FI104619B - Menetelmä lipidien erottamiseksi - Google Patents

Description

104619

Menetelmä lipidien erottamiseksi

Keksinnön ala 5

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää lipidien erottamiseksi käyttämällä ylikriittistä uuttoa.

Keksinnön tausta 10

Lipideillä on tärkeä osa solun biologiassa. Esimerkiksi biologisissa kalvoissa lipidit voivat vaikuttaa kalvon entsymaattiseen aktiivisuuteen ja fysikaaliseen luonteeseen, läpäisevyys mukaan lukien. Lääkkeitä, joissa on aktiiviaineena fosfo- ja/tai glykolipidejä, käytetään muun muassa ravinnelisäaineina. Hermoku-15 doksesta johdettuja lipidejä on myös käytetty lipidiuutteiden muodossa oraalisissa syöpähoidoissa.

Aivojen, luuytimen ja hermokudoksen sisältämät lipidit, neurolipidit, voidaan jakaa kolmeen pääryhmään. Nämä ryhmät ovat kolesterolit (CL), fosfolipidit ja sereb-:-:20 rosidit. Voidaan myös erottaa toisistaan kaksi fosfolipidien (PL) alaryhmää, joista : ensimmäinen käsittää glyserofosfolipidit, mukaan lukien fosfatidyylikoliinit (PC), fosfatidyylietanoliamiinit (PE), fosfatidyyliseriini (PS) ja fosfatidyyli-inositolit (Pl), • | ja toinen käsittää sfingomyeiiinit (SM). Serebrosidit (Cer) ja serebrosidien sulfaat-tiesterit (sulfatidit) ovat glykolipidejä (GL). Triglyseridejä esiintyy vain ääreisher- • · · : 25 mokudoksissa.

• · • ·

On tunnettua erottaa polaarisia lipidejä, kuten fosfolipidejä ja glykolipidejä muista • · · ·. * lipideistä, erityisesti neutraaleista lipideistä kuten kolesteroli, käyttämällä nesteu-*" · · i ’·· uttoa sopivan liuottimen kanssa kuten asetoni, joka ei liuota fosfolipidejä. Ase-• · · ·... 30 toniuuton haittana on, että se ei ole täydellisen selektiivinen ja että tuote sisältää i väistämättä pieniä määriä liuotinjäänteitä, jotka ovat hankalia poistaa. On myös vaikeaa saada tuote, jonka polaarinen lipidikoostumus vastaa siinä kudoksessa, josta näyte on saatu, olevaa lipidikoostumusta.

2 104619

Polaarisia lipidejä on myös puhdistettu apolaarisista lipideistä adsorboimalla ne adsorbenttiaineen pinnalle asetoni-dikloorimetaaniseoksesta. Käyttämällä edeltä määriteltyä liuotinsuhdetta adsorboidut polaariset lipidit saostetaan, kun taas neutraalit lipidit pysyvät liuoksessa. Kuitenkin liuottimien saostuminen yhdessä 5 adsorbenttiaineessa olevien lipidien kanssa tekee liuotinjäänteiden poistamisesta vaikean.

Ylikriittinen uutto fluidilla tai nesteellä (supercritical fluid extraction, lyh. SFE) on menetelmä, jota on viime aikoina käytetty erilaisten aineiden erottamiseksi. Yli— 10 kriittisissä uuttoprosesseissa uuttamiseen käytettävä paine ja lämpötila ovat uut-toliuottimen kriittisen paineen ja lämpötilan yläpuolella. (Kriittinen lämpötila on korkein lämpötila, jossa saman aineen kaksi muotoa, neste ja kaasu, ovat läsnä samanaikaisesti. Kriittisen lämpötilan yläpuolella ei ole mahdollista nesteyttää kaasua nostamalla painetta. Kriittinen paine on se paine, jossa kaasu nesteytyy 15 kriittisessä lämpötilassa.) Ylikriittisessä tilassa kaasun tiheys ja viskositeetti ovat alhaisia ja uuttamiskyky on suuri verrattuna nestemäisen muodon vastaaviin arvoihin. Kuitenkin kaasun tiheys on silti riittävän suuri, jotta saadaan suuret liukenevuudet, mutta viskositeetti ja diffuusio ovat lähellä kaasumuodon vastaavia arvoja. Sellainen fysikaalisten parametrien yhdistelmä johtaa nopeaan uuttoon ja 20 nopeaan erottamiseen. Muuttamalla lämpötilaa ja painetta on mahdollista sää-della kaasun liuottamisominaisuuksia laajalla alueella.

• · « • «« • f " Ylikriittistä hiilidioksidia on käytetty erilaisten lipidejä sisältävien aineiden,, esi-« · · merkiksi kaakaorasva, uuttamiseen. Ylikriittistä hiilidioksidia on käytetty myös 25 kofeiinin uuttamiseen kahvipavuista ja kahviöljystä. Hiilidioksidin tiheyden suhde • · paineeseen ja lämpötilaan on esitetty kuviossa 1.

• · · • · · • · • " On myös tunnettua käyttää ylikriittistä uuttoa jäteveden käsittelyprosessissa (kat- i » so esimerkiksi US-patentit 4 061 566 ja 4 124 528), joissa epäpuhtaudet poiste- «I · : V 30 taan adsorboimalla ne adsorbenttiaineeseen, kuten aktiivihiileen. Ladattu aktiivi- • « V·: hiili uutetaan sitten ylikriittisellä fluidilla käyttämällä hiilidioksidia uuttoaineena.

Ylikriittinen fluidi, johon on liuennut adsorboitunut aine, käsitellään sitten fysikaa- 3 104619 lisesti, joka käsittely muuttaa sen ei-liuottimeksi ainakin osalle adsorboitunutta ainetta, jotta erotetaan ylikriittinen fluid! ja adsorbaatti.

On myös tunnettua helpottaa uutettavan aineen liukenemista ja parantaa uuttotu-5 losta säätelemällä aineen jakautumiskerrointa fluidissa. Tämä voidaan suorittaa hienosäätelemällä uutto-olosuhteita, kuten uuttosysteemin polaarisuutta, käyttämällä lisäaineita tai modifikaattoreita.

Kuitenkin yritykset polaaristen lipidien erottamiseksi neutraaleista lipideistä uutta-10 maila lipidiseos ylikriittisellä uuttoprosesilla eivät ole onnistuneet. Suurin ongelma näyttää olevan kanavoitumisilmiö (joka aiheutuu lipidimuodostuman kovettumisesta, mikä rajoittaa fluidin virtausta "kanaviin"), joka tapahtuu käsiteltävän lipidi-seoksen sisällä ja joka estää tyydyttävän kontaktin ylikriittisen fluidin ja lipidien välillä, mistä aiheutuu yksittäisten lipidien epätäydellinen erottuminen.

15

Siten alalla on tarve menetelmälle suhteellisten puhtaiden lipidien tehokkaaksi uuttamiseksi lipidiseoksesta käyttämällä ylikriittistä uuttoa.

Piirustusten kuvaus :.i, 20 ' ' Kuvio 1 esittää hiilidioksidin tiheyden lämpötilan ja paineen funktiona.

• i • · I f If I · • ·

Kuvio 2 on kaavamainen diagrammi systeemistä, joka on käyttökelpoinen kek- • · « sinnön mukaiseen ylikriittiseen uuttoon.

.. 25 • · • · ·

Kuvio 3A esittää kaupallisesti saatavan lipidivalmisteen suhteellisen lipidikoostu- · · muksen.

*" · · • ·

• M

«M

: : ”· Kuvio 3B esittää keksinnön mukaisella menetelmällä saadun lipidivalmisteen • · » : V 30 suhteellisen lipidikoostumuksen.

* · ...

• · » * ·

Kuvio 4A esittää lipidisuhteen näytteessä ennen keksinnön mukaista ylikriittistä uuttoa.

4 104619

Kuvio 4B esittää lipidisuhteen uutettujen lipidien näytteessä kuviossa 4A esitetyn aineen ylikriittisen uuton jälkeen.

Keksinnön yhteenveto 5

Esillä oleva keksintö koskee patenttivaatimuksessa 1 esitettyä menetelmää lipidien erottamiseksi käyttämällä ylikriittistä uuttoa. Erityisesti keksintö koskee menetelmiä lipidien erottamiseksi lipidien seoksesta, joka menetelmä käsittää sen, että käytetään adsorbenttiainetta ja ylikriittistä fluidia. Minkä tahansa tyyppisiä 10 lipidejä voidaan eristää lipidien seoksesta käyttämällä keksinnön mukaisia menetelmiä. Edullisessa toteutusmuodossaan keksintö koskee menetelmää neutraalien lipidien, pääasiassa kolesterolin ja triglyseridien, erottamiseksi näytteestä, joka sisältää sellaisia neutraaleja lipidejä seoksessa polaaristen lipidien, erityisesti fosfolipidien ja glykolipidien kanssa. Edullisessa toteutusmuodossan keksintö 15 tarjoaa välineet polaarisen lipidifraktion eristämiseksi kudoksesta, edullisesti hermo- tai luuydinkudoksesta, joka lipidifraktio sisältää yksittäiset polaariset lipidit sellaisessa suhteessa, joka vastaa niiden suhdetta lähtöaineessa. Erotettu lipidituote voidaan yhdistää tavanomaisten apuaineiden kanssa, esim. voitelu-aineen kanssa formulaatioon, joka sopii annosteltavaksi kapselissa tai muussa 20 muodossa.

Keksinnön mukaisesti esitetään menetelmä lipidien erottamiseksi lipidien seok- • · :sesta menetelmän käsittäessä vaiheet, joissa adsorboidaan lipidiseos adsor-* · · benttiaineeseen, altistetaan adsorbenttiaine, johon on adsorboitunut lipidiseos, 1 2 3 4 5 6 ylikriittiselle fluidille ja erotetaan adsorbentttiaine ylikriittisestä fluidista. Halutut • · · • · · 2 lipidit (se on seoksesta eristettävät lipidit) ovat riippuen adsorbenttiaineen ja yli- • · · 3 kriittisen fluidin valinnasta läsnä joko adsorbenttiaineessa tai ylikriittisessä fluidis- .

4 * · · • · ’···] sa uuttamisen jälkeen. Keksinnön edullisen toteutusmuodon mukaisesti halutut 5 ' lipidit voidaan eristää adsorbenttiaineesta, mutta riippuen käytettävästä adsor- 6 benttiaineesta, sellaiset lipidit voidaan käyttää edelleen suoraan (so. adsorboidus- • · · :...· sa muodossa). Kuten tässä selitysosassa mainitaan, lipidin tyyppi (so. polaari nen, apolaarinen), joka eristetään adsorbenttiaineessa, on keksinnön mukaisissa menetelmissä käytettävien adsorbenttiaineen ja ylikriittisen fluidin funktio. Siten keksinnön mukaiset menetelmät voivat käsittää myös vaiheet, joissa adsor- 5 104619 boidaan lipidien seos adsorbenttiaineeseen, altistetaan adsorbenttiaine ylikriittiselle fluidille, eristetään ylikriittinen fluidi ja erotetaan halutut lipidit (so. seoksesta eristettävät lipidit) ylikriittisestä fluidista, esimerkiksi muuttamalla lämpötilaa ja/tai painetta.

5

Esillä olevaan keksintöön kuuluu ylikriittisen uuttoprosessin käyttäminen lipi— diseoksen erottamiseksi, erityisesti neurolipidien seoksen erottamiseksi, jotta erotetaan neutraalit lipidit, kuten kolesteroli ja trigiyseridit, polaarisemmista lipideistä. Erityisesti keksinnön kohteena on lipidien eristäminen, jolloin eristetyt 10 lipidit ovat läsnä suhteessa, joka vastaa niiden suhdetta lähtöaineessa. Tarkemmin keksinnön mukaiset menetelmät ovat käyttökelpoisia polaaristen lipidien eristämiseksi kudosnäytteestä suhteessa, joka vastaa sitä, jossa ne luonnollisesti esiintyvät kudosnäytteessä.

15 Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä lipidien spesifisten populaatioiden uuttamiseksi lipidiseoksista, jotka on uutettu näytteestä, kuten luuydin- tai hermokudoksesta. Esillä olevan keksinnön edullinen menetelmä käsittää sen, että adsorboidaan lipidien seos adsorbenttiaineeseen; altistetaan adsorbenttiaine ylikriitti— "·ί selle fluidille; ja erotetaan ylikriittinen fluidi, joka voi olla kaasumaisessa tilassa, 20 adsorbenttiaineesta.

< f f I «

• I

• I

’•.'i Keksinnön mukaisessa edullisessa toteutusmuodossa lipidiseos adsorboidaan « · • » * " adsorbenttiaineeseen ja käsitellään sitten ylikriittisellä fluidilla. Sitten adsorbent- • · · tiaine ja ylikriittinen fluidi erotetaan. Adsorbenttiaineeseen adsorboituneet lipidit 25 voidaan sitten käyttää suoraan tai ne voidaan erottaa adsorbenttiaineesta.

• · • · · » * ♦ · « · · • « · \ Keksinnön edullisessa toteutusmuodossa ylikriittinen fluidi on hiilidioksidi, SF6, “ · · • · ·’ ** Xe, CH2CI2F2 tai CHF3, metaani, etaani, propaani, n-butaani, n-pentaani, eteeni, j ; ”·’ propeeni, asetoni, tolueeni, ammoniakki, metanoli, rikkidioksidi, vesi tai typpiok-• · · : *.·’ 30 sidi.

• · « · · • · ·

Keksinnön edullisessa toteutusmuodossa patenttivaatimusten kohteena olevissa menetelmissä käytettävä adsorbenttiaine on Si02 (silikageeli), alumiinioksidi, 6 104619

CaO, MgO, magnesiumsilikaatti, kalsiumfosfaatti, tärkkelys, selluloosa, sokeri, piimää tai kuohusavi (Fuller's earth). Edellä olevat ovat erityisen käyttökelpoisia adsorboitaessa polaarisia lipidejä neutraaleista lipideistä polaaristen ja neutraalien lipidien seoksesta. Yleisesti on saatavilla lukuisia kaupallisia laatuluokaltaan 5 erilaisia adsorbenttiaineita. Erityisen edullinen aine on silikageeli, erityisesti sellainen, jonka keskimääräinen hiukkaskoko on noin 12 x 10"9 m ja pinta-ala on 200 ± 25 mz/g.

Käytettäessä käänteisfaasiadsorbenttiaineita polaariset aineet uutetaan ylikriitti-10 sellä fluidilla keksinnön mukaisesti samalla kun polaarittomat jäävät adsorbent-tiaineeseen. Sellaiset adsorbenttiaineet voidaan valita silanisoidusta silikageelistä, kuten silika, jossa on sidottua oktyyli-, oktadekyyli-, syanoalkyyli-, aminoalkyyli-tai diolialkyyliryhmiä, mikä tarjoaa vähemmän adsorptiivisen pakkausaineen ja lukuisan määrän polaarisuuksia dipoli—dipoli— ja dipoli-indusoituihin dipoiivuoro-15 vaikutuksiin.

Keksinnön mukaiset menetelmät voidaan suorittaa modifikaattoreiden kanssa. Modifikaattorit lisäävät yleisesti ylikriittisen liikkuvan faasin liuotusvoimaa. Ne lisäävät myös liukoisuutta, erityisesti polaarisille liuotteille tai niille, joilla on alhai-:.i.: 20 nen haihtuvuus, siten mahdollistaen alhaisen paineen käyttämisen. Modifikaattorit tekevät myös mahdolliseksi ylikriittisen fluidin paine-tilavuus-lämpötila-käyttäyty-misen moduloinnin, ja ne parantavat selektiivisyyttä ja jakautumiskertoimia. Tietyn modifikaattorin valinta on alan ammattimiehen tietojen piirissä. Yleisesti käytetään • · · lyhytketjuisia alkoholeja samoin kuin lukuisia orgaanisia happoja, eettereitä ja 25 estereitä. Ylikriittisessä uutossa usein käytettyjä modifikaattoreita on kuvattu • · julkaisussa Analytical Supercritical Fluid Chromatography and Extraction, (Lee, et « · • · · *. al., toim., Chromatography Conferences, Inc., 1990), joka sisällytetään tähän • · • ** viitteenä.

• « · : • · « · * : 30 Esillä olevan keksinnön iisänäkökulmat ja edut käyvät ilmeisiksi alan ammatti- :.’·ί miehelle seuraavasta keksinnön yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

7 104619

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Lukuisia adsorbenttiaineita ja ylikriittisiä fluideja voidaan käyttää keksinnön mukaisissa menetelmissä, mukaan lukien alla kuvatut. Käytettävä spesifinen adsor-5 benttiaine ja/tai ylikriittinen fluidi riippuu eristettävien lipidien luokasta. Samoin se, vaihdellaanko lämpötilaa, painetta tai kumpaakin, jotta saostetaan eristetyt lipidit, on ylikriittisen fluidin luonteen ja haluttujen eristettävien lipidien tyyppien funktio. Alla on annettu esimerkkejä keksinnön mukaisissa menetelmissä käytettyjen komponenttien tyypeistä. Alan ammattimies pystyy esillä olevan selityksen avulla 10 valitsemaan lipidien halutun luokan eristämisessä tarvittavat spesifiset komponentit riippuen fysikaaliskemiallisista seikoista ja tässä annetuista ohjeista.

Keksinnön mukaisilla menetelmillä on mahdollista saavuttaa polaaristen ja neutraalien lipidien selektiivinen ja täydellinen erottuminen adsorboimalla lipidiseos 15 kantajaan (adsorbenttiaine) ja sitten uuttamalla kantaja ylikriittisellä fluidilla.

Adsorboimalla lipidiseos adsorbenttiaineeseen, pikemminkin kuin altistamalla se käsittelyyn ylikriittisen fluidin kanssa absorboitumattomassa muodossa, lipidiseos saatetaan muotoon, joka ei ole pelkästään helppo käsitellä, vaan joka mahdollis- < , ·,' 20 taa sen, että ylikriittinen fluidi on paremmin kosketuksissa lipidin kanssa ja siten < helpottaa ja parantaa halutun lipidityypin uuttamista.

* f • · * • I « « ·

Riippuen adsorbenttiaineen valinnasta ylikriittinen fluidi liuottaa selektiivisesti joko | · · ·* * lipidiseoksen polaariset komponentit tai apolaariset komponentit, jotka liuenneet 25 komponentit poistetaan seoksesta ja voidaan kuljettaa pois syntyneen kaasun • · kanssa.

• « · • · · - · · ·* *** Säätelemällä lämpötila- ja paineolosuhteita, samoin kuin vaihtamalla uuttoaikaa • « · ·;·* ja mahdollisesti käyttämällä modifikaattoreita, on mahdollista optimoida prosessin > * · i V 30 selektiivisyys mille tahansa käytettävälle uuttoaineelle ja adsorbenttiaineelle ja • * saada hyvin tehokas erotustulos. Sellainen optimointi on hyvin alan ammattimiehen kykyjen rajoissa esillä olevan selityksen ohjatessa. Esimerkiksi etanoli on edullinen modifikaattori C02:lle.

8 104619

Uuttoprosessin jälkeen adsorbenttiaine sisältää ne lipidiseoksen komponentit, jotka pysyvät siinä erityyppisten fysikaalisten ja kemiallisten voimien vaikutuksesta ja jotka ovat liukenemattomia fluidiin ylikriittisissä olosuhteissa. Ylikriittinen fluidi toisaalta liuottaa ne komponentit, joita adsorbenttiaine ei pidätä, mutta jotka 5 liukenevat fluidiin. Adsorbenttiaineen valinta riippuu siten erotettavien tuotteiden luonteesta ja adsorbenttiaineessa pysyvien tuotteiden luonteesta.

Tuotteet, jotka erotusvaiheessa liukenevat ylikriittiseen fluidiin, voidaan erottaa. Tavallisimmin erotus suoritetaan muuttamalla parametreja, kuten painetta ja/tai 10 lämpötilaa, alikriittisiin arvoihin, jolloin fluidin liuotusominaisuudet muuttuvat ja tuote erottuu tai fluidi haihtuu.

Kun esimerkiksi neurolipidien seos adsorboituna Si02:een uutetaan ylikriittisellä C02:lla, uuttamisen jälkeen saatu tuote, so. adsorbenttiaine adsorboituneiden pois laaristen lipidien kanssa, voidaan käyttää ilman lisämuunnoksia tai käsittelyjä. Tämä tuote voidaan yhdistää lisäaineisiin, jolloin parannetaan tuotteen käsittelyominaisuuksia, mukaan lukien voiteluaineet tai liukasteet (esim. magnesiums-tearaatti), täyteaineet (esim. mikrokiteinen selluloosa), paakkuuntumisen estoai- neet ja pintakäsittelyaineet kapseleiden täyttämiseen.

20 Käänteisfaasiadsorbenttiainetta voidaan käyttää esimerkiksi erotettaessa soija-

V I

:.'*i lesitiinejä soijasta, jolloin edellä esitetyn mukaiset polaariset lipidit, erottuvat uut-, · ♦ · tofluidin kanssa, ja sitten ne otetaan talteen.

• · · * i#: :

25 Esimerkki I

* * · • · »

> t I

Lämpösteriloidusta ja pakastekuivatusta kudoksesta, kuten sian, poron, naudan e · tai muun vastaavan aivoista tai luuytimestä, uutettiin lipidit ensin seoksella, jossa '•j·' oli etanolidietyylieetteriä (4:1 v/v, tiheys 0,77 kg/dm3). Sitten liuotin haihdutettiin ja i a · : V 30 lipidit liuotettiin asetoniin. Sitten lipidit adsorboitiin asetoniliuoksesta hienoksi V*: jaettuun silikaan ja asetoni suodatettiin pois. Lipidien suhde adsorbenttiafneeseen voi vaihdella paljonkin, noin 15 %:sta noin 75 %:iin painosta. Edellä mainitun 9 104619 hiukkaskoon ja halkaisijan omaavan silikan tapauksessa sopiva määrä on noin 30 % painosta.

Saatu adsorbenttiaine adsorboituine neurolipideineen laitettiin sitten kuviossa 2 5 kuvatun systeemin uuttoastiaan E. Sitten ylikriittistä C02:ta syötettiin uuttoastiaan alhaalta. Tässä esimerkissä uuttoastiaa, joka sisälsi adsorbenttiaineen, käytettiin lämpötilassa välillä 65 - 75 °C ja 600 baarin paineessa, joissa olosuhteissa neutraalit lipidit poistuivat lähes kvantitatiivisesti adsorbenttiaineesta. Sen jälkeen kun kaasu oli kulkenut uuttoastian läpi, se kulki erotusastiaan S, jossa painetta io alennettiin ilmakehän paineeseen. Tällaisissa olosuhteissa kaasu höyrystyy ja neutraalit lipidit erottuvat. Syntyneet lipidit poistetaan sitten erotusastiasta. Vaihtoehtoinen tapa fluidin erottamiseksi uutetuista lipideistä on laskea lämpötilaa. Sitten kaasu voidaan uudelleenkierrättää uuttoastiaan, mikäli niin halutaan.

15 Adsorbenttiaine, johon on adsorboitunut fosfo- ja glykolipidejä puhtaassa muodossa, voidaan ottaa talteen venttiilin kautta, joka on uuttokammion pohjassa.

Esimerkkejä yhden koeajon parametreistä on esitetty alla taulukossa I: «

» I

> 1 I

• » I

I » i • · " * > • ' I * ·

*1» f « I

• « · » « • · t II m : : : ~ · · • t • * · v i * · * t · * f t 1 r · • * * * * · 10 104619

Taulukko I

Uuttopaine, bar 600

Uuttolämpötila, °C 65-75 5 Uuttoaika, h 1.75

Keskimääräinen C02-virtausnopeus, kg/h 3,0

Kulutettu C02, kg 5,3 kg COj/kg uutetut neutraalit lipidit 54

Upidiuutekonsentraatio silikassa (%) 30,0 10 Lähtöaine (silika/lipidiuute) g 644,6

Lipidiuute koeyksikön alussa 193,4

Raffinaatti (silika/lipidiuute) kokeen jälkeen, g 547,0

Painohäviö kokeen aikana, g 97,6

Painohäviö %:na lähtöaineesta 15,1 _____________ I | . . ___ ___

\ I

15 Painohäviö %:na lipidiuutteesta 50 . r i i

Kerätty uute, g 102,0

f I

λ *#

**: Kolme sekalipidinäytettä uutettiin ylikriittisellä fluidilla edellä olevassa taulukossa I

osoitetuissa olosuhteissa.

4 * * '♦· ™ ' 20 ’’l» j * t \ * Näiden ylikriittisellä uutolla saatujen näytteiden lipidikoostumus analysoitiin käyt-·· : '·· tämällä ohutlevykromatografiaa yhdistettynä densitometriin.

#·· ' ; »Il ?'·/ Tulokset on esitetty alla taulukossa il. Näytteille 1332 ja 1333 saadut tulokset •\| 25 osoittavat kasvaneita kolesteroliarvoja optimaalisia alhaisempien olosuhteiden osoituksena. Tulokset näytteestä 1331, jotka osoittavat lukuisia eristettyjä lipidejä kokonaislipidikoostumuksen prosenttiosuuksista, on esitetty kuviossa 3B. Hyvin 104619 11 tunnetun kaupallisen valmisteen koostumus on esitetty vertailuksi kuviossa 3A. Kuvioissa 3A ja 3B ja taulukossa II lysofosfatidyylikoliinilla on lyhenne LPC, lyso-fosfatidyylietanolimiinilla LDE ja fosfatidihapolla AP.

5 Taulukko II

Näyte 1331 1332 1333 lipidi ka. % alue ka. % alue ka. % alue LPC 0,3 ♦ + 10 SM 1.3 - 0.9 0.7-1.1 0.6 PC 4.3 - 3.2 2,9-3,5 2,5 2,5-2.6 LPE 0.Θ 0.7-0,9 0.3 0.3-0,4 0.2 PE 3.6 3.5-3.7 3.4 3.1-3.8 2,7 2.6-2,8

Sulf 0.8 0.7-0.9 0,3 0.3-0,4 0,2 0.1-0,3 15 Cereb 2.5 2.4-2.7 2,4 2.2-2,5 2.0

Chol. 1.1 - 7.2 5.0-8.7 8.6 8.8-9.2

Tri ♦ + +

Kok. PL + OL 13,6 13,5-13,7 10.4 9,7-11,7 8,2 8,0-8,4 , Kok. lipidit 14.8 - 17.5 16.6-18,6 17,2

. 20 « f 1 « f I

" ' , Näyte 1131, 65-75 -C

'' " Näyte 1332. 45-55 ‘C

' Näyte 1333. 50 1C, paine 350 bar

I · I

• 1 - osoittaa, että mitään arvoa el ole annettu tai alue ei vaihtele.

• * 1 Ä _ • ·· 25 t ♦· v ; Edellä olevista tuloksista on ilmeistä, että näytteestä 1331 uutetut lipidit ovat läsnä suhteissa, jotka vastaavat lähtöaineen suhteita ja kaupallisesti saatavilla • - - - • " olevien tuotteiden suhteita. Siten esillä olevan keksinnön mukainen lipidien yli- « · · • « · *·] 1 kriittinen uutto tarjoaa käyttökelpoisen keinon spesifisten lipidien erottamiseksi »· : '· 30 lipidien ja muiden aineiden seoksista sellaisella tavalla, että uutetut lipidit ovat

IM

heti käytettävissä edelleen.

* · 1 • Il • · • · • · » • · · 12 104619

Esimerkki II

Esimerkissä I kuvattujen kokeiden kanssa samanlaiset kokeet suoritettiin myös suuremmassa mittakaavassa. Tällaisessa suurimittakaavaisissa kokeissa uuton 5 lähtöaine sisälsi 1/3 silikaa ja 2/3 lipidiseosta, joka oli saatu kuten esimerkissä I on kuvattu. Lipidin kokonaispaino paino oli 22 kg. Seoksen lipidikoostumus on esitetty kuviossa 4A. Kuten kuviossa on esitetty, lähtöseoksen kokonaiskolesteroli- ja triglyseridipitoisuus oli suurempi kuin 50 %.

10 Ylikriittinen uutto suoritettiin 30 l:n ruostumattomasta teräksestä valmistetussa uuttoastiassa 50 °C:n lämpötilassa ja keskimääräisessä paineessa noin 200 baaria. Ylikriittinen fluidi oli hiilidioksidi, jota syötettiin nopeudella 200 kg/h uutto-astlan pohjasta, poistuen ylhäältä. Modifikaattoria ei lisätty. Uutto kesti noin 4 tuntia, minkä ajan jälkeen noin 5 kg jäännösrasvaa kerättiin (kolesteroli ja muut 15 jäännösrasvakomponentit). Halutut polaariset lipidit pysyivät adsorbenttiaineessa.

Kahdeksan näytettä (näytenumerot 1-8) poistettiin uuttolaitteesta kahdeksalta eri korkeudelta uuttolaitteen pituudelta, näytteen 8 ollessa lähinnä pohjaa ja näytteen 1 lähinnä uuttolaitteen huippua. Kunkin näytteen lipidipitoisuudet on esitetty 20 alempana taulukossa III, osoittaen kunkin komponentin keskiarvomäärää. Näyte '\\\: 9 eristettiin ylikriittisestä fluidista uuton alussa ja näyte 10 eristettiin uuton lopus- .·. : sa. Taulukossa III esitetyt tulokset osoittavat, että esillä olevan keksinnön mukai- :·. * nen ylikriittinen uutto antaa tuloksena lipidien spesifioidun luokan suhteellisen • · · täydellisen uuton määrissä, jotka vastaavat lähtöaineessa, josta lipidit uutetaan, « 25 olevia määriä. Esimerkiksi näyte 8 on lähes vapaa neutraalista lipidistä (koleste- ·*·.. roli ja triglyseridit); kun taas polaaristen lipidien määrä on suurin piirtein sama « kuin lähtöaineessa. Taulukon III näytteen 5 koostumus on esitetty graafisesti i\ kuviossa 4B, joka osoittaa haluttujen polaaristen lipidien suhteen vastaavan nii- • · · den lähtöaineessa olevaa suhdetta, joka on esitetty kuviossa 4A. Kuvio 4B osoit- «· · ,.\m 30 taa myös, että neutraalit lipidit on suurimmalta osin poistettu.

• « • · 9 · · • · · 13 104619

Taulukko III

I NÄYTE KESKIARVO (%) 1 2 345 6789 10 IPC 0,3 0,3 0,3 0,3 0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 5 SM 2,1 1,8 1.9 1,9 2,3 2,2 2,1 2,5 0,7 PC 7,3 6,9 7.0 7,0 8,0 7,3 6,7 7.4 2,8 0,5

LPE

Foefatidyyll 1.2 1.0 1.0 1.0 1,0 1,0 0,9 1,1 0,3

Serlini ♦ ♦ ♦♦♦♦♦♦-- 10 AP 0,5 0.6 0,4 0,5 0.6 0,5 0,5 0,6 PE 9,1 9,1 8.1 9,0 9,3 7,2 6,7 7,6 3.0

Sulf 0.8 0,7 0.8 0.9 0.7 0,7 0,7 0,7

Cer 8,4 8.2 8.6 8,8 8,6 8,0 7,6 8,9 2,8 1.2

Choi 22,7 25,4 10.2 7.2 4,5 4,3 3,2 3,4 81,6 32,1 15 TG 0,4 0,9 0.7 0,6 0,4 0,4 0,3 0.7 0,8 45,8

Kok. PL 30,0 28,8 28,1 29,5 30.9 27,0 25,5 29,1 9.8 1,7

Edellä oleva esimerkki ja keksinnön mukaisten edullisten toteutusmuotojen ku-vaus annetaan havainnollistavassa tarkoituksessa, ja alan ammattimies tutus-20 tuessaan tässä kuvattuun keksintöön ymmärtää, että lukuisat lisätoteutusmuodot · kuuluvat keksinnön suojapiiriin. Siten keksintö rajoittuu vain ohessa olevien pa- • · : tenttivaatimusten suojapiiriin.

» · · • « · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · • · « · • · · « • · · • · 8 · • · · • 18 8 « 8 8 · 8 # 8 « · 8 8

Claims (9)

104619

1. Menetelmä polaaristen ja neutraalien lipidien erottamiseksi polaaristen ja neutraalien lipidien seoksesta, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavat vai-5 heet: (a) adsorboidaan mainittu lipidien seos adsorbenttiaineeseen; (b) altistetaan mainittu adsorboituneen lipidiseoksen sisältävä adsorbenttiaine 10 ylikriittiselle fluidille; ja (c) erotetaan mainittu adsorbenttiaine mainitusta ylikriittisestä fluidista, jolloin halutut lipidit ovat joko adsorbenttiaineessa tai ylikriittisessä fluidissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi vaiheen, jossa eristetään lipidit, jotka ovat adsorboituneet mainittuun adsorbenttiaineeseen tai jotka mainittu ylikriittinen fluidi sisältää. r

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu v 20 adsorbenttiaine on S1O2, alumiinioksidi, CaO, MgO, MgSi, kalsiumfosfaatti, : tärkkelys, selluloosa, sokeri, piimää tai kuohusavi. I I • a : ” 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu «aa a a a adsorbenttiaine on silikageeli, jonka hiukkasten keskimääräinen halkaisija on 25 noin 12 x 10‘^ m ja pinnan pinta-ala on noin 175-225 m2/kg. a · a a a a a a a a a a a a a a

4. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att nämnda adsor-bensmedel är silikagel, vars partiklars medeldiameter är cirka 12 x ΙΟ'** m och ytarea är cirka 175-225 m2/kg. s 5. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att nämnda hyperkri-tiska fluidum är C02, SFg, CH2CI2F2« CHF3, metan, etan, propan, n-butan, n-pentan, eten, propen, aceton, toluen, ammoniak, metanol, svaveldioxid, vatten eller kväveoxid. 10 6. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att nämnda adsor- bensmedel är silaniserad silikagel.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu a a a a a ’···* ylikriittinen fluidi on CO2, SFg, CH2CI2F2, CHF3, metaani, etaani, propaani, n-butaani, n-pentaani, eteeni, propeeni, asetoni, tolueeni, ammoniakki, me- :.j.: 30 tanoli, rikkidioksidi, vesi tai typpioksidi. • · · a a

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu adsorbenttiaine on silanisoitu silikageeli. 104619

7. Förfarande enligt patentkravet 5, kännetecknat därav, att nämnda adsor-bensmedel innehäller silika förknipat med en alkylgrupp, vilken är en oktyl-, 15 oktadekyl-, cyanoalkyl-, aminoalkyl- eller dialkylgrupp.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu adsorbenttiaine sisältää silikan liittyneenä alkyyliryhmään, joka on oktyyli-, oktadekyyli-, syanoalkyyli-, aminoalkyyli- tai dialkyyliryhmä.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että adsorbent tiaine on S1O2 ja ylikriittinen fluidi on CO2·

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ylikriittisessä fluidissa olevat lipidit eristetään muuttamalla lämpötilaa tai painetta, tai 10 kumpaakin. 15 1. Förfarande för avskiljning av polära och neutrala lipider frin en blandning av polära och neutrala lipider, kännetecknat därav, att det omfattar följande steg: (a) adsorbering av nämnda lipidblandning i ett adbsorbensmedel; 2 0 (b) utsättning av adsorbensmedlet innehällande nämnda adsorberade lipid blandning för ett hyperkritiskt fluidum, och • · • ** (c) avskiljning av nämnda adsorbensmedel frän nämnda hyperkritiska fluidum, • · · • · · varvid de önskade lipiderna är antingen i adsorbensmedlet eller i det hyperkri-25 tiska fluidumet. Ml » f · • · · 104619

8. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att adsorbensmedlet är Si02 och det hyperkritiska fluidumet är C02- 20

9. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att lipiderna i det hyperkritiska fluidumet isoleras genom att ändra temperatur eller tryck eller , bäda. « i • · • ·« * * * • · · • · • · · • · · • · « * · · • · · « · · • · · • « t · »·· » « « « · « I • «