μΐ testipuskuriin laimennettua entsyymiä, inkuboitiin 40 °C:ssa. Eri aikapisteissä otettiin 50 μΐ näytteet ja reaktio lopetettiin laimentamalla se 1 ml:aan 5 mM NaOH:ia. Pelkistyvien sokereiden mää- • · · 20 rä määritettiin hydroksibentsoehappohydratsidireagenssilla (HBAH)(Lever, 1972, • · V1i Analytical Biochem. 47: 273 - 279). Entsyymin yhden aktiivisuusyksikön määritel- *:1·: tiin olevan se määrä, joka muodosti 1 pmol pelkistyvää sokeria yhdessä minuutissa 40 °C:ssa.

• · • · • · · *·./ Jotta voitiin verrata spesifisiä aktiivisuuksia mutanttiksylanaasien ja natiivin ksy- • · *···1 25 lanaasin välillä, mutanttiksylanaasin spesifinen aktiivisuus muutettiin suhteelliseksi aktiivisuudeksi. Suhteellinen aktiivisuus lasketaan prosenttina jakamalla mutant- • · « : V tientsyymin spesifinen aktiivisuus natiivin ksylanaasin spesifisellä aktiivisuudella.

• · · • · • ♦ • · ♦ • · • · · • · • · • · · • ·· • · · • · · · • · « • · · • · 43

Taulukko 4 TrX-ksylanaasin ja natiivin ksylanaasin suhteellinen aktiivisuus 40 °C:ssa

Ksylanaasi__Suhteellinen aktiivisuus (%)_

Natiivi TrX__100*_

TrX-105H__97_

TrX-75A__95_

TrX-HML-75A-105H__95_

TrX-HML-75A-105R 93 ~ * Natiivin ksylanaasin spesifisen aktiivisuuden määritettiin olevan 770 U/mg.

5 Taulukossa 4 kuvatut tulokset osoittavat, että mutanttiksylanaasien spesifiset ent-symaattiset aktiivisuudet 40 °C:ssa eivät ole muuttuneet merkittävästi verrattuna na-tiiviin ksylanaasiin.

Esimerkki 3: Mutanttiksylanaasien termofiilisyys

Termofiilisyys tutkittiin sen testaamiseksi, miten eri lämpötilat vaikuttavat liukoisen 10 ksylaanin entsymaattiseen hydrolyysiin eri mutanttiksylanaaseilla.

.···. Testimenetelmä oli samanlainen kuin standarditesti niin, että muutoksia tehtiin in- • · .·]*· kubaatiolämpötilassa ja -ajassa. Ksylanaasit (15 μg/ml) ja liukoinen ksylaanisubst- • · · | raatti sekoitettiin 50 mM natriumsitraattipuskurissa, pH 5,5, ja niitä inkuboitiin kier- • · . . tovesihauteessa eri lämpötiloissa. Kolmenkymmenen minuutin inkubaation jälkeen • · · *; *j 15 määritettiin ksylaanista vapautuneiden pelkistyvien sokereiden määrä HBAH-ana-’· ” lyysillä ja laskettiin suhteellinen aktiivisuus niin, että arvo 40 °C:ssa edusti arvoa 100 %.

Lämpötilan vaikutus TrX- ja TrX-75A-ksylanaasien aiheuttamaan ksylaanin hydro-lyysiin on esitetty kuviossa 3. TrX-75A-mutanttiksylanaasi, jossa on yksittäismutaa- • · 20 tio S75A, osoitti suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin luonnollinen TrX-ksylanaasi 50, 55, 60 ja 65 °C:ssa. Lisäksi, TrX-HML-75A-mutanttiksylanaasissa L.: oleva S75A-mutaatio osoitti suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin TrX- HML-emoksylanaasi 70 °C:ssa ja 75 °C:ssa (kuvio 4). Nämä tulokset vihjaavat, että • · · \m . S75A-mutaatio parantaa TrX- ja TrX-HML-ksylanaasien termofiilisyyttä.

• ·· • · 25 TrX-HML-ksylanaasiin TrX-HML-105H-mutanttiksylanaasin tuottamiseksi tehty mutaatio Leu 105 —> His (L105H) osoitti myös kohonneen entsymaattisen aktiivi- 44 suuden verrattuna TrX-HML-emoksylanaasin vastaavaan 70 °C:ssa ja 75 °C:ssa (kuvio 4).

Huomionarvoista on, että TrX-HML-75A-105H-yhdistelmämutanttiksylanaasilla oli maksimaalinen entsymaattinen aktiivisuus 70 °C:ssa ja lisäksi se osoitti suuremman 5 entsymaattisen aktiivisuuden kuin kumpikaan yksittäismutanttiksylanaasi TrX-HML-75A tai TrX-HML-105H 70 °C:ssa (kuvio 4). Nämä tulokset vihjaavat, että näiden kahden mutaation, S75A ja L105H, vaikutukset mutanttiksylanaasin termo-fiilisyyteen ovat additiivisia tai täydentäviä.

Asn:n substituutio kohdassa 157 Asp:lla, Ala:n substituutio kohdassa 161 Arg:lla 10 (A161R), Gln:n substituutio kohdassa 162 His:llä (Q162H) ja Thr:n substituutio kohdassa 165 His:llä (T165H) TrX-157D-161R-162H-165H:n tuottamiseksi olivat neutraaleja tai johtivat lievään kohoamiseen mitä tulee tämän entsyymin termofiili-syyteen verrattuna TrX-emoentsyymin vastaavaan (kuvio 15).

Rakennettiin sarja TrX-HML-ksylanaaseja, joissa oli mutaatiot kohdassa 105, nii-15 den aminohappojäännösten määrittämiseksi, jotka tehostavat TrX-HML-emoentsyy-min termofiilisyyttä (kuvio 5). Kolme kohdan 105 suhteen olevaa mutanttia, TrX-HML-105H, TrX-HML-105R ja TrX-HML-105K, osoittivat suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin TrX-HML-esiaste-entsyymi 70°C:ssa tai korkeam- • · · massa lämpötilassa. Nämä kolme mutanttia sisältävät Leu:n, joka on suhteellisen 20 hydrofobinen haarautuneen ketjun sisältävä aminohappo, substituution kohdassa ·:··· 105 His:llä, Arg:lla ja Lys:llä, jotka ovat hydrofiilisia tai positiivisesti varattuja tai emäksisiä aminohappoj äännöksiä. Sellaiset mutaatiot tehostavat mutanttiksyla- • · : naasien termofiilisyyttä.

• · ···

TrX-HML-75A-105R-yhdistelmämutanttiksylanaasi osoitti samanlaisen lämpötila-25 aktiivisuusprofiilin kuin TrX-HML-75A-105H-ksylanaasi, joka vihjaa, että S75A- • · · • *.·* ja L105R-mutaatioiden, kuten S75A- ja L105H-mutaatioidenkin, vaikutukset ovat additiivisia tai täydentäviä. Nämä tulokset vihjaavat lisäksi, että emäksiset jäännök-set kohdassa 105 tehostavat ksylanaasien termofiilisyyttä.

• · • · ·

Toisessa mutanttiksylanaasisarjassa TrX-HML-105R-entsyymin kohta 75 mutatoi-30 tiin niiden jäännösten määrittämiseksi, jotka osoittivat tehostuneen termofulisyyden .·. ; (kuvio 6). Kolme geneettisesti modifioitua ksylanaasimutanttia, TrX-HML-75C- 105R, TrX-HML-75A-105R ja TrX-HML-75G-105R, osoittivat suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin kumpikaan esiasteksylanaasi TrX-HML-105R tai TrX-HML lämpötiloissa, jotka olivat korkeampia kuin 60 °C. Mielenkiintoista on, että 45 neljäs mutanttiksylanaasi, TrX-HML-75T-105R, ei osoittanut tehostumista termofii-lisyydessä verrattuna TrX-HML-105R-esiasteksylanaasiin, jossa on luonnollinen Ser-jäännös kohdassa 75. Mutantin treoniinijäännös kohdassa 75 on, kuten TrX- ja TrX-HML-emoksylanaaseissa oleva luonnollinen Ser 75 -jäännöskin, hydrofiilinen 5 aminohappo. Yhteenvetona mutaatiot, joissa korvataan polaarinen Ser-aminohappo kohdassa 75 pienellä ei-polaarisella aminohapolla, kuten, mutta ei niihin rajoittuen, Ala:lla, Gly:llä tai Cysrllä, johtavat ksylanaasin termofiilisyyden kohoamiseen.

Toisessa sarjassa TrX-HML-entsyymin Gln-125-jäännöksen mutaatio Ala:ksi (Q125A) johti suurempaan aktiivisuuteen korkeammissa lämpötiloissa (kuvio 7). 10 Toinen mutaatio, Ile-129 —* Glu (I129E), johti myös kohtuulliseen parantumiseen ksylanaasin termofiilisyydessä. Sitten edulliset mutaatiot jäännöksissä 75, 105, 125 ja 129 yhdistettiin saaden TrX-HML-75G-105R-125A129E-mutantti ja se osoitti aktiivisuuden lisäparantumisen korkeammissa lämpötiloissa (kuvio 7). Muut yhdis-telmämutantit, joissa oli mutaatiot jäännöksissä 75 (S75A tai S75G) ja 105 (L105H 15 tai L105R), ovat myös osoittaneet saman parantumisen aktiivisuudessa korkeammassa lämpötilassa (kuvio 8).

Viimeisessä sarjassa kohdan Lys-104 mutaatio proliiniksi (K104P) tuotti myös ksylanaasin, jolla oli suuresti parantunut termofiilisyys, joka oh samanlainen kuin edul-... listen S75G-, L105R- tai L105H-, Q125A- ja I129E-mutaatioiden vastaava (kuvio 20 9).

• · · • · · • · *:**: Esimerkki 4 Mutanttiksylanaasien alkalofiilisyys • · • · · • · · l Geneettisesti modifioitujen ksylanaasien alkalofiilisyys tutkittiin sen testaamiseksi, miten eri pH-olosuhteet vaikuttavat liukoisen ksylaanin entsymaattiseen hydrolyy- * · '···’ siin eri mutanttiksylanaaseilla. Testimenetelmä oli samanlainen kuin standarditesti 25 niin, että muutoksia tehtiin inkubaatiolämpötilassa ja -ajassa. Geneettisesti • · · : modifioitujen ksylanaasien näytettä (15 μg/ml) ja liukoista ksylaanisubstraattia 50 • · · mM natriumsitraattipuskurissa, jonka pH vaihteli välillä 4-7, inkuboitim yhdessä 65 °C:ssa. Kolmenkymmenen minuutin inkubaation jälkeen määritettiin ksylaanista • · t...# vapautuneiden pelkistyvien sokereiden määrä HBAH-analyysillä ja laskettiin entsy- • · T 30 maahinen aktiivisuus pH:n funktiona eri mutanttiksylanaaseille niin, että maksimaa-··· v : linen aktiivisuus oli 100 %.

• · • · · • ··

Vaikutus, joka pH-olosuhteilla oli TrX-75A-yksittäismutanttiksylanaasin entsymaattiseen aktiivisuuteen, on esitetty kuviossa 10. TrX-75A-mutanttiksylanaasin maksimiaktiivisuus oli 55 °C:ssa pH:ssa, joka oli korkeampi (pH 5,5) kuin se pH, jossa natiivi TrX-entsyymi osoittaa maksimiaktiivisuutensa (pH 5,0). Mutantilla oli kohonnut entsymaattinen aktiivisuus myös pH-olosuhteissa 6,0 ja 6,5 verrattuna luonnolliseen TrX-ksylanaasiin.

46

Samanlainen parantunut alkalofiilisyysvaikutus kuin S75A-mutaatiolla oli TrX-5 75A-entsyymiin, havaittiin myös TrX-HML-75A-entsyymillä verrattuna TrX-HML-emoksylanaasiin pH-olosuhteissa, jotka olivat 6,5 - 7 (kuvio 11).

L105H-mutaatio TrX-HML-105H-mutanttiksylanaasissa kohotti myös entsymaattista aktiivisuutta verrattuna TrX-HML-emoksylanaasiin pH:ssa 6,5 ja 7,0 (kuvio 11). Mielenkiintoista on, että TrX-HML-75A-105H-yhdistelmämutanttiksylanaasi 10 osoitti suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin kumpikaan yksittäismutanttik-sylanaasi TrX-HML-75A tai TrX-HML-105H pH:ssa 6,5 ja 7,0 (kuvio 11), joka vihjaa, että S75A-mutaation ja L105H-mutaation vaikutukset ksylanaasin alkalofii-lisyyteen ovat additiivisia tai täydentäviä.

Rakennettiin sarja geneettisesti kohtaan 105 modifioituja ksylanaaseja niiden jään-15 nösten määrittämiseksi, jotka edistävät modifioitujen ksylanaasien alkalofiilisyyttä (kuvio 12). Kolme mutanttiksylanaasia, joissa oli kolme mutaatiota kohdassa 75, TrX-HML-105H, TrX-HML-105R ja TrX-HML-105K, osoittivat suuremman entsymaattisen aktiivisuuden kuin TrX-HML-esiasteksylanaasi pH-olosuhteissa 6,5 ja 7,0. Yhteenvetona mutaatiot, jotka johtavat alkalofiilisyyden kohoamiseen, edusta- ;*·.· 20 vat muutosta haarautuneen ketjun sisältävästä suhteellisen hydrofobisesta Leu- • · jäännöksestä jäännökseksi, joka on hydrofiilinen, positiivisesti varattu tai emäksi- ... : nen.

• · · • · • ·

Teoriaan sitoutumatta, hydrofiiliset, positiivisesti varatut tai emäksiset jäännökset • · · ϊ...ϊ voivat tehostaa molekyylinsisäistä pakkautumista muiden atomien kanssa, jotka si- 25 jaitsevat vierekkäin samalla alueella ksylanaasin tertiaarirakenteessa. Nämä jään- :*·*: nökset voivat stabiloida entsyymin kolmiulotteista rakennetta sellaisia rakenteellisia • · .·**. häiriöitä vastaan, jotka voivat syntyä molekyylissä molekyylin muiden alueiden ·*· • , useiden aminohappojen ionisoituvien sivuketjujen titrauksen välityksellä. Jälleen si- ‘ ‘ toutumatta teoriaan, sivuketjun emäksinen ionisoitunut muoto voi olla tärkeä muu- 30 tettaessa entsyymin pH-aktiivisuusprofiilia, koska pH-olosuhteissa välillä 6 ja 7 :*·*: Arg- ja Lys-jäännöksillä on sivuketjut, jotka todennäköisesti jäävät protonoituneik- • si. Tälle päinvastaisesti His-jäännökset, joiden pKa-arvo imidatsoliryhmän suhteen • · on liuoksessa noin 6, voivat olla läsnä joko protonoituneena tai protonoitumattoma-na muotona. Alan ammattimiehet kuitenkin tietävät, että aminohapposivuketjua 35 ympäröivien substituenttien polaarisuus voi vaikuttaa sen pKa-arvoon. Esimerkiksi 47

His-jäännöksen sivuketjun pKa-arvo voi proteiinin polaarisella tai hydrofobisella alueella olla 6, kun taas saman sivuketjun pKa-arvo voi hydrofobisessa tai apolaari-sessa ympäristössä olla 7 tai suurempi.

Toisessa tutkimuksessa rakennettiin mutaatiot TrX-HML-entsyymin kohtaan 75 5 niiden jäännösten määrittämiseksi, jotka edistävät kohonnutta alkalofiilisyyttä modifioiduissa ksylanaaseissa (kuvio 13). Neljä ksylanaasia, joissa oli mutaatiot kohdassa 75, TrX-HML-75C-105R, TrX-HML-75A-105R, TrX-HML-75G-105R ja TrX-HML-75T-105R, osoittivat suuremman entsymaattisen aktiivisuuden pH-olo-suhteissa 6,0, 6,5 ja 7,0 kuin TrX-HML- ja TrX-HML-105R-esiasteksylanaasit.

10 Kaksi mutaatiota, Q125A ja I129E TrX-HML-125A- ja TrX-HML-125 A 129E-mu-tanttiksylanaaseissa, jotka onnistuneesti kohottivat näiden entsyymien termofiili-syyttä, eivät yleensä vaikuttaneet niiden aktiivisuuteen korkeammassa pHrssa verrattuna TrX-HML-entsyymiin. Tämä spesifinen parantuminen ksylanaasin termofii-lisyydessä, mutta ei alkalofiilisyydessä, osoitettiin myös verrattaessa TrX-HML-15 75A-105H- ja TrX-HML-75A-105H-125A129E-yhdistelmämutantteja (kuvio 14).

Tämä on myös havaittu muilla mutanteilla TrX-HML-75G-105H-125A129E (kuvio 14), T rX-HML-75 A-105R-125 A129E j a TrX-HML-75G-105R-125A129E.

Happaman aminohapon substituutio kohdassa 157 ja emäksisten aminohappojen • · · substituutio kohdissa 161, 162 ja 165 niin, että läsnä oli emäksisen aminohapon 20 substituutiot kohdissa 132, 135 ja 144 tai ilman niitä, kohotti myös alkalofiilisyyttä.

·:··: Sekä TrX-HML-AHAE-RR-DRHH että TrX-HML-AHAE-RRR-DRRH (katso täy- :*·.· dellinen kuvaus substituoitujen aminohappojen suhteen taulukosta 2) osoittivat ko- • · hoamisen alkalofiilisyydessä (kuviot 18 ja 19). Näiden entsyymien MEP-arvon on .···.* myös karakterisoitu olevan noin pH 7,0 (kuviot 18 ja 19).

• · ··· 25 Alkalofiilisyyden lisäkohoaminen verrattuna yllä kuvattuihin saatiin myös aikaan ·· · : substituoimalla hapan aminohappo kohdassa 157 ja emäksiset aminohapot kohdissa : 135, 144, 161, 162, 165 ja jättämällä aminohapot kohdissa 129 ja 132 niiden luon- nolliseksi jäännökseksi, esimerkiksi TrX-HML-AHA-RR-DRHH (kuviot 18 ja 19).

... TrX-HML-AHA-RR-DRHH:n MEP on noin pH 7,4 (kuviot 18 ja 19).

• · ··· m 30 Yhteenvetona, TrX-mutanttiksylanaasit, joilla on parantunut alkalofiilisyys, voidaan .·. : rakentaa i) mutatoimalla Ser 75 pieniksi apolaarisiksi jäännöksiksi. Olematta rajoit- • ·· tavia, nämä jäännökset voivat käsittää Gly:n, Ala:n ja Cys:n; ii) mutatoimalla Ser 75 Thr:ksi; iii) mutatoimalla Leu 105 emäksiseksi jäännökseksi, kuten, mutta ei rajoittuen, Arg:ksi, Lys:ksi tai Hisrksi; iv) mutatoimalla Ala 132, Tyr 135, His 144, Gin 48 161, Gin 162, Thr 165 tai niiden yhdistelmä emäksiseksi aminohapoksi, esimerkiksi, mutta ei rajoittuen, Arg:ksi, Lys:ksi tai His:ksi; v) mutatoimalla Asn 157 happamaksi aminohapoksi Asp tai Glu; tai vi) yhdistämällä kohdissa i) tai ii) kuvatut mutaatiot kohdissa iii) ja iv) kuvattujen mutaatioiden kanssa alkalofiilisyyden paranta-5 miseksi.

Samalla, kun esillä olevassa keksinnössä on kuvattu mutanttiksylanaasit, joilla on parantunut termofiilisyys ja alkalofiilisyys, ja näiden entsyymien edut paperisellun tuotossa, näitä mutanttiksylanaaseja voidaan käyttää myös muissa teollisuusprosesseissa, esimerkiksi, mutta ei rajoittuen, tarkkuuslaitteiden ja puolijohteiden puhdis-10 tuksessa. Lisäksi, johtuen mutanttiksylanaasien kohonneesta termofiilisyydestä ja termostabiiliudesta, niitä voidaan käyttää kemiallisissa prosesseissa, joissa käytetään pieniä määriä denaturantteja tai detergenttejä, tai liuottimien kanssa, esimerkiksi, mutta ei rajoittuen, pienien määrien kanssa apolaarisia liuottimia, kuten, mutta ei rajoittuen, heksaanin, dioksaanien, hiilitetrakloridin, bentseenin, eettereiden, kloro-15 formin, etikkahapon ja metyleenikloridin kanssa, ja polaaristen liuottimien kanssa, kuten, mutta ei rajoittuen, asetonin, alkoholien, dimetyyliformamidin, asetonitriilin, sulfolaanin, dimetyylisulfoksidin ja veden kanssa.

Esillä oleva keksintö on kuvattu koskien edullisia suoritusmuotoja. Alan

ammattimiehille on kuitenkin ilmeistä, että useita variaatioita ia modifikaatioita ·«« J

:: 20 voidaan tehdä ilman, että poistutaan tässä kuvatun keksinnön piiristä.

• · • » · • ·· « ·

Kaikki viitteet ja lainaukset, joihin tässä viitataan.

• ·

Viitteet • · • · ·

Arase, A., Yomo, T., Urabe, I., Hata, Y., Katsube, Y. and Okada, H. (1993) • · FEBS Lett. 316:123-127.

• Casimir-Schenkel, J., Davis, S., Fieehter, a., Gysin, B., Murray, E., Perrolaz, J.-J.

• · · and Ziinmennann, W. European Patent application no. 91810652.7, •: ♦ published on 04.03.92. Publication no. 0 473 545 A2.

• · * • · • · • · ·

.···. Campbell, R. L., Rose, D. R., Sung, W. L., Yaguchi, M. and Wakarchuk, W. US

• · * : patent no. 5,405,769 issued on Apr. 11,1995.

• ·♦ • ♦ 25 49

Campbell, R. L., Rose, D. R., Sung, W. L., Yaguchi, M. and Wakarchuk, W. PCT publication no. WO 94/24270, published on 27.10.1994.

Fisk, R. S. and Simpson, C. (1993) in Stability and Stabilization of Enzymes, edited by W. J. J. van den Tweel, A. Harder and R. M. Buitelaar; published by Elsevier Science Publishers B. V. pp323-328.

Gruber, K., Klintschar, G., Hayn, M, Schlacher, A., Steiner, W. and Kratky, C. (1998) Biochemistry 37:13475-13485.

Irwin, D., Jung, E. D. and Wilson, D. B. (1994) Appi. Environ. Microbiol. 60:763-770.

Lee, S. L., Forsberg, C. W., and Rattray, J. B. (1987) Appi. Environ. Microbiol. 53:644-650.

Ltithi, E., Jasmat, N. B., and Bergquist, P. L. (1990) Appi. Environ. Microbiol. 56:2677-2683.

• · • · • · · • · • · · ' ! Mathrani, I. M. and Ahring, B. K. (1992) Appi. Microbiol. Biotechnol. 38:23-27.

• · • « • · · • · · .·. J Misset, O. (1993) in Stability and Stabilization of Enzymes, edited by W. J. J.

• · · .···.* van den Tweel, A. Harder and R. M. Buitelaar; published by Elsevier • ·

Science Publishers B. V. ppl 11-131.

• · · : ’.· Nissen A. M., Anker, L., Munk, N., and Lange, N. K. in Xylans and Xylanases, • · · *... · edited by J. Visser, G. Beldman, M. A. Kusters-van Someren and A. G. J.

•: · ·: Voragen, published by Elsevier, Amsterdam, 1992. p325-337.

«·· • · • · • · ·

Sakka, K., Kojima Y., Kondo, T., Karita, S., Ohmiya, K. and Shimada, K. (1993) : Biosci. Biotech. Biochem. 57:273-277.

• · · • · 50

Simpson, H. D., Haufler, U. R., and Daniel, R. M. (1991) Biochem. J. (1991) 277:413-417,

Sung. W. L., Yao. F.-L., Zahab, D. M, and Narang, S. A. (1986) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 83:561-565.

Sung, W. L., Luk, C. K., Zahab, D. M. and Wakarchuk, W. (1993) Protein Expression Purif. 4:200-206.

Sung, W. L., Luk, C. K., Chan, B., Wakarchuk, W., Yaguchi, M., Campbell, R., Willick, G., Ishikawa, K. and Zabab, D. M. (1995) Biochem. Cell. Biol. 73:253-259.

Sung, W. L., Yaguchi, M and Ishikawa, K. US patent #5,759,840, issued on Jun. 2,1998.

Sung, W. L., Yaguchi, M and Ishikawa, K. US patent #5,866,408, issued on Feb. 2,1999 • * • · ··· • · • · · ' ! Tolan, J. S. and Vega Canovas, R. (1992) Pulp & Paper Canada 93:116-119).

« · • · • · · ♦ · · · Wakarchuck W. W., Sung, W. L., Campbell, R. L., Cunningham, A., Watson, D.

• · · .···. C. and Yaguchi, M. (1994) Protein Engineering 7:1379-1386.

• · «*·

Wilson, D. B., Jung, E. D., Changas, G. S., Irvin, D. C. PCT international • · · ; ·* publication on 11 may 1995. Publication No. WO 95/12668.

• * • · • · ·

Winterhalter C. andLiebl, W. (1995) Appi. Environ. Bicrobiol. 61:1810-1815.

• · · • · • · • · · :: Zappe, H., Jones, W. A., and Woods, D. R. (1987) Appl.Microbiol. Biotechnol.

27:57-63.

• ·

Zappe, H., Jones, W. A., and Woods, D. R. (1990) Nucleic Acids Res. 18:2179.

Claims (25)

1. 51
2. 1. Modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, joka käsittää yhden substituoidun amino-happojäännöksen kohdassa 75, mainitun kohdan ollessa määritetty mainitun modi- 20 fioidun ksylanaasin sekvenssivertailulla Trichoderma reesei -ksylanaasi II:n aminohapposekvenssiin, joka on määritelty sekvenssissä nro 16, jolloin mainittu modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi sisältää parantuneen termofiilisyyden, alkalofiilisyyden tai niiden yhdistelmän, verrattuna vastaavaan natiiviin ryhmä 11 -ksylanaasiin, ja jossa mainittu substituoitu aminohappo kohdassa 75 on valittu ryhmästä, jonka muodos-25 tavat Ala, Cys, Gly ja Thr.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa mainittu ryhmä 11 -ksylanaasi on valittu joukosta, jonka muodostavat Trichoderma reesei -ksylanaasi II, Trichoderma reesei -ksylanaasi I, Trichoderma viride -ksylanaasi, Streptomyces lividans -ksylanaasi B ja Streptomyces lividans -ksylanaasi C.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa mai nittu ryhmä 11 -ksylanaasi on Trichoderma reesei-ksylanaasi II.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa on lisäksi His kohdassa 10, Met kohdassa 27 ja Leu kohdassa 29 (HML).
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa mai-35 nittu ainakin yksi substituoitu aminohappoj äännös on emäksinen aminohappo koh- ·;··) dassa 105. *· *| 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa mai- :.**i nittu polaarinen aminohappo on valittu ryhmästä, jonka muodostavat His, Lys ja • · · Arg.
7. 7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jolloin • · · mainittu ryhmä 11 -ksylanaasi on valittu joukosta, jonka muodostavat Trichoderma • · 7 reesei -ksylanaasi II, Trichoderma reesei -ksylanaasi I, Trichoderma viride -ksyla- v.: naasi, Streptomyces lividans -ksylanaasi B ja Streptomyces lividans -ksylanaasi C. • · · • · • ·
8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jolloin 45 mainittu ryhmä 11 -ksylanaasi on Trichoderma reesei -ksylanaasi II. • ·
9. 9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa on yksi substituoitu ei-polaarinen aminohappoj äännös kohdassa 125 ja yksi substituoitu hapan aminohappoj äännös kohdassa 129. 52
10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa mainittu substituoitu aminohappo kohdassa 125 on Ala.
11. 11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa mainittu hapan aminohappoj äännös kohdassa 129 on Glu.
12. 12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, joka lisäksi käsittää ei-polaarisen substituoidun aminohappojäännöksen kohdassa 104.
13. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa mainittu ei-polaarinen substituoitu aminohappo kohdassa 104 on Pro.
14. 14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, joka lisäksi 10 käsittää emäksisen substituoidun aminohappojäännöksen kohdassa 132 ja emäksisen substituoidun aminohappojäännöksen kohdassa 135.
15. 15. Patenttivaatimuksen 9 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, joka lisäksi käsittää emäksisen substituoidun aminohappojäännöksen kohdassa 135 ja emäksisen substituoidun aminohappojäännöksen kohdassa 144.
16. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, joka lisäk si käsittää substituoidun aminohappojäännöksen kohdassa 157, substituoidun ami-.···. nohappojäännöksen kohdassa 161, substituoidun aminohappojäännöksen kohdassa 162. a substituoidun aminohappoj äännöksen kohdassa 165, mainittu) en substituoitu- • · · * I jen aminohappojen kohdissa 161, 162 ja 165 kunkin ollessa emäksinen aminohappo [ ] 20 ja mainitun substituoidun aminohapon kohdassa 157 ollessa hapan aminohappo. • · · • · · • ·
17. 17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, joka lisäk- :***: si käsittää substituoidun aminohappojäännöksen kohdassa 144, substituoidun ami- ·· · nohappoj äännöksen kohdassa 157, substituoidun aminohapon kohdassa 161, substi-tuoidun aminohapon kohdassa 162 ja substituoidun aminohapon kohdassa 165, • · · 25 mainittujen substituoitujen aminohappojen kohdissa 144, 161, 162 ja 165 kunkin oi- • · *;1 lessa emäksinen aminohappo ja mainitun substituoidun aminohapon kohdassa 157 • · ollessa hapan aminohappo. • · · • · • · ··· ··· • ♦ • · ·· · · 53
18. 18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jolla mainitulla modifioidulla ksylanaasilla on maksimitehokkuuslämpötila (MET) noin 69 °C - noin 78 °C, tai jolla mainitulla modifioidulla ksylanaasilla on maksimi-tehokkuus-pH (MEP) noin pH 5,8 - noin pH 7,6, ja joka mainittu modifioitu 5 ksylanaasi on ryhmä 11 -ksylanaasi, joka saadaan Trichoderma sp:stä.
19. 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jossa mainittu MET on välillä, joka on noin 70 °C - noin 75 °C.
20. 20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jonka mainitun modifioidun ksylanaasin maksimitehokkuuden pH (MEP) on välillä, joka 10 on noin pH 5,8 - noin pH 7,6 ja maksimitehokkuuslämpötila (MET) noin 69 °C -noin 78 °C.
21. 21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, jonka mainitun modifioidun ksylanaasin maksimitehokkuuden pH (MEP) on välillä, joka on noin pH 6,5 - noin pH 7,4.
22. 22. Modifioitu ryhmä 11 -ksylanaasi, joka on valittu ryhmästä, jonka muodosta vat: TrX-75A (SEQ ID NO:59); TrX-HML-75A (SEQ ID NO:62); :\j TrX-HML-75A-105H (SEQ ID NO:63);
23. 20 TrX-HML-75A-105R (SEQ ID NO:64); : TrX-HML-75C-105R (SEQ ID NO:65); Vj TrX-HML-75G-105R (SEQ ID NO:66); T rX-HML-7 5T-10 5R (SEQ ID NO:67); * TrX-HML-75G-105R-125A-129E (TrX-HML-GRAE) (SEQ ID NO:68);
24. 25 TrX-HML-75A-105H-125A-129E (TrX-HML-AHAE) (SEQ ID NO:69); v / TrX-HML-75G-105H-125A-129E (TrX-HML-GHAE) (SEQ ID NO:70); O TrX-HML-75 A-105R-125 A-129E (TrX-HML-ARAE) (SEQ ID NO:71); :γ. TrX-HML-75G-104P-105R-125A-129E (TrX-HML-GPRAE) (SEQ ID NO:72); TrX-HML-75G-104P-105H-125A-129E (TrX-HML-GPHAE) (SEQ ID NO:73);
25. 30 TrX-HML-AHAE-RR (SEQ ID N0:74); O TrX-HML-AHAE-RRR (SEQ ID NO:75); ·”*: TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH (SEQ ID NO:76); TrX-HML-AHA-RR-DRHH (SEQ ID NO:77); ja TrX-HML-AHAE-RR-DRHH (SEQ ID NO:78). 54