FI106264B - Menetelmä farmakologisesti aktiivisen, fibronektiiniä sitovan peptidin valmistamiseksi - Google Patents

Description

106264

Menetelmä farmakologisesti aktiivisen, fibronektiiniä sitovan peptidin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en farmakologiskt aktiv, fibronek-' tin-bindande peptid 5

Kuvaus Tekniikan ala Tämä keksintö koskee menetelmää fibronektiiniä sitovan peptidin valmistamiseksi.

10

Keksinnön kohteena on minimaalisen fibronektiiniä sitovan polypeptidin saaminen.

Edelleen kohteena on saada mahdollisuus valmistaa mainittua peptidiä kemiallisella synteesillä.

15

Muut kohteet ilmenevät seuraavasta kuvauksesta.

Keksinnön tausta 20 WO-patenttijulkaisussa A1-85/05553 kuvataan bakteerisolun pintaproteiinit, joilla on fibronektiinin-, fibrinogeenin-, kollageenin- ja/tai laminiininsitomiskykyä. Täten osoitetaan, että eri bakteereilla on kyky sitoutua fibronektiiniin, fibrinogeeniin, kollageeniin ja/tai laminiiniin. Edelleen osoitetaan, että fibronektiiniä sitovan proteiinin molekyylipaino on 165 kD ja/tai 87 kD, jolloin on luultavaa, että pienempi proteiini • 25 on suuremman osa.

Fibronektiini on disulfidiliittynyt dimeerinen glykoproteiini (Mr 450000), jota on läsnä liukoisessa muodossa veriplasmassa ja muissa kehonesteissä, ja se kerrostuu fibrillimuodossa löyhän sidekudoksen solunulkoisen matriisin tärkein ainesosanen. 30 Se koostuu kolmesta eri 2 rakenneaiheesta, joita kutsutaan tyypin I, Il ja III homologeiksi (Petersen et ai., 1983; PNAS), antaen tulokseksi fibronektiinimolekyylin modulaarisen rakennelman, jossa sen erityiset biologiset aktiivisuudet voidaan lukea spesifisten alueiden tiliin.

35 Fibronektiinin tärkein biologinen tehtävä liittyy ilmeisesti sen kykyyn välittää euka-rioottisten solujen tarttumista ekstrasellul aari seen matriisiin spesifisellä interaktiolla erillisten solunpintareseptorien ja molekyylin 105-kDa keskusalueen välillä, joka koostuu täysin tyypin ITI homologiayksiköistä (Pierschbacher ja Ruoslahti, 1984, 2 106264

Nature 309:30-33). Solunsitomisaluetta seuraa sen C-terminaalisessa päässä 31 kDa hepariininsitomisalue ja 30 kDa fibriininsitomisalue. Solunsitomisaluetta edeltää 42 kDa gelatiinin (kollageenin) sitomisalue ja N-terminaalinen 29 kDa alue, joka koostuu viidestä peräkkäisestä tyypin I toistosta, joka sitoo fibriiniä, hepariinia ja 5 bakteereita (Yamada 1983, Ann. Rev. Biochem. 52:761-799).

Useiden patogeenisten Gram-positiivisten stafylokokkien ja streptokokkien on kuvattu sitoutuvan yksinomaan fibronektiinin 29-kDa N-terminaaliseen alueeseen (Speziale et ai., 1984, J. Bacteriol. 157:420-427, Mosher ja Proctor, 1980 Science 10 209:927-929). Joidenkin Gram-negatiivisista enterobakteereista, ts. Escherichia coli,

Salmonella typhimurium, S. enteritidis ja S. dublin, on myös kuvattu sitoutuvan fibronektiiniin (Froman et ai., 1984, JBC 259:14899-14905; Van de Water et ai., 1983, Science 220:201-204; Faris et ai., 1986, FEMS Microbiol. Lett. 34:221-224; Baloda et ai., 1986, FEMS Microbiol. Lett. 34:225-229; Baloda et ai., 1985, FEMS 15 Microbiol. Lett. 28:1-5; Kristiansen et ai., 1987), ja E. colille kuvattiin, että bakteerit sitoutuivat 29 kDa N-terminaaliseen alueeseen ja toiseen tunnistamattomaan kohtaan (Froman et ai., 1984). Vastakohtana spirokeetta Treponema palladium ja trypanosomi Trypanosoma cruzi poikkeavat muista fibronektiiniä sitovista mikro-organismeista siinä, että niillä on spesifisyyttä 105 kDa eukarioottisen solun sito-20 misalueelle (Thomas et ai., 1985a, J. Exp. Med. 161:514-525; Ouaissi et ai., 1986, J. Exp. Med. 162:1715-1719).

Näiden mikro-organismien dissosiaatiovakio vuorovaikutukselle fibronektiinin kanssa osoittaa 102 - 103-kertaisesti suuremman aktiivisuuden kuin dissosiaatiovakio, jo-25 ka on kuvattu käsittelemättömän fibronektiinin sitoutumiselle ihmisen sidekudosta muodostaviin soluihin (Hook et ai., 1989; Akiyama ja Yamada, 1985, JBC 260:4492-4500). Tämä ahnaus fibronektiinille voi olla virulenssitekijä, helpottaen haavakudosten ja verihyytymien kolonianmuodostusta, jossa fibronektiinirikkaan matriisin tiedetään kerrostuvan haavan paranemisen ensimmäisen ja toisen viikon 30 aikana (Kurikinen et ai., 1980, Lab Invest. 43:47-51; Grinell et ai., 1981, J. Invest. .«1 Dermatol. 76:181-189; Clark et ai., 1982, J. Invest. Dermatol. 79:269-276). Tämän tutkimuksen tarkoitus on ollut karakterisoida mikrobiaalisia fibronektiiniä sitovia proteiineja (FnBP:t), ja kehittää reseptorianalogeja mahdolliseen terapeuttiseen käyttöön haavainfektion vaaran estämiseen tai vähentämiseen.

35

Tutkimukset FnBP;illä ovat tähän asti koskeneet lähinnä S. aureus'in FnBP:tä. FnBP, jonka Mr on 210000, on kuvattu kolmesta laboratoriosta (Espersen ja Clem- 3 106264 mensen, 1982, Infect. Immun. 37:526-531; Froman et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:6564-6571; Signas et al., 1989, PNAS 86:699-703). S. aureus 8325-4:n FnBP:tä koodittava geeni on kloonattuja ekspressoity E. colissa (Flock et al., 1987, EMBO J. 2351-2357). Fibronektiiniä sitova aktiivisuus lokalisoitiin 600 emäsparin inserti-5 oon, joka fuusioituna lukuvaiheistukseen DNA:n kanssa, joka koodittaa kahta stafy-lokokkiproteiinin A IgG-sitomisaluetta, tuotti proteiinifuusion, jota merkitään ZZ-FR, jolla oli sama fibronektiiniä sitova aktiivisuus kuin natiivilla 210 kDa reseptorilla. Seuraava DNA-sekvenssianalyysi paljasti 600 emäsparin insertion 184 aminohapon koodittamiseen, josta huomiotaherättävä piirre oli 38 aminohapon homolo-10 giayksikkö, joka toistui kolmesti, ja osaksi neljäs (Signas et al., 1989).

On keksitty, että synteettiset peptidianalogit kullekin homologiayksikölle, joita merkitään Dl, D2 ja D3, olivat tehokkaita S. aureus 8325-4:ään sitoutuvan fibro-nektiinin inhibiittoreita. Peptidi D3, joka konstruoitiin kolmannelle homologiayksi-15 kölle, oli 50 - 100-kertaisesti tehokkaampi fibronektiinin sitoutumisen estäjä, mutta sillä nähtiin huomattavaa poikkeamista perushomologiayksiköstä. Tässä keksinnössä määritellään lisäksi fibronektiiniä sitova determinantti D3-homologiayksikön sisällä D3-sekvenssin käsittävien pienempien peptidien lukumäärän kemiallisen modifioinnin, proteolyyttisen katkaisun ja kemiallinen synteesin avulla.

20

Keksinnön kuvaus Tämä keksintö koskee menetelmää farmakologisesti aktiivisen, fibronektiiniä sitovan peptidin valmistamiseksi, jolla on rakenne 25 R'-PSYQFGGHNSVDFEEDT-R2 jossa R' on vety, K tai DK, ja R2 on hydroksi, L, LP tai LPK, jolloin 30 A Ala, alaniini * · R Arg, arginiini N Asn, asparagiini D Asp, asparagiinihappo C Cys, kysteiini 35 C Cys, kystiini G Gly, glysiini E Glu, glutamiinihappo 4 106264 Q Gin, glutamiini H His, histidiini I lie, isoleusiini L Leu, leusiini 5 K Lys, lysiini M Met, metioniini F Phe, fenyylialaniini P Pro, proliini S Ser, seriini 10W Trp, tryptofaani Y Tyr, tyrosiini V Vai, väliini

Edellä mainittu peptidi voidaan keksinnön mukaisesti valmistaa synteettisesti sinän-15 sä tunnetulla tavalla sopivista aminohapoista tai siten, että peptidille, joka sisältää mainitun peptidin, suoritetaan proteolyysi mainitun peptidin muodostamiseksi.

Materiaalit ja menetelmät Bakteerit ja kasvatusväiiaineet 20

Staphylococcus aureus 8325-4:ää, jonka on kuvannut Lofdahl et ai, (1983, PNAS USA 80: 697-701) varastoitiin syvässä agarissa 4 °C:ssa. Kasvatukset aloitettiin siir-rostamalla aivo/sydän-infuusioliemeen (Difco, Detroit, MI). Yön yli inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa bakteerit kerättiin sentrifugoimalla, suspendoitiin fosfaattipusku-25 roituun suolaliuokseen (pH 7,4) sisältäen 0,02 % (paino/tilavuus) natriumatsidia, ja säädettiin arvoon 1010 solua/ml suspensiota vakiokäyrän avulla, jossa oli solujen lu-kumäärä/optinen tiheys. Sitten solut tapettiin lämmöllä 88 °C:ssa 20 min ajan, jaettiin eriin, ja varastoitiin pakastettuina -20 °C:ssa.

. 30 Ligandien valmistus ja jodaus *

Ihmisen fibronektiiniä joko ostettiin laitoksesta the New York Blood Center, tai puhdistettiin vanhentuneesta plasmasta, jota saatiin samasta lähteestä, tavalla, jonka kuvaavat Engvall ja Rouslahti (1977, Int. J. Cancer Res. 20.1-5). Fibronektiinin 29-35 kDa N-terminaalisen alueen puhdistamiseksi ihmisen fibronektiiniä laimennettiin ta solle 1 mg/ml puskurissa, joka koostui 25 mM Tris-HCl:stä (pH 7,6), 50 mM nat-riumkloridista, 2,5 mM kalsiumkloridista ja 0,5 mM etyleenidiamiinitetraetikkaha- f 5 106264 posta (EDTA). Proteaasisulatus aloitettiin lisäämällä 5 pg tennolysiiniä (Calbio-chem, La Jolla, CA) kutakin fibronektiinin 1 mg:aa kohden, minkä jälkeen seurasi inkubointi 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa pystyasentoisessa rumpusekoittimes-sa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä EDTA:ta tasolle 5 mM. Sitten 29 kDa fragmentti 5 eristettiin ajamalla hajotuksen affiniteettigeelimatriisin läpi, joka koostui ZZ-FR-fuusioproteiinista (Flock et ai., 1987), joka oli liitetty Sepharose CL-4B:hen (Pharmacia, Upsala, Ruotsi), ja eluoitiin seuraavaksi 4 M guanidiinihydrokloridilla fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Sitten eluaatti dialysoitiin pitkälle PBS:ää vastaan. Joko fibronektiinin tai 29 kDa fragmentin jodaus suoritettiin klora-10 miini T-työohjeella, jonka on kuvannut Hunter (1978).

Fibronektiininsitomismääritys

Synteettisillä peptideillä analysoitiin fibronektiininsitomisaktiivisuus mittaamalla 15 niiden kyky kilpailla S. aureus 8325-4-solujen kanssa 125l-leimatun fibronektiinin tai leimatun N-terminaalisen 29 kDa fragmentin sitomisesta, täsmälleen aikaisemmin kuvatulla tavalla (Signas et ai., 1989). Kun on ilmaistu, tätä määritystä modifioitiin korvaamalla bakteerisuspension 40 1:11a ZZ-FR Sepharosea (liittämissuhde 0,3 mg/ml turvonnutta geeliä). Tässä tapauksessa taustaradioaktiivisuus määritettiin 20 määrityksestä, jossa affiniteettimatriisin sijasta käytettiin modifioimatonta Sepharosea. Radioleimattu ligandi, joka oli sitoutunut joko bakteereihin tai ZZ-FR Sepharo-seen, kvantisoitiin LKB-gammalaskurissa (Turku, Suomi).

Peptidien synteesi ja puhdistus 25

Kaikki peptidit lukuunottamatta S16-36:ta syntetisoitiin automaattisella Applied Biosystems -peptidisyntetisoijalla yliopiston University of Alabama keskeisessä laitoksessa Birmingham Cancer Center aikaisemmin kuvatulla tavalla (Signas et ai., 1989). Peptidi S16-36 syntetisoitiin laitoksessa Vega Biotechnologies (Tucson, AZ) , 30 käyttämällä F-moc-synteesiproseduuria. Peptidit puhdistettiin raakavalmisteista käänteisfaasi-HPLC:llä käyttämällä preparatiivisen mittakaavan Ct8-kolonnia (Vydac 218TP510; The Separation Group, Hesparia, CA) ja LKB-HPLC-järjestel-mää. Puhdistukseen käytetty puskuri oli TEAP/EDTA (pH 5,5), joka koostui 0,11 %:sta (tilavuus/tilavuus) fosforihappoa, 0,28 %:sta (tilavuus/tilavuus) trietyy-35 liamiinia ja 0,25 mM EDTA. Eluointipuskuri oli 15 % TEAP/EDTA:ta asetonitrii-lissä.

Ä 106264 o

Trietyyliamiini ostettiin yhtiöstä Pierce (Rockford, IL), kun taas HPLC-Iaatuinen fosforihappo ja asetonitriili oli yhtiöstä Fisher (Pittsburgh, PA). Käänteisfaasikroma-tografian jälkeen sopivat fraktiot dialysoitiin pitkälle 50 mM ammoniumbikarbo-naattia vastaan ja lyofilisoitiin. Tulokseksi saatujen valmisteiden puhtaus tarkastet-5 tiin käänteisfaasikromatografialla analyyttisellä Cig-kolonnilla (Vydac 218TP546; The Separation Group, Hesperia, CA) käyttämällä puskuria, joka koostui 0,1 %:sta (tilavuus/tilavuus) trifluorietikkahappoa (Pierce; Rockford, IL) vedessä, ja 0,1 %:sta (tilavuus/tilavuus) TFA:ta 60-% asetonitriilissä eluointipuskurina. Tässä puskurijärjestelmässä eluoituvat peptidit kuivattiin pyöröhaihduttimella ja alistettiin joko N-10 terminaaliselle sekvenssianalyysille tai aminohappokoostumusanalyysille.

Peptidisekvensöinti suoritettiin yliopiston University of Alabama laitoksessa the Birmingham Protein Chemistry Core Applied Biosystems -peptidisekvensoijalla malli 470A. Aminohappoanalyysi suoritettiin laitoksessa the Atherosclerosis Re-15 search Unit Protein Chemistry Core.

Synteettisten peptidien proteolyyttinen hajotus L-(tosyyliamido-2-fenyyli)etyylikloorimetyy liketoni (TPCK)-käsitelty trypsi in i 20 (koodi TRTPCK) ja kymotrypsiini (koodi CDS) saatiin yhtiöstä Worthington (Freehold, NJ). Soijapaputrypsiini-inhibiittori ja TPCK ostettiin yhtiöstä Sigma (St Louis, MO), endoproteinaasi Glu-c (V8-proteaasi) ostettiin yhtiöstä Boerhinger Mannheim, ja lysiiniendopeptidaasi C (LEC) saatiin yhtiöstä Calbiochem (La Jolla. CA).

' 25

Peptidi D3 liuotettiin sekä trypsiini- että kymotrypsiinihajotusta varten tasolla 2 mg/ml 0,1 M ammoniumbikarbonaattiin ja käsiteltiin 24 tunnin ajan 37 °C:ssa pro-teaasilla entsyymi.substraatti-suhteella 1:200. Trypsiini inaktivoitiin lisäämällä soi-jatrypsiini-inhibiittoria ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridia tasolle 20 g/ml ja I mM, 30 vastaavasti. Kymotrypsiiniä varten TPCK:ta ja PMSF:ää lisättiin konsentraatioiden 0,3 mg/ml ja 1 mM saavuttamiseksi, vastaavasti.

Endoproteinaasi Glu-c-hajotusta varten entsyymi . substraatti-suhde oli 1:100 ja peptidi oli 2 mg/ml fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. 24 tunnin huoneenlämpöti-35 lassa inkuboinnin jälkeen hajotus pysäytettiin lisäämällä PMSF:ää tasolle 1 mM. LEC- hajotusta varten peptidi liuotettiin PBS:ään tasolla 2 mg/ml, johon lisättiin 1 yksikkö proteaasia/ml. Hajotus sai jatkua 40 tunnin ajan 37 °C:ssa, ja päätettiin kun 7 106264 pilkkomistuotteet erotettiin HPLC:llä. Kutakin hajotusta varten proteolyysin etenemisen ja pilkkomistuotteiden puhtauden tarkkailuun käytettiin käänteisfaasi-HPLC:tä TEAP/EDTA-puskurijärjestelmällä. Koostumusanalyysiin tai N-terminaa-liseen sekvensoitiin tarvitut näytteet kromatografoitiin lisäksi TFA-puskurijärjestel-5 mällä.

Synteettisten peptidien kemiallinen modifiointi

Lysiinin aminosivuketjun dihydroksipropylointipelkistys oli modifikaatio menetel-10 mästä, jonka on kuvannut Acharya (1984; J. Chrom. 297:37-38). Peptidi liuotettiin PBS:ään (2,5 mg/ml), minkä jälkeen seurasi DL-glyseraldehydin ja natrium-syaaniborohydridin (Sigma, St. Louis, MO) lisääminen lopulliseen konsentraatioon 0,1 ja 1,0 mol/1, vastaavasti. Reaktiota suoritettiin huoneenlämpötilassa I tunnin ajan ja pysäytettiin dialysoimalla 50 mM ammoniumbikarbonaattia vastaan. Lysii-15 nisivutähteiden derivatisoinnin laajuus määritettiin aminohappoanalyysillä.

Glutamiini- ja asparagiinitähteiden karboksyylisivuketjut muutettiin glysiinimetyy-liestereiksi l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidin (EDC) välittämällä kondensoinnilla (Lungblad ja Noyes, 1985; Chemical Reagents for Protein Mo-20 dification, voi. II). Peptidi liuotettiin kahdesti tislattuun veteen tasolla 2 mg/ml ja tehtiin 1-molaariseksi glysiinimetyyliesterin (Sigma) suhteen. Säädettiin 0,1 M HCkllä happamaksi pH-arvoon 4,3, ja lisättiin EDC.tä konsentraatioon 0,1 M. Liuosta sekoitettiin 3 tunnin ajan huoneenlämpötilassa säätäen 30 min kuluttua pH-arvon uudelleen pH-arvoon 4,3, ja jälleen 1,5 tunnin kuluttua. Reaktio pysäytettiin 25 dialysoimalla PBS:ää vastaan. Derivatisointiaste määritettiin glysiinin moolisuhteen kasvulla verrattuna derivatisoimattomaan peptidiin. Derivatisointi suoritettiin etano-liamiinilla käytettiin glysiinimetyyliesterin sijasta, ja suoritettiin kontrollikoe, jossa peptidin kanssa sekoitettiin vain EDC:tä.

30 Tyrosiinitähteiden fenyylisivuketjut hapetettiin lisäämällä 10 μ] tetranitrometaania (TNM; Sigma) kuhunkin mkaan 1 mg/ml peptidiä liuotettuna 100 mM Tris-HCkään, 150 mM NaCl (pH 8,0), ja sekoittamalla 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen seurasi dialyysi Tris/NaCl-puskuria (pH 8,0) vastaan TNM.n poistamiseksi.

35 Näiden kolmen D-toiston aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 1. Dl- ja D2-toistot osoittavat korkean homologia-asteen eroten vain viidessä 38 tähteestä (87-% 8 106264 homologia), kun taas D3:11a on alle 50-% homologia D2:n kanssa. Kuten aikaisemmin mainittiin (Signas et ai., 1989), peptidi aiheutti kuitenkin 50-% inhibition 2 I-HFN:n sitoutumisessa S. aureus 8325-4-soluihin konsentraatiossa 2 g/ml, kun puolestaan vaadittiin konsentraatioita 90 g ja 230 g/ml D2:lle ja Dl:lle, vastaavasti, 5 saman inhibitioasteen antamiseen. Tämän vuoksi valitsimme peptidin D3 edelleen karakterisointia varten.

Kemiallinen modifiointi 10 Taulukko 1 koostuu peptidin D3 ja sen derivatisointituotteiden aminohappokoostu-musanalyysitiedoista. Lysiinisivutähteiden dihydroksipropylointi oli kvantitatiivisesti täydellinen osoittaen yli 98-% lysiinisisällön vähenemisen D3:een verrattuna. Vähäisempi sivureaktio, jota normaalisti tapahtuu tämän työohjeen käytöllä, oli fenyylialaniinin derivatisointi asemassa 1 sen vapaan NH2-ryhmän kautta, kuten ha-15 vaitaan fenyylialaniinipitoisuuden pienen kasvun kautta. Asparagiini-ja glutamiini-tähteiden muuttaminen glysiinimetyyliesteriksi oli myös kvantitatiivisen täydellinen, kuten havaitaan glysiinisisällön muutoksesta 54 tähteestä 1000 kohden 293:een.

Tämä on arvo, jota odotetaan kahdelle glysiinitähteelle D3:ssa, ja yhdeksälle lisätäh-teelle, jotka lisättiin asparagiini/glutamiini-tähteiden täydellisellä kemiallisella mo-20 difioinnilla. Tyrosiinin TNM-välitteinen hapetus oli myös menestyksekäs osoittaen 95-% tyrosiinipitoisuuden alenemisen.

Kuviossa 2 esitetään kemiallisesti modifioitujen peptidien inhibitioaktiivisuus verrattuna modifioimattoman D3:n inhibitioaktiivisuuteen. Vaikka lysiini-ja tyrosiini-25 modifikaatiot vähensivät D3:n aktiivisuutta vain osaksi, antoi asparagiini/glutamiini-tähteiden modifiointi aktiivisuuden täydelliseen menetykseen. Tämä tulos havaittiin joko glysiinimetyyliesterillä tai etanoliamiinikondensoinnilla karboksyylisivuketjui-hin. Kontrollina EDC-käsittely yksinään osoitti vain vähäisen aktiivisuuden menetyksen, joka oli samanlainen kuin lysiini- ja tyrosiinimodifikaatioilla havaittu. Tä-30 män vuoksi havaittu aktiivisuuden menetys johtuu erikoisesti karboksyylisivuketju- . jen modifikaatiosta.

Trypsiinin, kymotrypsiinin ja D3:n endoproteaasi-Glu-c- hajotusten käänteisfaasi-HPLC varmisti, että peptidisubstraatti oli täydellisesti muuttunut pienemmiksi tuot-35 teiksi. Kuviossa 3 esitetään D3:n ja sen tryptisen hajotuksen edustavat käänteisfaasi-profiilit, seuraavaksi puhdistettujen fragmenttien identiteetin kanssa. Alustavat määritykset suoritettiin raakahajotuksilla sopivien proteaasi-inhibiittorien läsnä ollessa 9 106264 testaamaan joko 125l-HFN:n tai 125l-29 kDa N-terminaalisen fragmentin sitoutumista S. aureus -solususpensioon (kuvio 4). Täydellisen trypsiinihajotuksen jälkeen, kuviossa varmistettuna, tulokseksi saaduilla fraktioimattomilla katkaisutuotteilla nähtiin vähäinen biologisen aktiivisuuden menetys, kun taas kymo-trypsiinihajotus ei osoit-5 tanut inhiboivaa aktiivisuutta. Tulokset olivat vähemmän selviä endoproteaasi Glu-c-sulatuksella, jossa osoitettiin inhiboivaa aktiivisuutta käyttämällä 125I-29 kDa:ta ligandina, muttei lainkaan I25I-HFN:llä. Tämä voi johtua konformaatiomuutoksista kun N-terminaalinen alue irrotetaan proteolyyttisellä katkaisulla.

10 Kuviossa 1 esitetään aminohapposekvenssit useista katkaisutuotteista, jotka puhdistettiin raakahajotuksista käänteisfaasi-HPLC.llä. Tärkein trypsiinisulatuksesta puhdistettu katkaisutuote koostui tähteistä 15-36 (Tl5-36) D3:n 37 aminohaposta, ja biologinen aktiivisuus säilyi tällä peptidillä (kuvio 5). Tämän peptidin hajotus edelleen lysiiniendopeptidaasi-c.llä antoi tulokseksi N-terminaalisen dipeptidin poista-15 misen, tuottaen TL 17-36:n, jolla edelleen oli inhiboivaa aktiivisuutta. T15-36:n katkaisu endoproteaasi Glu-c;llä antoi tulokseksi C-terminaalisen heksapeptidin poistamisen ja samanaikaisen aktiivisuuden menetyksen. D3:n endoproteaasi Glu-c- ja kymotrypsiinihajotuksista eristettyjen peptidien sekvenssit esitetään myös kuviossa 1. Millään näistä peptideistä ei ollut inhiboivaa aktiivisuutta (kuvio 5).

20

Koska Tl5-36 osoitti samanlaista biologista aktiivisuutta kuin D3, konstruoitiin useita synteettisiä peptidejä, jotka ulottuivat tämän sekvenssin yli (kuvio 2), ja testattiin niiden biologinen aktiivisuus (kuvio 6). Peptidi S16-36, yhtä tähdettä lyhyempi N-terminaalisessa päässä kuin T15-36, tuotti fibronektiinin sitoutumisen 50-% 25 inhibition konsentraatiolla 10 nmol/ml verrattuna D3:n 3 nmol/ml. Tietäen että peptidillä TL 17-36 säilyi biologinen aktiivisuus konstruoimme peptidin S17-33 testaamaan C-terminaalisten aminohappojen osallisuutta fibronektiinin sitomisessa. Sen havaittiin olevan merkittävästi alentunut mutta jatkuvasti havaittu biologinen aktiivisuus, antaen fibronektiinin sitomisen 50-% inhibition konsentraatiolla 100 nmol/ml. 30 Tämän peptidin koon pienentäminen edelleen N-terminaalisesta päästä tuottaen . S20-33:n antoi tulokseksi lähes täydellisen aktiivisuuden menetyksen. Peptidin S20- 33 laajennus C-terminaalisesta päästä S20-36:n tuottamiseksi antoi tulokseksi pep- * tidin, jolla oli aktiivisuustaso, joka oli verrattavissa SI7-33:n aktiivisuustasoon, osoittaen 50-% inhibition tasolla 200 nmol/ml. Peptidillä S21-36 oli yhä inhibitio-35 aktiivisuus, joka oli suoraan suhteellinen peptidin määrään, mutta se oli noin 10-kertaisesti vähemmän tehokas kuin S20-36. Olemme sen vuoksi pienentäneet D3:n fibronektiiniä sitovan alueen ydinpeptidiksi S20-33, joka on välttämätön aktiivisuu- ίο 106264 delle, muttei ole yksinään riittävä sitoutumisen estämiseen. Sekvenssin PSY lisääminen N-terminaaliseen päähän tai LPK:n lisääminen C-terminaaliseen päähän antoi tulokseksi peptidejä, joilla oli samanlainen biologinen aktiivisuus. Jokainen näiden peptidien koon edelleen pienentäminen aiheuttaa aktiivisuuden suuren alentumisen.

5

Fibronektiinin tarttumista bakteereihin on ehdotettu virulenssitekijäksi, joka mahdollistaa bakteerien muodostaa kolonioita haavakudoksiin ja verihyytymiin (Ryden et ai., 1983, JBC 258: 3396-3401; Proctor et al„ 1982, JBC 257: 14788-14794); ja tämän vuorovaikutuksen estäminen on houkutteleva kohde joko ennaltaestoon tai 10 rokotustutkimuksiin. Jonkin verran edistystä tämän päämäärän saavuttamiseksi on kuvattu aikaisemmin tutkimuksista fibronektiinin sitoutumisesta Treponema palladiumilla (Thomas et ai., 1985, J. Exp. Med., 14-25) ja Trypanosoma cruzi'lla. Mo-noklonaalinen vasta-aine, joka inhiboi eukarioottisten solujen kiinnittymisen fibro-nektiinilla päällystettyihin alustoihin, estää myös fibronektiinin sitoutumisen Trepo-15 nema palladiumiin (Thomas et ai., 1985a) ja Trypanosoma cruziin (Ouaissi et ai, 1986; J. Exp. Med., 162: 1715-1719). Sitomisen esti myös peptidi RGDS, fibro-nektiinisolunsitomisalueen aminohapposekvenssi, jonka eukarioottiset fibronektiini-integriinireseptorit tunnistavat (Thomas et ai., 1985b; J. Exp. Med. 162: 1715-1719; Ouaissi et ai., 1986). Tämä sama peptidi myös esti spirokeettojen tarttumisen kasva-20 tettuihin ihmisen soluihin. On kuitenkin otettava huomioon, että RGDS-peptidi voisi myös kumota fibronektiinin merkityksen. Toiseksi, nämä mikro-organismit ovat epätavallisia spesifisyydeltään fibronektiinin solunsitomisalueelle.

Lähestymistapa on ollut karakterisoida fibronektiinin ja S. aureus -reseptorin vuoro-25 vaikutusta molekyylitasolla käyttämällä synteettisiä peptidejä.

Tulokset D3-peptidin kemiallisesta modifikaatiosta ilmaisevat, että glutamiini- ja asparagiinitähteet ovat välttämättömiä fibronektiiniin sitoutumiselle. Tämä on erityisen kiinnostavaa, koska joko aihelma FEEDT tai DFEEDT ilmenee S. aureus FN-30 reseptorin kolmessa D-toistossa. Itse asiassa D3:ssa tämä aihelma toistuu kahdesti. \ Lisäksi sekvenssitiedot, jotka saatiin geeneistä, jotka koodittavat Streptococcus dys- galactiae'n kahta fibronektiinireseptoria, osoittavat molemmat kolme toistosekvens-siä, jotka sisältävät joko DFTEDT- (geeni I) tai EVEDT- (gene II) aihelmat kummassakin toistoista (jätetty julkaistavaksi). Aktiivisuuden menetys endoproteaasi 35 Glu-c:llä katkaisun jälkeen voi olla seurausta FEEDT-aihelman hajoamisesta, ja on edelleen merkki happamien aminohappotähteiden liittymisestä.

11 106264 D3 tryptisen hajotustuotteen T15-36 ja synteettisen peptidin S16-36 osoittama aktiivisuus paikallisti D3:n fibronektiiniä sitovan determinantin peptidin C-termi-naaliseen puoliskoon, joka sisältää FEEDT-aihelman. On kiinnostavaa, että sekvenssi IEEDT ilmenee myös D3:n N-terminaalisen pään lähellä (tähteet 8 - 12), ja 5 että toistot Dl ja D2 sisältävät FEEDT:n samassa sijaintipaikassa. Tämän aihelman läsnäolo toistuen kahdesti D3:ssa voi olla syynä sen oleellisesti suurempaan biologiseen aktiivisuuteen verrattuna Dl:een ja D2:een.

Pyrkimykset lokalisoida fibronektiiniä sitovan determinantin peptidin S16-36 sisällä 10 antoi tulokseksi oleellisia biologisen aktiivisuuden menetyksiä. Me uskomme, että peptidi S20-33 sisältää aminohappotähteet, jotka aikaansaavat kontaktin fibronek-tiinin kanssa ja sitoutuvat siihen. Tällä peptidillä ei itsellään ole oleellista aktiivisuutta. Tripeptidin PSY lisääminen N-terminaaliseen päähän (S 17-33) tai LPK:n lisääminen C-terminaaliseen päähän (20 - 36) antoi tulokseksi aktiivisuuden dramaat-15 tisen paranemisen. Jos tässä ydinpeptidissä olisi molemmat reunasekvenssit, se olisi yhtä tähdettä lyhyempi N-terminaalisessa päässä kuin peptidi S16-36, jolla oli suoraan D3:een verrattavissa olevat aktiivisuustaso. Kemialliset modifiointikokeemme ilmaisivat, ettei tyrosiini eikä lysiini ole osallisena kontaktissa fibronektiinin kanssa. Me ehdotamme, että reunustavat PSY- ja LPK-tripeptidit eivät ole osallisena kon-20 takteissa fibronektiinin kanssa, vaan niitä vaaditaan peptidille sen omaksumiseksi oikean ja stabiilin konformaation. Huomautamme, että yhden aminohapon menetys S20-36:n N-terminaalisesta päästä aiheutti yli 10-kertaisen aktiivisuuden menetyksen.

' 25 D3:n ja ZZ-FR-fuusioproteiinin aikaisempi tutkimus (Signas et ai., 1989), yhdis telmänä tämän keksinnön tulosten kanssa osoittaa, että vaikka aktiivisuudessa tapahtuu dramaattinen väheneminen kun kolmen peräkkäisen D-toiston jatkuvuus katkaistaan, niin aktiivisuuden muutos D3:n kokoa S17-36:een pienennettäessä on aivan irrelevantti. S17-36:n koon pienentäminen edelleen aiheuttaa aktiivisuuden menetyk-30 sen, joka on venattavissa siihen, joka havaitaan erotettaessa peräkkäiset toistot fysi-.· kaalisesti. Tämän vuoksi yksittäisten toistojen sekundäärinen rakenne aikaansaa yh den affiniteettitason fibronektiiniä varten, ja näiden kolmen toiston tertiäärinen järjestäytyminen antaa tulokseksi affiniteetin, joka on suuruusluokkaa suurempi. Kolmas, hypoteettinen ja edelleen tutkimaton, järjestäytymistaso ja affiniteetin edelleen 35 kasvu fibronektiiniä varten voidaan saavuttaa fibronektiinireseptorien kvatemääri-sellä järjestäytymisellä S. aureus 8325-4:n solupinnalla.

12 106264

Taulukko 1

Peptidin D3 ja sen derivatisointituotteiden aminohappokoostumus

Aminohappotähteitä/1000 5

Modifioimaton DHP-K1 Gly-OCH32 TNM-Y3

Asx* 217,7 (189,2) 226,8 155,9 157,1

Glx* 156,3 (162,2) 193,4 138,4 174,9

Ser 51,4 (54,1) 58,7 44,7 57,7

Gly* 54,6 (54,1) 62,7 292,7 64,6

His 57,4 (54,1) 65,8 43,5 46,6

Arg

Thr 82,7 (81,1) 95,3 76,9 100,6

Ala

Pro 54,5 (54,1) 63,5 49,9 60,4

Tyr* 18,2 (27,0) 23,4 10,5 0,9

Vai 51,6 (54,1) 61,6 39,3 57,1

Met Cys

Ile 29,3 (54,1) 33,8 26,8 31,8

Leu 30,6 (27,0) 33,5 22,2 2,8

Phe 70,2 (81,1) 55,0 57,6 72,1

Lys* 107,9 (108,1) 2,4 89,2 100,9

Kemiallisen modifikaation kohteena olevat tai sen vaikutuksen alaiset aminohapot ilmaistaan tähdellä. Suluissa olevat luvut viittaavat odotettuihin arvoihin perustuen tunnettuun D3:n vertailuun.

10 1 Lysiinin dihydroksipropylointi 2 Asparagiini- ja glutamiinitähteiden muuttaminen glysiinimetyyliestereiksi 15 3 Tyrosiinin tetranitrometaanihapetus

Keksinnön mukaista fibronektiiniä sitovaa peptidiä voidaan käyttää immunisointiin, jolloin peptidiä, edullisesti yhdistelmänä fuusioproteiinin kanssa muodostamaan 13 106264 suuren antigeenin, jolle kehittää vastetta, injisoidaan annoksina, jotka aiheuttavat immunologista reaktiota isäntänisäkkäässä. Siten fibronektiiniä sitovaa peptidiä voidaan käyttää märehtijöiden rokotukseen stafylokokki-infektioiden aiheuttamaa rinta-rauhastulehdusta vastaan.

5

Lisäksi fibronektiiniä sitovaa peptidiä voidaan käyttää estämään infektiota avoimessa ihohaavassa käsittelemällä haavan käyttämällä fibronektiiniä sitovaa peptidiä suspensiossa. Siten fibronektiiniä sitovaa peptidiä voidaan käyttää hoitamaan haavoja, esimerkiksi salpaamaan proteiinireseptoreita, tai immunisointiin (rokotus). Vii-10 meksi mainitussa tapauksessa isäntäkeho tuottaa spesifisiä vasta-aineita, jotka voivat suojata bakteerikantojen invaasiota vastaan, jotka sisältävät tällaista fibronektiiniä sitovaa peptidiä. Täten vasta-aineet estävät bakteerikantojen tarttumisen vaurioituneeseen kudokseen.

15 Esimerkkejä kudosvaurion kolonisoimisesta ovat: a) haavojen kolonisoiminen ihossa ja sidekudoksissa, jotka haavat on aiheuttanut mekaaninen vamma, kemiallinen vamma ja/tai lämpövaurio; 20 b) haavojen kolonisoiminen limakudosmembraaneilla, kuten suuaukossa, tai maito-rauhasissa, virtsaputkessa tai vaginassa; c) sidekudosproteiinien kolonisointi, jotka sidekudosproteiinit on altistettu minimaaliselle kudosvauriolle (mikrovaurio) epiteelin ja endoteelin yhteydessä (rinta-25 rauhastulehdus, sydämen läpän tulehdus, lonkkanivelenvaihtokirurgia).

Käytettäessä keksinnön mukaista FNBP:tä, tai peptidiä, immunisointitarkoitukseen (rokotukseen) nisäkkäissä, mukaan lukien ihmisessä, peptidi dispergoidaan steriiliin, isotoniseen suolaliuokseen, mahdollisesti samalla kun lisätään farmaseuttisesti hy-. 30 väksyttävää dispergoimisainetta. Lisäksi voidaan käyttää erityyppisiä apuaineita vii- . vyttämään vapautumista kudoksessa, ja altistamalla täten peptidin pitemmäksi ajaksi immuunipuolustusjärjestelmälle kehossa.

Sopiva annos immunisoinnin saavuttamiseksi on 0,5-5 μg peptidiä kg kehonpainoa 35 ja immunisointi-injektiota kohden. Kestävän immunisoinnin saamiseksi rokotus olisi suoritettava useammassa kuin yhdessä peräkkäisessä tilanteessa 1-3 viikon välein, edullisesti kolmessa tilanteessa.

,4 106264

Kun keksinnön mukaista peptidiä käytetään paikalliseen, lokaaliseen antoon, proteiini dispergoidaan isotoniseen suolaliuokseen konsentraatioon 25-250 pg/ml. Sitten haavat käsitellään sellaisella määrällä, että saavutetaan vain haavapinnan täydellinen kostuminen. Keskivertohaavaan käytetään täten tällä tavalla vain muutama ml liuos-5 ta. Käsittelyn jälkeen peptidiliuosta käyttämällä haavat pestään sopivasti isotonisella suolaliuoksella tai muulla sopivalla haavankäsittelyliuoksella.

Lisäksi keksinnön mukaista fibronektiiniä sitovaa peptidiä samoin kuin minimaalisen fibronektiininsitomiskohdan peptidiä voidaan käyttää diagnosoimaan stafylo-10 kokkikantojen aiheuttamia bakteeri-infektioita, jolloin keksinnön mukaista fibro-nektiiniä sitovaa peptidiä immobilisoidaan kiinteälle kantajalle, kuten pieniin lateksi- tai SepharoseR-helmiin, minkä jälkeen vasta-aineita sisältävien seerumien annetaan kulkea ja reagoida näin immobilisoidun FNBP:n kanssa. Sitten agglutinoitumi-nen mitataan tunnetuilla menetelmillä.

15

Lisäksi peptidiä voidaan käyttää ELlSA-testissä (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; E Engvall, Med. Biol. 55, 193, (1977)). Tällöin kaivot polystyreenimikrotiit-terilevyissä päällystetään FNBP:llä, ja inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa. Sitten levyt pestään läpikotaisin käyttämällä PBS.ää, joka sisältää 0,05 % TWEEN 20:tä, ja kui-20 vataan. Potilasseerumin sarjalaimennokset tehtiin PBS-Tweeniin, lisättiin kaivoihin ja inkuboitiin 30 °C:ssa 1,5 tunnin ajan. Huuhtomisen jälkeen kaivoihin lisättiin an-tihumaani-IgG:tä, joka on konjugoitu entsyymiin, tai anti-nauta-IgG.tä, joka on konjugoitu entsyymiin, vastaavasti, piparjuuriperoksidaasia tai alkalista fosfataasia, ja inkuboitiin 30 °C:ssa 1,5 tunnin ajan, minkä jälkeen kun IgG oli sitoutunut siihen, 25 ja huuhtomisen jälkeen, lisätään entsyymisubstraattia, p-nitrofosfaattia alkalisen fos-fataasin tapauksessa, tai peroksidaasin tapauksessa on käytetty ortofenyleenidia-miinisubstraattia (OPD), vastaavasti. Täten levyt, jotka sisälsivät kaivot, huuhdottiin sitten käyttämällä sitraattipuskuria, joka sisältää 0,055 % OPD.tä, ja 0,005 % H202, ja inkuboitiin 30 °C:ssa 10 min ajan. Entsyymireaktio pysäytettiin lisäämällä ku-30 hunkin kaivoon 4N H2S04:ää. Värinkehitys mitattiin spektrofotometriä käyttämällä. Käytetystä entsyymisubstraattityypistä riippuen voidaan käyttää myös fluoresens-simittausta.

Toinen menetelmä stafylokokki-infektioiden diagnosoimiseen on käyttää DNA-35 geenikoetinmenetelmää, joka perustuu peptidisekvenssiin. Tällöin luonnollisia tai synteettisiä DNA-sekvenssejä kiinnitetään kiinteään kantajaan, kuten edellä mainittuun polystyreenilevyyn, esimerkiksi lisäämällä pinnalle rintarauhastuloksen diag- 15 106264 nosoimisen tapauksessa maitoa. DNA-geenikoetin, mahdollisesti leimattu entsymaattisesti, tai radioaktiivisella isotoopilla, lisätään sitten kiinteäpintaiseen levyyn, joka sisältää DNA-sekvenssin, jolloin DNA-geenikoetin tarttuu sekvenssiin tämän ilmaantuessa. Entsyymi tai radioaktiivinen isotooppi voidaan sitten määrittää hel-5 posti tunnetuilla menetelmillä.

Kuvioiden selitykset

Kuvio 1 10

Aminohapposekvenssi peräkkäisistä toistoista, jotka muodostavat S. aureus 8325-5 FnBP.n fibronektiiniä sitovan kohdan. Synteettiset peptidit vastaten kutakin toistoista on nimetty Dl, D2 ja D3. D3:n sekvenssin alla kuvataan D3-peptidin useiden proteolyyttisten katkaisutuotteiden koostumus, ja pienempien synteettisten pep-15 tidien, joita käytettiin D3:n fibronektiiniä sitovan determinantin edelleen määrittelemiseen. Kahta numeroa, joita edeltää 1 tai 2 kirjainta, käytetään yksittäisten peptidien tunnistamiseen. Numerot viittaavat kunkin peptidin N- ja C-terminaalisten tähteiden sijaintiin D3:n 37 aminohapposekvenssin sisällä. Kirjaimet V, C ja T ilmaisevat katkaisutuotteet, jotka on eristetty peptidin D3 endoproteaasi Glu-c-, 20 trypsiini- tai kymotrypsiinisulatuksista, vastaavasti. Peptidi Tl5-36 alistettiin toiselle sulatukselle joko lysiiniendopeptidaasi-c:llä tuottaen TL17-36:n, tai endoproteaasi Glu-c:llä tuottaen TV15-30:n. Kirjainta S käytetään merkitsemään peptidejä, jotka on muodostettu kemiallisella synteesillä.

25 Kuvio 2

Kemiallisen modifioinnin vaikutus peptidin D3 kykyyn inhiboida ,25I-HFN:n sitoutuminen S. aureus 8325-4:ään. Ilmaistu määrä peptidiä sekoitettiin 5 x 108 solun ja 5 x 104 cpm:n kanssa I25I-HFN:ää määritystilavuudessa 0,5 ml PBX.ää, jota oli täy-. , 30 dennetty 0,1 %:lla (paino/tilavuus) naudan seerumialbumiinia, 0,1 %:lla (tilavuus/- tilavuus) Tween 80:tä ja 0,02 %:lla (paino/tilavuus) natriumatsidia. 60 min kuluttua pystyasentoisella rumpusekoittimella sekoittamisen jälkeen huoneenlämpötilassa, sitoutumaton fibronektiini laimennettiin lisäämällä 3 ml jääkylmää PBS:ää, joka sisälsi 0,1 % (tilavuus/tilavuus) Tween 80:tä. Kun oli sentrifugoitu 20 min ajan 1350 35 x g:llä, supematantti imettiin pois, ja bakteeripellettiin liittyvä radioaktiivisuus kvantisoitiin LKB-gammalaskurilla.

16 106264

Paneli A: Modifioimattoman D3:n (-) inhibitioaktiivisuus, ja tyrosiini (Δ—Δ)-, tai lysiini (o—o)-tähteillä modifioimisen jälkeen.

Paneli B: Modifioimattoman D3:n (-) inhibitioaktiivisuus, ja karboksyylisivutähtei-5 den modifioimisen jälkeen glysiinimetyyliesterillä (o—o), etanoliamiinilla (Δ—Δ) tai EDC-reagenssilla yksinään (□—□).

Kuvio 3 10 Peptidin D3 käänteisfaasi-HPLC ennen (paneli A), ja jälkeen (paneli B) trypsiinillä hajotusta. Kromatografia suoritettiin käyttämällä analyyttistä Vydac C]8-kolonnia ja TFA-puskuroitua asetonitriiliä eluenttina virtausnopeudella 1 ml/min. Huippujen päällä olevat luvut tunnistavat katkaisutuotteiden ensimmäiset ja viimeiset tähteet D3:n sekvenssin sisällä. Paneli C on trypsiinin profiili yksinään.

15

Kuvio 4 Määritys peptidin D3 kyvystä estää ,25I-HFN:n tai HFN:n 125I-29 kDa-fragmentin sitoutuminen S. aureus 8325-4:ään joko ennen (Δ—Δ) tai jälkeen (o—o) täydellisiä 20 hajotusta trypsiinillä (A,D), kymotrypsiinillä (B,E) tai endoproteaasi Glu-c:lla (C,F).

Kuvio 5 25 Määritys puhdistettujen proteaasikatkaisutuotteiden kyvystä estää ,25I-HFN:n sitoutuminen S. aureus 8325-4:ään. 1251-HFN, jonka solut sitoivat peptidin puuttuessa, merkittiin 100 %:ksi, ja sitominen peptidien läsnä ollessa ilmaistiin suhteessa tähän arvoon.

, 30 Kuvio 6 Määritys synteettisten peptidien kyvystä estää l-HFN:n sitoutuminen S. aureus 8325-4-soluihin. Määritysolosuhteet kuvataan kuvion 2 selityksessä. Peptidien sekvenssit kuvataan kuviossa 1. Tulokset ilmaistaan %-osuutena fibronektiinistä, jonka 35 solut sitoivat peptidin puuttuessa.

Claims (2)

106264 Patenttivaatimus * Menetelmä farmakologisesti aktiivisen, fibronektiiniä sitovan peptidin valmistamiseksi, jolla on rakenne 5 R'-PSYQFGGHNS VDFEEDT-R2, jossa R' on vety tai K tai DK, ja R2 on hydroksi, L, LP tai LPK, tunnettu siitä, että mainittu peptidi valmistetaan synteettisesti sinänsä tunnetulla tavalla sopivista ami-10 nohapoista tai että peptidille, joka sisältää mainitun peptidin, suoritetaan proteolyysi mainitun peptidin muodostamiseksi.

15 Förfarande för framställning av en farmakologiskt aktiv, fibronektin-bindande pep-tid med strukturen R'-PSYQFGGHNS VDFEEDT-R2, 20 väri R’ är väte eller K eller DK, och R2 är hydroxi, L, LP eller LPK, kännetecknat av att nämnda peptid framställs syntetiskt pä, i och för sig känt sätt frän lämpliga aminosyror, eller att en peptid innehällande nämnda peptid utsätts för proteolys för bildande av nämnda peptid. • * * * m