FI112373B - Uusi menetelmä pihkaongelmien kontrolloimiseksi massa- ja paperiteollisuudessa - Google Patents

Description

112373

Uusi menetelmä pihkaongelmien kontrolloimiseksi massa- ja paperiteollisuudessa

Esillä oleva keksintö koskee uutta menetelmää pihkaongelmien kontrolloimiseksi massa-ja paperiteollisuudessa patenttivaatimuksen 1 johdanto-osan mukaisesti. Tämä keksintö 5 antaa myös patenttivaatimusten 17, 18 ja 19 mukaisia uusia mikrobikantoja sekä patenttivaatimuksen 20 mukaisen bakteerisiirrosteen.

Massan ja paperin valmistuksessa käytettävä puumassa valmistetaan pääasiassa kemiallisella tai mekaanisella massanvalmistuksella. Ennen massanvalmistusta, puupöllit tai muu 10 puuaine (esimerkiksi sahojen hylkypuu) haketetaan yleensä koon pienentämiseksi ja aineen tekemiseksi sopivammaksi lisäprosessointiin. Mekaanisessa massanvalmistuksessa puun selluloosakuidut erotetaan jauhamis- tai hiertomenetelmillä. Kemiallisessa massanvalmistuksessa ligniini liuotetaan emäksisellä sulfaattikeitolla tai happamalla sulfiittikei-tolla. Mekaaniset massat valmistetaan yleensä havupuusta kuten kuusesta, mutta myös 15 haavasta. Kemialliset massat valmistetaan pääsiassa lehtipuista, kuten koivusta ja haavasta.

Puu sisältää uuteaineita, jotka aiheuttava pihka- ja jätevesiongelmia. Uuteaineet dispergoi-tuvat osittain prosessivesiin massan valmistuksessa, valkaisussa ja paperin valmistuksessa.

,: 20 Osa uuteaineista muodostaa aggregaatteja, jotka tarttuessaan paperikoneiden pintoihin ai heuttavat esimerkiksi paperirainan katkoksia paperinvalmistuksessa. Uuteaineet voivat • myös aiheuttaa tahmeita kohtia paperiin, jotka heikentävät paperin laatua. Paperin tah- •; · meat kohdat aiheuttavat ongelmia paperikoneen ajettavuuteen ja paperin päällystyksessä ja ': * : painossa. Uuteaineet voivat aiheuttaa haju- ja makuongelmia elintarvikepakkausmateriaa- 25 leissa. Kun vesikierto on suljettu, uuteaineiden aiheuttamat ongelmat ovat entistä vakavampia. Tämä kaikki aiheuttaa tuotantokustannusten kasvua ja tuotteen huonompaa laatua.

» » » • · *..,: Puun uuteaineiden koostumus ja määrä vaihtelee paljon. Uuteaineiden määrä on kuusessa : noin puolet siitä, mitä se on männyssä ja koivussa. Noin 30 % havupuun uutteista on trig- :' “: 30 lyseridejä, 20 % on steryyliestereitä ja 25 % hartsihappoja (Sjöström, 1981). Koivun uute- ! , , aine-koostumus on täysin erilainen kuin havupuiden. Koivussa neutraalien aineosien ja . · ·, rasvahappoestereiden suhteellinen määrä on selvästi suurempi kuin männyssä tai kuusessa, eikä koivussa ole hartsihappoja.

112373 2

Havupuumassassa, joka on keitetty emäksisellä sulfaattimenetelmällä, uuteaineiden määrä on tavallisesti alle 0,1 %. Keittoprosessin korkea pH liuottaa ja dispergoi uuteaineet, jotka vapautuvat pesuveteen pesuvaiheessa. Uuteaineiden sisältämät triglyseridit ja osa steryyli-estereistä hydrolysoituvat emäksisissä keitto-olosuhteissa. Koivu-ja haapasulfaattisellussa 5 uuteaineita on tavallisesti 0,3 - 0,8 %. Syy tähän korkeaan uutepitoisuuteen on koivun uuteaineiden huono liukeneminen ja dispergoituminen keittoprosessin aikana. Nämä määrät voivat aiheuttaa vakavia ongelmia paperin valmistuksessa ilman riittäviä kontrollointitoi-menpiteitä.

10 Havupuun mekaanisessa massanvalmistuksessa suurin osa uuteaineista dispergoituu kol loidaalisiksi pisaroiksi ja vapautuvat prosessiveteen vahvoista mekaanisista leikkausvoi-mista ja korkeasta lämpötilasta johtuen, mutta uuteaineet eivät muutu kemiallisesti. Myös ditioniitti-ja peroksidivalkaisun aikana mekaanisten massojen triglyseridit ja steryylieste-rit pysyvät lähes muuttumattomina. Puun uuteaineiden määrä hierteessä on noin 1 %. Mel-15 kein sama määrä uuteaineita kulkeutuu paperikoneeseen kuitu- tai vesifaasissa. Puun uute-aineet voivat muodostaa pihkakertymiä massa-ja paperitehtaassa ja heikentää tuotteen laatua ja tuotantonopeuksia.

Perinteisesti uuteaineiden kontrollointi paperinvalmistuksen aikana toteutetaan varastoi-20 maila (vanhentamalla) haketta ennen massanvalmistusta (Blanchette et ai. 1992). Varas-. tointi aiheuttaa usein kuitenkin hakkeen ei-toivottua värjäytymistä. Johtuen raaka-ainepu- ; : lasta, ja suurten hakekasojen vaatimasta varastoalueesta, massatehtaat ovat lyhentäneet •; · · hakkeen varastointiaikoja, mikä suurentaa edelleen pihkaongelmia. Ongelmia on yritetty ; * ratkaista siirrostamalla hake mikrobiviljelmillä, jotka kykenevät käyttämään puun uuteai- : ”; 25 neita kasvuunsa ja samaan aikaan estämään haitallisten mikrobien kasvua, jotka aiheutta vat saantohävikkiä massanvalmistusprosessissa.

»V « > » : / Mekaanisessa massanvalmistuksessa haketta on esikäsitelty sienillä, joiden on todettu pa- ’ · rantavan paperin laatua ja pienentävän energiankulutusta. On myös raportoitu, että kemial- '; 30 lisessa massanvalmistuksessa sienikäsittely parantaisi keittoliuoksen imeytymistä ja muokkaisi ligniinin helpommin hajoavaan muotoon.

Kaupallisia sienituotteita hakkeen käsittelyyn ovat esimerkiksi Ophiostoma piliferum -sienestä kehitetty tuote, Cartapip™ (Clariant Corp. USA). Käsiteltäessä haketta Carta- 3 1123.73 pip™-tuotteella, dikloorimetaaniuuteaineiden määrä pieneni mäntyhakkeissa 40 %:lla 2 viikossa. Kemiallisessa massanvalmistuksessa triglyseridien, rasvahappojen ja hartsihap-pojen määrä pieneni ja lisäksi emäksen käyttötarve pieneni jopa 20 %:lla (Wall et ai.

1996). Mekaanisessa massanvalmistuksessa Cartapip™-tuote paransi myös paperin lu-5 juusominaisuuksia (Forde-Kohler et ai, 1996). Varastoinnin aikana sienituote vähensi puun uuteaineita 8 %:lla verrattuna käsittelemättömään hakkeeseen.

Vaikka joissakin kokeissa sienikäsittely alensi puun uuteaineiden kokonaismäärää, lipofii-listen uuteaineiden määrä voi kasvaa. Käytettäessä haapaa pihkaongelmia aiheuttivat pää-10 asiassa steryyliesterit ja vahat (Leone ja Breul 1998). Niinpä olisi tärkeää analysoida ne yhdisteet, jotka aiheuttavat pihkaongelmia eikä ainoastaan mitata uuteaineiden kokonaismäärää.

Yhtenä haittana lignolyyttisillä sienillä käsittelystä on, että kaikki ne heikentävät massan 15 vaaleutta (Setcliff et ai. 1990). Toisena haittana sienikäsittelystä on, että lignolyyttiset sie net aiheuttavat saantohävikkiä hakkeessa. Painohävikki oli 0,5 -15 % 4 viikon käsittelyssä Leathamin et ai. 1990 tutkimuksissa. Riskinä erityisesti joissain sienikäsittelyissä on myös, että sieni voi tuottaa entsyymejä, jotka pilkkovat selluloosaa ja hemiselluloosaa käsittelyn aikana, mikä voi aiheuttaa ongelmia massan huonontuneista lujuusominaisuuksista 20 johtuen.

Puun tai hakkeen käsittelyä sienillä on ehdotettu myös US-patentissa 3 486 969, (home tai . pintakerrostuman sieni), eurooppalaisissa patenttihakemuksissa EP 0 387 187 A2 ja EP

_,; 0 470 929 A2 (puuhun tunkeutuva sieni). Ranskalaisessa patenttihakemuksessa nro 2 692 ," , 25 590 on kuvattu puuhun tunkeutuva sieni Ophiostomapiliferum. US-patentissa 5 055 1509 kuvataan valkolahosieni Ceriporiopsis subvermispora ja julkaisussa WO 94/21854 ehdo-, *. : tetaan puuaineen pihkapitoisuuden alentamista valkolahottajalla Schizophyllum commune, ;***. Trichaptum biforme jaPhanerochaetegigantea (tunnetaan myös nimelläPeniophora tai .' ; Phlebiopsis gigantea).

30 • > Pihkaongelmien välttämiseksi massanvalmistuksessa tiettyjä entsyymejä on ehdotettu i » i < * ] , ’ puun käsittelemiseen, esimerkiksi entsyymiä Resinase®, Novo Nordisk A/S, ja steryylie-

' « I

steraasia (PCT/FI00/00180). Näitä käsittelyjä sovelletaan kuitenkin pääasiassa vain massanvalmistuksen aikana.

4 112373

Bakteerien käytöstä massan esikäsittelyssä ei tiedetä paljon. Julkaisussa WO 96/36765 kuvataan Pseudomonas fluorescens, Pantoea agglomerans, Bacillus cereus ja Xantho-monas campestris -kantojen käyttö pihkapitoisuuden alentamiseksi massapuussa tai mas-5 sassa. Näiden ilmoitettiin vähentävän myös sinistäjäsienten aiheuttamaa värjäytymistä. Dikloorimetaaniuuteaineiden määrän ilmoitettiin vähentyneen 2 viikossa 14-45 %:lla. Käsitellyt puut olivat mänty, haapa, lehtipuuseos, vaahtera, punamänty, koivu, kuusi-koivuseos ja eukalyptus.

10 Nagieb et ai. (1994) käyttivät hakkeen käsittelyssä Streptomyces viridosporus -bakteereita ja vertasivat tuloksiaan Coriolus versicolor ja Phanerochaete chrysosporium —valkolahot-tajakäsittelyihin. Käsittely S. viridosporus -bakteerilla ei parantanut paperin lujuutta, vaikka se paransi paperin joustavuutta. Valkolahosienet paransivat molempia näitä ominaisuuksia. S. viridosporu]csella ei ollut vaikutusta paperin optisiin ominaisuuksiin, kun taas 15 valkolahosienet heikensivät paperin vaaleutta.

Puuhiokemassan käsittelyssä Matsui et ai. (1998) käyttivät bakteereita, jotka eristettiin maasta ja jotka kuuluvat sukuun Pseudomonas. Muita kantoja olivat Pseudomonas re-sinovorans, P. putidaja Alcaligenes eutrophus. Käsittelyn tuloksena hartsihapot ja muut 20 uuteaineet vähentyivät. Puuhiokkeen laatu parani, jolloin siitä valmistetun paperin lujuus parani.

_ Johnson (1979) kuvaa, että bakteerille altistuksen jälkeen lännenhemlokin (western hem- ," ; lock), jättipihdan (grand fir), ja douglaskuusen pintapuun pitkittäinen kaasun läpäisevyys 25 ja kostuvuus parafiiniöljyllä kasvoi merkittävästi. Bacilluspolymyxa oli tehokkaampi kuin : > ; mikään muu testattu yksittäinen tai sekaviljelmä.

I * » ·

Mohn et ai. (1999) (Systematic and Applied Microbiology, Feb. Voi 22(1),68-78) ovat : V. eristäneet eri lähteistä bakteerikantoja, jotka kasvavat hartsihapoilla. Edustavat isolaatit » · ,···, 30 olivat sukujen Sphingomonas, Zoogloea, Ralstonia, Burkholderia, Pseudomonas ja My- t I t cobacterium jäseniä.

i t ' ; · ’ Patenttijulkaisussa JP 9119085 kuvattiin paperinvalmistuksessa käytettävän raaka-aineen •: ’': käsittely bakteerilla, joka kuului sukuun Pseudomonas, edullisesti lajiin P. resinovorans, 35 j oka kykenee haj ottamaan hartsihappoj a, rasvahappoglyseridej ä j a rasvahappoj a. Patentti- julkaisussa JP7313143 ehdotettiin abietiinihappojen poistoa puunjalostusteollisuuden jäte- I * 112373 5 vesistä tai pihkaongelmien vähentämistä massan valmistuksessa Pseudomonas-kmnoi 11a, jotka kykenivät hajottamaan abietiinihappoja. Patenttijulkaisussa JP2000119983 ehdotettiin Pseudomonas- suvun bakteerien ja pelkistävän valkaisuaineen lisäämistä mekaanisen massanvalmistuksen prosessiveteen massan valkoisuuden menetyksen estämiseksi ja pih-5 kaongelmien kontrolloimiseksi. Yue et ai. (2000) Appi. Environ. Microbiol 66(12), 5148-5154 tutkivat hartsihappoja hajottavien bakteerien esiintymistä arktisella tundralla.

WO 97/40194 kuvasi menetelmän puun rakenteen ja koostumuksen muuttamiseksi. Menetelmä käsitti puusubstraatin puristamisen ennen tai jälkeen käsittelyä biologisella tekijällä 10 (sieni, bakteeri tai entsyymi). Puusubstraatin puristaminen aiheutti puuhun säröjä mahdollistaen biologisen tekijän tunkeutumisen puun rakenteisiin.

Vaikka kirjallisuudessa kuvataan joitakin bakteerikantoja, joilla on vaikutusta puun uute-aineisiin, tarvitaan silti uusia kantoja ja uusia käsittelymenetelmiä, jotka vähentäisivät 15 hakkeen uuteaineita. Tekniikan tasossa ei kuvata yhtään tällä hetkellä teollisuudessa mer kittävää menetelmää hakkeen esikäsittelemiseksi mikrobeilla, erityisesti bakteereilla, ennen massanvalmistusta.

Keksinnön tavoitteena on tarjota uusi menetelmä hakkeen käsittelyyn. Tarkemmin sanoen 20 keksinnön menetelmälle on tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tun-nusmerkkiosassa.

> » i · .:. · Bakteerikannat on toisaalta kuvattu patenttivaatimuksissa 17, 18 ja 19 sekä bakteerisiirros- * • * te patenttivaatimuksessa 20.

25 ·' ” · Keksinnöllä saadaan huomattavia etuja aikaan. Hakkeen lipofiilisten uuteaineiden määrä #, t vähenee viikossa vähintään 10 %, edullisemmin vähintään 20 %, edullisimmin vähintään 25 %. Kahdessa viikossa lipofiilisten uuteaineiden kokonaismäärän pieneneminen voi olla : ’ : huomattavasti suurempi: vähintään 15 %, edullisemmin vähintään 25 %, edullisimmin vä- : ”': 30 hintään 35 %. Triglyserideihin voidaan vaikuttaa erityisen tehokkaasti. Hartsihappojen ja ‘y steryyliestereiden määrää voidaan myös vähentää.

* » ’;' Paperikoneen ajettavuus paranee paperirainan harvempien katkosten ja koneen puhdistus- :.! : kertojen vähenemisen johdosta, mistä johtuu myös paperikoneen parempi ajettavuus. Pa- ;* 35 perissä on vähemmän tahmeita kohtia, mistä syystä paperituotteen laatu on parempi. Li säksi päällystämisen ja painamisen aikana on vähemmän ongelmia. Paperin katkeamis- 6 112373 vaara painamisen aikana pienenee. Kemikaalikustannuksissa saadaan myös selviä säästöjä, koska tarvitaan vähemmän kiinnitteitä tai muita paperikemikaaleja. Verrattuna sieniesikä-sittelyihin bakteerikäsittelyt eivät aiheuta merkittävää puuaineksen tummumista, ja menetelmät siirrosteen valmistamiseksi ovat nopeampia ja helpompia.

5

Seuraavassa keksintöä tarkastellaan lähemmin yksityiskohtaisen kuvauksen ja lukuisten suoritusesimerkkien avulla.

Mukana olevissa kuvioissa 10 Kuvio 1 esittää bakteerien hiilidioksidin tuoton hakkeessa kahden viikon kasvatuksen aikana.

Kuvio 2 esittää bakteerien hiilidioksidin tuoton hakkeessa yhden viikon kasvatuksen aikana.

Kuvio 3 esittää bakteerien hiilidioksidin tuoton kuusen sydänpuuhakkeessa kahden viikon 15 kasvatuksen aikana.

Talletukset

Kannat talletettiin Budapestin sopimuksen mukaisesti 8.5.2001 talletuslaitokseen DSMZ-20 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Saksa, ja ne on merkitty seuraavalla tavalla: ”: Pseudomonas marginalis E-001624, merkitty tunnuksella DSM14287 a ’ ·, - Pseudomonas marginalis E-991379, merkitty tunnuksella DSM14285 ':": Pseudomonas-sp. E-991380, merkitty tunnuksella DSM14286 ·:··! 25 » » * * · ,,, Määritelmät I · • * » · # “Mekaaninen massanvalmistus” tarkoittaa valmistusmenetelmiä, joilla raaka-aine paperin j ' i valmistusta varten lohdutetaan. Mekaaninen massa valmistetaan pääasiassa jauhamis- ja : ’ ”: hiertomenetelmillä, joissa raaka-aine altistetaan jaksoittaisille paineimpulsseille. Kitka- ; V, 30 lämmöstä johtuen puun rakenne pehmenee ja sen rakenne löystyy, mikä johtaa lopulta ’. · · kuitujen erottumiseen. “TMP”:llä tarkoitetaan termomekaanista massaa eli kuumahierret- ' · ’ tä, “GW”:llä tarkoitetaan puuhioketta, “PGW”:llä tarkoitetaan painepuuhioketta, ' ‘ “RMP”:llä tarkoitetaan hierrettä, “PRMP”:llä painehierrettä ja “CTMP”:llä kemikuuma- 1 » » : .' hierrettä. Mekaaniset massat valmistetaan pääasiassa havupuusta, mutta myös haavasta.

35 7 112375 “Kemiallinen massanvalmistus” tarkoittaa valmistusmenetelmiä, joissa oleellisia määriä puun ligniini- ja hemiselluloosa-aineosista poistetaan keittomenetelmillä. "Kraftmassan-valmistus" -termiä käytetään synonyymisesti termin "sulfaattikeitto" kanssa ja se tarkoittaa keittomenetelmää, jossa natriumsulfidia ja natriumhydroksidia käytetään pääkeittokemi-5 kaaleina. Mekaanisen massanvalmistuksen menetelmät säästävät ligniinin ja hiilihydraatit, josta on tuloksena suurempi saanto verrattuna kemialliseen massanvalmistukseen. “Sul-fiittimassa” tehdään havupuusta tai lehtipuusta "sulfiittikeitolla".

"Havupuulla" tarkoitetaan esimerkiksi mäntyä, kuusta ja muita havupuita. "Lehtipuulla" 10 tarkoitetaan esimerkiksi Betula- j a Populus-laj ej aja eukalyptusta.

“Valkaisu” merkitsee perinteisesti menetelmiä, joissa selluloosamassojen jäännösligniini tehdään liukoiseksi käyttämällä klooria tai klooridioksidia. Tällä hetkellä massat valkaistaan usein happikaasulla, vetyperoksidilla, otsonilla, tai yhdistetyillä saqoilla, joihin kuu-15 luu nämä aineet sekä edellä mainitut perinteiset valkaisukemikaalit.

Mekaaniset massat valkaistaan melko miedoissa olosuhteissa käyttämällä erilaisia kemikaaleja kuten peroksidia tai ditioniittiä.

20 '“Paperikone” tarkoittaa tässä yhteydessä myös pahvi- ja kartonkikoneita.

Termillä ’’uuteaineet” tarkoitetaan tässä lukuisia kemiallisia aineosia, jotka ovat uutetta-, vissa puusta erilaisilla orgaanisilla liuottimilla tai vedellä. Tärkeimpiä näistä ovat orgaani- . siin liuottimiin liukenevat yhdisteet kuten triglyseridit, rasvahapot, hartsihapot, steryy- ... 25 liesterit ja sitosterolit, joita kutsutaan lipofiilisiksi uuteaineiksi. Vesiliukoisia yhdisteitä, esimerkiksi lignaaneja, kutsutaan hydrofiilisiksi uuteaineiksi. "Hartsilla" tai "pihkalla" tar-, ·, ; koitetaan tässä puun hydrofobisia aineita, jotka ovat liukoisia neutraaleihin orgaanisiin , ·' . liuottimiin, esimerkiksi dietyylieetteriin, metyleenikloridiin, bentsyylialkoholiin. Hartsei- , ‘ , hin j a pihkaan kuuluvat rasvahapot j a esterit, hartsihapot, sterolit j a glyseridit.

! 30

Uuteaineiden määrä j a uuteaineiden määrän väheneminen voidaan mitata Örsän ja Holm- t « * 9 t bomin (1994) menetelmällä nestemäisestä näytteestä ja asetoniuuttomenetelmällä hak-’ ’ keesta, kuten on kuvattu tässä jäljempänä ja esimerkissä 1, vaikka muut menetelmät voivat myös olla käyttökelpoisia erityisesti joillekin puulajeille.

8 112375 "Hakkeella" tarkoitetaan kaikenlaista massapuuta, jota voidaan käyttää massanvalmistus-prosessissa ja joihin on käytetty mekaanisia ja/tai leikkausvoimia suuripinta-alaisten pienten palasten aikaansaamiseksi. Tällaisia ovat hake sekä esimerkiksi myös sahajauho. "Siir-5 rosteella" tarkoitetaan tässä mikrobiviljelmiä tai soluvalmisteita, jotka sisältävät itiöitä, ja/tai soluja, jotka kykenevät kasvamaan alustalla, jolle ne on siirrostettu. Siirroste voi myös olla kiinteässä tai nestemäisessä muodossa. Siirroste voi olla mikrobien kasvatusalusta sellaisenaan, tai se voi olla konsentroidussa muodossa tai laimennetussa muodossa. Siirrostetta voidaan säilyttää kylmäkuivattuna tai sitä voidaan säilyttää nestemäisessä 10 muodossa valinnaisesti säilöntäaineiden ja stabilisaattoreiden kanssa. Siirroste voi sisältää aineita, jotka helpottavat tai voimistavat mikrobin kasvua hakkeessa, nämä lisäaineet voivat olla esimerkiksi ravinteita, suoloja tai hivenaineita.

Hakkeen käsittelyä varten tarkoitettu siirroste käsittää ΙΟ10 -1015 bakteerisolua kasvatus-15 alusta-, vesi- tai puskurilitraa kohti, vettä tai puskuria, edullisesti 1012 -1013 bakteeriso-lua/litra. Siirroste voi sisältää ravinteita, jotka ovat peräisin bakteerien kasvatusalustasta tai ne lisätään erikseen. Keksinnön mukaisesti edullisia ravinteita ovat hiili ja typpi. Hiilen määrä voi olla 0-50 g/1, edullisesti 2 - 20 g/1 siirrostetta. Sopivan typpilähteen lisäämistä tarvitaan, jotta bakteerit kasvavat riittävästi hakkeessa. Typpilähde voi olla peräisin itse ...: 20 siirrosteesta tai sitä on lisätty siirrosteeseen bakteerien helposti hyödynnettävässä muodos- . *. sa, esimerkiksi tryptic soy broth, jopa 50 g/1, edullisesti 0,2 - 20 g/1.

Ml» » · «· · · "Siirrostusmenetelmällä" tarkoitetaan tässä mitä tahansa menetelmää, jolla hakkeeseen ; · · j voidaan siirrostaa tämän keksinnön mukaisia bakteereita. Bakteerisiirroste voidaan suih- ; ‘": 25 kutiaa tai kaataa hakkeille, hakkeita voidaan kääntää mekaanisesti, jotta varmistetaan että oleellinen määrä haketta saa siirrostetta. On edullista, että vähintään 1 %, edullisesti vä-: ' : hintään 10 %, edullisemmin vähintään 20 %, edullisimmin vähintään 50 % hakkeesta käsi- :, t, · tellään "siirrostusmenetelmällä". Jos siirroste on kuivassa muodossa, se voidaan levittää :: hakkeelle ja tarvittaessa haketta voidaan kostuttaa. Siirrostus voidaan tehdä yhden tai use- : ‘: 30 ämmän kerran, jotta varmistetaan siirrostuksen teho hakkeessa. Siirrosteessa pitäisi olla • **# 103 -1012 bakteerisolua, edullisesti 106 - 1011 bakteerisolua ja edullisimmin 108 -1010 bak- , *. teerisolua kuivaa hakegrammaa kohti.

11237? 9 Käsittelyolosuhteet

Siirrostaminen pitäisi tehdä olosuhteissa, jotka edistävät bakteereiden kasvua. Kosteuden, lämpötilan ja ilmastuksen pitäisi olla sopivia bakteerien kasvulle. Haketta voidaan käsi-5 teliä vastaleikattuina, höyryttää ennen siirrostusta tai käsitellä muuten mikrobien määrän vähentämiseksi hakkeessa ennen siirrostusta. Hakkeen kosteuspitoisuutta voidaan säätää vedellä. Haketta voidaan käsitellä reaktorissa tai kasassa. Kasvuun sopivan lämpötilan ylläpitämiseksi hakekasat voidaan peittää muovikalvolla, joka voidaan levittää siirrostetun hakkeen yli tai sen päälle. Kasoja voidaan myös lämmittää lämmitysputkilla tai muilla 10 mahdollisilla tavoilla. Tämä on tarpeellista vain kylmissä olosuhteissa, jos hakkeessa mikrobien vaikutuksesta tai luonnollisesti muodostunut lämpö ei pidä lämpötilaa riittävän korkeana. Reaktoria tai hakekasaa voidaan jäähdyttää ja ilmastaa ilmavirralla, ja kasan kosteuspitoisuuteen voidaan vaikuttaa käyttämällä lämmintä vedellä kyllästettyä ilmaa tai kylmällä kuivalla ilmalla. Hakkeen kosteuspitoisuus siirrostuksen jälkeen on 40 - 90 %, 15 edullisesti 55 - 75 %. Haketta käsitellään edullisesti tämän keksinnön mukaisilla bakteerikannoilla lämpötilassa välillä 5-45 °C, edullisemmin 10 - 40°C, edullisimmin 20 - 35 °C. Käsittelyaika on 20 tunnista useisiin kuukausiin, edullisemmin 3 päivästä kuukauteen, edullisimmin 7 päivästä 3 viikkoon. Edullisissa olosuhteissa tyydyttävät tulokset, uuteai-neiden määrän väheneminen noin 20 %:lla tai enemmän, saadaan aikaan yleisesti tämän . 20 keksinnön mukaisella menetelmällä. Uuteaineiden määrän vähenemistä on parannettu kä sittelemällä haketta ympäristöä korkeammissa lämpötiloissa ja käsittelyaikaa pidentämäl-‘ * *. lä. Niinpä paremmat tulokset on saatu 30 °C:ssa kuin 20 °C:ssa ja kahden viikon käsitte- 11 ; lyllä kuin yhden viikon käsittelyllä. Myös suuremmat kosteuspitoisuudet, noin 60 %, ovat eduksi. Käsittely on vähentänyt uuteaineiden määrää tavallisesti 30 - 60 %:lla, ja jopa noin , · · *. 25 70 %:lla edullisissa olosuhteissa.

.'. : On edullista, jos käsittely toteutetaan bakteerikasvua voimistavien aineiden läsnäollessa, ; ‘; kuten lisättyjen ravinteiden, suolojen ja hivenaineiden. Aineet voidaan lisätä ennen, sa- .' . maan aikaan tai jälkeen hakkeen siirrostuksen. Edullisen sovellusmuodon mukaisesti siir- t,,,; 30 roste sisältää ravinnelähteen, edullisemmin hiili- ja/tai typpilähteen.

» > * t · 11237? 10

Puulajit

Menetelmää ei ole rajoitettu tiettyihin puuraaka-aineisiin, vaan sitä voidaan soveltaa yleisesti sekä havu- että lehtipuulajeihin, kuten heimojen Pinacae (esimerkiksi Picea ja Pinus 5 -suvut), Salicaceae (esimerkiksi Populus-suku) lajeihin ja Betula-suvun lajeihin ja Euca-lyptus-lajeihin. Tämän keksinnön mukaisella käsittelymenetelmällä on edullista käsitellä kuusta ja erityisesti mäntyä, koska männyllä on korkea uuteainepitoisuus.

Termillä "pintapuu" tarkoitetaan puiden ulko-osia. Puiden pääosa on pintapuuta. Uu-10 teainepitoisuus on suurin pintapuussa.

Termillä "sydänpuu" tarkoitetaan puiden sisäosaa. Noin 20 % puusta on sydänpuuta.

Hakkeen pihkapitoisuutta pienentämään kykenevien bakteerien eristäminen 15

Sopivat bakteerikannat, jotka kykenevät hajottamaan puun uuteaineita, voidaan eristää ha-kekasojen, puuta sisältävien jätteiden, muiden puuaineiden, kompostin tai minkä muun tahansa mahdollisen lähteen orgaanisesta aineesta. Vaihtoehtoisesti kantakokoelmien kantoja voidaan seuloa niiden puun uuteaineiden hajottamiskyvyn ja/tai puuaineissa kasvun 20 suhteen.

., ; Nestemäisen alustan puun uuteaineet voidaan analysoida metyyli-tert-butyylieetteriuutolla ,,.,: ja kaasukromatografialla Örsän ja Holmbomin (1994) menetelmän mukaisesti. Tulokset ,:: on ilmaistu mg:na uuteaineita 1 litraa alustaa kohti (mg uuteaineita/11 alustaa).

;'* ; 25

Puunäytteiden puun uuteaineet voidaan analysoida asetoniuuteainemenetelmällä. Asetoni-:' ·. · uutto suoritettiin Scandinavian Pulp Paper and Board testing committee -menetelmän : : SCAN-CM 49:93 mukaan. Asetoniuutteiden analyysi suoritettiin Örsän ja Holmbomin . . : (1994) menetelmän mukaan erotettujen uuteaineyhdisteiden pitoisuuksien määrittämiseksi ... : 30 (esimerkiksi triglyseridit, rasvahapot, hartsihapot, steryyliesterit, sitosterolit, lignaanit).

' . Tulokset ilmaistiin mg uuteaineita (tai spesifistä uuteaineyhdistettä) kuivan puunäytteen ... grammaa kohden. Uuteaineiden pitoisuuden aleneminen arvioitiin suhteessa vertailukäsit- telyyn, jota käsiteltiin muuten samalla tavalla, mutta siirrostamisen sijaan lisättiin sama määrä steriiliä vettä. Tämä menetelmä antaa arvion bakteerikäsittelyn todellisesta vaiku- 112373 11 tuksesta. Siihen ei sisälly esimerkiksi autoklaavissa käsittelyn vaikutus puun uuteaineiden määrään, jotka pitäisi ottaa lukuun, jos vertailuna käytettäisiin vastaleikatulle hakkeelle saatuja arvoja.

5 Tässä keksinnössä eristettiin hakkeesta 9 bakteerikantaa, j otka kykenevät pilkkomaan puun uuteaineita. Parhaimmat kannat kuuluvat Pseudomonas-sukmm j a P. marginalis -lajiin. Yhtä Pseudomonas-keamoista. ei voitu tunnistaa, mutta se kuuluu RNA-ryhmään I, ja se kuuluu mahdollisesti P. migulae -lajiin.

10 Ilmaisulla "laji, jota edustaa kanta E-001624 tai E-991379" tarkoitamme tässä lajia, johon nämä kannat kuuluvat, so. P. marginalis. Niinpä ilmaisulla "laji, jota edustaa kanta E-991380" tarkoitamme tässä lajia, johon E-991380 kuuluu, vaikka lajin nimeä ei vielä tiedetä.

15 "Kannalla, jota edustavat kannat E-001624 tai E-991379 tai E-991380", tarkoitamme bakteerikantoja, joilla on kaikki tunnusomaiset ominaispiirteet kuten näillä talletetuilla kannoilla, tai on niiden variantti tai mutantti, jolla on oleellisesti samat puun uuteaineita hajottavat ominaisuudet kuin näillä kannoilla kahden viikon autoklavoidun kuusihakkeen käsittelyssä, kun niille siirrostetaan noin 5 x 109 solua hakegrammaa kohti noin 30 °C:ssa, , 20 ja kun kosteuspitoisuus on noin 60 %. Nämä olosuhteet on kuvattu yksityiskohtaisesti esimerkissä 3.

. Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit valaisevat keksintöä: 25 Esimerkki 1 : Bakteerikantojen eristäminen ja valinta . ‘ . Bakteerikannat eristettiin paperitehtaalta saadusta kuusihakkeesta. Seuraavia agarmaljoja _ ’ 30 käytettiin bakteerien eristämiseksi: • 1. Ravinne-agar (Difco 0001) »»li* 2. Agarmaljat, jotka sisälsivät puun uuteaineita I, pH 6,5 : *’ TMP-vettä (10 %) 270ml/l

Yeast Nitrogen Base (Difco 0392-15) 6,7 g/1 112373 12

Agar 6 g/1 3. Agarmaljat, jotka sisälsivät puun uuteaineita II, pH 6,5 TMP-vesi (10 %) 300 ml/1

Benomyyli-sienimyrkky 0,01 g/1 5 Agar 6 g/1 TMP-veden valmistaminen on kuvattu esimerkissä 2. Kaimat E-001624 ja E-991379 eristettiin inkuboimalla hakenäytteitä maljoilla 3. Muut kannat eristettiin ravistelemalla (200 rpm, 2 h) kourallista haketta erlenmayerpullossa, joka sisälsi 100 ml steriiliä fysiologista liuosta (0,9 % NaCl) ja siirrostamalla maljat suspensiolla. Kannat 2,3,4,5 ja 6 eristettiin 10 maljoilta 1 (ravinne-agar). Niiden kasvu testattiin myös maljoilla 2. Kannat E-991380 ja 1 eristettiin maljoilla 3, jotka sisälsivät sienimyrkkyä estämään maljoilla 2 havaittua sienten kasvua. Valmistettiin valittujen kasvustojen puhdasviljelmät ja siirrostettiin ravinne-agar-vinopinnoille. Eristetyt kannat on esitetty taulukossa 1.

15 Taulukko 1. Eristetyt bakteerikannat.

Bakteeri viljelmä Tunnistus Lähde E-001624 Pseudomonas marginalis Tuore kuusihake, Suomi E-991379 Pseudomonas marginalis Tuore kuusihake, Suomi E-991380 Pseudomonas sp. * Tuore kuusihake, Suomi :: 1 Pseudomonas sp.* Tuore kuusihake, Suomi ‘ ‘ 2 Tunnistamaton Kuusihake, Suomi • t > · ' * 3 Tunnistamaton Kuusihake, Suomi 4 Tunnistamaton Kuusihake, Suomi ’ * 5 Tunnistamaton Kuusihake, Suomi 6 Tunnistamaton Kuusihake, Suomi . . * ei voitu tunnistaa, RNA-ryhmä I, mahdollisesti P. migulae.

• ·

Esimerkki 2 i 11 * i 20 Bakteerikantojen kyky hajottaa puun uuteaineita nestemäisessä alustassa tili» * ·' Tämän kokeen tarkoituksena oli tutkia, voisivatko eristetyt bakteerit hajottaa puun uuteai neita nestemäisessä alustassa.

11237? 13

Kasvatusainetta, joka sisälsi puun uuteaineita, valmistettiin seuraavalla tavalla: TMP-massaa suomalaisesta paperitehtaasta (kuivapaino 37,5 %) suspendoitiin veteen, jotta saatiin kuiva-ainepitoisuudeksi 3 %. Uuttaminen suoritettiin sekoittamalla voimakkaasti 5 vesihauteessa 3 tuntia. Uutto-olosuhteet olivat 60 °C ja pH 5. Uuttamisen jälkeen suspensio sentrifiigoitiin (500 g, 30 min) ja konsentroitiin 3,3-kertaiseksi. Suspension hiilihydraatit hydrolysoitiin entsyymikäsittelyllä lisäämällä 1 ml/1 Pectinex Ultra SPL -entsyymiä ja inkuboitiin 40 °C:ssa 1 tunti. Konsentraatin pH säädettiin 7,2:een hydrolyysin jälkeen. 45 ml konsentraattia annosteltiin 250 ml:n erlenmayerpulloihin ja autoklavoitiin. Lisättiin 10 5 ml steriilisuodatettua Yeast Nitrogen Base -liuosta (Difco 0392-15). Tätä alustaa, joka sisälsi puun uuteaineita, käytettiin kasvatusalustana. Kasvatusalustan sisältämä uutepitoi-suus on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2. Kasvatuselatusaineen uuteainepitoisuus

Yhdiste Pitoisuus (mg/1)

Lipofiiliset uuteaineet Rasvahapot 20

Triglyseridit 102

Steryyliesterit 58

Sitosteroli 9

Hartsihapot 39

Hydro fiiliset uuteaineet Lignaanit 126 . Yhteensä 353 . 15 . · · *. Kannat säilytettiin ravinne-agar (Nutrient Agar, Oxoid CM3) -vinopinnoilla. Siirroste valmistettiin kasvattamalla bakteereita tryptic soy broth:ssa (Becton Dickinson 4311768) : v, 30 °C:ssa 24 tuntia ravistelupulloissa. 1 ml siirrostetta lisättiin kuhunkin 50 ml:aa uuteai- • · : . neita sisältävää kasvatusalustaa sisältävään pulloon, jotka oli valmistettu kuten edellä on j. 20 kuvattu. Vertailukäsittelyyn ei lisätty siirrostetta. Bakteerien kasvua tarkkailtiin kasvatuk- * · » , · · t sen aikana. Mikrobisolujen määrä viljelmissä (PMY/ml:na) kasvatuksen alussa ja sen ai-

* I

kana olivat seuraavia:

Taulukko 3. Pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (PMY) määrä uuteaineita sisältävässä 25 kasvatusalustassa siirrostuksen jälkeen sekä 1, 2, 3 ja 7 päivän kasvatuksen jälkeen.

11237? 14 __ pMY/ml Öd Td 2d 3d 7d E-001624 1,5 108 2,5· 109 2,2-109 2,4· 109 1,2109 E-991379 1,8 108 1,8 109 2,3 109 2,4 109 1,6 109 E-991380 1,3 108 1,7 109 1,6 109 1,4 109 5,1 108 1 2,0 108 1,1 109 1,9 109 1,2 109 3,1 108 2 2,2 108 2,3 108 1,5 108 1,0 108 1,9 107 3 3,3 108 1,6 109 1,4 109 1,3 109 1,7 108 4 2,4-108 1,4109 9,7-10* 6,8-10* 3,8-10* 5 3,6-10* 1,3-109 1,1 109 6,1-10* 4,5-10* 6 1,1-107 2,0-108 1,6-10* 3,7-107 1,2-107

Pesäkkeitä muodostavien yksiköiden määrä analysoitiin maljaviljelymenetelmällä. Näytteet laimennettiin steriilillä peptoni-suolaliuoksella (Maximal recovery diluent, LabM, labl03), jotta saatiin laimennokset, kuten lxlO'5, lxlO'6 ja lxlO'7. Kustakin laimennok-5 sesta levitettiin 0,1 ml Plate Count agar (Difco 0479-17) -levyille. Levyjä inkuboitiin 30 °C:ssa 1-3 päivää. Bakteerien yksittäiset pesäkkeet laskettiin ja jaettiin laimennoksella.

Tämä menetelmä antoi niiden solujen lukumäärän, jotka muodostavat pesäkkeitä arvioitavan soluja sisältävän suspension ml:aa kohti.

i ! • 10 Siirrostettuja pulloja inkuboitiin 30 °C:ssa, ravisteltiin nopeudella 200 rpm yhden viikon aj an. Kasvatuksen j älkeen puun uuteainepitoisuus analysoitiin MTBE-uutolla (örsä ja ‘ Holmbom, 1994). Tulokset on esitetty taulukossa 4.

* * * ‘ * ♦ i

Taulukko 4. Puun uuteaineita sisältävien käsiteltyjen kasvatusalustojen uuteainepitoisuus.

’. ’ : Kanta Rasvahapot Hartsihapot Lignaanit Sitosteroli Steryyliesterit Triglyseridit (mg/1) ,. : (mg/1) (mg/1) (mg/1) (mg/1) (mg/1)

Vertailu 24 43 U7 8^ 60 102 :· : E-001624 12 45 109 7,7 59 101 : E-991379 11 44 110 8,1 60 80 E-991380 16 45 106 7,6 55 99 1 15 51 105 8,1 65 116 112373 15 3 9 40 Ϊ02 Ί~β 58 106 4 12 47 117 7,3 55 99 5 10 39 104 6,6 55 97 6 13 38 98 6,7 56 98

Bakteerikäsittely vähensi kokonaisuuteaineita 0-13 %:lla.

Esimerkki 3 5

Hakkeen käsittely olosuhteissa I

Tämän kokeen tarkoituksena on testata, voisivatko valitut bakteerit vähentää kuusen pin-tapuuhakkeen asetoniuuteaineaineiden määrää.

10

Kuusen pintapuuhake steriloitiin autoklavoimalla 121 °C:ssa 20 min muovipusseissa. Siir-roste valmistettiin kasvattamalla bakteereita tryptic soy brothrssa (Becton Dickinson 4311768) 30 °C:ssa 24 tuntia ravistuspulloissa. Tässä kohtaa syntyneillä kasvustoilla oli seuraava bakteerisolupitoisuus: 15 • · * Taulukko 5. Bakteereiden pitoisuudet siirrosteessa.

Viljelmä PMY/ml I E-001624 5,3 109 ’ E-991379 6,7 109 t I t 320 grammaa (kuivapaino) haketta siirrostettiin 100 ml:lla siirrostetta. Vertailuviljelmissä . ‘: 100 ml steriiliä vettä lisättiin siirrosteen sijaan. Siirrosteet sekoitettiin hakkeeseen ja auto-

• I

. *”; 20 klavoidut reaktorit täytettiin hakkeella. Hakkeen kosteuspitoisuus oli 60 % siirrostuksen I I t . ’ . jälkeen.

• » » »* · * » ...,; Bakteereja kasvatettiin kuusihakkeella säädellyissä olosuhteissa bioreaktoreissa 14 päivää.

: ·. *. Käytettiin lasireaktoria (kokonaistilavuus 2,75 1), jonka ilman sisään- ja ulostulossa oli 25 ilmasuodattimet. Reaktoreiden lämpötilaa säädettiin 30 °C:een vesihauteella. Kosteutettua 11237? 16 ilmaa johdettiin jatkuvasti reaktorin läpi CC^n poiston jälkeen. Ilmavirran nopeus säädettiin arvoon 10 ml/min. CC>2:n prosenttiosuus ulostulossa mitattiin on-line-analysaattorilla (Normocap, Datex, Suomi) bakteerien metabolisen aktiivisuuden tarkkailemiseksi. CO2-tuotto kasvatuksen aikana on esitetty kuviossa 1.

5

Kasvatuksen jälkeen hake ilmakuivattiin 3 päivää huoneenlämpötilassa ja jauhettiin (Pul-verisette 14.702, Fritsch, Saksa). Asetoniuuteainepitoisuudet analysoitiin näytteistä. Tulokset on esitetty taulukossa 6.

10 Taulukko 6. Hakkeen asetoniuuteainepitoisuus ja lipofiilisten uuteaineiden väheneminen hakkeessa kahden viikon käsittelyn jälkeen.

Kanta Uuteainepitoisuus (mg/g) Lipofiilisten

Rasvaha- Hartsiha- Steryy- Sitosteroli Triglyseridit Lipofiiliset uu- uuteaineiden pot pot liesterit teaineet yhteen- väheneminen sä (%) E-0016240,8 " 1,2 " 1,3 0,10 1,9 5,3 ~32 E-991379 0,7 0,8 0,5 0,09 0,4 2,5 67

Vertailu 0,6 1,6 1,5 0,08 3,9 7,7 0

Kanta E-991379 vähensi merkittävästi uuteaineiden määrää. Rasvahappojen, steryylieste-': reiden ja triglyseridien määrä aleni yli 50 %:lla. Kanta E-991379 alensi lipofiilisten uute- 15 aineiden määrää 67 %:lla. Myös kannalla E-001624 oli selvä vähentävä vaikutus uuteaineiden määrään.

Esimerkki 4

20 Hakkeen käsittely olosuhteissa II

*· * * » ;1 Tämän kokeen tarkoituksena oli määrittää, voisivatko eristetyt bakteerit vähentää kuusen v* pintapuun uuteaineiden määrää yhden viikon käsittelyssä.

: : : 25 Hakkeen valmistaminen ja siirrostaminen olivat samat kuin esimerkissä 3. 320 grammaa : : (kuivapaino) haketta siirrostettiin 100 ml:lla siirrostetta. Vertailuviljelmissä 100 ml sterii liä vettä lisättiin siirroksen sijaan. Siirroste sekoitettiin hakkeeseen ja autoklavoidut reak- 112373 17 torit täytettiin hakkeella. Hakkeen kosteuspitoisuus reaktoreissa oli 60 % siirrostuksen jälkeen.

Bakteereja kasvatettiin kuusihakkeella säädellyissä olosuhteissa bioreaktoreissa 7 päivää.

5 Käytettiin lasireaktoria (kokonaistilavuus 2,751), jonka ilman sisään- ja ulostulossa oli ilmasuodattimet. Reaktoreiden lämpötilaa säädettiin 30 °C:een vesihauteella. Kosteutettua ilmaa johdettiin jatkuvasti reaktorin läpi C02:n poiston jälkeen. Ilmavirran nopeus säädettiin arvoon 10 ml/min. CC>2:n prosenttiosuus ulostulossa mitattiin on-line-analysaattorilla (Normocap, Datex, Suomi). C02-tuotto kasvatuksen aikana on esitetty kuviossa 2.

10

Kasvatuksen jälkeen hake ilmakuivattiin 3 päivää huoneenlämpötilassa ja jauhettiin (Pul-verisette 14.702, Fritsch, Saksa). Asetoniuuteainepitoisuudet analysoitiin näytteistä. Tulokset on esitetty taulukossa 7.

15 Taulukko 7. Hakkeen asetoniuuteainepitoisuus ja lipofiilisten uuteaineiden väheneminen yhden viikon käsittelyn jälkeen.

Uuteainepitoisuus (mg/g) Väheneminen lipofiili-

Kanta Rasvahapot Hartsihapot Steryyliesterit Sitosteroli Triglyseridit Lipofiiliset uute- sissä uutteissa (%) aineet yhteensä . E-001624 Ϊ/7 ϊβ Öfi9 "Ϊ6 ' ‘ E-991379 0,8 U 0,8 0,10 1,0 3,9 38 ; Vertailu 0,5 1,6 1,3 0,09 2,9 6,3 0 •: * ·; Kuusen pintapuun yhden viikon käsittely bakteereilla alensi lipofiilisten uuteaineiden ·:*·: määrää 16 - 38 %:lla.

ΓΊ 20

Esimerkki 5 • » > • »

> I I

•.,. · Hakkeen käsittely olosuhteissa III

25 Tämän kokeen tarkoituksena oli määrittää, vähentäisikö eristetty bakteeri E-991379 kuu-,,, : sen sydänpuun uuteaineiden määrää kahden viikon käsittelyssä huoneenlämpötilassa, ja t · : , . tutkittiin bakteerikäsittelyn vaikutusta hakkeen väriin.

112373 18

Kuusen sydänpuuhake (kosteuspitoisuus 32 %) autoklavoitiin polypropeenipusseissa. Hakkeen kuivapaino oli 5 kg. Kosteuspitoisuus säädettiin lisäämällä 3 litraa vettä ennen autoklavointia. Hake siirrostettiin lisäämällä 1300 ml siirrostetta, jota oli kasvatettu 24 tuntia tryptic soy broth:ssa. Bakteerien pitoisuus siirrosteessa oli 2,1-109 PMY/ml. Siirros-5 tuksen, sekoittamisen ja näytteen oton jälkeen hake laitettiin reaktoriin. Hakkeen määrä oli 10,5 kg (kosteuspitoisuus 55 %).

Bakteereja kasvatettiin kuusihakkeella bioreaktoreissa 14 päivää. Käytetty reaktori oli kompostointireaktori (Biolan 220, Suomi), jonka kokonaistilavuus oli 220 litraa. Reaktori 10 oli eristetty, mutta ei lämmitetty. Reaktoria ilmastettiin kosteutetulla ilmalla. Ilma suodatettiin ilman sisäänviennissä ja ulostulossa. Ilmavirran nopeus säädettiin arvoon 0,2 - 0,33 1/min ja mitattiin Honeywell AWM 5101 Mass -ilmavirtaanturilla. C(>2:n prosenttiosuus ulostulossa mitattiin on-line-analysaattorilla (Normocap, Datex, Suomi). Tulokset on esitetty kuviossa 3.

15

Kasvatuksen jälkeen puun asetoniuuteaineet analysoitiin näytteistä. Haketta ilmakuivattiin 3 päivää huoneenlämpötilassa ja jauhettiin (Pulverisette 14.702, Fritsch, Saksa). Asetoni-uuteainepitoisuus analysoitiin näytteistä. Tulokset on esitetty taulukossa 8.

20 Taulukko 8. E-991379-käsitellyn ja autoklavoidun kontrollihakkeen asetoniuuteaineaineet ,,.: (mg/g kuivaa puuta).

Näyte Rasvaha- Hartsiha- Sitosteroli Steryyli Trigly- Lignaa- Lipofiiliset Lipofiilisten ' · pot(mg/g) pot(mg/g) (mg/g) esterit seridit nit uuteaineet uuteaineiden : i (mg/g) (mg/g) (mg/g) yhteensä väheneminen (mg/g) (%) I 7 E-991379 0,9 1,2 0,1 1,0 1,2 0,5 4,6 20 ... * -käsittely ! : : Autoklavoi- 1,2 1,4 0,1 1,2 1,6 0,6 5,7 0 ;' ’'; tu kontrolli i « i > ·

T t I

, · *' Kuusen sydänpuun käsittely E-991379:11a huoneenlämpötilassa alensi lipofiilisiä uuteai- neita, steryyliestereitä, triglyseridejä ja rasvahappoja vastaavasti 20 %:lla, 21 %:lla, 22 11237? 19 %:lla ja 24 %:lla. Näytteiden värit analysoitiin kuivista jauhetuista näytteistä analysaattorilla (CR-200, Minolta, Japan). Värimittausten tulokset ovat taulukossa 9.

Taulukko 9. Kuusen sydänpuuhakkeen väri ennen ja jälkeen bakteerikäsittelyn. Tulokset 5 ovat neljän mittauksen keskiarvoja. L on vaaleus, a on ensisijainen väri ja b on sävy.

Näyte L a b E-991379-käsittely, 2 viikkoa 84,0 2,5 18,5

Ennen käsittelyä, autoklavoitu 83,5 2,9 18,3 Värimääritykset osoittavat sen tosiseikan, että bakteerikäsittely ei merkittävästi vaikuta puun väriin tai vaaleuteen. Näytteiden välinen ero on minimaalinen verrattuna monien sienten vaikutukseen ja se on mittausepätarkkuuden alueella.

10

Esimerkki 6

Hakkeen käsittely olosuhteissa IV

15 Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia, voitaisiinko eristetyn bakteerin E-991379 ‘ * * kasvua parantaa hakkeessa lisäämällä ravinteita.

’ ' Käytetyt reaktorit olivat 500 ml:n Schott-pulloja. Hakkeen määrä reaktoreissa oli 73,5 * ‘ grammaa (kuivapaino 32 grammaa). Ilmavirran nopeus säädettiin arvoon 4 ml/min. Bak- 20 teerien kasvua tarkkailtiin manuaalisilla mittauksilla Servomex-analysaattorilla. Reakto-‘’ reiden lämpötila säädettiin 30 °C:seen vesihauteella.

> ; Siirroste valmistettiin kasvattamalla kantaa E-991379 tryptic soy broth:ssa (Becton

Dickinson 4311768) 30 °C:ssa 24 tuntia ravistelupullossa. Tässä vaiheessa saadulla vil-25 jelmällä oli 1,1109 pesäkettä muodostavaa yksikköä ml:aa kohti. Siirrosteen kasvattami-; * * sen jälkeen solut erotettiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin 2,5 ml:aan fysiologista suola- “· liuosta (0,9 % NaChää). Siirrosteen valmistamiseksi reaktoreita varten 0,1 ml NaCl- suspensiota ( 5,6-1010 PMY/ml) laimennettiin 9,9 rnklla kasvatusalustaa, kuten on kuvattu 112373 20 taulukossa 10. Alustoja oli 0,9 % NaCl (vertailu), supematantti sentrifugoinnista (sisältäen esimerkiksi hieman typpeä) sekä kasvatusalusta, joka sisälsi erilaisia määriä glukoosia ja typpilähdettä (tryptikaasipeptoni, Becton-Dickinson).

5 Taulukko 10. Siirrosteen koostumus. Hiilen ja typen pitoisuus siirrosteessa (g/1) ja siirros-teen kanssa reaktoriin lisättyjen ravinteiden määrä.

Siirroste Lisätyt aine- Pitoisuus siirroksessa (g/1) Lisäravinteiden määrä (g)

osat C N C N

_ ______ _ _ _ _ 2 Supematantti Alle 2 Alle 20 alle 0,02 alle 0,2 3 C, N 2 20 0,2 2 4 C(10x), N 20 20 2 2 5 N 0 20 0 2

Kuusen pintapuuhaketta autoklavoitiin reaktoripulloissa ja lisättiin 10 ml siirrostetta, joka valmistettiin kuten edellä on kuvattu. Kasvatuksista tehtiin rinnakkaiset kasvatukset. Kas-10 vatusaika oli 14 päivää. Kasvatuksen aikana kasvua tarkkailtiin CXVmittauksilla. Kasvatuksen jälkeen hakkeen kosteuspitoisuus analysoitiin. Tulokset on esitetty taulukossa 11.

‘tili i · 112373 21

Taulukko 11. Lisäravinteiden vaikutus bakteerien kasvuun. Tulokset ovat rinnakkaisten kasvatusten keskiarvoja. Hakkeen kosteuspitoisuus kasvatuksen jälkeen, hiilidioksidin tuotto kasvatuksen aikana, tuotetun hiilen määrä ja lisäravinteina lisättyjen hiilen ja typen määrä.

Kosteuspi- C02-tuotto Tuotetun hii- Reaktoriin lisät- Reaktoreihin toisuus (%) (mg/g kuivaa Ien määrä tyjen sokerien lisättyjen typ-m haketta) (mg) määrä (mg) pilähteiden määrä (g) «3 ve>/ 1 62 0,0 0 0 0 2 65 12,4 109 1,3 <0,2 3 61 14,7 128 1,3 0,2 4 61 17,1 149 13,3 0,2 5 61 15,4 134 0 0,2 5

Ravinteiden lisäämisellä oli selvä vaikutus kannan E-991379 kasvuun hakkeessa. Solut yksinään ilman ravinteita (siirroste 1, NaCl:n kanssa) eivät pystyneet kasvamaan. Tulokset osoittavat, että bakteerien kasvua hakkeessa voidaan parantaa lisäämällä ravinteita, jotka sisältävät esimerkiksi typpilähteen.

·; · 10 : : : Esimerkki 7 112373 22

Taulukko 12. Bakteerien pitoisuus siirrosteessa.

Viljelmä PMY/ml E-001624 2-8 -109 E-991379 2-8 -109 60 grammaa (kuivapaino) haketta siirrostetaan 20 ml:lla siirrostetta. Vertailuviljelmät siir-rostetaan steriilillä vedellä. Siirrosteet sekoitetaan hakkeeseen ja autoklavoidut reaktorit 5 täytetään hakkeella. Hakkeen kosteuspitoisuus on noin 60 % siirrostuksen jälkeen.

Bakteereja kasvatetaan kuusihakkeella säädellyissä olosuhteissa bioreaktoreissa 14 päivää. Käytetään lasireaktoria (kokonaistilavuus 0,5 1), jonka ilman sisään-ja ulostulossa on il-masuodattimet. Reaktoreiden lämpötila säädetään 30 °C:een vesihauteella. Kosteutettua 10 ilmaa johdetaan jatkuvasti reaktorin läpi C02:n poiston jälkeen. Ilmavirtauksen nopeus säädetään arvoon 10 ml/min. C02in prosenttiosuus ulostulossa mitataan on-line-analysaattorilla (Normocap, Datex, Suomi) bakteerien metabolisen aktiivisuuden tarkkailemiseksi. CCVtuotanto kasvatuksen aikana mitataan, kuten on kuvattu esimerkissä 3.

15 Kasvatuksen jälkeen haketta ilmakuivataan 3 päivää huoneenlämpötilassa ja jauhetaan (Pulverisette 14.702, Fritsch, Saksa). Asetoniuuteainepitoisuudet analysoidaan näytteistä. Bakteerit vähentävät puun uuteaineiden määrää männyn pintapuun hakkeella.

: Esimerkki 8 20

Puun sahajauhon käsittely ' ‘; Tämän tutkimuksen tarkoitus on tutkia, voisivatko valitut bakteerit vähentää männyn pin- ; ’' ‘: tapuun sahajauhon asetoniuuteaineiden määrää.

.·:·. 25 , · · , Siirrosteet valmistetaan kasvattamalla bakteereja tryptic soy broth:ssa (Becton Dickinson , ‘, 4311768) 30 °C:ssa 24 tuntia ravistuspulloissa. Tällä kohtaa syntyneillä viljelmillä on seu- ' 7raava bakteerisolupitoisuus: 23 1 12373

Taulukko 13. Bakteerien pitoisuudet siirrosteessa.

Viljelmä PMY/ml E-001624 2-8 109 E-991379 2-8 109 60 grammaa (kuivapaino) steriloitua (121 °C, 20 min) tai steriloimatonta männyn pinta-puusahajauhoa siirrostetaan 20 ml:lla siirrostetta. Vertailuviljelmät siirrostetaan steriilillä 5 vedellä. Siirroste sekoitetaan sahajauhoon ja autoklavoidut reaktorit täytetään sahajauholla. Sahajauhon kosteuspitoisuus on 60 % siirrostuksen jälkeen.

Bakteereja Joita on kasvatettu, kontrolloidaan bioreaktoreissa 14 päivää. Käytetään lasire-aktoria (kokonaistilavuus 0,51), jonka ilman sisään- ja ulostulossa on ilmasuodattimet.

10 Reaktoreiden lämpötila säädetään 30 °C:een vesihauteella. Kosteutettua ilmaa johdetaan jatkuvasti reaktorin läpi CC>2:n poiston jälkeen. Ilmavirran nopeus säädetään arvoon 10 ml/min. COr.n prosenttiosuus ulostulossa mitataan on-line-analysaattorilla (Normocap, Datex, Suomi) bakteerien metabolisen aktiivisuuden tarkkailemiseksi. CC>2-tuotanto kasvatuksen aikana mitataan, kuten on kuvattu esimerkissä 3.

15

Kasvatuksen jälkeen sahajauhonäytteitä ilmakuivataan 3 päivää huoneenlämpötilassa.

• Asetoniuuteainepitoisuus analysoidaan näytteistä. Bakteerit vähentävät puun uuteaineiden ’ määrää sahajauhossa.

' 20 Kirjallisuusviitteet: • ’ Blanchette, R.A., Farrell, R.L., Bumes, T.A., Wendler, P.A., Zimmerman, W., Brush, T.S.

and Snyder, R.A., Biological control of pitch in pulp and paper production by Ophiostoma ;,, * piliferum, Tappi J. 75 (1992) 102-106.

25 t 1 ’. : Johnson, B.R., Permeability changes induced in three western conifers by selective bacte rial inoculation, Wood and Fiber 11 (1979) no.l, 10-21.

* * * ; » i ’. * Forde-Kohler, L., Dinus, R., Malcom, E., Rudie, A., Farrell, R. and Brush, T., Enhancing 30 softwood mechanical pulp properties through chip treatment with Ophiostoma piliferum, 11237? 24

Proceedings of the 6th international conference on biotechnology in the pulp and paper industry: advances in applied and fundamental research, Eds. E. Srebotnik ja K. Messner, Facultas-Universitätsverlag, Wien 1996, pp. 225-228.

5 Leone, R. and Breuil, C., Filamentous fungi can degrade aspen steryl esters and waxes,

Int. Biodeterior. &Biodegrad. 41 (1998) 133-137.

Leatham, G.F., Myers, G.C. and Wegner, T.H., Biomechanical pulping of aspen chips: energy savings resulting from different fungal treatments, Tappi J. 73 (1990) No 5,197-10 200.

Matsui, M., Taneda, H., Fujita, Y., Matsukura, M. and Hata K., Biodegradation of resin acids in the papermaking process, Proceedings of the 7th international conference on biotechnology in the pulp and paper industry, Publication Clerk, Montreal 1998, pp. A217-15 A220.

Nagieb, Z.A., Helmy, S.M. and El-Gammal, A., Effects of different microorganisms on pulp and paper properties, Polym.-Plast. Technol. and Eng. 33 (1994) No 4,457-464.

» 20 Setliff, E.C., Marton, R., Granzow, S.G. and Eriksson, K.L., Biomechanical pulping with white-rot fungi, Tappi J. 73 (1990) No 8,141-147.

; Sjöström, E. (1981) Extractives. In: Wood Chemistry. Fundamentals and applications. 2 ; eds. Academic Press. San Diego, pp. 90-108.

, 25

Wall, M.B., Stafford, G., Noel, Y., Fritz, A., Iverson, S. and Farrell, R.L., Treatment with : Ophiostoma piliferum improves chemical pulping efficiency, Proc. 6th international con- ; ference on biotechnology in the pulp and paper industry: advances in applied and funda- : mental research, eds. E. Srebotnik and K. Messner, Fakultas-Universitätsverlag, Wien 30 1996, pp. 205-210.

Örsä, F. and Holmbom, B., A convinient method for the determination of wood extracti- t ves in papermaking process waters and effluents, J. Pulp Paper Sci. 20 (1994) no 12, 361-366.

Claims (25)

11237 7

1. Menetelmä uuteaineiden kontrolloimiseksi mikrobeilla massan ja paperin valmistuksessa, tunnettu siitä, että haketta käsitellään bakteerikannan siirrosteella valittuna ryh- 5 mästä, joka käsittää kannat, j otka kuuluvat laj eihin, joita edustavat kannat Pseudomonas marginalis E-001624 (DSM14287), Pseudomonas marginalis E-991379 (DSM14285) ja/tai Pseudomonas sp. E-991380 (DSM14286), sellaisissa olosuhteissa, jotka sallivat siir-rosteen kasvaa hakkeella tai hakkeessa riittävän aikaa, jotta hakkeen uuteainepitoisuus pienenee. 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kanta kuuluu Pseudomonas marginalis -lajiin.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kanta on kan-15 ta, jota edustaa Pseudomonas marginalis E-001624 (DSM14287) tai Pseudomonas marginalis E-991379 (DSM14285).

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kanta kuuluu lajiin, jota edustaa Pseudomonas sp. E-991380 (DSM14286). . ... 20 t _

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kanta on kan- . ,: ta, jota edustaa Pseudomonas sp. E-991380 (DSM14286).

.: 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hake al- 25 tistetaan siirrosteelle, jossa on 103 -1012 bakteerisolua, edullisesti 106 - 10u bakteerisolua ja edullisimmin 108 -1010 bakteerisolua kuivaa hakegrammaa kohti.

: 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely toteutetaan ruiskuttamalla tai kaatamalla siirroste hakkeen päälle. : 30

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely toteutetaan lämpötilassa 5 - 45 °C, edullisesti 10-40 °C, edullisimmin 20 - 35 °C. 11237?

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely toteutetaan 20 tunnista useisiin kuukausiin, edullisemmin 3 päivästä kuukauteen, edullisimmin 7 päivästä 3 viikkoon.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsit tely toteutetaan olosuhteissa, joissa kosteuspitoisuus hakkeen siirrostuksen jälkeen on 40 -90 %, edullisesti 55 - 75 %.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsit- 10 tely käsittää bakteerien kasvua parantavien aineiden lisäämisen.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely käsittää typen ja/tai hiilen lisäämisen, joita siirrostetut bakteerit voivat käyttää kasvuunsa. 15

13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siir-roste käsittää typpeä ja/tai hiiltä, joita siirrostetut bakteerit voivat käyttää kasvuunsa.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puu- 20 laadut valitaan heimojen Pinacae (esimerkiksi Picea- ja Pinus -suvut), Salicaceae (esi merkiksi Populus-suku) lajeista ja Betula-suvun lajeista ja Eucalyptus-lajeista.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsiteltyä haketta käytetään mekaanisessa massanvalmistuksessa. .··; 25 I » ·

16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsi- : v. teltyä haketta käytetään kemiallisessa massanvalmistuksessa.

; ’ , 17. Bakteerikanta Pseudomonas marginalis E-001624 (DSM14287) tai muu tästä kannasta , · * , 30 saatu kanta, joka kykenee alentamaan hakkeen uuteainepitoisuutta oleellisesti samassa > · ’ , määrin kuin mainittu kanta. < I 11237?

18. Bakteerikanta Pseudomonas marginalis E-991379 (DSM14285) tai muu tästä kannasta saatu kanta, joka kykenee vähentämään hakkeen uuteainepitoisuutta oleellisesti samassa määrin kuin mainittu kanta.

19. Bakteerikanta Pseudomonas sp. E-991380 (DSM14286) tai muu tästä kannasta saatu kanta, joka kykenee alentamaan hakkeen uuteainepitoisuutta oleellisesti samassa määrin kuin mainittu kanta.

20. Bakteerisiirroste hakkeen käsittelemiseksi, käsittäen bakteereita, jotka on valittu ryh-10 mästä, joka käsittää jonkin patenttivaatimuksen 17-19 mukaiset bakteerikannat, ja valinnaisesti puskureita ja/tai stabilisaattoreita.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen bakteerisiirroste, tunnettu siitä, että se käsittää 1010 -1015 bakteerisolua/litra siirrostetta, edullisesti 1012 - 1013 bakteerisolua/litra. 15

22. Patenttivaatimuksen 20 tai 21 mukainen bakteerisiirroste, tunnettu siitä, että se käsittää aineita, jotka pystyvät parantamaan bakteerien kasvua.

23. Jonkin patenttivaatimuksen 20 - 22 mukainen bakteerisiirroste, tunnettu siitä, että ,; 20 se käsittää hiiltä ja/tai typpeä, joita siirrostetut bakteerit voivat käyttää kasvuunsa.

: 24. Jonkin patenttivaatimuksen 20 - 23 mukainen bakteerisiirroste, tunnettu siitä, että , : se käsittää lisättyä hiiltä jopa 50 g/1, edullisesti 2-20 g/1 ja/tai lisättyä typpeä jopa 50 g/1, ; edullisesti 0,2 - 20 g/1 siirrostetta.

: 25 » 11237?